Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-12-18Bitstream added on 2014-06-13T21:06:58Z : No. of bitstreams: 1 cruz_jcs_dr_botfca.pdf: 308912 bytes, checksum: 39a12254aaeafdcfc7adbf88eea87463 (MD5) / A doença conhecida por hérnia das crucíferas é causada pelo patógeno Plasmodiophora brassicae Woronin, sendo uma das mais importantes e de difícil controle em brássicas. Em virtude da dificuldade de preservação das estruturas de resistência de P. brassicae em condições laboratoriais, por se tratar de um parasita obrigatório, foi desenvolvido um ensaio visando a obtenção de uma técnica eficiente e prática de preservação. Para isto, raízes de diferentes brássicas naturalmente infectadas por P. brassicae, contendo hérnias, foram coletadas de uma mesma propriedade (município de Pardinho - SP), em diferentes períodos, e imediatamente congeladas em freezer a -20°C±2°C. Os tratamentos foram: T1: hérnias congeladas por 389 dias, (rúcula); T2: hérnias congeladas por 242 dias (brócolis); T3: hérnias congeladas por 21 dias (couve-chinesa) e T4: testemunha (sem inóculo). Os testes de patogenicidade, após os diferentes períodos de armazenamento, foram realizados em condições controladas de casa de vegetação (25±2°C), onde em cada planta, de uma variedade suscetível de couve-chinesa (Pak choi), foi inoculado 2mL da suspensão de esporos, dos diferentes tratamentos, na concentração de 107 esporos.mL–1. Cada tratamento contou com seis repetições distribuídas ao acaso. Passadas cinco semanas, após a inoculação, as raízes foram lavadas e avaliadas. Houve diferença estatística significativa entre os materiais avaliados quanto aos diferentes períodos de armazenamento em “freezer”. Os materiais congelados entre 21 a 242 dias preservaram suas características infectivas, sendo este método uma boa opção para a preservação das estruturas de repouso nesse período. Foram realizados testes de patogenicidade e análises moleculares de populações de P. brassicae,... / Disease known as clubroot of crucifers is caused by the pathogen Plasmodiophora brassicae Woronin, and is one of the most important and difficult control crucifer diseases in brassicas. Because of the difficulty in preserving the resistance structures of P. brassicae under laboratory conditions, given that it is an obligate parasite, an assay was carried out to develop a practical and effective technique that would allow further studies to be conducted. On this proposal, roots of different brassica species naturally infected by P. brassicae showing clubroot symptoms were collected in the some grower (Pardinho, SP-city, Brazil) during different seasons, and were immediately frozen at approximately 20°C±2°C. The treatments were: T1: clubroots frozen for 389 days (arugula); T2: clubroots frozen for 242 days (broccoli); T3: clubroots frozen for 21 days (Chinese cabbage), and T4: control (no inoculum). The pathogenicity tests after different storage periods were conducted under controlled greenhouse conditions (25±2°C); each plant of a susceptible variety of Chinese cabbage was inoculated with 2mL of a spore suspension of the various treatments at a concentration of 107spores.mL-1. Each treatment consisted of six replicates distributed at random. The roots were washed and evaluated five weeks after inoculation. There were statistical differences between the materials evaluated with respect to different storage periods in the freezer. Materials kept frozen between 21 and 242 days retained their infective traits. Therefore, this method is a good option to preserve resting spores during this period. In addition, pathogenicity tests and molecular analyses were conducted with P. brassicae populations obtained from infected roots of several production regions of Brazil, on some...(Complete abstract click electronic access below)

Foram coletadas amostras de água de piscinas térmicas e não térmicas na cidade de Porto Alegre, RS, Brasil entre os meses de maio de 2006 e março de 2007, com o objetivo de determinar a presença do gênero Acanthamoeba, bem como realizar a caracterização fenotípica e genotípica dos isolados. Amebas foram isoladas em cultivo monoxênico com Escherichia coli. A identificação dos isolados foi baseada na morfologia dos cistos e trofozoítos e na amplificação por PCR com oligonucleotídeos gênero-específico. O potencial patogênico foi avaliado usando testes de osmotolerância e termotolerância. Das 65 amostras analisadas, 13 (20%) foram positivas para amebas de vida livre e identificados morfologicamente como pertencentes ao gênero Acanthamoeba. Destas, 9 possuíam características compatíveis com o grupo morfológico II e 4 com o grupo III. Todos os isolados identificados morfologicamente quando submetidos à Reação de PCR, confirmaram pertencer ao gênero Acanthamoeba e 38% (5/13) dos isolados foram considerados potencialmente patogênicos a partir dos testes de osmotolerância e termotolerância. Neste estudo, o método molecular de RAPD ("Random Amplified Polymorphic-DNA") foi utilizado para investigar a relação genética entre os 13 isolados de piscinas e dois isolados de referência da ATCC. De 10 oligonucleotídeos decaméricos testados, quatro foram selecionados por gerarem produtos de amplificação passíveis de análise. A similaridade entre os isolados foi calculada utilizando-se o coeficiente de Jaccard e o dendrograma construído pelo método da média das distâncias entre grupos ("Average Linkage"). Quatro grupos distintos (G1-G4) de isolados foram formados de acordo com a similaridade genética entre eles. Sugeriu-se que os isolados do G1 por agruparem-se aos isolados de referência de A. castellanii (ATCC 30010 e 50492) possam pertencer a esta espécie. Os dados fenotípicos, tais como, morfologia e testes de tolerância foram relacionados aos dados genotípicos de RAPD e permitiram a caracterização dos isolados. Os resultados deste primeiro estudo de isolamento e caracterização de Acanthamoeba de água de piscinas na cidade de Porto Alegre-RS, Brasil confirmam a presença de isolados potencialmente patogênicos que podem representar um risco à saúde humana. / Water samples were collected from both heated and unheated swimming pools in the city of Porto Alegre, RS, Brazil between May 2006 and March 2007, to determine the presence of Acanthamoeba in the water of swimming pools as well as perform the phenotypic and genotypic characterization of the isolates. Amoebae were isolated in monoxenic culture with Escherichia coli. The identification of the isolates was based on the trophozoites and cysts morphology and on the amplification through PCR with genus-specific oligonucleotides. The potential pathogenic was assessed by osmotolerance and temperature tolerance assays. From the 65 samples analyzed, 13 (20%) were positive for free-living amoebae, and the isolates morphologically identified as belonging to the genus Acanthamoeba. Out of these, 9 presented characteristics compatible with morphological group II, and 4 with group III. All the morphologically identified isolates, when submitted to PCR, were confirmed as belonging to the genus Acanthamoeba, and 38% (5/13) of the isolates were considered potentially pathogenic according to osmotolerance and temperature tolerance assays. In this study, the molecular RAPD method (Random Amplified Polymorphic-DNA) was used to investigate the genetic relationship among 13 isolates from swimming pools and two strains from the ATCC reference. From the ten decameric oligonucleotides tested, four were selected for generating products of amplification possible to be analyzed. The similarity between isolates was calculated using the Jaccard coefficient and the dendrogram constructed by using the method of the average distances between groups ("Average Linkage"). Four distinct groups (G1-G4) of isolates were separated according to genetic similarity between them. It was suggested that the isolates from G1 once group up with the reference isolates of A. castellanii may belong to this species. The phenotypic data such as morphology and tolerance tests were related to RAPD genotypic data and led to the characterization of isolates. The results of this study about isolation and characterization of Acanthamoeba in swimming pools water at Porto Alegre, RS, Brazil confirm the presence of potentially pathogenic isolates which can present risks to human health.

Doctor of Philosophy / Department of Diagnostic Medicine/Pathobiology / Wenjun Ma / Influenza A virus (IAV) is an enveloped, segmented, negative-sense RNA virus that infects avian species and mammals. Its segmented feature enables antigenic shift which can generate novel IAVs that pose a threat to animal and public health due to lack of immunity to these viruses. Pigs have been considered the “mixing vessels” of influenza A viruses to generate novel reassortant viruses that may threaten animal and public health. Therefore, it is necessary to understand the pathogenicity and transmissibility of newly emerged reassortant viruses in swine. Adding to this complexity is the newly identified bat influenza A-like viruses which have roused interest in understanding the evolutionary history and pandemic potential of bat influenza. At least 10 different genotypes of novel reassortant H3N2 IAVs with gene(s) from 2009 pandemic H1N1 [A(H1N1)pdm09] have been identified in pigs in the United States. To date, only three genotypes of these viruses have been evaluated in animal models leaving the pathogenicity and transmissibility of the other seven genotype viruses unknown. We showed that reassortant viruses with genes from A(H1N1)pdm09 are pathogenic and transmissible in pigs. Further studies showed that avian-like glycine at position 228 of the HA receptor binding site is responsible for inefficient transmission of the reassortant H3N2 IAV with five A(H1N1)pdm09 genes. Studying the recently discovered IAV-like sequences from bats has been hindered by the lack of live virus isolation or culturing. Using synthetic genomics, we successfully rescued modified bat influenza viruses that had the HA and NA coding regions replaced with two classical IAVs. Additional studies were performed with truncations on NS1 protein and substitution of a putative virulence mutation in bat influenza PB2. Virus reassortment experiments demonstrated that bat influenza has limited genetic and protein compatibility with other influenza viruses; however, it readily reassorts with another divergent bat influenza virus. Taken together, our results provide insights into the pathogenicity and transmissibility of novel reassortant H3N2 IAVs in pigs. It also indicates that the bat influenza viruses recently identified are viable viruses that pose little pandemic threat to humans. Moreover, they provide new insights into the evolution and basic biology of influenza viruses.

Submitted by PATRICK DA SILVA null (patrick_dasilva@ymail.com) on 2016-09-01T14:44:37Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Patrick da Silva.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-09-01T18:20:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_p_me_arafcf.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-01T18:20:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_p_me_arafcf.pdf: 3098856 bytes, checksum: 3fb93fb0061cbc5d3f1d4f4066945e07 (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Sinalização química em bactérias patogênicas é um mecanismo empregado para interagir com o hospedeiro e sua respectiva microbiota. Através desta interação ocorre a regulação dos mecanismos de virulência. Estudando o mecanismo de sinalização química do sistema de 2-componentes QseBC em Salmonella enterica serovar Typhimurium foi aberta uma nova perspectiva para desvendar os mecanismos de patogenicidade. Dentre estes, uma nova proteína VisP (Virulence and stress-related Periplasmic protein) foi reportada. Seu papel inicial na interação com a enzima LpxO em S. Typhimurium foi anteriormente demonstrada. O antígeno-O da camada de LPS fornece proteção contra as defesas do hospedeiro e, particularmente, o comprimento de sua cadeia exerce um papel essencial. A montagem do antígeno-O possui o sistema Wzz, o qual determina o comprimento final de sua cadeia polissacarídica, e também apresenta uma distribuição tri-modal. Forma cadeias curtas (S-OAg), longas (L-OAg) e muito longas (VL-OAg) de antígeno-O. As proteínas WzzST e WzzfepE regulam, respectivamente, a síntese das cadeias L-OAg e VL-OAg. Neste estudo, os genes wzzST, wzzfepE, visP e lpxO foram mutados, via mutagênese λ Red, obtendo simples e duplos mutantes. Dados preliminares evidenciaram que há um aumento nas cadeias VL-OAg e L-OAg no mutante ΔvisP, e reciprocamente há diminuição de L-OAg em ΔlpxO. Foram feitos ensaios para avaliar a motilidade, invasão em células epiteliais e sobrevivência intracelular em macrófagos com as amostras obtidas pelos ensaios de mutagênese. Foi evidenciado uma redução de 1,2 e 1,0 ordem de magnitude nos processos de invasão e sobrevivência intracelular, respectivamente, no mutante ΔvisP em relação à amostra selvagem, conforme já descrito, e também uma redução de 70,61% na motilidade comparada com à amostra selvagem. Observou-se que a deleção dos genes wzzfepE e lpxO no mutante ΔvisP faz com que a bactéria retorne ao fenótipo da amostra selvagem nos processos de motilidade, invasão em células epiteliais e sobrevivência intracelular em macrófagos. Este efeito de complementação fenotípica não ocorre no mutante duplo ΔwzzST, apresentando os mesmos níveis do mutante simples ΔvisP, apesar deste possuir um aumento na expressão de genes envolvidos na motilidade e invasão celular comparado com o mutante ΔvisP. Aparentemente, há a atenuação destes processos patogênicos em bactérias com um alto nível de VL-OAg, levando-nos a hipotetizar que este tipo de cadeia de antígeno-O possui relevância na patogênese de S. Typhimurium. WzzfepE e LpxO apresentaram uma evidente participação nos processos de motilidade, invasão celular e sobrevivência intracelular via VisP, e possivelmente o antígeno-O de comprimento muito longo (VL-Oag) apresenta um papel de inibição nestes processos, além disso, evidenciou-se que VisP desempenha uma função relevante na montagem das cadeias de antígeno-O e na patogênese de S. Typhimurium. / Chemical signaling is a mechanism employed by several bacterial species to interact within surrounding microbiota and their host. Upon this interaction the pathogenic bacteria regulate their virulence traits. The two-component system QseBC was described on chemical signaling in Salmonella enterica serovar Typhimurium, and a novel branch of pathogenic cascade regulation was revealed. Among these mechanisms a novel protein was described, VisP (Virulence and stress related Periplasmic protein). VisP interacts with LpxO enzyme on the periplasm. The O-antigen of the LPS layer provides protection against host defenses, and particularly its chain’s length plays an essential role. The O-antigen assembly has the Wzz system, which determines the O-antigen final chain length, and also presents a tri-modal distribution. It forms short (S-OAg), long (L-OAg) and very-long (VL-OAg) O-antigen chains. The WzzST and WzzfepE proteins respectively regulate the L-OAg and VL-OAg synthesis. In this study, wzzST, wzzfepE, visP and lpxO genes were mutated via λ Red mutagenesis, obtaining single and double-mutants. Our preliminary data have shown that VisP increases VL-OAg and L-OAg, conversely LpxO diminishes L-OAg chain length. The motility, epithelial cell invasion and macrophage intracellular survival and replication were assessed with the mutants obtained. The ΔvisP presented 1,2 and 1,0 order of magnitude reduction in cell invasion and intracellular macrophage replication, respectively, comparing with WT S. Typhimurium, as described, and 70,61% less motility rate than WT. Mutating wzzfepE or lpxO genes in ΔvisP recovers the motility, epithelial cell invasion and macrophage intracellular survival and replication WT phenotypes. Nonetheless, this effect does not occur with wzzST gene deletion in ΔvisP, as this double-mutant presents the same phenotypes of ΔvisP single-mutant, although this deletion raises expression rates of motility and cell invasion related genes significantly. Apparently, these pathogenic processes are attenuated within samples with VL-Oag high levels, taking us to hypothesize that there is a correlation between this O-antigen chain length and S. Typhimurium pathogenesis. WzzfepE and LpxO presented an important role on motility, epithelial cells invasion and macrophage intracellular survival through VisP, and probably the VL-OAg inhibits these processes. Furthermore, VisP plays a relevant function on O-antigen chain assembly and pathogenesis of S. Typhimurium. / CNPq: 134434/2014-5

Submitted by JULIANA TEODORA DE ASSIS REGES null (juliana.teodora@bol.com.br) on 2016-10-21T00:48:25Z No. of bitstreams: 1 Reges-Tese-DR.pdf: 2852424 bytes, checksum: e86c4e7420b8cf40a8dcc1e723431082 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-10-27T16:48:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 reges_jta_dr_jabo.pdf: 2852424 bytes, checksum: e86c4e7420b8cf40a8dcc1e723431082 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-27T16:48:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 reges_jta_dr_jabo.pdf: 2852424 bytes, checksum: e86c4e7420b8cf40a8dcc1e723431082 (MD5) Previous issue date: 2016-08-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Na primeira parte de nosso estudo descrevemos a associação de Pyricularia pennisetigena e P. zingibericola a gramíneas invasoras de áreas de trigo no centro-sul do Brasil. Desconhece-se, entretanto, qual o potencial de P. pennisetigena e P. zingibericola como patógenos de poáceas de interesse econômico para a agricultura brasileira. Dessa forma, objetivamos caracterizar o espectro de patogenicidade de P. pennisetigena e P. zingibericola a braquiária, cevada e trigo e compará-lo com P. grisea e com a espécie até recentemente descrita como P. oryzae patotipo Triticum, de ocorrência generalizada no agroecossistema brasileiro. Foram testados 20 isolados de Pyricularia spp. obtidos de amostras de folhas infectadas de plantas invasoras de campos de trigo. A classificação dos isolados em espécies distintas de Pyricularia foi efetuada usando-se filogenia molecular baseada nas sequencias parciais dos genes actina e calmodulina. Pyricularia pennisetigena e P. zingibericola inoculadas em folhas, foram patogênicas a braquiária, cevada e trigo, com diferenças na agressividade entre as espécies. Pyricularia zingibericola foi a espécie mais agressiva a braquiária e cevada, enquanto P. pennisetigena foi a espécie mais agressiva em plantas jovens de trigo. Por outro lado, P. grisea isolada de Digitaria sanguinalis ou de Urochloa spp. não infectou trigo. A análise filogenética das regiões ACT e CAL concatenadas reproduziu as relações filogenéticas e a magnitude das diferenças descritas entre Pyricularia zingibericola, P. pennisetigena, P. oryzae patotipo Triticum e P. grisea. Urochloa spp. provavelmente representam fonte permanente de inóculo inicial dos patógenos da brusone do trigo entre as épocas de cultivo. Na segunda parte desta pesquisa, foi estudado a estrutura genética de populações do patógeno da brusone do trigo, o fungo Ascomiceto Pyricularia graminis-tritici sp. nov., no centro-sul do Brasil. Os objetivos foram responder às seguintes perguntas: As populações geograficamente distintas de P. graminis-tritici do trigo eram geneticamente subdivididas? Como se distribuía a diversidade gênica e genotípica entre as populações regionais de P. graminis-tritici, cerca de 30 anos após as primeiras epidemias de brusone no Brasil? Qual o sistema reprodutivo predominante de P. graminis-tritici no país? Conclui-se que não houve subdivisão na maioria das populações geográficas contemporâneas de P. graminis-tritici do trigo, indicando mecanismo eficiente de fluxo gênico. A magnitude e a extensão do fluxo gênico entre populações geográficas de P. graminis-tritici do trigo, o sistema reprodutivo predominantemente sexual, aliados a alta diversidade genética do fungo, indicam um patógeno com alto potencial evolutivo no agroecossistema brasileiro. Outras espécies de poáceas hospedeiras com ampla distribuição geográfica no Brasil, como por exemplo, o capim-braquiária (Urochloa brizantha), podem ter importante papel no ciclo de vida e na biologia reprodutiva, na sobrevivência e na dispersão do inóculo de P. graministritici a curta e longa distâncias, mantendo as populações geográficas do patógeno conectadas. Os padrões de fluxo gênico e genotípico entre populações hospedeiro-distintas do patógeno reforçam a hipótese de que a brusone do trigo pode ter tido origem de novo a partir de populações endêmicas de P. graminis-tritici que infectam outras espécies de poáceas (nativas ou invasoras de áreas de trigo) no país. / In the first part of our study we described the association of Pyricularia pennisetigena and P. zingibericola with invasive grasses from wheat cropping areas in South-Central Brazil. However, the potential of P. pennisetigena and P. zingibericola as pathogens to poaceous plants of economic interest for Brazilian agriculture is still unknown. Therefore, this study aimed to characterize the pathogenicity spectrum of P. pennisetigena and P. zingibericola to signal grass, barley and wheat and compare with P. grisea and with the species until recently described as P. oryzae pathotype Triticum, of widespread occurrence in the Brazilian agroecosystem. Twenty isolates of Pyricularia spp. obtained from samples of infected leaves of weed species in wheat fields were tested. Classification of isolates into different species of Pyricularia was performed using molecular phylogeny based on the partial actin and calmodulin gene sequences. Pyricularia pennisetigena and P. zingibericola inoculated on leaves were pathogenic to signal grass, barley and wheat, with differences in aggressiveness between species. Pyricularia zingibericola was the most aggressive species to signal grass and barley, while P. pennisetigena was the most aggressive species to young plants of wheat. On the other hand, P. grisea isolated from Digitaria sanguinalis or Urochloa spp. did not infect wheat. Phylogenetic analysis of the concatenated regions ACT and CAL reproduced the phylogenetic relationships and the magnitude of the differences reported between Pyricularia zingibericola, P. pennisetigena, P. oryzae pathotype Triticum and P. grisea. Urochloa spp. probably represents a permanent source of initial inoculum of the wheat blast pathogens between growing seasons. In the second part of this research, we studied the genetic structure of populations of the wheat blast pathogen, the Ascomycete fungus Pyricularia graminis - tritici sp. nov., in the South-Central Brazil. The objectives were to answer the following questions: The geographically distinct populations of P. graminis-triticiwheat were genetically subdivided? How gene and genotypic diversity were distributed among regional populations of P. graminis-tritici about 30 years after the first outbreaks of wheat blast in Brazil? What is the predominant reproductive system of P. graminis-tritici in the country? We concluded that there was no subdivision among most of the contemporary geographical populations of Pyricularia graminis- tritici from wheat fields, indicating an efficient mechanism of gene flow. The magnitude and extent of gene flow among geographical populations of P. graminis-tritici, the predominantly sexual reproductive system, coupled with high genetic diversity of the fungus, indicated a pathogen with high evolutionary potential in the Brazilian agro-ecosystem. Other species of poaceous hosts with wide geographic distribution in Brazil, for example, signal grass (Urochloa brizantha) can play an important role in the life cycle and reproductive biology, survival and spread of inoculum of P. graminis- tritici at short and long distances, keeping the geographical populations of the pathogen connected. The patterns of gene and genotypic flow between host-distinct populations of the pathogen reinforce the hypothesis that the wheat blast may had a de novo origin from endemic populations of P. graminis-tritici infecting other poaceous species (native or invasive WRwheat areas) in the country.

Submitted by LARISSA NOGUEIRA DE SOUZA null (larissaiftm@gmail.com) on 2017-05-24T19:31:43Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_Larissa_Nogueira_de_Souza.pdf: 3902345 bytes, checksum: fc3833c63f2f779042077b0ab45fb745 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-05-24T20:56:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 souza_ln_me_jabo.pdf: 3902345 bytes, checksum: fc3833c63f2f779042077b0ab45fb745 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-24T20:56:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 souza_ln_me_jabo.pdf: 3902345 bytes, checksum: fc3833c63f2f779042077b0ab45fb745 (MD5) Previous issue date: 2017-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O clima tropical brasileiro propicia o desenvolvimento de inúmeras doenças fúngicas nas culturas produzidas, incluindo as fruteiras tropicais. O Brasil é um grande produtor de frutas, incluindo goiaba e manga, que são inclusive exportadas para outros países. Além das doenças conhecidas que incidem sobre essas culturas, sintomas atípicos têm sido observados em condições de campo, sem relação específica com patógenos já identificados. Assim, este trabalho teve por objetivo isolar fungos de tecidos lesionados de frutos, folhas e ramos de goiabeiras, assim como de folhas de mangueiras para estabelecer suas relações parasitárias e identificá-los molecularmente. Foram obtidos 25 isolados de goiabeiras de três municípios e dois isolados de mangueiras de um município do Estado de São Paulo. Os isolados tiveram sua região ITS rDNA (Internal Transcribed Spacer) e a região parcial do gene TEF1 (translation elongation factor 1-alpha) sequenciadas, o que proporcionou a identificação acurada dos isolados, em gênero. Os isolados de goiabeiras foram identificados como Neopestalotiopsis spp., sendo esse o primeiro relato em goiabeiras, e os isolados de mangueiras foram agrupados juntamente com as espécies Pseudopestalotiopsis theae e Pestalotiopsis trachicarpicola, sendo este também o primeiro relato dessas espécies em mangueiras. Os isolados de goiabeiras e de mangueiras foram inoculados em folhas destacadas de goiabeira ‘Paluma’, em condições de laboratório, com ferimento e sem ferimento. Em adição, os isolados oriundos de mangueiras foram inoculados em folhas destacadas de mangueiras ‘Tommy Atkins’. Os isolados causaram sintomas característicos daqueles dos quais provieram, sendo com maior severidade quando em folhas previamente feridas. No entanto, os isolados de Neopestalotiopsis spp. também foram capazes de ocasionar sintomas em folhas intactas. Concluiu-se que novos gêneros de fungos estão associados a lesões em mangueiras e goiabeiras no Brasil, os quais apresentam falta de especificidade de tecidos e hospedeiros, representando novo risco à sanidade das plantas. / The Brazilian tropical climate promotes the development of numerous fungal diseases in the crops produced in the country, including tropical fruit crops. Brazil is a major producer of fruits, including guava and mango, which are even exported to other countries. Besides the known diseases that affect these crops, atypical symptoms have been observed under field conditions, with no specific relation to pathogens already identified. Thus, this work aimed to isolate fungi from such lesions of fruits, leaves and branches of guava plants, as well as from leaves of mango plants to identify them molecularly and prove their symptomatic association with such crops. We obtained 25 isolates from guava plants located in three municipalities and two isolates from mango plants located in one municipality of São Paulo state. These isolates were submitted to sequencing of ITS rDNA region (Internal Transcribed Spacer) and the partial TEF1 gene (translation elongation factor 1-alpha), which provided the accurate identification of the isolates in genus. The isolates from guava plants were identified as Neopestalotiopsis spp. It is the first report of this genus in guava. Moreover, the isolates from mango plants were grouped with the species Pseudopestalotiopsis theae and Pestalotiopsis trachicarpicola. It is also the first report of these species in mango trees. Guava and mango isolates were inoculated on 'Paluma' guava leaves under laboratory conditions, with injury and without injury. In addition, the isolates from mango plants were inoculated on detached leaves of 'Tommy Atkins' mango. The isolates were able to cause symptoms similar to those from which they came in greater severity in wounded leaves. However, the isolates of Neopestalotiopsis spp. were also capable of causing symptoms on intact leaves. Thus, it was concluded that new genotypes of fungi are associated with lesions in mango and guava plants in Brazil, which present lack of tissue and host specificity, representing a new risk to the orchards sanity.

Orientador: Edson Luiz Furtado / Banca: Marli Teixeira de Almeida Minhoni / Banca: Romulo Fujito Kobori / Banca: Louise Larissa May de Mio / Banca: César Júnior Bueno / Resumo: A doença conhecida por hérnia das crucíferas é causada pelo patógeno Plasmodiophora brassicae Woronin, sendo uma das mais importantes e de difícil controle em brássicas. Em virtude da dificuldade de preservação das estruturas de resistência de P. brassicae em condições laboratoriais, por se tratar de um parasita obrigatório, foi desenvolvido um ensaio visando a obtenção de uma técnica eficiente e prática de preservação. Para isto, raízes de diferentes brássicas naturalmente infectadas por P. brassicae, contendo hérnias, foram coletadas de uma mesma propriedade (município de Pardinho - SP), em diferentes períodos, e imediatamente congeladas em freezer a -20°C±2°C. Os tratamentos foram: T1: hérnias congeladas por 389 dias, (rúcula); T2: hérnias congeladas por 242 dias (brócolis); T3: hérnias congeladas por 21 dias (couve-chinesa) e T4: testemunha (sem inóculo). Os testes de patogenicidade, após os diferentes períodos de armazenamento, foram realizados em condições controladas de casa de vegetação (25±2°C), onde em cada planta, de uma variedade suscetível de couve-chinesa (Pak choi), foi inoculado 2mL da suspensão de esporos, dos diferentes tratamentos, na concentração de 107 esporos.mL-1. Cada tratamento contou com seis repetições distribuídas ao acaso. Passadas cinco semanas, após a inoculação, as raízes foram lavadas e avaliadas. Houve diferença estatística significativa entre os materiais avaliados quanto aos diferentes períodos de armazenamento em "freezer". Os materiais congelados entre 21 a 242 dias preservaram suas características infectivas, sendo este método uma boa opção para a preservação das estruturas de repouso nesse período. Foram realizados testes de patogenicidade e análises moleculares de populações de P. brassicae, ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Disease known as clubroot of crucifers is caused by the pathogen Plasmodiophora brassicae Woronin, and is one of the most important and difficult control crucifer diseases in brassicas. Because of the difficulty in preserving the resistance structures of P. brassicae under laboratory conditions, given that it is an obligate parasite, an assay was carried out to develop a practical and effective technique that would allow further studies to be conducted. On this proposal, roots of different brassica species naturally infected by P. brassicae showing clubroot symptoms were collected in the some grower (Pardinho, SP-city, Brazil) during different seasons, and were immediately frozen at approximately 20°C±2°C. The treatments were: T1: clubroots frozen for 389 days (arugula); T2: clubroots frozen for 242 days (broccoli); T3: clubroots frozen for 21 days (Chinese cabbage), and T4: control (no inoculum). The pathogenicity tests after different storage periods were conducted under controlled greenhouse conditions (25±2°C); each plant of a susceptible variety of Chinese cabbage was inoculated with 2mL of a spore suspension of the various treatments at a concentration of 107spores.mL-1. Each treatment consisted of six replicates distributed at random. The roots were washed and evaluated five weeks after inoculation. There were statistical differences between the materials evaluated with respect to different storage periods in the freezer. Materials kept frozen between 21 and 242 days retained their infective traits. Therefore, this method is a good option to preserve resting spores during this period. In addition, pathogenicity tests and molecular analyses were conducted with P. brassicae populations obtained from infected roots of several production regions of Brazil, on some...(Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Amebas de vida livre (AVL) do gênero Acanthamoeba estão amplamente distribuídas no ambiente e podem tornar-se amebas patogênicas ao homem. O objetivo deste trabalho foi isolar em de água de torneira amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba, identificá-las e classificá-las. Um total de 132 amostras de água de torneira foi coletado de escolas estaduais e municipais entre os meses de março a novembro de 2009. As amostras passaram pelo processo de filtração e as membranas foram semeadas em ágar não-nutriente 1,5% coberto por uma suspensão de E. coli inativadas pelo calor. Todas as amostras positivas para AVL foram submetidas à clonagem celular e identificadas como pertencentes ao gênero Acanthamoeba, através da morfologia dos cistos e trofozoitos e pela PCR utilizando oligonucleotídeos gênero-específicos que amplificam a região ASA.S1 do gene 18S rDNA. Ensaios fisiológicos de termo e osmotolerância foram utilizados para avaliar a patogenicidade dos isolados. Vinte sete isolados foram positivos para AVL e 10 foram identificados como pertencentes ao gênero Acanthamoeba tanto pelas características morfológicas quanto pela análise molecular. Destes, nove isolados apresentaram características do grupo II e um do grupo III, segundo Pussard e Pons (1977). A análise do sequenciamento através da comparação das sequências dispostas no GenBank, demonstrou a distribuição no grupo genotípicos T2 (40%), T2/T6 (40%), T6 (10%) e T4 (10%). Nos ensaios de termotolerância e osmotolerância 50% dos isolados obtiveram um baixo potencial patogênico. Os resultados indicaram a presença do gênero Acanthamoeba em água tratada no estado do RS, revelando sua importância epidemiológica e a necessidade de mais estudos para determinar sua distribuição no ambiente e seu potencial patogênico. / Free-living amoebae (FLA) of Acanthamoeba genus are widely distributed in the environment and can become human pathogenic amoebae. The aim of this study was to isolate from tap water in free-living amoebae of Acanthamoeba, identify them and then classify them. A total of 132 samples of tap water was collected from state and municipal schools between march and november 2009. The samples passed through the filtration process and the membranes were seeded in non-nutrient 1.5% covered by a suspension of E. coli heatinactivated. All samples of AVL were cloned and identified as belonging to the genus Acanthamoeba by the morphology of cysts and trophozoites by PCR using primers and genus-specific primers that amplify the ASA.S1 region of 18S rDNA gene. Tests of physiological thermotolerance and osmotolerance were used to evaluate the pathogenicity of the isolates. Twenty seven isolates of AVL and 10 were identified as belonging to the genus Acanthamoeba through the morphological and molecular analysis. Nine of the isolates showed characteristics of group II and one isolate showed characteristics of group III, according Pussard and Pons (1977). The sequencing analysis by comparing the sequences submitted to GenBank, showed that genotype distribution in group T2 (40%), T2/T6 (40%), T6 (10%) and T4 (10%). In tests of thermotolerance and osmotolerance 50% of isolates had a low pathogenic potential. The results indicated the presence of Acanthamoeba in tap water in the RS, revealing its importance and the need for more epidemiological studies to determine their distribution in the environment and its pathogenic potential.

O patógeno Escherichia coli pertence ao grupo de cepas que podem causar infecções extraintestinais, designadas como (ExPEC). Existem cepas de E. coli ExPEC, tais como: a E. coli causadora de meningite neonatal (NMEC), a E. coli uropatogênica (UPEC) e a E. coli patogênica para aves (APEC). Na avicultura, esta bactéria é responsável por vários processos patológicos, atuando tanto como agente primário como secundário, sendo responsável por significativas perdas econômicas que ocorrem na produção avícola. Vários trabalhos têm demonstrado que muitos isolados ExPEC de humanos e animais compartilham genes de virulência em comum, sugerindo que ocorra uma troca genética entre essas cepas, e o risco para a saúde humana de tais bactérias ainda é indefinido. Além disto, existe outra preocupação em relação ao fato de estudos sugerirem que a E. coli pode facilmente adquirir resistência a antimicrobianos utilizados por humanos e animais. As aves domésticas são reconhecidas como importante fonte de disseminação de resistência antimicrobiana às amostras de E. coli. O objetivo do presente estudo foi realizar a caracterização de amostras de Escherichia coli patogênica aviária (APEC) e Escherichia coli uropatogênica (UPEC) através da classificação em grupos filogenéticos e da avaliação da resistência antimicrobiana. Neste trabalho foram utilizados os dados disponíveis referentes a 237 cepas de E. coli isoladas de camas de aviários, lesões de celulite e quadros respiratórios de frangos de corte e 211 amostras de E. coli uropatogênica (UPEC) isoladas de pacientes com infecção urinária. Para verificar se existia diferença significativa entre a resistência antimicrobiana a (ampicilina, gentamicina, norfloxacina, amicacina e cefuroxima) e a origem das amostras, e destes mesmos antimicrobianos em relação aos grupos filogenéticos. As amostras APEC diferiram na resistência antimicrobiana das amostras UPEC para ampicilina, gentamicina, norfloxacina e cefuroxima. O mesmo não foi observado para a amicacina. Nas condições do presente trabalho, estes resultados contrariam, parcialmente, os estudos que sugerem que a resistência antimicrobiana é originária das amostras de origem avícola, já que três dos cinco fármacos testados apresentaram maior resistência nas amostras UPEC que nas APEC. Quando analisada a relação entre os grupos filogenéticos observou-se que o perfil de resistência antimicrobiana foi semelhante em todos os grupos, somente para norfloxacina e ampicilina houve diferença, porém a resistência estava bem distribuída entre os quatro grupos, comprovando que a patogenicidade não se relaciona com a resistência antimicrobiana. Este fato já havia sido caracterizado em trabalho anterior da mesma autora. Estes resultados ressaltam a necessidade de realizar monitorizações rotineiras e constantes visando conhecer as flutuações da patogenicidade e da resistência antimicrobiana, separadamente. / The pathogen Escherichia coli, belongs to the group of strains that can cause extraintestinal infections, designated as (ExPEC). There are strains of extraintestinal E. coli ExPEC as: a E. coli that causes neonatal meningitis (NMEC), a uropathogenic E. coli (UPEC) and a avian pathogenic E. coli (APEC). In poultry, this bacterium is responsible for several pathological processes, acting as primary agent and secondary as well, and it is also responsible for significant economic losses that occur in poultry production. Several articles show that many ExPEC isolates from humans and animals share common virulence genes, suggesting a genetic exchange between these strains, and the risk to human health of more bacteria is still undefined. In addition, there is another concern about studies which suggest that E. coli can readily acquire antimicrobial resistance when used by animals and humans. Poultry is recognized as an important source of dissemination of antimicrobial resistance in E. coli samples. The objective of the present study was to characterize samples of avian pathogenic Escherichia coli (APEC) and uropathogenic Escherichia coli (UPEC) using phylogenetic groups and antimicrobial resistance. In this study, we used data available on 237 strains of E. coli isolated from avian litter, cellulitis lesions and respiratory lesions of broilers and 211 uropathogenic E. coli (UPEC) samples isolated from patients with urinary tract infection. To verify if there was a significant difference between the antimicrobial resistance (ampicillin, gentamicin, norfloxacin, amicacin, cefuroxime) and the origin of the samples, and of these same antimicrobials and phylogenetic groups. The APEC samples differed in antimicrobial resistance of the UPEC for ampicillin, gentamicin, norfloxacin and cefuroxime. The same was not observed for amikacin. Under the conditions of the present study, these results partially contradict the studies which suggest that antimicrobial resistance originates from samples of poultry origin, three of the five drugs tested, presented higher resistance in the UPEC samples than in the APEC. When analyzing the relationship between the phylogenetic groups, it was observed that the antimicrobial resistance profile was similar in all groups, only for norfloxacin and ampicillin there was a difference, but the resistance was well distributed among the four groups, proving that the pathogenicity was not related with antimicrobial resistance. This fact had already been characterized in previous paper by the same author. These results highlight the need to perform routine and constant monitoring in order to know the fluctuations in pathogenicity and antimicrobial resistance, separately.

Pasteurella multocida, apesar de ser uma bactéria que compõe a microbiota respiratória, sob algumas circunstâncias pode manifestar-se como um agente patogênico primário ou secundário, causando doença em aves e outros animais. Como agente primário, P. multocida leva a grandes perdas econômicas, causando cólera em aves, rinite atrófica em suínos e septicemia hemorrágica em bovinos e bubalinos. P. multocida é uma espécie heterogênea, e a patogenicidade dos isolados pode ser amplamente variável. A suscetibilidade do hospedeiro à essas cepas varia consideravelmente entre espécies. Inoculações experimentais de P. multocida em camundongos e aves são comumente usadas para avaliar a patogenicidade de diferentes cepas, mas os resultados são geralmente subjetivos e pouco mensuráveis. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma nova metodologia para classificar a patogenicidade de cepas de P. multocida, através da formulação de um índice padrão. Para determinar esse índice, foram usadas 97 amostras de P. multocida, isoladas de cólera em aves e rinite em suínos. Cem microlitros (105 UFC) de uma cultura bacteriana contendo 106 UFC/mL, de cada isolado de P. multocida foram inoculados, por via intraperitoneal, em 10 pintos de um dia. Além da mortalidade causada pela inoculação, o tempo de morte e as lesões macroscópicas foram avaliados. Diferenças significativas foram observadas entre isolados de aves e suínos em relação aos índices de patogenicidade. O número de lesões e a porcentagem de bactérias recuperadas dos animais inoculados também variaram de acordo com a origem do isolado. A partir dos indices observados, os isolados foram distribuídos em três classes de patogenicidade: alta, média e baixa. O índice de patogenicidade desenvolvido neste trabalho permite a mensuração e classificação da patogenicidade de isolados de P. multocida e pode ser uma alternativa aos modelos subjetivos de triagem de patogenicidade usados até o momento. / Pasteurella multocida, despite being a bacteria that makes up the respiratory microbiota, under some circumstances can manifest as primary or secondary pathogenic agent, causing disease in birds and other animals. As primary agent, P. multocida leads to large economic losses, causing fowl cholera in birds, atrophic rinitis in swine and haemorragic septicemia in cattle and buffalos. P. multocida is a heterogeneous specie, and the pathogenicity of the samples can be widely variable. Host susceptibility to these strains varies considerably between species. Experimental inoculations of P. multocida in mice and birds are commonly used to evaluate the pathogenicity of the different strains, but the results are generally subjective and difficult to evaluate them. The aim of this work was to establish a new methodology to classify the pathogenicity of a specific strain, through the formulation of a standard score. To determine this score, we used 97 samples of P. multocida, from fowl cholera in birds and rhinitis in swine. One-hundred microliters (105 CFU) of bacterial culture containing 106 CFU/mL of each P. multocida isolate were inoculated, by intraperitoneal route, in 10 one-day-old chicks. Besides mortality caused by the inoculation, time of death and gross lesions were also evaluated. Significant differences were observed between avian and swine isolates in relation to pathogenicity scores. The number of lesions and the percentage of bacteria recovered from the inoculated animals also varied according to the origin of the isolate. From the observed scores, the isolates were distributed into three pathogenicity classes: high, medium and low. The pathogenicity score developed here allows the measurement and classification of the pathogenicity of P. multocida isolates and can be an alternative to subjective current models of pathogenicity screening used so far.