Os mexilhões são alimentos marinhos freqüentemente ingeridos crus, ou parcialmente cozidos, e o hábito de aferventar estes bivalves somente até que abram as valvas, é insuficiente para eliminar os microrganismos patogênicos eventualmente presentes neste molusco. Após levantamento inicial, e visando melhorar a qualidade do mexilhão Perna perna cultivado e comercializado no município de Ubatuba, SP, esta pesquisa estudou o crescimento de Staphylococcus aureus e Bacillus cereus em mexilhões in natura e pré-cozidos, e a eliminação dos mesmos por meio de tratamentos térmicos, avaliando, posteriormente, as características físico-químicas e sensoriais dos produtos. Em ambos os casos, lotes de 1 kg de mexilhão foram inoculados, individualmente, com cepas de S. aureus e B. cereus e mantidos, por 10 horas, a temperatura ambiente (25ºC±1ºC) e sob refrigeração (7ºC±1ºC). Posteriormente, foram estabelecidos seis tipos de tratamentos térmicos, sendo três sob vapor (5, 10 e 15 min) e três por imersão em água (5, 10 e 15 min), buscando estabelecer o binômio que proporcionasse a eliminação dos mesmos, e avaliando o rendimento, os aspectos físico-químicos e sensoriais. Para ambos microrganismos, ocorreu crescimento durante as 10 horas de estudo, sendo este mais evidente, nos tratamentos mantidos a temperatura ambiente. No mexilhão pré-cozido ocorreram as maiores contagens microbianas, se comparado ao mexilhão in natura. Com relação aos tratamentos térmicos, todos foram eficientes, eliminando os microrganismos da ordem de, pelo menos 2 ciclos logarítmicos, no entanto, os tratamentos térmicos por imersão em água, permitiram melhores resultados do que os tratamentos sob vapor. As análises fisico-químicas e sensoriais, não apresentaram diferença estatística entre os tratamentos térmicos estudados. Com o emprego de altas temperaturas por um determinado período, obteve-se perda de alguns minerais, como Potássio e Boro, tendo outros, não apresentado alteração com relação ao tempo de exposição ao calor. Já, quanto ao rendimento, houve diferença, em nível de 5%, sendo os melhores rendimentos alcançados nos menores tempos de exposição ao calor e, os tratamentos por imersão, apresentaram resultados melhores que os tratamentos sob vapor. Concluiu-se que o tratamento térmico, binômio tempo-temperatura, de 10 min em água à ebulição, é suficiente para reduzir os microrganismos, permitindo a retenção dos nutrientes e um rendimento de 54,36%, podendo, portanto, ser recomendado para os produtores, visando melhorar a qualidade do mexilhão, via adequação do manejo atualmente empregado. / Mussels are seafood frequently ingested raw or partially cooked and the habit of boiling bivalves only to open the valves, is insufficient to eliminate several species of pathogenic bacteria. Seeking to improve the quality of the cultivated and marketed Perna perna mussel in the district of Ubatuba, SP, this research studied the microbiological growth of Staphylococcus aureus and Bacillus cereus in fresh and pre-cooked mussels, and the elimination by thermal treatments, being evaluated its physicochemical and sensorial characteristics. For such, lots of 1 kg of mussel was inoculated individually with strains of S. aureus and B. cereus, and maintained by 10 hours at environmental temperature (25ºC±1ºC) and under refrigeration (7ºC±1ºC). Six thermal treatments were established, 3 in steam (5, 10 and 15 min) and 3 in boiling water (5, 10 and 15 min), being looked in the elimination of B. cereus and S. aureus, and also evaluating the performance, and physical-chemical and sensorial aspects. Microbiological growth was verified after 10 hours for both microorganisms, and this being more evident in the treatments maintained at environmental temperature. Pre-cooked mussel obtained the largest microbial developments, if compared to fresh mussels. About the thermal treatments, everyone was efficient, eliminating at least 2 logarithmic cycles, however, thermal treatments in boiling water obtained better results than the steam treatments. The physical-chemical and sensorial analyses, didn't present statistical difference among the thermal treatments studied. Use of high temperatures for a determinate period, obtained lost in some minerals, like potassium and boron, and others minerals not presented alteration in relation to the heat time exposure. Already in the performance, it was obtained statistical difference, being the best performances reached in the smallest times of heat exposition, and the treatments in boiling water presented better results than the steam treatments. The thermal treatment, binomial time-temperature, of 10 min in boiling water, is enough to reduce the microorganisms, allowing the retention of the nutrients and performance of 54.36%, could be recommended for the producers seeking to improve the traditional handling.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é a causa de doenças extra-intestinais em aves, que se manifestam na forma de doenças localizadas ou infecções sistêmicas, gerando grandes perdas econômicas para a indústria aviária. O objetivo desse trabalho foi estudar isolados de APEC do sul do Brasil em relação à resistência a agentes antimicrobianos; a prevalência de fatores associados à virulência; a tipagem filogenética e o perfil filogenético. Na avicultura, os agentes antimicrobianos são muito utilizados na prevenção de infecções e na forma de promotores de crescimento. Foram utilizadas 41 isolados de E. coli obtidos de infecções sistêmicas e 144 isolados de celulite, utilizando o método de difusão com discos. Isolados APEC apresentaram baixos níveis de resistência, com excessão da tetraciclina e das sulfonamidas; e para isolados de colissepticemia, também foi observado uma resistência aos antimicrobianos que atuam na parede celular (ampicilina, cefalotina, bacitracina e ceftiofur). Vários fatores de virulência têm sido investigados em cepas APEC, os que têm sido mais frequentemente associados com a patogenicidade são as fímbrias de aderência F1 e Tsh (hemaglutinina sensível à temperatura); o sistema sideróforo aerobactina, a proteína iss (increased serum survival), a cápsula K e a produção de colicina V. Foram realizadas reações da polimerase em cadeia multiplex (PCR), testando um total de 33 fatores nos isolados APEC. Os fatores relacionados a adesão, sideróforos e resistência ao soro foram presentes em todas as amostras. Os fatores que apresentaram maior prevalência nas amostras foram, fimC, ompA, crlA e traT. A tipagem filogenética foi realizada através do método descrito por Clermont et al., (2000), que permite separar os isolados em 4 grupos filogenéticos principais (A, B1, B2 e D). Observamos a maior presença de isolados APEC pertencentes ao grupo D, tanto para celulite quanto para colissepticemia. A análise do perfil filogenético foi realizada pelo método ARDRA, que é baseado na variação da região do espaçamento intergênico (ISR) na região 16S-23S do DNA ribossômico. Os resultados foram analisados formando um dendrograma que mostra a proximidade filogenética dos isolados, indicando que não foi possível separar os clones de celulite dos de colissepticemia e não existem clones endêmicos nas regiões analisadas. Os resultados obtidos no presente estudo, fornecem um panorama geral da resistência aos agentes antimicrobianos, prevalência dos fatores de virulência, tipagem filogenética e perfil filogenético encontrados nos isolados de E. coli aviária do sul do Brasil de infecções de colissepticemia e celulite. / extra-intestinal infections in poultry, called colibacilose, and cause great economic losses to the poultry industry. The aim of this work was to examine APEC strains, isolated from avian cellulitis and colisepticemic chickens from South Brazil, for antibiotic resistance, presence of virulence-associated genes (VAGs), phylogenetic typing and phylogenetic analyses. In poultry, antibiotics are routinely used to prevent infection and promote growth. We analyzed the susceptibility to 15 antibiotics in 144 E. coli isolates collected from cellulitis lesions and in 41 isolates from septicemic chickens. APEC isolates have shown low levels of resistance excepting tetracycline and sulphonamides, and colisepticemic isolates were resistant to antibiotics that act in the cell wall, such as ampicilin, cephalotin, ceftiofur and bacitracin. The virulence factors most frequently associated with APEC pathogenicity are the adhesins F1 and Tsh (Temperature sensitive hemagglutinin), the iron acquisition system aerobactin, the protein Iss (increased serum survival), K1 capsule and production of colicin V. To investigate the presence of VAGs in the isolates, we performed multiplex polymerase chain reactions to test 33 virulence factors. Virulence factors related to adhesion, iron acquisition and serum resistance were present in almost all strains. The factors fimC, ompA, crlA and traT were the most frequent in APEC isolates. The phylogenetic typing were done using the Clermont et al. (2000) method, which classifies E. coli strains into four main phylogenetic groups (A, B1, B2, and D). Our phylogenetic typing has shown that cellulitis and colisseptisemic isolates were more related to group D. Amplified ribossomal restriction analysis (ARDRA) was performed in colissepticemic and celullitis isolates from broiler chickens from Southern Brasil. The similarity among isolates were observed with a dendrogram based on the band pattern. Our results have shown that clones of celullitis and colissepticemic isolates could not be distinguished and there is no endemic clones in regions observed analised. The results of the present work give us a panorama of the susceptibility to antibiotics, virulence factors, phylogenetic typing and phylogenetic analyses currently found in APEC isolates from severe lesions of cellulites and colibacillosis in south Brazil. Besides that, these analyses could be helpful for monitoring and preventing outbreakes of colibacilosis. Controling the first stages of the disease and detecting more prevalent clones in this region may reduce the incidence of the disease.

Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e de distribuição cosmopolita. E. coli coloniza o intestino de humanos e outros animais endotérmicos logo após o nascimento, estabelecendo-se como um importante membro da microbiota intestinal. Algumas cepas de E. coli podem adquirir fatores de virulência, assumindo assim, uma natureza patogênica, como é o caso das E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). As cepas ExPEC apresentam a capacidade de colonizar e se disseminar em diversos nichos no hospedeiro, e são divididas em UPEC (E. coli uropatogênica), NMEC (E. coli causadora de meningite neonatal) e APEC (E. coli patogênica para aves). UPEC, NMEC e APEC compartilham fatores associados à virulência. Para serem aptas a causar doença, cepas ExPEC devem apresentar pelo menos um fator associado à adesão, um fator para captação de ferro (sideróforo) e um fator de resistência ao soro, podendo, também, apresentar genes que codificam toxinas e invasinas. Embora sejam conhecidos muitos fatores de virulência associados à patogenicidade de cepas ExPEC, a regulação da expressão de tais fatores ainda não foi elucidada. Fumarato-nitrato-redutase (FNR) é uma proteína que atua como regulador global, agindo como um sensor da presença de oxigênio em bactérias gramnegativas. Já foi demonstrado que FNR está relacionada à regulação da virulência de bactérias patogênicas como Shigella flexneri e Salmonella enterica serovar Typhimurium. Este trabalho teve como objetivo a análise epidemiológica e caracterização de cepas APEC, bem como a investigação do controle da expressão de fatores associados à virulência de ExPEC pelo regulador global FNR. Os resultados da análise epidemiológica das cepas APEC mostram o perfil de resistência aos agentes antimicrobianos, a prevalência dos fatores de virulência e dos grupos filogenéticos (de acordo com a classificação EcoR) e a relação filogenética dos isolados, fornecendo um panorama da caracterização de E. coli patogênicas aviárias de lesões severas de celulite e de infecção sistêmica oriundas da região sul do Brasil. Em relação ao FNR, este estudo mostrou a influência deste regulador sobre importantes fatores associados à virulência, estando envolvido no controle de várias etapas do estabelecimento da infecção por cepas ExPEC. A deleção de fnr na cepa UPEC CFT 073 reduziu a motilidade, a expressão das fimbrias tipo I e tipo P, reduziu a expressão da hemolisina e controlou a expressão da ilha de patogenicidade do α- cetoglutarato. Além disso, a deleção de fnr fez tornou as bactérias incapazes de invadir células dos rins e da bexiga e de causar doença in vivo em camundongos de 6 semanas. FNR também foi capaz de controlar as etapas da infecção por NMEC 56. Uma vez deletado, as bactérias perderam a capacidade de causar bacteremia, de crescer no fluido cerebrospinal e de causar doença in vivo em ratos de 5 dias de idade. A deleção de fnr em APEC O1 resultou na diminuição da expressão da proteína OmpT plasmidial, da fímbria do tipo I e do auto-transportador AatA. A principal contribuição deste trabalho foi demonstrar que FNR atua na regulação da expressão de importantes fatores associados à virulência de cepas ExPEC (UPEC, NMEC e APEC), sendo importante para o estabelecimento da infecção por essas cepas. Neste trabalho, verificamos que, além da função já conhecida de regular os genes envolvidos na manutenção de um meio anaeróbico, FNR também atua no controle de genes associados à virulência de cepas ExPEC, refletindo na capacidade de causar doença que tais cepas apresentam. / Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, facultative anaerobic and has cosmopolitan distribution. E. coli colonizes the intestine of humans and other endothermic animals immediately after birth, establishing as an important member of the intestinal microbiota. Some strains of E. coli can acquire virulence factors thereby assuming a pathogenic nature, as in the case of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC strains have the ability to colonize and spread out in different niches of the host, and are divided into UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (newborn meningitis E. coli) and APEC (avian pathogenic E. coli). UPEC, NMEC and APEC share virulence factors. To be able to cause disease, ExPEC strains must produce virulence factors required for adherence, for iron uptake (siderophore) and for resistance to serum and may also contain genes encoding toxins and invasins. Although many virulence factors associated with the pathogenicity of ExPEC strains are known, the regulation of the expression of these factors has not yet been fully elucidated. Fumarate nitrate reductase (FNR) is a global regulatory protein, acting as a sensor of oxygen in Gram- negative bacteria. It has been shown that FNR relates virulence of pathogenic bacteria such as Shigella flexneri and Salmonella enterica serovar Typhimurium. The aim of this study was to do an epidemiological analysis and characterization of APEC strains as well as the investigation of regulation of ExPEC’s virulence factors by the global FNR regulator. The results of epidemiological analysis of APEC strains showed the profile of antimicrobial resistance , the prevalence of virulence factors and phylogenetic groups (according to the EcoR group) and the phylogenetic relationship of the isolates, providing an overview of the characterization of avian pathogenic E. coli causing severe cellulitis lesions and systemic infection originating from southern Brazil. In relation to FNR, this study showed the influence of this important regulator of virulence factors that is involved in controlling various stages of establishment of infection by ExPEC strains. Deletion of fnr in UPEC strain CFT 073 reduced motility and expression of type I and type P fimbriae, reduced the expression of hemolysin and control the expression of the pathogenicity island of α -ketoglutarate. Furthermore, fnr mutant strains were unable to invade cells of kidney and bladder, and to colonize the urinary tract of 6 weeks-old mice. FNR was also able to control the stages of infection of NMEC 56. The fnr mutant lost its ability to cause bacteremia, grow in cerebrospinal fluid, cause disease in 5 days old rats. Deletion of fnr in APEC O1 resulted in decreased expression of genes corresponding to the plasmid encoded OmpT protein, type I fimbriae and autotransporter AatA. The main contribution of this work was to demonstrate that FNR regulates expression of important virulence factors of ExPEC strains (UPEC, NMEC and APEC), which is important for the establishment of infection by these strains. In this work, we found that, besides the already known function in regulating genes involved in maintaining an anaerobic environment, FNR also acts in the control of virulenceassociated genes of ExPEC strains, reflecting the ability of these strains to cause disease.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é a causa de doenças extra-intestinais em aves, que se manifestam na forma de doenças localizadas ou infecções sistêmicas, gerando grandes perdas econômicas para a indústria aviária. O objetivo desse trabalho foi estudar isolados de APEC do sul do Brasil em relação à resistência a agentes antimicrobianos; a prevalência de fatores associados à virulência; a tipagem filogenética e o perfil filogenético. Na avicultura, os agentes antimicrobianos são muito utilizados na prevenção de infecções e na forma de promotores de crescimento. Foram utilizadas 41 isolados de E. coli obtidos de infecções sistêmicas e 144 isolados de celulite, utilizando o método de difusão com discos. Isolados APEC apresentaram baixos níveis de resistência, com excessão da tetraciclina e das sulfonamidas; e para isolados de colissepticemia, também foi observado uma resistência aos antimicrobianos que atuam na parede celular (ampicilina, cefalotina, bacitracina e ceftiofur). Vários fatores de virulência têm sido investigados em cepas APEC, os que têm sido mais frequentemente associados com a patogenicidade são as fímbrias de aderência F1 e Tsh (hemaglutinina sensível à temperatura); o sistema sideróforo aerobactina, a proteína iss (increased serum survival), a cápsula K e a produção de colicina V. Foram realizadas reações da polimerase em cadeia multiplex (PCR), testando um total de 33 fatores nos isolados APEC. Os fatores relacionados a adesão, sideróforos e resistência ao soro foram presentes em todas as amostras. Os fatores que apresentaram maior prevalência nas amostras foram, fimC, ompA, crlA e traT. A tipagem filogenética foi realizada através do método descrito por Clermont et al., (2000), que permite separar os isolados em 4 grupos filogenéticos principais (A, B1, B2 e D). Observamos a maior presença de isolados APEC pertencentes ao grupo D, tanto para celulite quanto para colissepticemia. A análise do perfil filogenético foi realizada pelo método ARDRA, que é baseado na variação da região do espaçamento intergênico (ISR) na região 16S-23S do DNA ribossômico. Os resultados foram analisados formando um dendrograma que mostra a proximidade filogenética dos isolados, indicando que não foi possível separar os clones de celulite dos de colissepticemia e não existem clones endêmicos nas regiões analisadas. Os resultados obtidos no presente estudo, fornecem um panorama geral da resistência aos agentes antimicrobianos, prevalência dos fatores de virulência, tipagem filogenética e perfil filogenético encontrados nos isolados de E. coli aviária do sul do Brasil de infecções de colissepticemia e celulite. / extra-intestinal infections in poultry, called colibacilose, and cause great economic losses to the poultry industry. The aim of this work was to examine APEC strains, isolated from avian cellulitis and colisepticemic chickens from South Brazil, for antibiotic resistance, presence of virulence-associated genes (VAGs), phylogenetic typing and phylogenetic analyses. In poultry, antibiotics are routinely used to prevent infection and promote growth. We analyzed the susceptibility to 15 antibiotics in 144 E. coli isolates collected from cellulitis lesions and in 41 isolates from septicemic chickens. APEC isolates have shown low levels of resistance excepting tetracycline and sulphonamides, and colisepticemic isolates were resistant to antibiotics that act in the cell wall, such as ampicilin, cephalotin, ceftiofur and bacitracin. The virulence factors most frequently associated with APEC pathogenicity are the adhesins F1 and Tsh (Temperature sensitive hemagglutinin), the iron acquisition system aerobactin, the protein Iss (increased serum survival), K1 capsule and production of colicin V. To investigate the presence of VAGs in the isolates, we performed multiplex polymerase chain reactions to test 33 virulence factors. Virulence factors related to adhesion, iron acquisition and serum resistance were present in almost all strains. The factors fimC, ompA, crlA and traT were the most frequent in APEC isolates. The phylogenetic typing were done using the Clermont et al. (2000) method, which classifies E. coli strains into four main phylogenetic groups (A, B1, B2, and D). Our phylogenetic typing has shown that cellulitis and colisseptisemic isolates were more related to group D. Amplified ribossomal restriction analysis (ARDRA) was performed in colissepticemic and celullitis isolates from broiler chickens from Southern Brasil. The similarity among isolates were observed with a dendrogram based on the band pattern. Our results have shown that clones of celullitis and colissepticemic isolates could not be distinguished and there is no endemic clones in regions observed analised. The results of the present work give us a panorama of the susceptibility to antibiotics, virulence factors, phylogenetic typing and phylogenetic analyses currently found in APEC isolates from severe lesions of cellulites and colibacillosis in south Brazil. Besides that, these analyses could be helpful for monitoring and preventing outbreakes of colibacilosis. Controling the first stages of the disease and detecting more prevalent clones in this region may reduce the incidence of the disease.

Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e de distribuição cosmopolita. E. coli coloniza o intestino de humanos e outros animais endotérmicos logo após o nascimento, estabelecendo-se como um importante membro da microbiota intestinal. Algumas cepas de E. coli podem adquirir fatores de virulência, assumindo assim, uma natureza patogênica, como é o caso das E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). As cepas ExPEC apresentam a capacidade de colonizar e se disseminar em diversos nichos no hospedeiro, e são divididas em UPEC (E. coli uropatogênica), NMEC (E. coli causadora de meningite neonatal) e APEC (E. coli patogênica para aves). UPEC, NMEC e APEC compartilham fatores associados à virulência. Para serem aptas a causar doença, cepas ExPEC devem apresentar pelo menos um fator associado à adesão, um fator para captação de ferro (sideróforo) e um fator de resistência ao soro, podendo, também, apresentar genes que codificam toxinas e invasinas. Embora sejam conhecidos muitos fatores de virulência associados à patogenicidade de cepas ExPEC, a regulação da expressão de tais fatores ainda não foi elucidada. Fumarato-nitrato-redutase (FNR) é uma proteína que atua como regulador global, agindo como um sensor da presença de oxigênio em bactérias gramnegativas. Já foi demonstrado que FNR está relacionada à regulação da virulência de bactérias patogênicas como Shigella flexneri e Salmonella enterica serovar Typhimurium. Este trabalho teve como objetivo a análise epidemiológica e caracterização de cepas APEC, bem como a investigação do controle da expressão de fatores associados à virulência de ExPEC pelo regulador global FNR. Os resultados da análise epidemiológica das cepas APEC mostram o perfil de resistência aos agentes antimicrobianos, a prevalência dos fatores de virulência e dos grupos filogenéticos (de acordo com a classificação EcoR) e a relação filogenética dos isolados, fornecendo um panorama da caracterização de E. coli patogênicas aviárias de lesões severas de celulite e de infecção sistêmica oriundas da região sul do Brasil. Em relação ao FNR, este estudo mostrou a influência deste regulador sobre importantes fatores associados à virulência, estando envolvido no controle de várias etapas do estabelecimento da infecção por cepas ExPEC. A deleção de fnr na cepa UPEC CFT 073 reduziu a motilidade, a expressão das fimbrias tipo I e tipo P, reduziu a expressão da hemolisina e controlou a expressão da ilha de patogenicidade do α- cetoglutarato. Além disso, a deleção de fnr fez tornou as bactérias incapazes de invadir células dos rins e da bexiga e de causar doença in vivo em camundongos de 6 semanas. FNR também foi capaz de controlar as etapas da infecção por NMEC 56. Uma vez deletado, as bactérias perderam a capacidade de causar bacteremia, de crescer no fluido cerebrospinal e de causar doença in vivo em ratos de 5 dias de idade. A deleção de fnr em APEC O1 resultou na diminuição da expressão da proteína OmpT plasmidial, da fímbria do tipo I e do auto-transportador AatA. A principal contribuição deste trabalho foi demonstrar que FNR atua na regulação da expressão de importantes fatores associados à virulência de cepas ExPEC (UPEC, NMEC e APEC), sendo importante para o estabelecimento da infecção por essas cepas. Neste trabalho, verificamos que, além da função já conhecida de regular os genes envolvidos na manutenção de um meio anaeróbico, FNR também atua no controle de genes associados à virulência de cepas ExPEC, refletindo na capacidade de causar doença que tais cepas apresentam. / Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, facultative anaerobic and has cosmopolitan distribution. E. coli colonizes the intestine of humans and other endothermic animals immediately after birth, establishing as an important member of the intestinal microbiota. Some strains of E. coli can acquire virulence factors thereby assuming a pathogenic nature, as in the case of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC strains have the ability to colonize and spread out in different niches of the host, and are divided into UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (newborn meningitis E. coli) and APEC (avian pathogenic E. coli). UPEC, NMEC and APEC share virulence factors. To be able to cause disease, ExPEC strains must produce virulence factors required for adherence, for iron uptake (siderophore) and for resistance to serum and may also contain genes encoding toxins and invasins. Although many virulence factors associated with the pathogenicity of ExPEC strains are known, the regulation of the expression of these factors has not yet been fully elucidated. Fumarate nitrate reductase (FNR) is a global regulatory protein, acting as a sensor of oxygen in Gram- negative bacteria. It has been shown that FNR relates virulence of pathogenic bacteria such as Shigella flexneri and Salmonella enterica serovar Typhimurium. The aim of this study was to do an epidemiological analysis and characterization of APEC strains as well as the investigation of regulation of ExPEC’s virulence factors by the global FNR regulator. The results of epidemiological analysis of APEC strains showed the profile of antimicrobial resistance , the prevalence of virulence factors and phylogenetic groups (according to the EcoR group) and the phylogenetic relationship of the isolates, providing an overview of the characterization of avian pathogenic E. coli causing severe cellulitis lesions and systemic infection originating from southern Brazil. In relation to FNR, this study showed the influence of this important regulator of virulence factors that is involved in controlling various stages of establishment of infection by ExPEC strains. Deletion of fnr in UPEC strain CFT 073 reduced motility and expression of type I and type P fimbriae, reduced the expression of hemolysin and control the expression of the pathogenicity island of α -ketoglutarate. Furthermore, fnr mutant strains were unable to invade cells of kidney and bladder, and to colonize the urinary tract of 6 weeks-old mice. FNR was also able to control the stages of infection of NMEC 56. The fnr mutant lost its ability to cause bacteremia, grow in cerebrospinal fluid, cause disease in 5 days old rats. Deletion of fnr in APEC O1 resulted in decreased expression of genes corresponding to the plasmid encoded OmpT protein, type I fimbriae and autotransporter AatA. The main contribution of this work was to demonstrate that FNR regulates expression of important virulence factors of ExPEC strains (UPEC, NMEC and APEC), which is important for the establishment of infection by these strains. In this work, we found that, besides the already known function in regulating genes involved in maintaining an anaerobic environment, FNR also acts in the control of virulenceassociated genes of ExPEC strains, reflecting the ability of these strains to cause disease.

Xylella fastidiosa é uma bactéria patogênica encontrada em várias plantas. Esta bactéria secreta proteases extracelulares detectadas em gel de eletroforese, sendo a gelatina usada como substrato co-polimerizado. Três principais bandas protéicas foram detectadas com massa molar (MM) de 122, 84 e 65 kDa produzidas pelo isolado de citros (X0) e duas bandas de aproximadamente 84 e 65 kDa de isolado de videira (9713). Estas bactérias produziram zonas de hidrólise em meio sólido contendo gelatina, caseína e hemoglobina. Os resultados usando a gelatina como substrato foram os melhores para a atividade das proteases. A atividade enzimática das proteases de X. fastidiosa de citros e videira foi completamente inibida por PMSF e parcialmente inibida por EDTA, podendo ser visualizado em gel de eletroforese nativo. A temperatura ótima de atividade protéica foi de 30oC e o pH ótimo de 7,0. Além das proteases secretadas por este fitopatógeno, quitinase e β-1,3-glucanase foram também detectadas no sobrenadante das culturas. Os resultados sugeriram que estas proteases produzidas pela X. fastidiosa de citros e videira pertencem ao grupo das serina e metalo proteases. / Xylella fastidiosa is a pathogenic bacterium found in several plants. These bacteria secrete extracellular proteases into the culture broth as visualized in sodium-dodecyl-sulfate polyacrylamide activity gels containing gelatin as a co-polymerized substrate. Three major protein bands were produced by strain X0 (citrus) with molar masses (MM) of 122, 84 and 65 kDa. Grape strain 9713 produced two bands of approximately 84 and 64 kDa. These organisms produced zones of hydrolysis in agar plates amended with gelatin, casein and hemoglobin. Gelatin was the best substrate for these proteases. SDS-PAGE activity gel indicated that the protease activities of X. fastidiosa from citrus and grape were completely inhibited by PMSF and partially inhibited by EDTA. The optimal temperature for protease activity was 30oC with an optimal pH of 7.0. Among the proteolytic enzymes secreted by the phytopathogen, chitinase and β-1,3-glucanase activities were also detected in cultures of X. fastidiosa (citrus). From these results, it is suggested that these proteases produced by strains of X. fastidiosa from citrus and grape, belong to the serine- and metallo-protease group.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é a causa de doenças extra-intestinais em aves, que se manifestam na forma de doenças localizadas ou infecções sistêmicas, gerando grandes perdas econômicas para a indústria aviária. O objetivo desse trabalho foi estudar isolados de APEC do sul do Brasil em relação à resistência a agentes antimicrobianos; a prevalência de fatores associados à virulência; a tipagem filogenética e o perfil filogenético. Na avicultura, os agentes antimicrobianos são muito utilizados na prevenção de infecções e na forma de promotores de crescimento. Foram utilizadas 41 isolados de E. coli obtidos de infecções sistêmicas e 144 isolados de celulite, utilizando o método de difusão com discos. Isolados APEC apresentaram baixos níveis de resistência, com excessão da tetraciclina e das sulfonamidas; e para isolados de colissepticemia, também foi observado uma resistência aos antimicrobianos que atuam na parede celular (ampicilina, cefalotina, bacitracina e ceftiofur). Vários fatores de virulência têm sido investigados em cepas APEC, os que têm sido mais frequentemente associados com a patogenicidade são as fímbrias de aderência F1 e Tsh (hemaglutinina sensível à temperatura); o sistema sideróforo aerobactina, a proteína iss (increased serum survival), a cápsula K e a produção de colicina V. Foram realizadas reações da polimerase em cadeia multiplex (PCR), testando um total de 33 fatores nos isolados APEC. Os fatores relacionados a adesão, sideróforos e resistência ao soro foram presentes em todas as amostras. Os fatores que apresentaram maior prevalência nas amostras foram, fimC, ompA, crlA e traT. A tipagem filogenética foi realizada através do método descrito por Clermont et al., (2000), que permite separar os isolados em 4 grupos filogenéticos principais (A, B1, B2 e D). Observamos a maior presença de isolados APEC pertencentes ao grupo D, tanto para celulite quanto para colissepticemia. A análise do perfil filogenético foi realizada pelo método ARDRA, que é baseado na variação da região do espaçamento intergênico (ISR) na região 16S-23S do DNA ribossômico. Os resultados foram analisados formando um dendrograma que mostra a proximidade filogenética dos isolados, indicando que não foi possível separar os clones de celulite dos de colissepticemia e não existem clones endêmicos nas regiões analisadas. Os resultados obtidos no presente estudo, fornecem um panorama geral da resistência aos agentes antimicrobianos, prevalência dos fatores de virulência, tipagem filogenética e perfil filogenético encontrados nos isolados de E. coli aviária do sul do Brasil de infecções de colissepticemia e celulite. / extra-intestinal infections in poultry, called colibacilose, and cause great economic losses to the poultry industry. The aim of this work was to examine APEC strains, isolated from avian cellulitis and colisepticemic chickens from South Brazil, for antibiotic resistance, presence of virulence-associated genes (VAGs), phylogenetic typing and phylogenetic analyses. In poultry, antibiotics are routinely used to prevent infection and promote growth. We analyzed the susceptibility to 15 antibiotics in 144 E. coli isolates collected from cellulitis lesions and in 41 isolates from septicemic chickens. APEC isolates have shown low levels of resistance excepting tetracycline and sulphonamides, and colisepticemic isolates were resistant to antibiotics that act in the cell wall, such as ampicilin, cephalotin, ceftiofur and bacitracin. The virulence factors most frequently associated with APEC pathogenicity are the adhesins F1 and Tsh (Temperature sensitive hemagglutinin), the iron acquisition system aerobactin, the protein Iss (increased serum survival), K1 capsule and production of colicin V. To investigate the presence of VAGs in the isolates, we performed multiplex polymerase chain reactions to test 33 virulence factors. Virulence factors related to adhesion, iron acquisition and serum resistance were present in almost all strains. The factors fimC, ompA, crlA and traT were the most frequent in APEC isolates. The phylogenetic typing were done using the Clermont et al. (2000) method, which classifies E. coli strains into four main phylogenetic groups (A, B1, B2, and D). Our phylogenetic typing has shown that cellulitis and colisseptisemic isolates were more related to group D. Amplified ribossomal restriction analysis (ARDRA) was performed in colissepticemic and celullitis isolates from broiler chickens from Southern Brasil. The similarity among isolates were observed with a dendrogram based on the band pattern. Our results have shown that clones of celullitis and colissepticemic isolates could not be distinguished and there is no endemic clones in regions observed analised. The results of the present work give us a panorama of the susceptibility to antibiotics, virulence factors, phylogenetic typing and phylogenetic analyses currently found in APEC isolates from severe lesions of cellulites and colibacillosis in south Brazil. Besides that, these analyses could be helpful for monitoring and preventing outbreakes of colibacilosis. Controling the first stages of the disease and detecting more prevalent clones in this region may reduce the incidence of the disease.

Escherichia coli é um bacilo Gram-negativo, anaeróbico facultativo e de distribuição cosmopolita. E. coli coloniza o intestino de humanos e outros animais endotérmicos logo após o nascimento, estabelecendo-se como um importante membro da microbiota intestinal. Algumas cepas de E. coli podem adquirir fatores de virulência, assumindo assim, uma natureza patogênica, como é o caso das E. coli patogênicas extraintestinais (ExPEC). As cepas ExPEC apresentam a capacidade de colonizar e se disseminar em diversos nichos no hospedeiro, e são divididas em UPEC (E. coli uropatogênica), NMEC (E. coli causadora de meningite neonatal) e APEC (E. coli patogênica para aves). UPEC, NMEC e APEC compartilham fatores associados à virulência. Para serem aptas a causar doença, cepas ExPEC devem apresentar pelo menos um fator associado à adesão, um fator para captação de ferro (sideróforo) e um fator de resistência ao soro, podendo, também, apresentar genes que codificam toxinas e invasinas. Embora sejam conhecidos muitos fatores de virulência associados à patogenicidade de cepas ExPEC, a regulação da expressão de tais fatores ainda não foi elucidada. Fumarato-nitrato-redutase (FNR) é uma proteína que atua como regulador global, agindo como um sensor da presença de oxigênio em bactérias gramnegativas. Já foi demonstrado que FNR está relacionada à regulação da virulência de bactérias patogênicas como Shigella flexneri e Salmonella enterica serovar Typhimurium. Este trabalho teve como objetivo a análise epidemiológica e caracterização de cepas APEC, bem como a investigação do controle da expressão de fatores associados à virulência de ExPEC pelo regulador global FNR. Os resultados da análise epidemiológica das cepas APEC mostram o perfil de resistência aos agentes antimicrobianos, a prevalência dos fatores de virulência e dos grupos filogenéticos (de acordo com a classificação EcoR) e a relação filogenética dos isolados, fornecendo um panorama da caracterização de E. coli patogênicas aviárias de lesões severas de celulite e de infecção sistêmica oriundas da região sul do Brasil. Em relação ao FNR, este estudo mostrou a influência deste regulador sobre importantes fatores associados à virulência, estando envolvido no controle de várias etapas do estabelecimento da infecção por cepas ExPEC. A deleção de fnr na cepa UPEC CFT 073 reduziu a motilidade, a expressão das fimbrias tipo I e tipo P, reduziu a expressão da hemolisina e controlou a expressão da ilha de patogenicidade do α- cetoglutarato. Além disso, a deleção de fnr fez tornou as bactérias incapazes de invadir células dos rins e da bexiga e de causar doença in vivo em camundongos de 6 semanas. FNR também foi capaz de controlar as etapas da infecção por NMEC 56. Uma vez deletado, as bactérias perderam a capacidade de causar bacteremia, de crescer no fluido cerebrospinal e de causar doença in vivo em ratos de 5 dias de idade. A deleção de fnr em APEC O1 resultou na diminuição da expressão da proteína OmpT plasmidial, da fímbria do tipo I e do auto-transportador AatA. A principal contribuição deste trabalho foi demonstrar que FNR atua na regulação da expressão de importantes fatores associados à virulência de cepas ExPEC (UPEC, NMEC e APEC), sendo importante para o estabelecimento da infecção por essas cepas. Neste trabalho, verificamos que, além da função já conhecida de regular os genes envolvidos na manutenção de um meio anaeróbico, FNR também atua no controle de genes associados à virulência de cepas ExPEC, refletindo na capacidade de causar doença que tais cepas apresentam. / Escherichia coli is a Gram-negative bacillus, facultative anaerobic and has cosmopolitan distribution. E. coli colonizes the intestine of humans and other endothermic animals immediately after birth, establishing as an important member of the intestinal microbiota. Some strains of E. coli can acquire virulence factors thereby assuming a pathogenic nature, as in the case of extraintestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC strains have the ability to colonize and spread out in different niches of the host, and are divided into UPEC (uropathogenic E. coli), NMEC (newborn meningitis E. coli) and APEC (avian pathogenic E. coli). UPEC, NMEC and APEC share virulence factors. To be able to cause disease, ExPEC strains must produce virulence factors required for adherence, for iron uptake (siderophore) and for resistance to serum and may also contain genes encoding toxins and invasins. Although many virulence factors associated with the pathogenicity of ExPEC strains are known, the regulation of the expression of these factors has not yet been fully elucidated. Fumarate nitrate reductase (FNR) is a global regulatory protein, acting as a sensor of oxygen in Gram- negative bacteria. It has been shown that FNR relates virulence of pathogenic bacteria such as Shigella flexneri and Salmonella enterica serovar Typhimurium. The aim of this study was to do an epidemiological analysis and characterization of APEC strains as well as the investigation of regulation of ExPEC’s virulence factors by the global FNR regulator. The results of epidemiological analysis of APEC strains showed the profile of antimicrobial resistance , the prevalence of virulence factors and phylogenetic groups (according to the EcoR group) and the phylogenetic relationship of the isolates, providing an overview of the characterization of avian pathogenic E. coli causing severe cellulitis lesions and systemic infection originating from southern Brazil. In relation to FNR, this study showed the influence of this important regulator of virulence factors that is involved in controlling various stages of establishment of infection by ExPEC strains. Deletion of fnr in UPEC strain CFT 073 reduced motility and expression of type I and type P fimbriae, reduced the expression of hemolysin and control the expression of the pathogenicity island of α -ketoglutarate. Furthermore, fnr mutant strains were unable to invade cells of kidney and bladder, and to colonize the urinary tract of 6 weeks-old mice. FNR was also able to control the stages of infection of NMEC 56. The fnr mutant lost its ability to cause bacteremia, grow in cerebrospinal fluid, cause disease in 5 days old rats. Deletion of fnr in APEC O1 resulted in decreased expression of genes corresponding to the plasmid encoded OmpT protein, type I fimbriae and autotransporter AatA. The main contribution of this work was to demonstrate that FNR regulates expression of important virulence factors of ExPEC strains (UPEC, NMEC and APEC), which is important for the establishment of infection by these strains. In this work, we found that, besides the already known function in regulating genes involved in maintaining an anaerobic environment, FNR also acts in the control of virulenceassociated genes of ExPEC strains, reflecting the ability of these strains to cause disease.

E. coli isoladas de lesões de celulite aviária em frangos de corte produzem uma citotoxina, denominada ECVF (E. coli Vacuolating Factor), que causa intensa vacuolização citoplasmática em células aviárias, mas não em células mamárias. A importância de ECVF na patogenia da celulite foi avaliada neste estudo. ECVF purificado foi inoculado subcutaneamente em frangos de corte, e induziu sinais de inflamação nos tecidos subcutâneo, adiposo e conjuntivo. Em ensaios de citotoxicidade, foi verificado que ECVF induz alterações citoplasmáticas e nucleares que podem afetar diretamente o metabolismo celular, entre elas condensação da cromatina e fragmentação nuclear, intensa vacuolização citoplasmática e desorganização do citoesqueleto, conduzindo à apoptose. Também foi verificada interação de ECVF com proteínas de células aviárias, em detrimento das de células de mamíferos, sugerindo uma especificidade da toxina a este tipo celular. Nossos resultados, apoiados por dados de estudos anteriores, permitem sugerir um importante papel de ECVF na patogenia da celulite aviária. / E. coli isolated from cellulitis lesions in broiler chickens produce a citotoxin, called ECVF (Escherichia coli Vacuolating Factor), which causes intense cytoplasm vacuolization in avian cells, but not in mammalian cells. The importance of ECVF in the pathogenesis of avian cellulitis was assessed in this study. Purified ECVF was inoculated subcutaneously in broiler chickens, and induced signs of inflammation on subcutaneous, adipose and connective tissues. In citotoxicity assays, we verified that ECVF induced cytoplasmic and nuclear alterations, which can affect cellular metabolism directly, such as chromatin condensation and nuclear fragmentation, intense cytoplasm vacuolization, and disorganization of cytoskeleton, leading to apoptosis. It was also verified the interaction of ECVF with proteins of avian cells, instead of those from mammalian cells, suggesting the specificity of this toxin to this cells. Our results, supported by data from previous studies, suggest an important role of ECVF in the pathogenesis of avian cellulitis.

O cancro cítrico, causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), é um dos mais graves problemas fitossanitário da citricultura brasileira. Com a introdução da lagarta minadora dos citros (Phyllocnistis citrella [LMC]), houve um aumento drástico do número de focos do cancro cítrico, além da mudança do padrão espacial de fortemente agregado para moderadamente agregado e ao acaso. Foram avaliados: (1) suscetibilidade de três condições foliares: folha intacta, ferimento mecânico e injúria de LMC nas fases ovo, 1º ínstar, 3º ínstar e pupa, inoculados em diferentes concentrações de Xac (101, 102, 104 e 106 ufc/ml); (2) período de suscetibilidade da folha intacta, do ferimento mecânico e injúria de LMC inoculados a 106 ufc/ml; e (3) efeito da temperatura (12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 e 42°C) e duração do molhamento foliar (0, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h) em folhas sem ferimento inoculadas a 106 ufc/ml. A concentração mínima de inóculo para causar sintomas da doença em folha intacta, injúria de LMC fase ovo e 1º ínstar foi de 104 ufc/ml; em ferimento mecânico e injúria de LMC fase 3º ínstar e pupa, 102 ufc/ml. Injúria da fase pupa resultou em grande severidade do que nos demais tratamentos a 106 ufc/ml (2 vezes maior do que em folha intacta).O período de suscetibilidade da injúria de LMC foi seis vezes mais longo do que do ferimento mecânico e a máxima suscetibilidade foi três vezes maior que em folha intacta. A LMC está relacionada com o aumento do dano que expõem mesofilo foliar à infecção direta de Xac, aumentando a suscetibilidade da folha por longo período. A faixa de temperatura ótima para o desenvolvimento do cancro cítrico foi de 25-35ºC. Entretanto, a severidade foi mais alta entre 30-35ºC. Sintomas de cancro não desenvolveram a 42ºC e na ausência de molhamento foliar. O efeito da temperatura foi maior do que a duração do molhamento foliar. A mínima duração de molhamento para infecção de Xac foi menor que 4 horas. / Asiatic citrus canker, caused by X. axonopodispv.citri (Xac), is one of the most serious phytosanitary problems in Brazilian citrus crops.The introduction of the citrus leafminer (Phyllocnistis citrella [CLM]), has resulted in an increase in the number of disease foci and has changed the spatial pattern of citrus canker symptomatic trees from strong aggregation to intermediate aggregation and random patterns. We evaluated: (1) susceptibility of three distinct leaf condition: intact leaves, mechanical wounding, and injury caused by CLM at the egg stage, 1st instar, 3rd instar, and pupal stage, inoculated at different concentration of Xac (101, 102, 104, and 106 cfu/ml); (2) susceptibility period of intact leaves, mechanical wounding, and CLM injury inoculated at 106 ufc/ml; and (3) effect of temperature (12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 42°C) and leaf wetness durations (0, 4, 8, 12, 16, 20, and 24 h) on unwounded leaves inoculated at 106 ufc/ml. The minimum inoculum concentration to cause symptom development in intact leaves, CLM injury at the egg stage and 1st instar was 104 cfu/ml; in mechanically wounded leaves and CLM injuries at the 3rd instar and pupa stage, 102 cfu/ml. The injuries from pupa stage resulted in greater disease severity than other treatments at 106 cfu/ml (two times higher than in the intact leaf). Susceptibility period of CLM injury was six time longer than mechanical wounding and maximum observed susceptibility was three times higher than intact leaf. CLM is related to the amount of damage that exposes mesophyll cells to direct Xac infection, increasing the susceptibility of leaf for long period. Optimal temperature for development of citrus canker was 25–35°C. However, disease severity was highest in the range 30–35°C. Symptoms did not develop at 42°C and zero hour of leaf wetness duration. Effect of temperature was .greater than leaf wetness duration. The minimum wetness duration for Xac infection was as short as 4 h.