Orientador: Wanderley Dias da Silveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T02:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Campos_TatianaAmabilede_D.pdf: 3044211 bytes, checksum: 4bdf180c662f55913d6301220e0b3ed4 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Quarenta e nove linhagens de Escherichia coli isoladas de aves isoladas de aves doentes (24 de aves com septicemia - S, 14 de aves com síndrome da cabeça inchada SHS e 11 de aves com onfalite - O) e 30 linhagens isoladas da região cloacal de aves saudáveis (C) foram analisadas em relação à presença de genes de virulência, grupos filogenéticos de E. coli, similaridade do gene mc. Estes dados foram comparados a um estudo populacional previamente obtido a partir de ERIC PCR (Silveira et al.,2002b), para a caracterização de possíveis dones patogênicos presentes nesta população. Os resultados demonstraram que os genes de virulência analisados foram mais freqüentes entre as linhagens isoladas de aves doentes. Linhagens isoladas de aves saudáveis, de aves com onfalite e de aves com septicemia derivam-se de grupos clonais não patogênicos de E. coli (A, e 81). Por 'outro lado, linhagens SHS e com septicemia derivam-se de grupos clonais patogênicos (82 e D). A comparação destes dados com os dados de ERIC-PCR demonstrou que estas linhagens constituem de três grupos principais: (i) 1 não patogênico, formado por linhagens isoladas de aves com onfalite e de aves saudáveis ambas derivadas principalmente de grupos clonais não patogênicos de E. coli (A); (ii) outro composto por linhagens SHS, derivadas principalmente do grupo clonal patogênico de E. coli (grupo D); e um terceiro grupo (iii) formado por linhagens isoladas por aves com septicemia onde 46% derivaram-se do grupo não patogênico A e outros 46% do grupo patogênico D. Estes dados sugerem que linhagens SHS provavelmente constituem um grupo clonal patogênico dentro da população analisada. Por outro lado, linhagens S possivelmente apresentam uma origem polifilética de dois ancestrais diferentes (um patogênico e outro não patogênico) onde a aquisição de genes de virulência através de transmissão horizontal possivelmente seja responsável por eventos que conduziram a um processo de evolução convergente. O agrupamento das linhagens isoladas de aves saudáveis e de linhagens O, sugere que a onfalite seja causada por linhagens não patogênicas. Os dados de similaridade do gene fIíC demonstram que houve a formação de dois grupos: um formado por linhagens isoladas de aves doentes e outro formada por linhagens isoladas de aves saudáveis. Estes dados sugerem que o gene fliC pode estar associado à diferenciação de possíveis dones patogênicos e não patogênico em linhagens de E. coli de origem aviária, assim como o observado em E. calí patogênicas para humanos / Abstract: Forty and nine Escherichía coli strains isolated frem sick chickens (24 frem septicaemia - S, 14 frem swollen head syndrem - SHS, and 11 frem omphalitis - O), and 30 strains isolated frem the cloacae region (C) of healthy chickens were analyzed in relation of the presence of virulence-related genes, E. colí phylogenetical groups, fliC gene similarity. These data were compared to a ERIC-PCR study realized of the same strains (Silveira et a/.,2002b) to characterize possible pathogenic clones present in this population. The results demonstrated that the virulence genes were more frequent among E. colí strains isolated from sick chicken. Strains isolated frem healthy chicken, frem omphalitis and from septicemic chickens were derived frem E. colí non pathogenic greups (A and B 1). SHS and septicemic strains belonged to E. coli pathogenic greups (B2 and D). The comparison of these data with the ERIC-PCR study demonstrated that these strains compounded three main clusters: (i) one non pathogenic, comp<?unded by E. colí strains isolated frem healthy chickens and frem omphalitis; (ii) one compounded by SHS strains belonged to D phylogenetical group; (iii) one compounded by septicemic strains where 46% belonged to A E. colí greup and 46% belonged to D E. calí greup. These data suggests the SHS strains prebably form a pathogenic clonal group inside the population analyzed. By contrast, septicemic strains may have a poliphyletical origin frem two ancestors (one pathogenic and another non pathogenic) where the horizontal acquisition of virulence genes may be respansible for events that conduced to a convergent evolution. The clustering of omphalitis and strains isolated frem healthy chickens suggests that omphalitis is caused by non pathogenic E. colí strains. The mc similarity data demonstrated that were two clusters one compounded by strains isolated frem healthy chickens and other compounded by strains isolated frem sick chickens. These data suggest that f/iC gene can be associated to pathogenic and non pathogenic clones differentiation like described among E. colí strains pathogenic for human / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Michel Georges Albert Vincentz, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Bologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T17:33:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alvim_FatimaCerqueira_D.pdf: 16832247 bytes, checksum: aa55ec0b542b8e84b76a0875bf6604df (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O fungo basidiomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, agente causal da doença vassoura-de-bruxa (VB) em Theobroma cacao, é o principal patógeno da lavoura cacaueira nas Américas e no Caribe. O presente trabalho apresentou como objetivo primordial identificar proteínas relacionadas com a patogenicidade deste fungo. No primeiro capítulo desta tese foi demonstrado o efeito de diferentes fontes de carbono sobre a morfologia e fisiologia do M, perniciosa. O fungo foi crescido em fontes de carbono fermentáveis e/ou não-fermentáveís. Foram observadas diferenças significativas na morfologia do micélio que se correlacionaram com a fonte de carbono utilizada. Foram observadas também diferenças qualitativas e quantitativas marcantes para as proteínas secretadas (secretoma) pelo micélio. O ensaio biológico efetuado em folhas de Nicotiana tabacum revelou que a capacidade do secretoma em induzir necrose nos tecidos vegetais também diferia em função da fonte de carbono utilizada pelo fungo durante o seu crescimento. O glicerol, como fonte única de carbono, foi identificado como o composto que mais induziu a atividade necrótica do secretoma do patógeno. O nível do chaperone molecular BiP (Binding Protein) em meristema de cacau aumentou em resposta à infiltração do secretoma de M. perniciosa, indicando uma resposta fisiológica do hospedeiro às proteínas secretadas in vitro pelo patógeno. Foi sugerido então que o metabolismo energético de M. perniciosa, dependendo das fontes de carbono aplicadas, resulta em alterações fisiológicas na expressão e secreção de proteínas e que esses efeitos atuam, não apenas afetando o crescimento do fungo, mas também, na capacidade de expressar proteínas de patogenicidade. No segundo capítulo investigamos mais detalhadamente as modificações induzidas por glicerol em M. perniciosa. Inicialmente demonstramos que glicerol induz a secreção de proteínas relacionadas com indução de morte celular especificamente no M. perniciosa dicariótico, tipo celular característico da fase necrotrófica do patógeno. O secretoma induzido por glicerol foi o único capaz de induzir necrose em meristemas de cacau do genótipo resistente a M. perniciosa. Simultaneamente, o glicerol induziu alterações na composição/estrutura da parede celular do micélio tomando-a mais resistente a agentes indutores de estresse em parede celular, como o SDS e vermelho congo. Adicionalmente, o micélio apresentou maior nível de transcritos de catalases, indicando uma maior resistência a estresse oxidativo. Análises em géis bi-dimensionais e fracionamento das amostras em HPLC de alta capacidade, ligados a espectrometria de massas, resultaram na identificação de proteínas secretadas que acumularam especificamente em resposta ao glicerol. Proteases e lipases, enzimas hidrolíticas relacionadas com a patogenicidade em outros fungos hemibiotrdfícos, também apresentaram aumento de atividade em resposta a glicerol. Essas alterações correlacionaram com um aumento no nível de transcritos do gene Rholp-gef, um elemento chave da rota RHOlp GTPase, a qual sabidamente está relacionada a virulência de fungos fitopatogênicos. Análises conduzidas com isolados de M. perniciosa, que apresentaram diferentes graus de patogenicidade em ensaios conduzidos em casa de vegetação, demonstraram que a sensibilidade a glicerol é maior nos genótipos mais patogênicos. Esse estudo ressalta a importância do glicerol como uma molécula chave na interação cacau: M. perniciosa. tipo celular característico da fase necrotrófica do patógeno. O secretoma induzido por glicerol foi o único capaz de induzir necrose em meristemas de cacau do genótipo resistente aM perniciosa. Simultaneamente, o glicerol induziu alterações na composição/estrutura da parede celular do micélio tomando-a mais resistente a agentes indutores de estresse em parede celular, como o SDS e vermelho congo. Adicionalmente, o micélio apresentou maior nível de transcritos de catalases, indicando uma maior resistência a estresse oxidativo. Análises em géis bi-dimensionais e fracionamento das amostras em HPLC de alta capacidade, ligados a espectrometria de massas, resultaram na identificação de proteínas secretadas que acumularam especificamente em resposta ao glicerol. Proteases e lipases, enzimas hidrolíticas relacionadas com a patogenicidade em outros fungos hemibiotróficos, também apresentaram aumento de atividade em resposta a glicerol. Essas alterações correlacionaram com um aumento no nível de transcritos do gene Rholp-gef, um elemento chave da rota RHOlp GTPase, a qual sabidamente está relacionada a virulência de fungos fltopatogênicos. Análises conduzidas com isolados de M. perniciosa, que apresentaram diferentes graus de patogenicidade em ensaios conduzidos em casa de vegetação, demonstraram que a sensibilidade a glicerol é maior nos genótipos mais patogênicos. Esse estudo ressalta a importância do glicerol como uma molécula chave na interação cacau: M. perniciosa / Abstract: The basidiomycete hemibiotrophic fungus Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches' broom disease in Theobroma cacao, is the major cacao disease pathogen present in the Americas and the Caribbean. A compatible interaction of this fungus with its host comprehends a series of concerted biochemical and molecular events. In the first chapter of the thesis, we performed analyses where quantitative and qualitative relationships were found between secreted proteins and their activity, and the hyphal morphology of Moniliophthora perniciosa. This fungus was grown on fermentable and non-fermentable carbon sources; significant differences in mycelial morphology were observed and correlated with the carbon source. A biological assay performed with Nicotiana tabacum leaves revealed that the necrosis-related activity of extracellular fungal proteins also differed with carbon source. There were clear differences in the type and quantity of the secreted proteins. In addition, the expression of the cacao molecular chaperone BiP (HSP 70) increased after treatment with secreted proteins, suggesting a physiological response to the fungus secretome. We suggest that the carbon source-dependent energy metabolism of M. perniciosa results in physiological alterations in protein expression and secretion; these may affect not only M. perniciosa growth, but also its ability to express pathogenicity proteins. In the second chapter, we showed that glycerol efficiently triggers the production of secreted pathogenicity proteins by M. perniciosa, as revealed by the increased ability of the secreted proteins (secretome) in promoting cell death on Nicotiana benthamiana cell suspensions, N. tabacum leaves and meristems of a resistant cacao genotype, when compared to other carbon sources such as glucose. Simultaneously, glycerol induces cell wall modifications turning hyphae more resistant to inducers of cell wall stress and increasing the resistance of the fungus to oxidative stress. These modifications correlated with the up-regulation of RhoJp-gef, a key element of the RHOlp GTPase pathway that is known to be related to fungal virulence in plants. Two-dimensional gel electrophoresis and high throughput HPLC coupled with mass spectrometry resulted in the identification of secreted proteins that specifically accumulated in response to glycerol. This study highlights the importance of glycerol as a key molecule modulating the fungus-induced pathogenicity / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O leite produzido a ultra alta temperatura denominado oficiamente como UHT é o leite de maior aceitação no mercado consumidor brasileiro. Com a finalidade de ampliar o conhecimento sobre a segurança microbiológica do leite UHT, objetivou-se estudar tanto os Bacillus spp, que vêm sendo relatados como contaminantes do leite UHT no Brasil, como os eventuais esporos sobreviventes ao processamento. A partir de 65 análises de leite UHT para a determinação de microrganismos mesófilos aeróbios estritos e facultativos viáveis, no leite UHT procedente das indústrias sob Inspeção Federal no estado de São Paulo, 7 apresentaram contagens acima de 100 UFC/ml, indicando um percentual de 10,76 % de provas fora dos padrões para essa determinação, no período de jul a nov de 2003. Entretanto por atuação dos controles de qualidade das indústrias partidas foram inutilizadas e o leite que foi ao consumo apresentou 7,69% de microrganismos mesofílicos aeróbios acima dos padrões, sendo que 6.15% destes microrganismos foram considerados como Bacillus sporothermodurans. Dos isolamentos das contagens de microrganismos mesófilos acima dos padrões, foram efetuados estudos de seis cepas de Bacillus spp do leite UHT das indústrias, além de três cepas isoladas do leite UHT alvo de reclamações de consumidores procedente do Instituto Adolfo Lutz da capital de São Paulo. O objetivo do presente projeto foi, após a identificação cultural, microscópica, bioquímica e genética de culturas do Bacillus spp, estudar a patogenicidade das amostras em diversos modelos experimentais como: Teste do camundongo neonatos, alça ligada de coelho, inoculação intraperitoneal em camundongo BALB C e culturas celulares (Vero, HEp2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha). As 3 amostras isoladas de leite de reclamações dos consumidores do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo foram tipificadas preliminarmente pela técnica de Espectroscopia Infra-Vermelho a Transformada Fourier (FT- IR) como Bacillus flexus, enquanto que as amostras isoladas do leite procedente de três indústrias de São Paulo apresentaram presença de B. flexus e B.oleronius e Bacillus sporothermodurans. Exemplares de B.flexus testados quanto a patogenicidade apresentaram efeito citopático nas culturas celulares Vero, HEP2 e Fibroblastos de Embrião de Galinha e morbidade em camundongo BALB C. O Bacillus sporothermodurans não apresentou patogenicidade a nenhum dos modelos biológicos citados. / The milk produced at ultra high temperature, denominated UHT, is the most popular milk in the Brazilian market. With the intention of increasing the knowledge of microbiologic safety in UHT milk, we concentrated our study on the Bacillus spp, described as the most important contaminants of UHT milk in Brazil, and on possible survivors of the processing procedures. From the 65 analysis of UHT milk collected to determine the presence of strict, aerobe, mesophile microorganisms and viable options, coming from industries under Federal Inspection in São Paulo state, 7 presented a microbial count higher than 100CFU/ml, indicating a percentage of 10.76% samples outside the standard for this determination, in the period between July and November 2003. However, due to the quality control in industries, batches were rendered useless and the milk that went for consumption presented 7.69% mesophile microorganisms above standard, being these organisms 6.15% was considered Bacillus sporothermodurans. From the isolation of mesophile Bacillus counts above average, 5 strains Bacillus spp species from UHT industries were studied, as well as 3 strains isolated from UHT milk denounced by consumers of São Paulo city\'s Adolfo Lutz Institute. The aim of the project, following cultural, microscopic, biochemical and genetic identification of the Bacillus spp, was to study pathogenicity in samples from several experimental models, such as: neonatal mice; rabbit ileum loops, intraperitoneal inoculation of BALB C mice and cell cultures: Vero, Hep2 and Chick Embryo Fibroblasts. The three isolated samples of milk denounced by São Paulo consumers were typified as Bacillus flexus by the Fourier Infrared Transformed Espectroscopy (IF-FR) technique, while isolated samples of milk from 3 industries in São Paulo, accused the presence of the B. flexus, B. oleronius and Bacillus sporothermodurans. Samples of the B. flexus tested in terms of pathogenicity presented a citopatic effect upon cell cultures Vero, HeP2 and Chick Embryo Fibroblasts and a morbidity in mice BalbC. The Bacillus Sporothermodurans did not present pathogenicity in any of the biological models mentioned.

A ferrugem e o carvão estão entre as principais doenças da cana-de-açúcar, visto que são consideradas em todos os Programas de Melhoramento Genético (PMG), tanto na seleção de genitores resistentes quanto no comportamento das progênies. Quando a cultura está distribuída em grandes extensões tornam-se importante conhecer a amplitude da variação patogênica na população dos agentes causais. Diante a importância de obter variedades com resistência efetiva e duradoura, o objetivo do presente estudo foi verificar a ocorrência e caracterizar, no Estado de São Paulo, a variabilidade patogênica de Puccinia melanocephala e Ustilago scitaminea. Coletaram-se 12 populações de cada patógeno em 3 regiões canavieiras, Piracicaba, Jaú e Ribeirão Preto. Para os experimentos de ferrugem usaram-se 3 variedades de comportamento conhecido frente à doença, SP70-1143, SP91-1397 e R570, suscetível, intermediária e resistente, respectivamente. Plantas com 20 dias de desenvolvimento foram inoculadas com suspensões de 104 esporos viáveis/mL de cada população, e colocadas em câmara de crescimento a 20 ºC e 12 h de fotoperiodo. Após 14 dias foram avaliados os sintomas na folha +1, quantificando severidade medida em porcentagem de área foliar afetada e incidência, medida em número de pústulas/cm2. Para carvão utilizaram-se 3 variedades de reação conhecida, SP84-2066, suscetível, Co421 intermediária e SP71-8210 resistente. Inocularam-se gemas de cada variedade com suspensões de 1,7 x 106 esporos viáveis/mL das populações. Após do desenvolvimento em casa de vegetação, as plantas foram transplantadas no campo instalando-se um ensaio em delineamento de blocos casualizados com 4 repetições. As avaliações foram realizadas a cada 14 dias durante o ciclo de cana-planta, determinando-se a incidência da doença segundo as porcentagens acumuladas de touceiras doentes por parcelas, obtendo-se também a área abaixo da curva de progresso da doença. Para ferrugem verificou-se que houve diferenças significativas de agressividade entre as populações estudadas. Duas populações de Jaú, J3 e J4, destacaram-se pela maior agressividade em todas as variedades. Além disso, as populações de Jaú mostraram também virulência diferenciada em relação às demais populações. As populações de U. scitaminea apresentaram diferentes níveis de agressividade, porém não houve alterações de virulência entre as populações estudadas. Segundo os parâmetros observados, uma população de Piracicaba e duas de Jaú comportaram-se como as mais agressivas. Dessa forma, ficou comprovada que, tanto para P. melanocephala como para U. scitaminea, existe uma considerável variabilidade patogênica entre as populações destes agentes causais no Estado de São Paulo, Brasil. Os PMG que submetem os materiais a inoculações artificiais com esporos de ferrugem e carvão em alguma etapa do programa necessitam considerar a variação na agressividade dos patógenos determinada neste estudo. / Rust and smut are among the most important diseases of sugarcane, being considered in every breeding program both in parent selection as well as in evaluating progeny behavior. When the crop is distributed to large extensions, it becomes very important to know the amplitude of the pathogenic variation in the population of the causal agent. Considering the importance of obtaining varieties with effective and long lasting resistance, the objective of the present study was to verify the occurrence, in the state of São Paulo, of pathogenic variability in Puccinia melanocephala and Ustilago scitaminea. Twelve populations of each pathogen were collected from three sugarcane producing regions: Piracicaba, Jaú and Ribeirão Preto. For the rust experiments three varieties of known behavior to the disease were used, SP70-1143, SP91-1397 and R570, susceptible, intermediate, and resistant, respectively. Twenty day-old plants were inoculated with 104 viable spores/mL suspensions of each population, and incubated at 20 ºC with 12 h photoperiod. Fourteen days later, symptoms were evaluated in the leaf +1, quantifying severity as the percentage of the leaf area affected and incidence as the number of pustules/cm2. For smut, three varieties with know response to the disease were used, SP84-2066, susceptible, Co421, intermediate and SP71-8210, resistant. Buds of each variety were inoculated with 1,7 x 106 viable spores/mL of each population. After growth in the greenhouse the plants were transplanted to the field in a random block trial with 4 repetitions. Disease was monitored every fourteen days during the plant cane cycle, determining the incidence according to the accumulated percentage of diseased stools per plot, also obtaining the area below the disease progression curve. For rust, it was observed that the populations showed different levels of aggressiveness. Two populations from Jaú, named J3 and J4, behaved as the most aggressive in the three varieties. Moreover, populations from Jaú showed different virulence among studied populations. The populations of U. scitaminea showed distinct aggressiveness levels, however it was not observed changes in the virulence among tested populations. According to the evaluated parameters, one population from Piracicaba and two from Jaú behaved as the most aggressive ones. Thus, it was showed that a considerable pathogenic variability exists among Brazilian populations of both pathogens. The sugarcane breeding programs that perform artificial inoculations with rust and smut spores at some stage in the program must take into consideration the variability in the aggressiveness of the pathogens determined in this study.

Este estudo teve como objetivos: investigar o método mais adequado para detecção de fungos associados às sementes de cana-de-açúcar; fazer o levantamento dos fungos associados às sementes e incidência; correlacionar a incidência fúngica nessas sementes e o ambiente onde foram produzidas; efeitos que fungos associados às sementes têm em sementes e plântulas; patogenicidade dos fungos mais freqüentes e sintomas que podem causar; determinar a sensibilidade dos principais fungos a fungicidas; determinar a fitotoxicidade de sementes e plântulas a fungicidas e propor o tratamento fungicida mais adequado para produção de plântulas vigorosas, sem sintomas, para os programas de melhoramento. Para avaliar o método mais adequado de detecção dos fungos, realizaram-se análises sanitárias utilizando combinações entre recipientes, substratos e regimes de luz. Para levantamento dos fungos associados e da incidência em sementes, realizaram-se análises sanitárias das sementes de 29 amostras e as incidências fúngicas obtidas foram comparadas com os dados climáticos do local onde foram produzidas as sementes. Os possíveis efeitos dos fungos às sementes e plântulas foram estudados por testes de sanidade e germinação de sementes, observando-se quais condições se apresentavam as sementes e plântulas que haviam incidência fúngica. A patogenicidade dos fungos, encontrados com maior freqüência, foi avaliada por inoculação de sementes através do contato com cultura em meio colonizado pelo fungo, posterior distribuição das sementes em substrato estéril e avaliação da emergência de plântulas e total de plântulas com sintomas e tipos de sintomas. Por meio de ensaios de fungitoxicidade in vitro , estudou-se a sensibilidade dos fungos, mais freqüentemente detectados em sementes, a nove fungicidas nas doses de 1, 10 e 100 ppm e determinação da ED50. Os fungicidas mais eficientes foram avaliados, in vivo, quanto a sua fitotoxicidade por meio da pulverização, em diferentes doses, em sementes distribuídas em substrato estéril. Foram avaliados: emergência, altura da parte aérea e comprimento da raiz das plântulas, total de plântulas com sintomas de fitotoxicidade e outros tipos de sintomas. Ao final, realizou-se validação, pulverizando-se o fungicida eficiente in vitro e não fitotóxico em sementes de cana-deaçúcar. Os resultados encontrados foram: a) o método escolhido para realização das análises sanitárias foi o de placas de Petri de plástico com papel de filtro como substrato e incubação a 28 ± 2°C sob regime de luz alternada (12h luz branca fluorescente/ 12h escuro); b) os gêneros fúngicos mais freqüentemente presentes nas sementes de cana-de-açúcar foram Bipolaris, Cladosporium, Curvularia, Fusarium e Phoma; c) não foi constatada relação entre incidência fúngica e ambiente de produção das sementes; d) a condição de semente de cana-de-açúcar mais comumente encontrada com presença de fungos associados foi a não germinada, independentemente do fungo avaliado. Houve baixa porcentagem de sintomas necróticos na parte aérea e raiz, no entanto, quando ocorreram, estavam associados às incidências dos fungos Bipolaris sacchari, Curvularia GM1, Fusarium verticillioides e Phoma herbarum; e) os gêneros considerados altamente patogênicos foram Bipolaris e Curvularia, considerando-se os demais medianos, pouco/ não patogênicos; f) os fungicidas de maiores eficiências de inibição, principalmente dos fungos patogênicos, foram triadimenol e fludioxonil + metalaxil-M; g) o fungicida não fitotóxico e que apresentou efeito estimulante nas doses utilizadas foi o fludioxonil + metalaxil-M. Quando esse fungicida foi aplicado na validação, as doses avaliadas não foram suficientes para se detectar diferença significativa benéfica, de acordo com as variáveis analisadas. / The present study had as objectives: to investigate the most adequate method to detect sugarcane seedborne fungi; to do the survey of the seedborne fungi and of the incidence; to correlate the fungi incidence in the seeds and the conditons where they were produced; to evaluate the possible effects that seedborne fungi have on seeds and seedlings; to verify the pathogenicity of the most frequent ones and the symptoms that they can cause; to determine the sensitivity of the main fungi to fungicides; to determine the seeds and seedlings phytotoxicity to fungicides and to propose the most adequate fungicidal treatment to the production of vigorous seedlings, without symptoms, to the breeding programs. To assess the most adequate method to detect seedborne fungi, health tests using different combinations between containers, substrates and light regimen, were done. To do the survey of seedborne fungi and their incidence on seeds, seed health tests of 29 samples and the fungical incidence obtained were compared with the climatic data from where the seeds were produced. The effects that seedborne fungi have on seeds and seedlings were studied by health and seed germination tests and the conditions of seeds and seedlings with fungi incidence were observed. The fungi pathogenicity, found in a higher frequency, was assessed by seed inoculation through contact with medium colonized by the fungi, than the seeds were distributed on sterilized substrate and the seedlings emergency and total seedlings with symptoms and kind of symptoms were assessed. By in vitro fungitoxicity assays, the sensitivity, of the most frequently detected fungi, to nine fungicides in the doses of 1, 10 and 100 ppm, was studied and ED50. The phytotoxicity in vivo, of the most efficient fungicide was done by spraying different doses on seeds distributed on sterilized substrate. Emergency, seedling height of aerial part and length of the root, total of seedlings with phytotoxicity symptoms and other kind of symptoms were assessed. A validation, in vitro, was done by spraying the efficient and non phytotoxic fungicide on sugarcane seeds. Obtained results were: a) the chosen method for health tests was the plastic Petri plates with filter paper as substrate and incubation at 28 ± 2°C under 12h alternating cycles of light and darkness; b) the fungi genera most frequently present on sugarcane seeds were: Bipolaris, Cladosporium, Curvularia, Fusarium and Phoma; c) the relation between fungical incidence and seed production conditions had not been noticed; d) the most commonly sugarcane seed conditon found with seedborne fungi was the not-germinated, independently of the assessed fungi. Low percentage of necrotic symptoms on aerial part and root where observed, however, when occurred, it was associated to the incidence of the fungi Bipolaris sacchari, Curvularia GM1, Fusarium verticillioides and Phoma herbarum; e) the genera considered highly pathogenic were Bipolaris and Curvularia. The other fungi were considered of median pathogenicity or little/not pathogenic; f) the fungicides with a higher inibition efficiency to most pathogenic fungi, were triadimenol and fludioxonil + metalaxil-M; g) fludioxonil + metalaxil-M was not a phytotoxic fungicide and presented stimulant effect on used doses. When this fungicide was applied on the validation, the assessed doses were not enough to detect beneficial significant differences, in agreement with the analyzed variables.

O fosfato inorgânico é um composto essencial por estar relacionado com diversos processos metabólicos e biossíntese de moléculas relevantes à sobrevivência celular. Em bactéria são conhecidos dois tipos principais de transportadores específicos de fosfato inorgânico, o sistema Pit, de baixa afinidade, e o sistema Pst de alta afinidade, um ABC transportador, ativado sob carência de fosfato extracelular. A interação deste sistema com a fisiologia e patogênese de Streptococcus mutans, o principal agente etiológico da cárie dental, foi estudada neste trabalho. Os genes que codificam o sistema Pst de S. mutans UA159, estão organizados em um óperon policistrônico (pstS, C1, C, B, smu.1134 e phoU). A análise das sequências de aminoácidos das proteínas do sistema Pst de S. mutans com ortólogos do gênero Streptococcus, demonstrou maior identidade com bactérias da cavidade oral. Análise de prevalência do gene pstS, que codifica a proteína ligadora, demonstrou conservação entre todas as cepas laboratoriais e clínicas avaliadas. A deleção de pstS reduziu a capacidade de incorporação de ortofosfato que se refletiu na diminuição da taxa de replicação celular em meios com diferentes concentrações de fosfato inorgânico. A mutação também reduziu a capacidade da bactéria em aderir à superfícies abióticas e diminuiu sua hidrofobicidade de superfície, além de aumentar a resistência intrínseca a ácido. No entanto, não houve alteração na eficiência de transformação bacteriana. Por fim, o gene pstS de S. mutans foi clonado, expresso e a proteína purificada utilizada para obter anticorpos que inibiram o crescimento de S. mutans in vitro. Deste modo, segere-se que o sistema Pst é relevante na fisiologia e patogênese de S. mutans. / Inorganic phosphate is an essential compound related to several metabolic process and biosynthesis of molecules relevant to cellular survival. Bacteria are known to posses two main types of specific inorganic phosphate transporters, the low-affinity Pit system, and the high affinity Pst system, an ABC transporter family constituent, activated by extracellular phosphate starvation. The aim of this work was to study the role of Pst system in physiology and pathogenesis of Streptococcus mutans, the main etiological agent of dental caries. The genes of the Pst system of S. mutans UA159, are organized in a polycistronic operon (pstS, C1, C, B, smu.1134 and phoU). The amino acid sequence analysis of Pst proteins of S. mutans related to orthologs of Streptococcus genus, showed the highest identity value when compared to oral cavity bacteria. The PstS binding protein was present in all tested clinical and laboratory strains of S. mutans. The pstS mutant showed a decreased capacity of ortophosphate uptake which leaded to growth deficiency in different phosphate concentrations. The mutation also reduced the bacteria adherence to abiotic surfaces and the hydrophobicity of the cell surface, diverging from the increase the intrinsic acid resistance. Otherwise, there was no change in the bacterial transformation eficiency. Finally, the S. mutans pstS gene was cloned, expressed and the purified protein was used to obtain antibodies that inhibited the growth of S. mutans in vitro. Taking together, these results suggesting that the Pst transport system is relevant to S. mutans physiology and pathogenesis.

Xylella fastidiosa é o agente etiológico de diversas doenças em plantas, incluindo a Clorose Variegada dos Citros (CVC), uma séria ameaça à indústria citrícola. Os níveis de transcritos sob diferentes disponibilidades de ferro foram medidos com microarranjos de DNA representando 2608 (91,6%) sequências codificadoras (CDS) da cepa 9a5c de X. fastidiosa. Na presença de 100 uM pirofosfato férrico, 218 e 256 CDS foram consideradas como reguladas positiva e negativamente, respectivamente. Quando tratada com o quelante de ferro 2,2\'-dipiridil, 193 CDS foram consideradas como reguladas positivamente e 216 negativamente. A expressão diferencial de um subconjunto de 44 CDS foi também avaliada por RT-qPCR, que mostrou uma correlação de Pearson de 0,77 com os resultados dos microarranjos. As CDS diferencialmente expressas nas variações de concentração de ferro participam em diversas funções celulares. Muitas CDS envolvidas com funções regulatórias, patogenicidade e estrutura celular foram moduladas em ambas as condições testadas, sugerindo que grandes mudanças na arquitetura celular e metabolismo ocorrem quando células de X. fastidiosa são expostas a variações extremas na concentração de ferro. Interessantemente, as CDS moduladas incluem as de síntese e secreção de bacteriocinas similares à colicina tipo V e funções ligadas a formação de pilus e fímbria. Nós também investigamos a contribuição do regulador transcricional Fur no stimulon do ferro em X. fastidiosa. Para tal, as regiões promotoras do genoma da cepa 9a5c foram varridas em busca de Fur boxes putativas. Nossas análises identificaram que regiões promotoras de 49 CDS contem elementos com características de Fur boxes. A funcionalidade de pelo menos uma das Fur boxes identificadas foi confirmada através de ensaios de alteração de mobilidade eletroforética que demonstraram sua interação específica com a proteína recombinante Fur de X. fastidiosa. Entretanto, nem todos os genes cuja expressão é modulada por alterações na concentração de ferro, são diretamente regulados por Fur, apoiando a hipótese de que Fur não é o único responsável pela modulação do stimulon de ferro em X. fastidiosa. Em conjunto, nossos dados apresentam novas evidências da relação entre a disponibilidade de ferro e a regulação de determinantes de patogenicidade e virulência em X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the etiologic agent of a wide range of plant diseases including citrus variegated chlorosis (CVC), a major threat to citrus industry. Transcript levels in different iron availabilities were assessed with DNA microarrays representing 2608 (91.6%) coding sequences (CDS) of X. fastidiosa CVC strain 9a5c. In the presence of 100 uM of ferric pyrophosphate, 218 and 256 CDS were considered as up- and down-regulated, respectively. When treated with the iron chelator 2,2\'-dipyridyl, 193 CDS were considered as up-regulated and 216 as down-regulated. Differential expression for a subset of 44 CDS was further evaluated by RT-qPCR that showed a Pearson correlation of 0.77 with array results. The CDS differentially expressed upon the iron concentration shift participate in diverse cellular functions. Many CDS involved with regulatory functions, pathogenicity and cell structure, were modulated in both conditions tested suggesting that major changes in cell architecture and metabolism occur when X. fastidiosa cells are exposed to extreme variations in iron concentration. Interestingly, the modulated CDS include those related to colicin V-like bacteriocin synthesis and secretion and to pili/fimbriae functions. We also investigated the contribution of the ferric uptake regulator Fur to the iron stimulon of X. fastidiosa. Thus, the promoter regions of strain 9a5c genome were screened for putative Fur boxes. Our analyses identified Fur boxes-like elements in promoter regions of 49 CDS. The functionality of at least one Fur box was confirmed by electrophoretic mobility shift assays which demonstrated its interaction with X. fastidiosa recombinant Fur. However, not all genes that appeared to be modulated by iron concentration shift are directly regulated by Fur. This supports the hypothesis that Fur is not solely responsible for the modulation of the iron stimulon of X. fastidiosa. Taken together, our data present novel evidence for iron regulation of pathogenicity and virulence determinants in X. fastidiosa.

O isolamento do vírus da raiva (genótipo 1) a partir de morcegos não hematófagos está se tornando cada vez mais freqüente nas grandes cidades do Brasil. Este trabalho foi delineado para investigar a patogenicidade de um isolado do vírus da raiva, do morcego insetívoro Lassiurus ega, procedente do município de Presidente Prudente SP, em comparação ao vírus fixo da raiva, amostra CVS/32 (Challenge Vírus Standard). Os vírus foram reativados por meio de inoculação intracerebral em camundongos e os experimentos de patogenicidade foram realizados em camundongos e hamsters, desafiando-os pelas vias intramuscular (IM), intradérmica (ID), intranasal (IN) e abrasão superficial da pele (AP). A presença do vírus nos cérebros de animais que haviam manifestado sinais compatíveis à raiva, foi confirmada mediante a prova de imunofluorescência direta. Foram considerados para a avaliação da patogenicidade o quadro clínico, proporção de mortos, e a duração dos períodos de incubação (PI) e clínicos (PC) em dias. Em hamsters, o isolado de L. ega exibiu um quadro furioso, com proporção total de mortos de 2.60%; assim discriminada: 2.08% IM (PI: 11 dias; PC: 6 dias) e 8.33% IN (PI:10.66 ± 1.15 e PC: 7.33 ± 1.54). A presença do vírus no SNC foi detectada apenas em animais inoculados por essas vias. Por outro lado, o vírus CVS produziu um quadro paralítico com mortalidade total de 39.84%, com a seguinte distribuição: 62.50% IM (PI 7.50 ± 2.33; PC: 5.13 ± 1.89) 78.12% ID (PI 9.13 ± 2.23; PC 3.88 ± 2.23) 18.75% IN (PI 12.00 ± 2.77; PC 7.14 ± 2.54). Em camundongos, o isolado do L. ega manifestou sinais de agressividade e a raiva foi confirmada em animais inoculados IM e IN. A proporção de mortos observados em camundongos foi de 50.00% (PI 16.80 ± 2.20; PC 1.4 ± 0.54) e 30% (PI 14 ± 4.35; PC: 2.66 ± 0.57) respectivamente e o vírus CVS produziu mortalidade de 45.00% (PI: 6.30 ± 0.67; PC: 1.5 ± 0.70), 70% (PI: 7.14 ± 1.34; PC 2.28 ± 1.25) e 30% (PI:10.00; PC:1) pelas vias mencionadas acima, com quadro clínico de paralisia. O isolado de L. ega mostrou diferenças na proporção de mortos e quadro clínico furioso quando comparado com o CVS nos dois modelos animais. Os resultados sugerem que o contato com os morcegos insetívoros infectados pelo vírus da raiva representa um risco de transmissão da doença, por meio de ferimentos superficiais da pele provocadas pelas mordeduras ou ainda pela via respiratória, supostamente por meio de aerossóis. Pelo sequenciamento completo da proteína G viral do isolado do L. ega, foram observadas substituições na seqüência de aminoácidos nos sítios antigênicos AI, AII, assim como no domínio de fusão dependente de baixo pH. Os resultados obtidos, sugerem que as diferenças no comportamento biológico podem estar associadas às substituições encontradas na sequencia de aminoácidos da proteína G. / The isolation of rabies virus (genotype 1) from the non-hematophagous bats is becoming frequent in heavy urbanized areas in Brazil. This work intended to investigate the pathogenicity of a Brazilian rabies virus isolate from the insectivorous bat Lassiurus ega, from PresidentePrudente-SP, comparing with the CVS/32 (Challenge Virus Standard) fixed rabies virus strain. The viruses were reactivated through intracerebral inoculation into mice and the pathogenicity experiments were made in hamsters and mice, challenged by intramuscular (IM), intradermal (ID) and intranasal (IN) routes and by superficial abrasion of skin. The presence of virus in the brain of animals manifesting the signs compatible with rabies was confirmed by the direct immunofluorescence test. For the evaluation of the pathogenicity, the clinical manifestations, incubation (IP) and clinical (CP) periods in days and the mortality were considered. In hamsters, the isolate of L. ega exhibited a furious form of rabies with total mortality rate of 2.60%, with following distribution: 2.08% IM (IP: 11 days; CP: 6 days) and 8.33% IN (IP: 10.66 ± 1.15 and PC: 7.33 ± 1.54). The presence of rabies virus in the CNS was detected only in animals inoculated through IM and IN routes. The CVS strain has provoked paralytic disease with a total mortality rate of 39.84% as the follow: 62.50% IM (IP 7.50 ± 2.33; CP: 5.13 ± 1.89), 78.12% ID (IP 9.13 ± 2.23; CP 3.88 ± 2.23) and 18.75% IN (IP 12.00 ± 2.77; CP 7.14 ± 2.54). In mice, the isolate of L. ega manifested signs of aggressiveness and rabies was confirmed in animals that were inoculated intramuscularly and intranasally. The total mortality rate observed in mice was 20%, by the IM route was 50% (IP 16.80 ± 2.20; CP 1.4 ± 0.54) and 30% by the intranasal route (IP 14.00 ± 4.35; CP: 2.66 ± 0.57) respectively. The CVS strain showed a total mortality rate of 45.00% and by the IM route, 100% (PI: 6.30 ± 0.67; CP: 1.5 ± 0.70), by the ID route, 70% (IP: 7.14 ± 1.34; CP 2.28 ± 1.25) and by IN, 30% (IP: 10, 00; C: 1.00) showing signs of paralysis. Compared to the CVS strain, the isolate of L. ega showed difference in mortality rate and signs of aggressiveness were found both in hamster and mouse model. The results suggest that the contact with the insectivorous bats infected with rabies virus would represent a risk of disease transmission, by means of superficial wounds of the skin inflicted by bites or by inhalation of aerosols. By the complete sequencing of the viral G protein of the isolate of L. ega, sequencings of amino acids substitutions were observed at antigenic sites AI, AII, as well as the in domain of fusion dependent on low pH. According to the results, differences in the biological behavior may be associated to the substitutions found in the amino acids sequence of the G protein.

Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma doença autossômica dominante, caracterizada por elevados níveis plasmáticos da lipoproteína de baixa densidade (LDL), desenvolvimento de xantoma tendíneo e arco corneal, além do aumento do risco de doença coronariana e acidente vascular cerebral prematuros. Frequentemente subdiagnosticada, estima-se que apenas 10% dos 400.000 indivíduos com HF no Brasil têm conhecimento da própria doença; afetando, desta forma, a qualidade e a expetativa de vida dos pacientes. Mutações no gene do receptor da LDL (LDLR) são consideradas as alterações genéticas mais frequentes para o desenvolvimento da hipercolesterolemia familiar, pois comprometem a capacidade de remoção das partículas de LDL circulantes, promovendo seu aumento em níveis plasmáticos. Já foram descritas mais de 1600 mutações diferentes no gene LDLR associadas ao fenótipo da HF; entretanto, ainda é difícil determinar em muitas delas o efeito deletério na atividade do receptor. O objetivo desse estudo foi identificar e caracterizar funcionalmente mutações no gene LDLR não descritas na literatura para determinar sua patogenicidade na hipercolesterolemia familiar. Foi avaliada a atividade residual de LDLR através da captação de LDL marcado com fluoróforo lipofílico em cultura de linfócitos T dos pacientes portadores das mutações analisadas após estimulação dos linfócitos T por mitógenos específicos. As mutações Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr foram consideradas patogênicas por acarretarem diminuição da atividade residual do receptor de LDL. As mutações Glu 602X e His388ProfsX53 confirmaram sua patogenicidade e podem ser considerados como controle positivo para futuros ensaios funcionais. Estudos que esclareçam os mecanismos moleculares da HF e da relação genótipo/fenótipo abrem perspectivas para o desenvolvimento de terapias mais específicas na redução dos níveis de colesterol e, consequentemente, da morbidade e mortalidade associadas às doenças cardiovasculares. / Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder characterized by elevated plasma levels of low-density lipoprotein (LDL), and development of corneal arcus tendinous xanthoma, and increased risk of coronary heart disease and premature stroke. Often misdiagnosed, it is estimated that only 10% of the 400.000 patients with FH in Brazil has knowledge of the disease itself, affecting in this way the quality and life expectancy of patients. Mutations in the LDL receptor (LDLR) are considered the most frequent genetic alterations for the development of familial hypercholesterolemia because compromise the ability of removal of circulating LDL particles, promoting its increase in plasma levels. Have been described over 1600 different mutations in the LDLR gene associated with the phenotype of FH, however, it is still difficult to determine in many of the deleterious effects on receptor activity. The aim of this study was to identify mutations in the LDLR gene and functionally characterize mutations not described in the literature to determine its pathogenicity in familial hypercholesterolemia. The residual activity of LDLR was evaluated by raising LDL labeled with lipophilic fluorophore in cultured T lymphocytes of patients with the analyzed mutations after stimulation of T lymphocytes by specific mitogen. The substitution mutations Cys82Ser, Thr404Ser, Gly529Arg e His285Tyr were considered pathogenic because it causes decrease of the residual activity of the LDL receptor in T lymphocytes. The His388ProfsX53 and Glu602X mutations confirmed their pathogenicity and can be considered as positive control for future functional assays. Studies to clarify the molecular mechanisms of HF and genotype/ phenotype open perspectives for the development of more specific therapies for reducing cholesterol levels, and therefore the morbidity and mortality associated with cardiovascular diseases.

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À medida que as drogas antimicrobianas são introduzidas no ambiente, os microrganismos respondem, tornando-se resistentes, podendo gerar alterações na fisiologia celular, e que podem interferir na relação bactéria-hospedeiro. Nosso objetivo foi investigar alterações em B . fragilis após exposição a concentrações subinibitórias de ampicilina (AMP), ampicilina/sulbactam (AMS), clindamicina (CLI) e cloranfenicol (CLO); e investigar aspectos da relação droga-bactéria-hospedeiro, após desafio experimental em camundongos. Foram obtidas 4 linhagens bacterianas: BfAMP, BfAMS, BFCLI e BfCLO. Alterações na morfologia, padrões de crescimento, habilidades bioquímicas e fisiológicas, perfis de expressão protéica e semelhança genética foram avaliadas comparativamente entre as linhagens obtidas e a linhagem Bf parental ATCC 25285. Infecção experimental foi realizada em camundongos convencionais, desafiados intraperitonealmente. Histologia de baço e fígado, além de dosagem das citocinas TNF-α, IL-6, IL-10, IL-17 e IFN-γ no intestino, foram realizadas. Ampicilina e ampicilina/sulbactam induziram alterações morfológicas significativas nas células bacterianas na primeira exposição. Foi verificada diminuição da sensibilidade aos antimicrobianos em todas as linhagens selecionadas. Além disso, a exposição aos antimicrobianos foi capaz de induzir alterações nos padrões bioquímico-fisiológicos bacterianos, se comparado com a amostra parental. Em relação à capacidade de formação de biofilme, observou-se alteração em todas as linhagens, quando comparadas à parental, sendo que as linhagens selecionadas pela exposição aos antimicrobianos tiveram capacidade de aderência diminuída. A identidade genética das linhagens bacterianas obtidas foi confirmada e não foram detectados fragmentos de DNA polimórfico. Variações nos perfis de citocinas foram verificadas nos animais desafiados com a linhagem BfAMS. Alterações histopatológicas também foram observadas no baço e fígado dos animais desafiados com as linhagens de B . fragilis selecionadas por exposição aos antimicrobianos. Nossos resultados permitem sugerir fenômenos relacionados à regulação da expressão gênica como uma resposta momentânea ou evolutiva dos microrganismos. Estes resultados podem ainda sugerir que essas drogas tem diferentes interações com a célula bacteriana, que podem ser prejudiciais para a interação bactéria-hospedeiro. Assim, nossos resultados chamam a atenção para o risco de terapia antimicrobiana inadequada, mesmo com baixas concentrações de fármacos, que poderiam alterar os níveis de expressão gênica de uma bactéria e modular sua patogenicidade. / Bacteroides fragilis is an anaerobic Gram negative rod member of resident gut microbiota, isolated from clinical infections due in part to its potent virulence factors. As antimicrobial drugs are introduced into the environment, microorganisms respond by becoming resistant and may cause changes in cell physiology. These changes can interfere with the bacterium-host relationship. The aim of this study was to investigate changes in B . fragilis after exposure to ampicillin (AMP), ampicillin/sulbactam (AMS), clindamycin (CLI) and chloramphenicol (CLO); and to investigate changes in host-bacteria relationships after experimental challenge in mice. Four bacterial strains were obtained: BfAMP, BfAMS, BFCLI e BfCLO. Morphological changes, growth patterns, biochemical and physiological abilities, protein expression profile and genetic relationships were comparatively evaluated among the drug-selected strains and Bf parent ATCC 25285. Experimental infection was performed intraperitoneally in conventional mice. Liver and spleen histology, besides cytokines determinations were performed in the intestines. Ampicillin and ampicillin/sulbactam induced the highest significant morphological alterations in the bacterial cells after the initial drug exposure. Decreased sensitivity to all antimicrobials was observed for all drug-selected bacteria strains. Furthermore, drug-exposure was able to induce changes in biochemical pathways and bacterial physiology, if compared with the Bf parent strain. Regarding the ability of biofilm formation, alterations in adherence properties were observed for all drug-selected bacteria, being this characteristic down regulated. The genetic identities were confirmed for the selected strains and no DNA polymorphisms were detected. The cytokine patterns in the intestines from mice challenged with drug-selected bacteria were highly altered, mainly considering the BfAMS strain, as well as the histological aspect concerning the liver and the spleen excised from the experimentally challenged animals. Our results may suggest phenomena related to the gene expression regulation, as a microbial momentary or evolutionary response to the selective pressure of the antimicrobial drugs. These results may also suggest that these drugs have different interactions with the bacterial cell which can be harmful to the host-bacteria relationships. In this way, the data ask for attention regarding the risks of inappropriate chemotherapy, even with low concentrations of the antimicrobial drugs, which might the bacteria genetic expression levels and modulate their pathogenicity