Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Lourdes Campaner dos Santos / Banca: Nara Amélia de Rosa Farias / Banca: Maria Izabel Souza Camargo / Banca: Ary Fernandes Junior / Resumo: O carrapato Rhipicephalus sanguineus é a espécie de maior disseminação mundial e está comprovadamente envolvido na transmissão de agentes patogênicos. Estudos têm demonstrado aquisição de resistência a alguns dos princípios ativos usados em formulações comerciais de acaricidas. Neste trabalho, utilizando-se extrato etanólico 70% (PAEtOH70%) e óleo essencial (OE) de partes aéreas de Tagetes patula, avaliamos a ação carrapaticida in vitro contra os diversos estágios de desenvolvimento no ciclo de vida do ixodídeo R. sanguineus. Na concentração de 50,0 mg/mL, PAEtOH70% diminuiu a oviposição em 21,5%, eliminou 99,8% das larvas e destruiu 96,5% dos ovos. O OE a 4% inibiu a oviposição em 33,94%. Apesar da baixa taxa de mortalidade de fêmeas adultas ingurgitadas, análises microscópicas da estrutura dos ovários revelaram importantes alterações morfológicas na estrutura dos ovócitos II-V e células do pedicelo, interferindo diretamente na embriogênese normal, prejudicando ou inviabilizando a formação de larvas sadias. Para garantir o uso seguro em uma possível formulação, avaliamos a atividade citotóxica de PAEtOH70% e do OE frente a macrófagos murinos, obtendo-se IC50 de 210,9 µg/mL e IC50 de 0,04%, respectivamente. O extrato foi caracterizado fitoquimicamente por HPLC-EM, tendo sido identificados 12 favonóides O-glicosilados. O óleo foi caracterizado fitoquimicamente por CG-EM, revelando a presença de 55 compostos, sendo os principais o 4-vinil-guaiacol e o gama-terpineno. Quanto aos ensaios antimicrobianos, o extrato PAEtOH70% não inibiu o crescimento de B. bassiana e M. anisopliae (CIMs > 1250,0 µg/mL) e apresentou a melhor ação contra T. rubrum e T. rubrum (FOC) (312,5 e 468,75 µg/mL, respectivamente) / Abstract: The tick Rhipicephalus sanguineus is the species most worldwide spread and is proven to be involved in the transmission of pathogens. Studies have shown acquisition of resistance to some of the active ingredients used in commercial formulations of acaricides. In this study, using 70% ethanol extract (PAEtOH70%) and essential oil (EO) from aerial parts of Tagetes patula, we evaluated the in vitro acaricide action against various developmental stages in the life cycle of ixodid R. sanguineus. At the concentration of 50.0 mg/mL, PAEtOH70% decreased the oviposition by 21.5%, eliminated 99.8% of the larvae and destroyed 96.5% of the eggs. The OE 4% inhibited oviposition in 33.94%. Despite the low mortality rate of engorged adult females, microscopic analysis of the structure of the ovaries showed significant morphological changes in the structure of II-V oocytes and cells of pedicel, interfering directly in normal embryogenesis, impairing or invalidating the formation of healthy larvae. To ensure safe use in a possible formulation, we evaluated the cytotoxic activity of PAEtOH70% and OE against murine macrophages, yielding IC50 of 210.9 mg/mL and IC50 of 0.04%, respectively. The extract was phytochemically characterized by HPLC-MS and was identified 12 flavonoids O-glycosylated. The oil was phytochemically characterized by GC-MS, revealing the presence of 55 compounds, the main ones being the 4-vinyl guaiacol and gamma-terpinene. Regarding antimicrobial assays, the extract PAEtOH70% did not inhibit growth of B. bassiana and M. anisopliae (MICs > 1250.0 mg/mL) and showed the best activity against T. rubrum and T. rubrum (FOC) (312.5 and 468.75 mg/mL, respectively) / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T21:29:13Z No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T21:32:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-21T21:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2009_JulianaAlvesParente_Parte1.pdf: 4665446 bytes, checksum: 7b742076f0f6642f386f8fef149a7f67 (MD5) 2009_JulianaAlvesParente_Parte2.pdf: 4205180 bytes, checksum: 194103bc54f6c42a2c3959e9ec4c2af8 (MD5) / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo patogênico humano, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). P. brasiliensis apresenta dimorfismo térmico, apresentando-se sob a forma miceliana a temperaturas inferiores a 28 ºC e sob a forma leveduriforme no hospedeiro humano e em temperaturas superiores à 28 ºC. Proteases são enzimas que clivam proteínas e desempenham funções como o processamento intracelular e a clivagem de proteínas do meio extracelular para obtenção de nitrogênio. Em microrganismos patogênicos proteases podem atuar como fatores de virulência, clivando proteínas do hospedeiro para facilitar a penetração pelos tecidos. No presente trabalho, foi realizado o rastreamento e identificação de proteases em banco de dados de ESTs oriundas de células leveduriformes de P. brasiliensis. Foram detectadas 53 ORFs codificantes para proteases. As seqüências preditas de aminoácidos foram obtidas e classificadas por homologia em banco de dados de proteases, sendo agrupadas em 3 aspartil, 8 cisteíno proteases, 10 metalo-, 10 serino proteases e 22 proteínas relacionadas às subunidades proteassomais. O presente trabalho inclui também o rastreamento e a identificação de ESTs codificantes de proteínas relacionadas à síntese e ao processamento de proteínas em banco de dados de ESTs oriundas de células de P. brasiliensis durante a transição dimórfica de micélio para levedura por 22 horas. Foram identificadas 200 ORFs apresentando homologia com seqüências codificantes a proteínas relacionadas aos processos de síntese e processamento de proteínas. Destas, 16 ORFs codificam para genes não descritos anteriormente em P. brasiliensis. Foi possível identificar ESTs que compõem subunidades ribossomais, assim como fatores de iniciação transcricional induzidos durante a transição dimórfica, sugerindo um aumento no nível de proteínas sintetizadas durante este processo. Também foram identificadas ESTs codificantes para chaperonas, para glicosiltransferases e para proteínas relacionadas com a aceleração do enovelamento de proteínas, sugerindo aumento da produção e do controle de qualidade durante a transição dimórfica de micélio para células leveduriformes. Alguns genes codificantes para proteases são induzidos após a indução da transição termodimórfica: uma aspartil protease A01, uma lon protease S16 e uma metaloprotease M28, o que sugere aumento dos processos de controle de qualidade das proteínas produzidas e da aquisição de aminoácidos do meio extracelular. Uma serino protease S08 foi caracterizada. As seqüências de nucleotídeos (Pbsp) e aminoácidos (PbSP) foram obtidas e analisadas. O cDNA codificante para Pbsp foi clonado em vetor de expressão para sistema bacteriano e a proteína recombinante foi utilizada para obtenção de anticorpo policlonal em camundongos. O anticorpo policlonal reconheceu especificamente uma espécie protéica de 66 kDa em extrato protéico e em sobrenadante de cultura de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo que PbSP seja uma molécula secretada. Ensaios de deglicosilação in vitro com endoglicosidase H demonstraram que PbSP é uma molécula N-glicosilada. PbSP tem seu nível de expressão induzido durante a privação de nitrogênio tanto em extrato protéico quanto em sobrenadante de cultura de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo que PbSP tenha importância na captação de nitrogênio. A expressão de Pbsp é aumentada durante a internalização de células leveduriformes por macrófagos murinos, sugerindo a importância do produto deste gene na resposta adaptativa de P. brasiliensis à internalização por macrófagos. A interação de PbSP com moléculas de P. brasiliensis foi avaliada utilizando o sistema de duplo-híbrido em Saccharomyces cerevisiae. Proteínas relacionadas com enovelamento protéico, controle de qualidade e destinação de proteínas, além de uma proteína de parede celular de P. brasiliensis foram identificadas. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides brasiliensis is a human pathogenic fungus, the causative agent of paracoccidioidomycose (PCM). P. brasiliensis is a thermodimorphic fungus presents as mycelium form in temperatures below 28º C and as yeast form in the human host and in temperatures above 28ºC. Proteases are enzymes that cleave proteins and are related to the intracellular protein processing and cleavage of extracellular proteins to nitrogen acquisition. In pathogenic microorganisms proteases could act as virulence factors by cleaving host proteins facilitating the invasion process in the host tissues. The present work identified proteases in ESTs database constructed with cDNAs sequences of P. brasiliensis yeast form. It was detected 53 ORFs encoding proteases. The predicted amino acids sequences were obtained and classified by homology in protease database: 3 sequences were classified as aspartil, 8 as cysteine, 10 as metallo-, 10 as serino and 22 proteins related to proteasomal subunits. The present work also includes the identification of ESTs encoding proteins related to protein synthesis and processing in ESTs database of P. brasiliensis during transition from mycelium to yeast cells. It was identified 200 ORFs presenting homology to sequences encoding proteins related to protein synthesis and processing. Sixteen ORFs were described as novel genes of P. brasiliensis. It was identified ESTs related to ribosomal subunits and initiation transcription factors, suggesting intense synthesis of new ribosome particles, affecting the rate of protein synthesis. It was identified ESTs encoding chaperones, glycosiltransferases and proteins related to acceleration of protein folding, suggesting high protein production and high quality control in the protein production during transition from mycelium to yeast cells in P. brasiliensis. Transcripts encoding proteases were induced in P. brasiliensis during transition from mycelium to yeast: an aspartil protease A01, a lon protease S16 and a metaloprotease M28. The higher expression of these genes during transition in P. brasiliensis suggests high control quality of proteins and nitrogen acquisition. A serine protease S08 was characterized. The cDNA (Pbsp) and deduced amino acids (PbSP) sequences were obtained and analyzed. Pbsp was cloned into expression vector in bacterial system and used to generate polyclonal antibody in mice. The polyclonal antibody recognized specifically a 66 kDa protein species in protein extracts and culture supernatants of P. brasiliensis yeast cells, suggesting PbSP is a secreted molecule. In vitro deglycosylation assays with endoglycosidase H demonstrated that PbSP is a N-glycosylated molecule. PbSP is increased during nitrogen starvation both in protein extracts and cultures supernatants of P. brasiliensis yeast cells, suggesting PbSP is important in nitrogen acquisition. Pbsp expression was induced during internalization of P. brasiliensis yeast cells by murine macrophages, suggesting the Pbsp product is important in the P. brasiliensis adaptative response to macrophage internalization. PbSP interaction with P. brasiliensis proteins was evaluated by two-hybrid assay in Saccharomyces cerevisiae. Proteins related to protein folding, quality control of translation, protein destination and a cell wall protein of P. brasiliensis were identified.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4463_1.pdf: 666226 bytes, checksum: 57046c022a8021530a9e644b9ad46131 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / O uso de produtos químicos no combate a doenças causadas por fungos fitopatogênicos, além de ter um alto custo, ocasiona problemas ao meio ambiente e ao homem, determinando graves danos à biota natural do solo, além de contribuir para o desenvolvimento da resistência microbiana. O controle biológico, utilizando actinomicetos produtores de antibióticos, é uma alternativa para estes problemas. Avaliou-se in vitro o potencial de antagonismo de actinomicetos, pertencentes a Coleção de Culturas do Departamento de Antibióticos da UFPE, com reconhecida atividade antifúngica, contra dois isolados de Botrytis cinerea, patógeno da videira (Vitis sp). A atividade antifúngica foi determinada pelos métodos do bloco de gelose, difusão em disco de papel e unidade de Waksman. Das 63 linhagens testadas, 19 apresentaram atividade, pelo teste do bloco de gelose. Destas, cinco mostraram halos iguais ou superiores a 40 mm de diâmetro para pelo menos um dos isolados e foram selecionadas para o teste de difusão em disco, em meios convencionais de produção de antibióticos (MPE e M-1) e meios alternativos utilizando resíduos das indústrias do milho (milhocina) e da cerveja (cevada). Foram formulados cinco meios alternativos, contendo diferentes concentrações de nitrogênio. As linhagens DAUFPE-8631B e DAUFPE- 11470, destacaram-se nos meios convencionais, apresentando os maiores halos de inibição nos tempos de 96 e 72 horas de fermentação, respectivamente e foram testadas com os meios alternativos. Taxonomicamente, as linhagens pertencem ao gênero Streptomyces. Os meios à base de milhocina mostraram melhores resultados, destacandose o meio Mi-2, (concentração de nitrogênio igual a do meio M1). O estudo fitoquímico do extrato bruto da linhagem DAUFPE-11470 demonstrou a predominância de fenóis, flavononas, flavonóis, xantonas e bases quaternárias. Os resultados obtidos permitem concluir que as linhagens DAUFPE-8631-B e DAUFPE-11470 de Streptomyces, são potencialmente utilizáveis no controle biológico de Botrytis cinerea, e que a milhocina pode substituir a farinha de soja como fonte de nitrogênio nos meios de produção, constituindo uma alternativa viável, na eliminação dos problemas causados pelo óleo da soja, na extração do princípio ativo

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-03-09T17:23:42Z No. of bitstreams: 1 2014_TaynáCristinadosSantos_Parcial.pdf: 1534538 bytes, checksum: f7c389f5eed641be4941edcc4bfa3c82 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-03-13T20:11:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_TaynáCristinadosSantos_Parcial.pdf: 1534538 bytes, checksum: f7c389f5eed641be4941edcc4bfa3c82 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T20:11:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_TaynáCristinadosSantos_Parcial.pdf: 1534538 bytes, checksum: f7c389f5eed641be4941edcc4bfa3c82 (MD5) / O fungo basidiomiceto Cryptococcus neoformans se trata de um patógeno oportunista, que geralmente acomete pacientes imunodeprimidos ou imunossuprimidos, causando a criptocococose. Esta doença é cosmopolita e pode ser fatal se não tratada. Os genes velvet VEA e VELC codificam uma família de proteínas conservadas em ascomicetos e basidiomicietos, tais proteínas foram descobertas em meados de 1960 em Aspergillus nidulans, onde foi descoberto o primeiro gene velvet, VEA. Os fenótipos apresentados por mutantes de VEA são os mais diversos nos fungos filamentosos nos quais esse gene foi estudado, sendo que os principais observados foram defeitos na parede celular e no desenvolvimento sexual, redução da produção de micotoxinas e da virulência. Assim, VEA é um fator transcricional conservado que regula diferentes respostas aos estímulos ambientais. Mais recentemente, foi descoberto o gene VELC e o mesmo foi recentemente caracterizado em Aspergillus nidulans, A. fumigatus e Fusarium oxysporum. Os fenótipos resultantes da deleção de VELC são sutis e indicam que o mesmo é um regulador positivo do desenvolvimento sexual. A análise in silico de VEA e VELC de C. neoformans revela que esses genes são conservados. Foi realizada a construção dos cassetes de deleção para cada um dos genes, que foram transformados separadamente em células haploides de KN99a/α por meio de biobalística para a obtenção dos mutantes veAΔ e velCΔ de C. neoformans. Os genes foram reconstituídos para a confirmação do fenótipo observado. Não foram observadas diferenças de veAαΔ e velCαΔ sobre os fatores de virulência clássicos de C. neoformans quando comparados com a cepa selvagem (KN99α), porém os mutantes veAΔ apresentaram o fenótipo de hiperfilamentação quando submetidos ao acasalamento e insensibilidade à luz branca nas mesmas condições. Entretanto, os mutantes velCΔ não apresentaram alteração no acasalamento, exceto, uma leve insensibilidade à luz branca nesta condição. A fim de verificar as interações entre as proteínas velvets de C. neoformans, experimentos de duplo-híbrido estão sendo conduzidos em Saccharomyces cerevisiae a fim de verificar as interações entre os velvets de C. neoformans. Os resultados obtidos indicam que VEA e VELC agem como reguladores negativos do desenvolvimento sexual em C. neoformans não afetando os principais fatores de virulência deste patógeno. Os dados deste trabalho são o início para o esclarecimento dos papéis de VEA e VELC na biologia de C. neoformans. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The basidiomycete fungus Cryptococcus neoformans is an opportunistic organism which commonly infects immunocompromised patients causing cryptococcosis. This is a comospolite disease and can be fatal if untreated. VEA and VELC genes codifies the conserved family of velvet proteins and this family is conserved in ascomycetes and basidiomycetes, such proteins were characterized in the mid 1960’s in Aspergillus nidulans, when VEA was discovered. VEA null mutants phenotypes display defects in sexual development and decreased production of mycotoxins in the filamentous fungi in which this gene was studied. VEA null mutants show cell wall defects and reduced virulence, indicating that VEA is a conserved transcriptional factor that regulates many responses to environmental cues. More recently, VELC was characterized in Aspergillus nidulans, A. fumigatus and Fusarium oxysporum. The phenotypes of the VELC null mutants are subtle and indicate that this gene is a positive regulator of sexual development. In silico analysis shows that both genes are conserved in C. neoformans. Deletion cassettes were constructed for each gene and separately transformed in KN99a/α haploid yeasts to obtain veAΔ and velCΔ strains. Then, the strains were complemented with the wild-type gene to confirm the phenotype. No differences were found in veAαΔ and velCαΔ on classical virulence factors of C. neoformans when compared to the wild-type strain (KN99α), but the veAΔ mutants showed hiperfilamentation when mating was performed in the dark and insensibility to white light when crossed. However, velCΔ crosses showed a slight insensitivity to white light. In order to identify the interactions among the velvets of C. neoformans, yeast two-hybrid assays are being conducted in Saccharomyces cerevisiae due to verify the protein-protein interactions between C. neeoformans velvet proteins. The results indicate that VEA and VELC act as negative regulators of sexual development in C. neoformans not affecting the main virulence traits of this pathogen. Data from this work are beginning to clarify the roles of VEA and VELC on the biology of C. neoformans.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-19T17:03:17Z No. of bitstreams: 1 2017_AngelinaMariaMoreschiBasso.pdf: 8664082 bytes, checksum: df2395cb8590c7b00e379fcfd9160aba (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-05-19T21:46:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AngelinaMariaMoreschiBasso.pdf: 8664082 bytes, checksum: df2395cb8590c7b00e379fcfd9160aba (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T21:46:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AngelinaMariaMoreschiBasso.pdf: 8664082 bytes, checksum: df2395cb8590c7b00e379fcfd9160aba (MD5) Previous issue date: 2017-05-19 / Os fungos patogênicos oportunistas são responsáveis pela maior parte das infecções fúngicas nos seres humanos. Nos últimos anos, foi observado um aumento considerável na incidência de infecções causadas por esses organismos, principalmente em pacientes imunossuprimidos (portadores de HIV), transplantados ou em tratamento quimioterápico. Atualmente, a medicina está proporcionando um aumento na sobrevida desses pacientes, contudo a taxa de mortalidade continua elevada. A resposta imunitária é essencial para a proteção do hospedeiro durante o curso destas infecções e a ativação imunológica adequada é fundamental para controlar o patógeno. Neste contexto, a utilização de estimuladores de ativação é uma estratégia terapêutica interessante, uma vez que possibilita o controle eficiente destes fungos. Os polissacarídeos são importantes indutores da resposta imune e podem se ligar aos receptores de reconhecimento padrão. Além disso estas moléculas podem ativar a mecanismos da resposta imunológica, como estimular a produção de citocinas pró- inflamatórias e da explosão respiratória, aumentando assim a eficiência da atividade microbicida. Os polissacarídeos são constituintes da parede celular de fungos, leveduras, bactérias e plantas. Os cogumelos são fontes importantes de polissacarídeos que apresentam diversas propriedades biologicamente ativas, principalmente aquele relacionado a atividade imunomodulatória, sendo capazes de modular a ativação da imunidade inata e adaptativa. Assim, estes carboidratos podem ser diferenciados de acordo com as diversas características estruturais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi selecionar e caracterizar os polissacarídeos provenientes dos cogumelos Ganoderma lucidum e Auricularia auricula, e avaliar sua capacidade imunomodulatória e a resposta imunitária do hospedeiro infectado pelo fungo patogênico Cryptococcus neoformans. Os resultados indicaram que ambas as frações (solúvel e insolúvel) de polissacarídicas extraídas dos cogumelos avaliados demonstraram uma composição monossacarídica similar (majoritariamente glicose na fração insolúvel e galactose na fração solúvel) e da identificação de beta glucanas nas frações solúveis e insolúveis de Auricularia auricula. Adicionalmente, a avaliação das frações dos cogumelos analisados não apresentou citotoxicidade, frações LPS free, uma atividade imunomodulatória em células dendríticas e macrófagos M1 e M2 por análise pela ligação aos receptores Dectina-1, TLR2 e TLR4). Ainda foi observado a secreção de citocinas (TNF-α, IL-1β, IL-10), de óxido nítrico e de espécies reativas de oxigênio. Assim como a modulação da imunidade adaptativa (pelo aumento da expressão de CD80, CD86 e MHCII) utilizando técnicas como ELISA e citometria de fluxo. Todavia, os ensaios in vitro referente à atividade microbicida das frações na infecção fúngica e também assim as análises de genes relacionados à defesa contra o patógeno assim como a avaliação da sobrevida in vivo indicaram que somente polissacarídeos da fração insolúvel de Auricularia auricula demonstraram serem promissores como adjuvantes para potencializar a defesa da imunidade inata referente à infecção por Cryptococcus neoformans. / Opportunistic pathogenic fungi are responsible for the majorist of human infection. In the last years, it was observed an increase in the incidence of infections by these organism, mainly in patients exhibiting immunosuppressed patients (HIV), transplanted or in chemotherapy treatment. Currently, medicine advances are providing to provide an increase in the survival of these patients although the mortality rate is still high. The immune response is essential to protect the host during these infections and the immune adequate activation is critical to pathogen control. In this context, immune cell activation stimulators is a therapeutic strategy promising, since it allows fungi efficient control. The polysaccharides are important immune response inductors and may receptors bind of pattern recognition receptors. Moreover, these molecules can activate various functions pro-inflammatory cytokine production stimulate and respiratory burst, thereby improving microbicide efficient activity. The polysaccharide are constituents of fungi bacteria and plants cell wall. The mushrooms are important sources of polysaccharides showing several active biological properties, mainly innate and adaptive immunomodulatory activity. These carbohydrates can be differentiated according to structural diversity. Then, the objective of this study was to select and to characterize polysaccharides from Ganoderma lucidum and Auricularia auricula mushrooms as well as to evaluate the host immune response infected by fungus pathogen Cryptococcus neoformans. The results showed that both fractions (soluble and insoluble) of polysaccharides obtained from Ganoderma lucidum and Auricularia auricula have similar monosaccharide composition (mainly glucose in insoluble fraction and galactose in soluble fraction) and beta-glucan in Auricularia auricula fractions. In addition, the assessment of insoluble fractions of the species analyzed showed acceptable cytotoxicity; free LPS molecules; immunomodulatory activity in dectin-1, TLR2 and TLR4 and macrophages by receptors ligation. Moreover, it was observed a production of TNF-α, IL-1β, IL- 10 cytokine as well as nitric oxide and species oxygen reactive production. In addition; an adaptive immune modulation with increase of CD80, CD86 and MHCII. Nevertheless, in vitro and in vivo fungal infection assays presented that only fraction insoluble obtained from Auricularia auricula were promising adjuvants in innate immunity defense Cryptococcus neoformans infection.

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Fernanda Freitas Anibal / Banca: Luciana Simon Pereira Crott / Banca: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Cleni Mara Marzocchi Machado / Resumo: A esporotricose é uma infecção fúngica causada pelas espécies do complexo Sporothrix, incluindo Sporothrix schenckii sensu stricto. Os receptores de reconhecimento padrão (PRRs), pertencentes às células da resposta imune inata, reconhecem os padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). Uma classe de PRRs que tem sido associada ao reconhecimento de fungos é a dos receptores Nod-like (NLR). Após o reconhecimento de PAMPs, os receptores NLR family pyrin domain-containing 3 (NLRP3), em conjunto com a molécula adaptadora Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) e com a caspase-1, formam o inflamassoma NLRP3. Quando ativado, este complexo protéico promove a maturação das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e IL-18, que influenciam no desenvolvimento das respostas imune Th17 e Th1, respectivamente. O inflamassoma NLRP3 também é responsável pela piroptose, uma morte celular inflamatória regulada por caspase-1. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel do inflamassoma NLRP3 em modelo de infecção sistêmica por S. schenckii, utilizando um camundongo selvagem (WT) e três diferentes camundongos knockout (KO): NLRP3-/-, ASC-/- e Casp-1-/-. Todos os animais KO foram mais suscetíveis que os WT na infecção por S. schenckii. A ativação do inflamassoma NLRP3 foi essencial para a liberação ex vivo de NO, IL-1β, IL-17, IL-18, mas não para IFN-γ. Além disso, S. schenckii desencadeou maior expressão de caspase-1 ativa e maior porc... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sporotrichosis is a mycosis caused by fungi from the Sporothrix schenckii species complex, whose prototypical member is Sporothrix schenckii sensu stricto. Pattern recognition receptors (PRRs) recognize and respond to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) and shape the following adaptive immune response. A family of PRRs most frequently associated to fungal recognition is the nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor (NLR). After recognition of a PAMP, NLR family pyrin domain-containing 3 (NLRP3) binds to apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain (ASC) and caspase-1 to form the NLRP3 inflammasome. When activated, this complex promotes maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1β and IL-18 that influence the development of the Th17 and Th1 immune responses, respectively. In addition, the NLRP3 inflammassome is responsible for pyroptosis, a highly inflammatory cell death regulated by caspase-1. In this work, we aimed to evaluate the role of the NLRP3 inflammasome to the outcome of the S. schenckii infection using a wild-type mice (WT) and three different knockout mice (KO): NLRP3-/-, ASC-/-, and Casp-1 -/- . All the KO mice were more susceptible to the infection than the WT during the S. schenckii infection. Furthermore, the NLRP3 inflammasome seems to be critical to the ex vivo release of NO, IL-1β, IL-18, and IL-17, but not IFN-γ. The S. schenckii infection led to increased activation of caspase-1 and cell death by pyroptosis in WT mice. Also, a role for the inflammasome in shaping the adaptive immune response was suggested by lower frequencies of type 17 helper T (Th17) and Th1/Th17 cells in S. schenckii-infected KO mice. On the other hand, absence of any of the inflammasome components resulted in increased frequency of cytotoxic T cells in this infection... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Ângela Maria Victoriano de Campos Soares / Coorientador: Ana Paula Bordon-Graciani / Banca: Silvio Luiz de Oliveira / Banca: Carlos Artério Sorgi / Banca: Sandra de Moraes Gimenes Bosco / Banca: Dulce Helena Jardim Constantino / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. O estabelecimento da paracoccidioidomicose-infecção ou paracoccidioidomicose-doença depende das interações parasita-hospedeiro que podem resultar em uma resposta imune mais ou menos eficaz por parte deste último. Embora vários dos mecanismos decorrentes dessa interação já estejam descritos, estudos sobre a participação de outros fatores potenciais podem ampliar sobremaneira o nosso entendimento sobre a imunopatogênese da PCM. Nesse sentido, os eicosanóides como as prostaglandinas (PGs) e leucotrienos (LTs) devem ser avaliados. Em trabalhos anteriores detectamos que o fungo induz a produção de PGs e LTs por monócitos humanos que, de uma forma autócrina, suprimem ou aumentam respectivamente, as atividades antifúngicas dessas células. No entanto, os estudos têm mostrado que além de induzir a produção de eicosanóides, os próprios fungos podem produzir esses mediadores, revelando um mecanismo de virulência que tem potencialmente grandes implicações para o entendimento dos mecanismos das infecções fúngicas. Baseados nesses estudos detectamos que o P. brasiliensis produz tanto PGs como LTs, usando fontes endógenas e exógenas de ácido araquidônico, e que ambos são importantes para a manutenção da viabilidade do fungo. Adicionalmente, os resultados sugeriram que o fungo utiliza as vias metabólicas da ciclooxigenase (COX) para a produção de PGs e da lipoxigenase (5-LO) para LTs. No presente trabalho, aprofundamos esses estudos objetivando avaliar se o fungo produz outras classes de eicosanóides, além da PGE2 e LTB4, se as PGs e LTs liberados pelo P. brasiliensis podem ser considerados como PGE2 e LTB4 autênticos, isto é semelhantes aos detectados para os mamíferos, assim como estabelecer de uma forma definitiva se a COX e a 5-LO são as vias metabólicas utilizadas ... / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The establishment of paracoccidioidomycosis-infection or the evolution to paracoccidioidomycosis-disease in its more or less severe forms, primarily depends on complex host-parasite interaction, in which immune response mechanisms play an essential role. While many of these mechanisms have been elucidated, studies on the participation of other potential factors can greatly expand our understanding of PCM immunopathogenesis. Accordingly, eicosanoids such as prostaglandins (PGs) and leukotrienes (LTs) should be evaluated. In previous studies we found that the fungus induces the production of prostaglandins and leukotrienes by human monocytes that in an autocrine way suppress and increase, respectively, the antifungal activities of these cells. However, studies have shown that in addition to inducing the production of eicosanoids, fungi themselves can produce these mediators, showing a mechanism for virulence that has potentially important implications for understanding the mechanisms of fungal pathogenicity. Based on these studies, we found that P. brasiliensis produces both PGs and LTs, using exogenous and endogenous sources of arachidonic acid and that both are important for fungus viability. Additionally, the results suggested that the fungus uses cyclooxygenase (COX) and lipoxygenase (5-LO) metabolic pathways for PGs and LTs production, respectively. Here, we profound these studies evaluating whether PGs and LTs released by P. brasiliensis can be considered as authentic LTB4 and PGE2, i.e. similar to those detected for mammals. We also asked whether the fungus, in addition to PGE2 and LTB4, produces other classes of eicosanoids. Finally, we intended to definitively determine whether COX and 5-LO are the metabolic pathways used for this production. We found that fungus PGE2 and LTB4 ... / Doutor

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-04-06T16:31:05Z No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-04-29T18:09:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-29T18:09:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_LauraMariaBarbosaGonçalves.pdf: 3250806 bytes, checksum: 090e9b400e068bd5c145dc1ddc1e6f71 (MD5) / Paracoccidioides spp. é um fungo termodimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM). Durante o processo de infecção Paracoccidioides spp. encontra ambientes com diferentes disponibilidades de micronutrientes essenciais como cobre, por exemplo. A obtenção de micronutrientes no hospedeiro é mecanismo crucial de estratégia adaptativa deste patógeno. Neste sentido, a identificação de proteínas relacionadas com captação/homeostase de metais traços, durante a infecção é importante para se obter um melhor entendimento dos mecanismos que compõem a resposta adaptativa do fungo. No presente estudo a técnica de eletroforese bidimensional (2-DE) e Nano-ESI-UPLC-MSE foi utilizada como ferramenta proteômica a fim de investigar o perfil de expressão de proteínas da forma de levedura de P. lutzii após 24 e 48h de privação de cobre. Foram identificadas 68 proteínas/isoformas por eletroforese 2-DE, sendo 42 com expressão aumentada e 26 com expressão diminuída em condições de depleção de cobre. Através do Nano-ESI-UPLC-MSE um total de 366 proteínas foram identificadas, sendo 232 induzidas e 134 reprimidas. As proteínas de P. lutzii que se apresentaram diferencialmente reguladas estão envolvidas em processos celulares que incluem metabolismo, energia, síntese de proteínas, defesa e virulência. As proteínas envolvidas no metabolismo de aminoácidos e que apresentaram expressão aumentada, são aquelas relacionadas à degradação de aminoácidos. Estas proteínas provavelmente foram induzidas para proporcionar precursores ao ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). O aumento da expressão de enzimas da via glicolítica também foi observado. Isto provavelmente ocorreu como forma de gerar ATP e intermediários metabólicos necessários para a manutenção do fungo sob condições de privação de cobre. Os dados gerados evidenciaram ainda uma indução em enzimas da via glicolítica, ciclo do TCA, via das pentoses fosfato, ciclo do metilcitrato e metabolismo dos lipídeos. Em condições de privação de cobre o metabolismo aeróbio é favorecido, o que provavelmente justifica o aumento da expressão de enzimas destas vias. Em conclusão, os dados do presente estudo indicam que a remodelação metabólica observada em condições de privação de cobre possivelmente é um mecanismo de sobrevivência do patógeno no ambiente hostil do hospedeiro. / Paracoccidioides spp. is a termodimorphic fungus, etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM). During the infection process, Paracoccidioides spp. faces environments with different availability of essential micronutrients such as copper, for example. The micronutrients obtainment in the host is a crucial mechanism of adaptive strategy for this host. Hence, the identification of proteins related to uptake/homeostasis of trace metals during infection is important for a better understanding of the mechanisms that makeup the fungus adaptive response. In the present study, the bidimensional electrophoresis (2-DE) and Nano-ESI-UPLC-MSE were used as proteomic tools in order to investigate the protein expression profile of P. lutzii in yeast form after 24 and 48h of copper deprivation. 68 proteins/isoforms were identified by 2-D analysis, which 42 were upregulated and 26 down regulated in copper depletion conditions. Through Nano-ESI-UPLC-MSE technique, 366 proteins were identified, 232 of them were induced and 134 repressed. P. lutzii proteins differentially regulated are involved in cellular processes including metabolism, energy, protein synthesis, defense and virulence. Proteins involved in the amino acid metabolism and showed an increased expression are related to amino acid degradation. These proteins were probably induced to provide precursors for tricarboxylic acid cycle (TAC). The increased expression of glycolytic pathway enzymes was observed. This probably happened as a way to generate ATP and metabolic intermediaries necessary for up keeping the fungus under copper deprivation conditions. The generated data pointed the induction of glycolytic pathway, tricarboxylic acid pathway, pentose phosphate pathway, methyl citrate pathway and lipid metabolism enzymes. The copper deprivation conditions favors the aerobic metabolism, which probably explains the increased expression of enzymes from the cited pathways. In conclusion, the presenting data indicate that the metabolic remodeling observed under copper deprivation conditions is possibly a survival mechanism of the pathogen under the host hostile environment.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-02-19T16:44:30Z No. of bitstreams: 1 2012_KellyPachecoCastro.pdf: 6686042 bytes, checksum: 8f72ba02f2bbdb1b7be575c47cce7792 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-02-26T15:15:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_KellyPachecoCastro.pdf: 6686042 bytes, checksum: 8f72ba02f2bbdb1b7be575c47cce7792 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-26T15:15:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_KellyPachecoCastro.pdf: 6686042 bytes, checksum: 8f72ba02f2bbdb1b7be575c47cce7792 (MD5) / O fungo Paracoccidioides é um patógeno humano com ampla distribuição na América Latina. A infecção se inicia por inalação de conídios e ou propágulos da forma miceliana que ao atingirem o pulmão do hospedeiro se diferenciam na fase leveduriforme. Embora o perfil de expressão gênica em Paracoccidioides venha sendo estudado, pouco se conhece sobre o padrão de expressão de genes desta espécie durante o processo infeccioso. Durante a infecção, patógenos regulam o metabolismo em resposta a diferentes tipos de estresse e quantidades variadas de nutrientes disponíveis no hospedeiro, presumivelmente permitindo a sua adaptação e sobrevivência. Os íons metálicos são elementos essenciais para a manutenção de importantes vias metabólicas, e por esse motivo, a capacidade de adquiri-los pelos patógenos, a partir de fontes disponíveis no organismo hospedeiro, é considerada um fator de virulência. O zinco é considerado um íon metálico essencial para todos os organismos, por ser requerido para transcrição, tradução, replicação, resistência ao estresse oxidativo e virulência. Transportadores para este íons são altamente expressos em condições de infecção por Paracoccidioides. O presente trabalho descreve a análise de genes e proteínas diferencialmente expressos em células leveduriformes de Paracoccidioides em condições que mimetizam a infecção. Foi realizada a comparação do perfil proteômico de Paracoccidioides durante a privação de zinco e na disponibilidade desse metal com o objetivo de se descrever os mecanismos utilizados pelo fungo para sobreviver no ambiente com baixa disponibilidade de zinco, mimetizando a condição encontrada pelo patógeno durante a infecção. Adicionalmente, foi realizada a análise transcricional de Paracoccidioides recuperado de animais infectados. Os dados revelaram que proteínas relacionadas com resposta ao estresse, metabolismo de aminoácidos, gliconeogênese e ciclo do metilcitrato foram regulados durante a privação de zinco. Os transcritos induzidos durante a infecção no pulmão foram aqueles predominantemente relacionados com metabolismo de lipídios, ácidos graxos e isoprenóides, metabolismo de aminoácidos, resposta ao estresse e virulência e metabolismo de carboidratos. A expressão diferencial dos genes e proteínas identificados foi confirmada por ensaios de qRT-PCR. Os dados gerados podem facilitar estudos funcionais de novos genes e proteínas os quais podem ser importantes para estratégias de sobrevivência e adaptação do Paracoccidioides no hospedeiro. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioides is a fungal human pathogen with a wide distribution in Latin America. The fungus causes infection through host inhalation of airborne propagules of the mycelial phase of the organism. These particles reach the lungs and differ in the yeast phase. Although gene expression in Paracoccidioides had been studied, little is known about the genome sequences expressed by this species during the infection process. During infection, pathogens regulate the metabolism in response to different types of stress and varying amounts of nutrients available in the host, presumably allowing its adaptation and survival. Metal ions are essential elements for the maintenance of important metabolic pathways, and therefore, the ability to acquire them by pathogens from sources available in the host organism, is considered a virulence factor. Zinc is considered a metal ion essential for all organisms, being required for transcription, translation, replication, resistance to oxidative stress and virulence. Here we describe the analysis of genes and proteins differentially expressed in yeast cells of Paracoccidioides under conditions mimicking of infection. It was performed a comparison of the proteomic profile of Paracoccidioides during zinc deprivation and in the availability of the metal in order to describe the mechanisms used by the fungus to survive in the environment with low vailability of zinc, mimicking the condition encountered by the pathogen during infection. Farther, was performed transcriptional analysis of Paracoccidioides recovered from lung of infected animals. The data revealed that proteins related to stress response, amino acid metabolism, gluconeogenesis and methylcitrate cycle were regulated during deprivation of zinc. The transcripts induced during infection in the lung were predominantly those related to lipid metabolism, fatty acid and isoprenoid, amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and stress response and virulence. The differential expression of genes and proteins identified was confirmed by qRT-PCR assays. The data generated can facilitate functional studies of novel genes and proteins which may be important for survival strategies and adaptation of Paracoccidioides in the host.

Submitted by Pedro Barros (pedro.silvabarros@ufpe.br) on 2018-09-04T19:58:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Juliana Maria Azevedo de Lyra.pdf: 3132284 bytes, checksum: e317cb1f9c952adb3328b338bdfc02be (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-09-17T22:53:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Juliana Maria Azevedo de Lyra.pdf: 3132284 bytes, checksum: e317cb1f9c952adb3328b338bdfc02be (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-17T22:53:14Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) TESE Juliana Maria Azevedo de Lyra.pdf: 3132284 bytes, checksum: e317cb1f9c952adb3328b338bdfc02be (MD5) Previous issue date: 2014-03-21 / FACEPE / Infecções fúngicas tem aumentado sua incidência, principalmente em imunocomprometidos. No Brasil, os fungos são responsáveis por cerca de 10% das infecções hospitalares, sendo as espécies de Candida responsáveis por cerca de 50% dos casos, seguidas pelo Aspergillus e Cryptococcus neoformans. O diagnóstico fúngico é dado pelo exame direto, que possui reduzida sensibilidade, e cultura que é tecnicamente laboriosa e demorada. A detecção do genoma de fungos apresenta diversas vantagens como a instalação precoce da terapia antifúngica diminuindo a mortalidade relacionada à infecção fúngica, e o tempo de internação dos pacientes em unidades de saúde. Este estudo tem como objetivo o desenvolvimento e avaliação de teste molecular para a detecção de infecção fúngica em pacientes imunocomprometidos através de PCR do tipo multiplex utilizando a sequência ITS como alvo, e sequências de rDNA específicas para detecção de 6 espécie de fungos de importância para a saúde humana: A. fumigatus, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis e C. neoformans. Dos 84 pacientes analisados, 46 foram adultos em tratamento oncológico e 38 neonatos. Das 144 amostras de sangue submetidas a PCR convencional com os iniciadores para a detecção da região ITS, 84 foram positivas e 60 negativas. As amostras positivas foram submetidas a PCR multiplex para a determinação da espécie do fungo. 46 foram positivas para uma ou mais espécie fúngica, sendo as espécies mais encontradas a C. parapsilosis (23,8%), C. glabrata (19,0%), C. neoformans (14,2%), C. tropicalis e C. albicans (ambas 4,7% dos casos). A baixa frequência de C. albicans possivelmente está relacionada ao uso profilático do antifúngico fluconazol. A PCR convencional apresentou sensibilidade de 67,3% (53,2-79,0), especificidade de 47,2% (36,6-58,0), valor preditivo positivo de 44,0% (33,4-55,3) e valor preditivo negativo de 70,0% (56,6-80,8) em relação ao diagnóstico da doença, baseado na clínica, comprovação microbiológica e teste terapêutico. As curvas melting da PCR em tempo real utilizando o sistema de detecção SYBR Green obtidas pela amplificação da sequência subclonada de rDNA de cada espécie em plasmídeo apresentaram formato alargado, possivelmente devido a homologia entre o iniciador e diferentes regiões das sequências de rDNA das espécies de fungos estudadas, principalmente nas espécies de Candida, permitindo a amplificação inespecífica em diferentes temperaturas de anelamento avaliadas. As curvas de amplificação das sequências subclonadas de rDNA de cada espécie utilizando o sistema TaqMan apresentaram reprodutibilidade, e especificidade nos experimentos utilizando o par de iniciador e sonda especifico para uma dada espécie com sequências de rDNA clonadas das demais espécies de fungos analisadas, executando o teste para C. neoformans, mostrando o potencial do teste para utilização em amostras clínicas. / Fungal infections have increased its incidence, especially in immunocompromised patients. In Brazil, the fungi are responsible for about 10 % of nosocomial infections, with Candida species account for about 50% of cases, followed by Aspergillus and Cryptococcus neoformans. Fungal diagnosis is made by direct examination, which has reduced sensitivity, and culture that is technically laborious and time consuming. The detection of the fungal genome has several advantages as the early onset of antifungal therapy decreased mortality related to fungal infection, and length of stay of patients in healthcare facilities. This study aims at the development and evaluation of molecular test for the detection of fungal infection in immunocompromised patients by multiplex PCR using ITS sequence targeted and specific rDNA sequences for detection of 6 species of fungi of importance to the human health: A. fumigatus, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. parapsilosis and C. neoformans. Of the 84 patients studied, 46 were adults undergoing cancer treatment and 38 neonates. 144 of blood samples with conventional PCR primers for detection of the ITS region, 84 were positive and 60 negative. The positive samples were subjected to multiplex PCR to determine the species of fungus. 46 were positive for one or more fungal species and the species most commonly found in C. parapsilosis (23.8%), C. glabrata (19.0%), C. neoformans (14.2%), C. tropicalis and C. albicans (both 4.7% of cases). The low frequency of C. albicans is probably related to the prophylactic use of antifungal fluconazole. Conventional PCR had a sensitivity of 67.3% (53.2 to 79.0), specificity of 47.2% (36.6 to 58.0), positive predictive value of 44.0% (from 33.4 to 55,3) and negative predictive value of 70.0% (56.6 to 80.8) compared to diagnosis based on clinical, microbiological and therapeutic proof test. The melting curves of real-time PCR using SYBR Green obtained by amplification of rDNA subcloned sequence of each species present in plasmid extended, possibly due to the homology between the initiator sequences and regions of rDNA of fungal species format studied, especially in Candida species, allowing nonspecific amplification at different annealing temperatures evaluated. The amplification curves of the subcloned rDNA sequences of each type using the TaqMan system showed reproducibility and specificity of the experiments using the pair of primer and probe specific for a species with cloned rDNA sequences of other species of fungi analyzed by running test for C. neoformans, showing the potential for use in clinical test samples.