Les brûlures profondes et étendues sont, de loin, le traumatisme le plus grave auquel un être humain peut faire face. La rapidité de couverture de ces plaies avec des pansements, surtout de nature biologique (p. ex. peau de cadavre), d’abord temporaire, et ensuite impérativement permanente, aura une influence déterminante sur le taux de survie des patients. À date, de nombreuses technologies ont été utilisées telles que les greffes pleines épaisseurs de peau provenant d’un site donneur sain, la culture d’épiderme autologue (CEA) et les substituts synthétiques. Cependant, ces technologies ont pour principale limite, respectivement, leur biodisponibilité, leur manque de propriété mécanique et leur manque d’activité biologique. Ces éléments ont ainsi mené au développement de substituts biologiquement actifs parmi lesquels les plus prometteurs possèderont une base autologue, l’épiderme, reposant sur une matrice, allogénique, xénogénique ou biosynthétique. Toutefois, la majorité de ces substituts ne pourra être utilisée que temporairement à cause de leur potentiel immunogénique résultant de la présence d’antigènes étrangers. Les technologies de production de substituts cutanés peuvent être divisées en deux approches distinctes, soit de type « Top-down », soit de type « Bottom-up ». La technologie la plus courante ainsi que la plus utilisée aujourd’hui est celle de type « Top-down ». Les substituts produits par cette approche se basent sur des matrices artificielles structurées élaborées via deux classes majeures de biomatériaux incluant (1) les biopolymères du sang comme la fibrine, et du tissu mou comme le collagène et la fibronectine ; (2) les polysaccharides, comme l’alginate, le chitosan et les glycosaminoglycanes, incluant le hyaluronan. L’approche de type « Bottom-up », quant à elle, se base sur la capacité des cellules à synthétiser et assembler leur propre matrice extracellulaire. Dans ce domaine, le laboratoire d’organogénèse expérimentale (LOEX) se positionne en tant que pionnier dans une méthode de production de substitut dite « d’auto-assemblage ». Cette méthode repose sur la capacité de l’acide ascorbique à promouvoir l’assemblage matriciel sécrété par les fibroblastes dermiques. Toutefois, les substituts obtenus par cette méthode présenteront (1) un temps de production long, car l’assemblage matriciel représentera à lui seul les 2/3 de la technique d’un total d’environ 8 à 9 semaines, (2) un manque de photoprotection de par l’absence de pigmentation, c’est à-dire sans ajout de cellules pigmentogènes (mélanocytes), et (3) peu ou pas de réseau de fibres élastiques, essentiel aux propriétés mécaniques cutanées. Afin de répondre aux problématiques identifiées, nous avons entrepris de concevoir plus rapidement des substituts cutanés pigmentés, intégrant un réseau de fibres élastiques selon la méthode d’autoassemblage. Pour ce faire, nous avons investigué la possibilité d’utiliser un derme reconstruit par « auto-assemblage » de type allogénique combiné à un épiderme syngénique. Cette modification au protocole qui implique initialement une reconstruction dermique et épidermique autologue à 100 % permettra d’éliminer l’étape de production dermique et ainsi réduire le temps global de production des substituts cutanés bilamellaires. L’esthétisme et la fonctionnalité des substituts ont été évalués par l’ajout de différentes densités de mélanocytes lors de la reconstruction de l’épiderme. Enfin, parallèlement à cette étude, nous avons investigué sur la faible présence du réseau de fibres élastiques dans nos substituts cutanés afin de proposer une technique de production modifiée permettant d’induire l’élastogenèse, le processus de formation de ce réseau. Plus spécifiquement, de l’aldostérone, une hormone minéralocorticoïde, et son inhibiteur compétitif, la spironolactone, ont été ajoutés dans le milieu de culture cellulaire en tout temps lors de la production des substituts cutanés afin de stimuler la voie de l’ « insulin-like growth factor I » (IGF-I) et ainsi l’élastogenèse. En résumé, mon projet de doctorat a permis de mettre en évidence : (1) la survie des fibroblastes allogéniques dermiques pour au moins huit semaines après greffes sur un modèle murin immunocompétent ; (2) qu’un seuil minimal de 200 mélanocytes par mm2 à la reconstruction de l’épiderme avait la capacité d’induire une pigmentation homogène après greffe, ainsi qu’une photoprotection comparable à une densité de 1500 mélanocytes par mm2 ; (3) que l’ajout d’aldostérone et de spironolactone augmente le nombre de fibres élastiques dans nos substituts cutanés et améliore les propriétés mécaniques par la diminution de la rétraction et l’augmentation de l’élasticité. De plus, l’ajout de mélanocytes a aussi permis d’améliorer les propriétés mécaniques des peaux reconstruites par leur effet positif encore mal compris sur l’élastogenèse. / Vast deep burns injuries are, by far, the worst trauma that a human being can experience. The time necessary for the coverage of thermal wounds with bandages, especially of a biological nature (e.g. cadaveric skin), at first temporary, and then permanently, influences the survival rate of patients. Over the years, numerous technologies were used to cover the skin wounds. Among them, we note split- and full-thickness skin grafts from a spared donor site, as well as cultured epithelial autografts (CEAs) and synthetic substitutes. However, these technologies showed some issues as the bioavailability of donor tissue or mechanical properties or biological activities. Indeed, it is the cellular and the extracellular matrix component that have a direct impact on the wound healing and on the longterm graft survival rate. In this way, new biologically active skin substitutes were developed. The most promising reconstructed skins to date are composed of an autologous epidermis associated with an extracellular matrix either allogeneic or xenogeneic or biosynthetic. However, the majority of these substitutes could only be used as temporary because of their immune inflammatory risk resulting from the presence of allogeneic or xenogeneic cells. Tissue-engineered technologies can be split in two approaches, either "Top-Down" or "Bottom-up". The most current as well as the most represented technology today is the "Top-Down" approach. Substitutes produced by this approach are based on structured artificial matrices developed via the major classes of biomaterials including (1) blood’s biopolymers such as fibrin, and components of the soft tissue such as collagen or fibronectin and (2) polysaccharides, as alginates, chitosan and glycosaminoglycan, including the hyaluronan. Alternatively, the "bottom-up" approach is based on the fibroblast’s capacity to synthesize and assemble their own extracellular matrix. In this field, the Laboratory of Organogenesis Experimental (LOEX) is a pioneer in a method of production of skin substitute called the "self-assembly" method. This method is based on the capacity of ascorbic acid to promote the extracellular matrix assembly secreted by fibroblasts. However, the histology and mechanical properties of these tissue-engineered skin substitutes, which are similar to native skin, (1) are quite long to produce, essentially because of the extracellular matrix assembly which takes twothird of the time of the whole production (2) lack of photoprotection, since pigment-producing cells called melanocytes are not added in the standard production and (3) the elastic fiber network, essential to insure their mechanical properties, is rudimentary. To address the identified problems, we designed a faster way to produce pigmented skin substitutes, integrating an elastic fiber network by tissue engineering according to the “self-assembly” method. To do so, we investigated the possibility of using an allogeneic reconstructed dermis associated with a syngeneic epidermis. This new method would allow eliminating two-third of the production time of the dermal part initially requested in the “on demand” production that was initially 100 % autologous. Estheticism and its functionality were evaluated by the addition of various densities of melanocytes during the epidermis reconstruction. Finally, at the same time, we addressed the weak presence of the elastic fiber network in our reconstructed skin. Indeed, we modified our production method to stimulate the elastogenesis process. More specifically, aldosterone, a mineralocorticoid hormone, and its competitive inhibitor, spironolactone, were added in the culture media during the skin substitute production in order to stimulate the insulin-like growth factor I (IGF-I) pathway and so the elastogenesis process. To conclude, my PhD project allowed to highlight: (1) the immunological tolerance of the allogeneic dermis with a long-term survival of their cellular components over the eight-week period, investigated in an immunocompetent murine model ; (2) that a minimal threshold of 200 melanocytes per mm2 in the epidermis reconstruction had the capacity to lead a homogeneous pigmentation after the transplant, as well as a photoprotection comparable to a 1500 melanocytes per mm2 density ; (3) that the addition of aldosterone and spironolactone increased the number of elastic fibers in our skin substitutes and improved the mechanical properties by the decrease of the shrinkage and the increase of the elasticity. Furthermore, the addition of melanocyte also increased the mechanical properties of the skin substitute. This positive impact on elastogenesis by melanocytes is poorly understood.

Le psoriasis est une maladie cutanée grave pour laquelle il n’existe encore aucun traitement curatif. Des modèles de peau psoriasique in vitro sont alors nécessaires afin de tester de nouveaux traitements. Cette étude visait, en premier lieu, à optimiser la production de substituts cutanés psoriasiques par la méthode d’auto-assemblage, pour ensuite les utiliser afin d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle molécule potentiellement antipsoriasique, la tBEU. Dans un premier temps, des substituts sains et psoriasiques ont été produits par la méthode d’auto-assemblage partiellement modifiée en utilisant des plaques 6 puits et 12 puits. Ces expériences ont permis de démontrer que les plaques 6 puits étaient plus efficaces pour la production de substituts reproductibles et représentatifs d’une peau psoriasique in vivo. Ensuite, ces substituts ont été traités avec la tBEU, démontrant que cette molécule diminue la prolifération des kératinocytes et améliore leur différenciation. Ainsi, la tBEU pourrait éventuellement être utilisée comme un traitement efficace du psoriasis. / Psoriasis is a serious cutaneous disease for which there is currently no cure. In vitro psoriatic skin models could become new tools to assess the potency of new drugs during the development of new therapies. First, this study aimed to optimize the production of psoriatic skin substitutes by the self-assembly method, and then use them to assess the effectiveness of a new potentially antipsoriatic molecule, tBEU. Initially, healthy and psoriatic substitutes have been produced by the self-assembly method partially modified, using 6-well and 12-well plates. These experiments demonstrated that the 6-well plates were more effective for the production of reproducible substitutes and representative of psoriatic skin in vivo than the 12-well plates. Then, these substitutes were treated with tBEU, showing that this molecule decreases significantly keratinocytes proliferation and improves their differentiation. Thus, tBEU may eventually be used as an effective topical treatment for psoriasis.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Pharmacie. Sciences pharmaceutiques. Biologie végétale : Reims : 2007. Reproduction de : Thèse de doctorat : Pharmacie. Sciences pharmaceutiques. Biologie végétale : Lomé (Université des sciences).Togo : 2007. / Thèse de doctorat en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliographie f.149-182.

Thèse de doctorat : Ingénierie cellulaire et tissulaire : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

No description available.

Il est présentement difficile de tester les médicaments anti-psoriasiques sur de nombreux échantillons de peaux pathologiques en raison de problèmes éthiques, de disponibilité et de variations interindividuelles. Ainsi, les formulations de médicaments proposées à la population atteinte de psoriasis ne sont pas bien adaptées à leur situation réelle. La pénétration cutanée de drogues est une méthode qui offre un grand potentiel et qui plus est particulièrement attrayante comparativement aux méthodes conventionnelles d'injection ou d'administration orale. Le principal objectif de notre étude est de présenter un nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques faits à partir de cellules de patients psoriasiques et selon la méthode d'auto-assemblage, afin de tester la pénétration de différentes molécules et de vérifier si le substitut est similaire au tissu pathologique in vivo. En comparaison à la peau normale humaine et à la peau de souris, une fonction barrière efficiente a été observée pour les substituts de peau faits à partir de cellules de patients sains lorsque les molécules suivantes ont été appliquées: l'acide benzoïque, la caféine et l'hydrocortisone. Il est connu dans la littérature que les peaux de patients psoriasiques sont plus perméables. Cette même caractéristique a été observée pour les substituts cutanés préparés à partir de cellules de patients psoriasiques. Ces tests de pénétration cutanée sont un premier pas vers la validation d'un modèle de substituts cutanés pathologiques, précisément psoriasiques, en vue de pouvoir le considérer en tant qu'outil efficace pour des études dermopharmacologiques d'agents anti-psoriasiques.

La stimulation électrique (SE) semble favoriser la cicatrisation des plaies par ses effets sur les fibroblastes. Cependant, son interaction avec les kératinocytes n'a pas été bien établie. Le polypyrrole (PPy) en tant que biomatériau conducteur est un excellent candidat pour délivrer les SE aux cellules, ce qui devient plus évident avec le développement de la nouvelle membrane souple à base de PPy. Cependant, les faibles propriétés mécaniques limitent l'utilisation de cette membrane. La présente étude visait à améliorer la résistance mécanique de la membrane à base de PPy et étudier les comportements cellulaires et moléculaires des kératinocytes après exposition à des SE via cette nouvelle membrane PPy. Premièrement, la membrane souple à base de PPy a été renforcée par électrofilage, de manière synergique, avec des fibres de polyuréthane (PU) et de polylactide (PLLA). Des tests mécaniques ont confirmé que la résistance à la traction de la membrane a été considérablement augmentée. Ensuite, les kératinocytes ont été cultivés sur la membrane PPy renforcée, puis stimulés par des intensités électriques de 100 ou 200 mV mm⁻¹ pendant 6 ou 24 heures. Les cellules stimulées présentaient une capacité proliférative considérablement accrue. Les sécrétions d'IL-6, IL-1α, IL-8, GROα, FGF2 et VEGF-A ont également augmenté. Fait intéressant, l'SE de 24 heures a induit une « mémoire de stimulation » car les cellules stimulées ont montré une augmentation significative de formation de colonies (CFE) après 6 jours après l'exposition à la stimulation électrique. De plus, l'expression des kératines 5, 14 et 10/13 était significativement augmentée par la SE. La SE a augmenté l'expression de la phosphorylation des kinases ERK1/2. L'expression des protéines des kératinocytes de la peau humaine peut être activée par des stimulations électriques appropriées pour favoriser la cicatrisation des plaies cutanées. La membrane PPy souple renforcée peut servir de pansement conducteur pour faciliter l'exposition de la plaie à une stimulation électrique pour favoriser sa cicatrisation. / Keratinocytes as the principal skin cell type play a major role in wound closure. In the meantime, electrical stimulation (ES) has been found effective in promoting wound healing. However, the role of ES on keratinocytes has not been well established. Polypyrrole (PPy), especially the recently developed soft PPy membrane, is an electrically conductive biomaterial and a good candidate to deliver ES to cells. However, the weak mechanical strength of the soft PPy membrane has limited its practical use. The present work was to enhance the mechanical strength of this soft PPy membrane and to investigate the cellular and molecular behaviors of the keratinocytes underwent ES via this novel PPy membrane. Firstly, the soft PPy membrane was synergically reinforced with polyurethane (PU) and poly (L-lactic acid) (PLLA) fibers through electrospinning technology. Mechanical tests confirmed the significantly increased tensile strength, which rendered the originally fragile PPy membrane strong enough to stand ordinary manipulations without compromising its electrical properties. Afterwards, HaCaT keratinocytes were cultured on the PU/PLLA reinforced PPy membranes under electrical intensities of 100 and 200 mV mm⁻¹ for 6 or 24 hr. The electrically stimulated cells exhibited a considerably increased proliferative ability. Meanwhile, secretions of the IL-6, IL-1α, IL-8, GROα, FGF2 and VEGF-A increased as well. Interestingly, the 24 hr ES induced a "stimulus memory" by showing a significant rise in colony forming efficiency (CFE) 6 days post-ES. Additionally, the expressions of keratin 5, keratin 14, keratin 10 and keratin 13 were significantly modulated by ES. Finally, the phosphorylation of ERK1/2 kinases was regulated by ES. The overall results demonstrated that the proliferation, differentiation, and protein expression of human skin keratinocytes can be activated through appropriate ES to benefit skin wound healing. Moreover, the PU/PLLA reinforced soft PPy membrane may server as a conductive wound dressing to facilitate ES to wound.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / La méthode d'auto-assemblage permet la production de substituts cutanés sans matériel exogène. L'objectif principal de notre travail a été de modifier cette méthode originale afin de produire un nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques fabriqués à partir de cellules psoriasiques. Dans un premier temps, des substituts sains ont été cultivés en présence et en absence de sérum de veau foetal dans le but d'optimiser les conditions de culture. Puis, des analyses histologiques, immunohistochimiques, de perméabilité et des propriétés physico-chimiques ont été réalisées. Les résultats obtenus ont permis de conclure que le retrait du sérum à partir de la culture à l'interface air-liquide ne cause aucun problème majeur au niveau de la différenciation épidermique, de la jonction dermo-épidermique, du derme et de la perméabilité des substituts. De plus, des analyses par spectroscopic infrarouge à transformée de Fourier ont permis d'observer que le retrait du sérum améliore même l'organisation lipidique pour trois des cinq populations cellulaires testées. Parallèlement à cette étude, des substituts psoriasiques ont été produits à partir de cellules psoriasiques dans le but de vérifier si ces derniers allaient permettre la conservation de ce phénotype en culture. Des analyses histologiques et immunohistochimiques ont été effectuées et ont permis d'observer que le phénotype psoriasique (hyperprolifération et différenciation anormale des kératinocytes) est en partie conservé dans les substituts pathologiques. De plus, lors d'un traitement à l'acide rétinoïque, ceux-ci réagissent de façon similaire à ce qui est observé dans les peaux psoriasiques in vivo. Finalement, des substituts produits à partir de cellules non lésionnelles ont été reconstruits pour vérifier s'il existait une différence entre les cellules lésionnelles et non lésionnelles d'un même patient. Les résultats ont permis d'observer que les cellules non lésionnelles ne sont pas totalement «normales» et qu'elles conservent en partie les caractéristiques du psoriasis. En conclusion, ce nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques pourrait devenir un puissant outil dermopharmaceutique permettant de tester de nouveaux traitements pour vaincre le psoriasis.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2022 / La greffe de peau autologue chez les grands brûlés est une technique répandue, mais souvent limitée lorsque le patient présente une petite surface disponible pour le prélèvement des greffons. Les substituts de peaux bilamellaires autoassemblés (PRB) permettent de pallier cette limitation, mais leur production est longue. Le but de cette étude est donc d'optimiser la méthode pour réduire le délai nécessaire avant la première greffe. Pour cela, nous souhaitons développer une technique de décellularisation et d'entreposage de dermes allogéniques produits par autoassemblage. Notre hypothèse est que les PRB produites avec les dermes reconstruits décellularisés (DRD) sont comparables aux PRB préparées avec le protocole du LOEX (Germain et al., 2018) présentement en essai clinique. Nos objectifs sont de trouver les conditions permettant d'éliminer les résidus allogéniques des dermes décellularisés et de les recellulariser de manière à soutenir la différenciation épidermique et la formation de la jonction dermoépidermique. Nous avons déterminé que l'utilisation de deux cycles de choc osmotique avec 0,4 mg/mL de DNAse permet de réduire la quantité résiduelle d'ADN allogénique en dessous de 50ng/mg de tissu sec. L'entreposage d'un mois permet de complémenter cette décellularisation en diminuant la dose de DNAse nécessaire à 0,2mg/mL. En testant différentes populations pour la formation matricielle et densités de fibroblastes pour la recellularisation de DRD, nous avons déterminé que la recellularisation d'une matrice riche en collagène avec une faible densité de fibroblastes (10 000 f/cm$^2$) permet d'obtenir des PRB similaires histologiquement aux PRB standards. Cette recellularisation permet également de regagner les glycosaminoglycanes et l'épaisseur perdues lors de la décellularisation. En conclusion, la méthode de décellularisation utilisée est efficace pour l'atteinte des seuils établis par la littérature et complémentée par l'entreposage des DRD. La recellularisation de ces matrices permet l'obtention de PRB de manière accélérée par rapport à la méthode classique. Le tout est adapté pour une translation clinique. / Autologous skin grafting in burn patients is a widespread technique, but often limited when patients have a small area available for graft harvesting. Self-assembled skin substitutes (SASS) can overcome this limitation, but their production is time consuming. The aim of this study is therefore to optimize the method in order to reduce the time required before the first graft. To this end, we aim to develop a technique for decellularization and storage of allogeneic dermis produced by the self-assembly approach. Our hypothesis is that SASS produced with decellularized reconstructed dermis (DRD) are comparable to autologous SASS prepared with the LOEX protocol(Germain et al., 2018) currently in clinical trial. Our objectives are to find conditions to remove allogeneic residues from decellularized dermis and recellularize it in a way that supports epidermal differentiation and dermal-epidermal junction formation. We determined that the use of two cycles of osmotic shock with 0.4 mg/mL DNAse reduces the residual amount of allogeneic DNA below 50 ng/mg of dry tissue. Storage for one month helps this decellularization by reducing the dose of DNAse required to 0.2 mg/mL. By testing different fibroblast populations and densities for recellularization, we determined that recellularization of a collagen-rich matrix with a low fibroblast density (10 000 f/cm2) yields SASS histologically similar to standard SASS. This recellularization also allows the retrieval of the glycosaminoglycans and thickness lost during decellularization. In conclusion, the decellularization method used is effective in meeting the thresholds established in the literature and is complemented by DRD storage. The recellularization of these matrices allows the obtention of SASS in an accelerated manner compared to the conventional method. This is suitable for clinical translation.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [122]-127. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.