"Thèse en cotutelle, Université Laval Québec, Canada Philosophiæ doctor (Ph. D.) et Université de Strasbourg Strasbourg, France" / Les réactions immunitaires de la peau sont initiées par les cellules dendritiques cutanées (dendritic cells, DCs). L'effet potentiellement sensibilisateur d'un composé peut être prédit in vitro en utilisant des monocytes humains différenciés en DCs (MonoDCs). Cependant, ces modèles simplistes restent imprécis car l'activation des DCs cutanés par les sensibilisateurs peut être déclenchée ou modulée par des interactions microenvironnementales avec de multiples types de cellules non immunitaires. Notre objectif est de développer une peau immunocompétente qui combinera des MonoDCs avec tous les éléments structurels et fonctionnels de la peau, c'est-à-dire une barrière épidermique posée sur un derme contenant une pseudo-vascularisation et des neurones nociceptifs. Une matrice de collagène a été ensemencée avec des fibroblastes et des cellules endothéliales, puis avec des précurseurs de fibres nerveuses dérivées soit de l'iPSC humaine, soit de la DRG embryonnaire murins. Enfin, nous avons introduit les MonoDC et les kératinocytes. Nous avons observé que les neurones différenciés in situ innervent l'épiderme comme observé habituellement dans la peau humaine normale. De plus, les neurones dérivées d’iPSCs, expriment neuropeptides et canaux calcique spécifiques des fibres nociceptives. Enfin, les Mono-DC intégrés au modèle restent stable pendant toute la durée nécessaire à la formation de l’épiderme et peuvent être stimulé. Le modèle sera utilisé pour prédire le potentiel irritant des composés chimiques et l'impact de l’innervation nociceptive sur l'activation des DCs. / Immune reactions in the skin are initiated by the cutaneous dendritic cells (DCs). The potential sensitizing effect of a compound can be predicted in vitro using human monocytes differentiated into DCs (Mono-DCs). However, these simplistic models remain inaccurate because the activation of cutaneous DCs by sensitizers may be triggered or modulated by microenvironmental interactions with multiple types of nonimmune cells. Our goal is to develop an immunocompetent human tissue-engineered skin that will combine DCs with all structural and functional element of the skin, i.e. an epidermal barrier laid upon a dermis containing a pseudo-vascularization and nociceptive neurons. Collagen matrix was seeded with fibroblasts and endothelial cells, then with precursors of nerve fibers derived from either human iPSC or murine embryonic DRG. Finally, we introduced Mono-DCs and keratinocytes. We observed that in situ differentiated neurons grow axons towards the epidermis as usually observed in normal human skin. What's more, the neurons derive from iPSC, express neuropeptides and calcium channel as normal nociceptive fibers. Moreover, Mono-DCs settled as expected beneath the epidermis and remained sessile to stimulation for several weeks. The model will be used to predict the irritant potential of chemical compounds, and the impact of nerves on DC activation.

Introduction: Le Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale (LOEX) utilise une technique de production de substituts cutanés bilamellaires autologues auto-assemblés (SASS) unique. Cette méthode permet la génération d’équivalents cutanés permanents avec une structure et une fonction similaire à la peau normale humaine. Problématique et objectifs: Cette thèse présente d’abord les premiers résultats d’essais cliniques pour le traitement de plaies chroniques complexes traitées avec SASS. Ces résultats démontrent une efficacité et une sécurité d’utilisation de ces SASS. Toutefois, il y a un intérêt de développer une méthode de production plus rapide de ces substituts cutanés afin d’améliorer l’accessibilité clinique et le pronostic des patients grands brûlés, lors de leur utilisation en phase aiguë. En effet, le délai de couverture cutanée définitive essentielle à la thermorégulation et à l’effet de barrière est directement en lien avec les pronostics vital et morbide de cette population. Le délai actuel de 8 semaines pour la production des greffons aurait avantage à être réduit pour améliorer leur utilité quant aux soins des patients. Méthode: Dans un premier temps, le développement et la mise au point d’une méthode de production plus rapide de SASS à partir de matrices dermiques décellularisées (SASS-DM), générant des peaux reconstruites en seulement 4 semaines et demie est présenté. Par la suite, l’équivalence de la méthode de production rapide de ces peaux est d’abord vérifiée in vitro et comparée à la méthode standard quant à ses caractéristiques histologiques, de différenciation cellulaire et la présence d’une membrane basale fonctionnelle. La méthode rapide est finalement comparée in vivo à la méthode standard quant à l’évolution de ces peaux greffées sur les vivants, de façon à compléter le développement préclinique de cette nouvelle méthode innovatrice. Résultats: La méthode rapide de production des peaux bilamellaires autologues auto-assemblées s’est montrée équivalente à la méthode de production standard et ce, autant in vitro qu’in vivo. Conclusion: Ce travail présente d’abord l’utilisation clinique des peaux reconstruites bilamellaires pour le traitement de plaies variqueuses chronique, qui s’avère efficace et sécuritaire. Puis, le développement préclinique d’une méthode plus rapide de production de peaux reconstruites bilamellaires autologues est présenté, permettant de générer des greffons en 4 semaines et demie plutôt que 8 semaines, et ce avec une qualité équivalente à la méthode standard. Cette innovation représente un ajout majeur aux modes de traitement des grands brûlés puisqu’elle a le potentiel de changer la planification chirurgicale et leur pronostic de survie. / Introduction: The Laboratoire d’Organogenèse Expérimentale (LOEX) has developed a unique production technique of self-assembled autologous skin substitute (SASS). This method allows the generation of permanent skin equivalents that display a structure and a function similar to normal human skin. Problematic and objectives: This thesis presents the first results of SASS clinical use in the treatment of chronic complex wounds to demonstrate the clinical efficacy and safety. The need to develop a faster production method in order to improve burn patient prognosis is also outlined. Indeed, the delay before definitive skin coverage to insure proper thermoregulation and protection from the external environment is directly associated to the vital and morbid prognosis of this population of severely traumatised patients. The current eight weeks SASS production delay must be reduced in order to further improve burn patients quality of care and survival. Method: This work describes the development and refinement of a faster production method for SASS using decellularized dermal matrices (SASS-DM) that generated skin substitutes produced in only 4 weeks and a half. These faster produced skin substitutes where compared in vitro to the standard SASS in regard to the histological characteristics, cellular differentiation and the presence of a functional basement membrane. The faster produced SASS-DM were then compared in vivo to standard SASS by following the evolution of grafted mice in order to complete a preclinical trial of this innovative technique. Results: The faster production method for the autologous self-assembled bilayered skin substitutes was shown to be equivalent to the standard production method in vitro and in vivo. Conclusion: This work presents the clinical use of bilayered skin substitutes for the treatment of chronic venous ulcers, which was shown to be efficient as well as safe. Afterwards, the preclinical development of a new faster production method of autologous bilayered self-assembled skin substitutes is presented, allowing the culture of skin grafts in four weeks and a half instead of the previous 8 weeks long protocol, with equivalent quality and characteristics as the standard cultured skins. This innovation represents a major adjunct to severely burned patients treatments and could possibly change their surgical planning and their survival.

Reproduction de : Thèse de doctorat : Pharmacie. Sciences pharmaceutiques. Biologie végétale : Reims : 2007. Reproduction de : Thèse de doctorat : Pharmacie. Sciences pharmaceutiques. Biologie végétale : Lomé (Université des sciences).Togo : 2007. / Thèse de doctorat en co-tutelle. Titre provenant de l'écran-titre. Bibliographie f.149-182.

Thèse de doctorat : Ingénierie cellulaire et tissulaire : Nancy 1 : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / La méthode d'auto-assemblage permet la production de substituts cutanés sans matériel exogène. L'objectif principal de notre travail a été de modifier cette méthode originale afin de produire un nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques fabriqués à partir de cellules psoriasiques. Dans un premier temps, des substituts sains ont été cultivés en présence et en absence de sérum de veau foetal dans le but d'optimiser les conditions de culture. Puis, des analyses histologiques, immunohistochimiques, de perméabilité et des propriétés physico-chimiques ont été réalisées. Les résultats obtenus ont permis de conclure que le retrait du sérum à partir de la culture à l'interface air-liquide ne cause aucun problème majeur au niveau de la différenciation épidermique, de la jonction dermo-épidermique, du derme et de la perméabilité des substituts. De plus, des analyses par spectroscopic infrarouge à transformée de Fourier ont permis d'observer que le retrait du sérum améliore même l'organisation lipidique pour trois des cinq populations cellulaires testées. Parallèlement à cette étude, des substituts psoriasiques ont été produits à partir de cellules psoriasiques dans le but de vérifier si ces derniers allaient permettre la conservation de ce phénotype en culture. Des analyses histologiques et immunohistochimiques ont été effectuées et ont permis d'observer que le phénotype psoriasique (hyperprolifération et différenciation anormale des kératinocytes) est en partie conservé dans les substituts pathologiques. De plus, lors d'un traitement à l'acide rétinoïque, ceux-ci réagissent de façon similaire à ce qui est observé dans les peaux psoriasiques in vivo. Finalement, des substituts produits à partir de cellules non lésionnelles ont été reconstruits pour vérifier s'il existait une différence entre les cellules lésionnelles et non lésionnelles d'un même patient. Les résultats ont permis d'observer que les cellules non lésionnelles ne sont pas totalement «normales» et qu'elles conservent en partie les caractéristiques du psoriasis. En conclusion, ce nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques pourrait devenir un puissant outil dermopharmaceutique permettant de tester de nouveaux traitements pour vaincre le psoriasis.

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La stimulation électrique (SE) semble favoriser la cicatrisation des plaies par ses effets sur les fibroblastes. Cependant, son interaction avec les kératinocytes n'a pas été bien établie. Le polypyrrole (PPy) en tant que biomatériau conducteur est un excellent candidat pour délivrer les SE aux cellules, ce qui devient plus évident avec le développement de la nouvelle membrane souple à base de PPy. Cependant, les faibles propriétés mécaniques limitent l'utilisation de cette membrane. La présente étude visait à améliorer la résistance mécanique de la membrane à base de PPy et étudier les comportements cellulaires et moléculaires des kératinocytes après exposition à des SE via cette nouvelle membrane PPy. Premièrement, la membrane souple à base de PPy a été renforcée par électrofilage, de manière synergique, avec des fibres de polyuréthane (PU) et de polylactide (PLLA). Des tests mécaniques ont confirmé que la résistance à la traction de la membrane a été considérablement augmentée. Ensuite, les kératinocytes ont été cultivés sur la membrane PPy renforcée, puis stimulés par des intensités électriques de 100 ou 200 mV mm⁻¹ pendant 6 ou 24 heures. Les cellules stimulées présentaient une capacité proliférative considérablement accrue. Les sécrétions d'IL-6, IL-1α, IL-8, GROα, FGF2 et VEGF-A ont également augmenté. Fait intéressant, l'SE de 24 heures a induit une « mémoire de stimulation » car les cellules stimulées ont montré une augmentation significative de formation de colonies (CFE) après 6 jours après l'exposition à la stimulation électrique. De plus, l'expression des kératines 5, 14 et 10/13 était significativement augmentée par la SE. La SE a augmenté l'expression de la phosphorylation des kinases ERK1/2. L'expression des protéines des kératinocytes de la peau humaine peut être activée par des stimulations électriques appropriées pour favoriser la cicatrisation des plaies cutanées. La membrane PPy souple renforcée peut servir de pansement conducteur pour faciliter l'exposition de la plaie à une stimulation électrique pour favoriser sa cicatrisation. / Keratinocytes as the principal skin cell type play a major role in wound closure. In the meantime, electrical stimulation (ES) has been found effective in promoting wound healing. However, the role of ES on keratinocytes has not been well established. Polypyrrole (PPy), especially the recently developed soft PPy membrane, is an electrically conductive biomaterial and a good candidate to deliver ES to cells. However, the weak mechanical strength of the soft PPy membrane has limited its practical use. The present work was to enhance the mechanical strength of this soft PPy membrane and to investigate the cellular and molecular behaviors of the keratinocytes underwent ES via this novel PPy membrane. Firstly, the soft PPy membrane was synergically reinforced with polyurethane (PU) and poly (L-lactic acid) (PLLA) fibers through electrospinning technology. Mechanical tests confirmed the significantly increased tensile strength, which rendered the originally fragile PPy membrane strong enough to stand ordinary manipulations without compromising its electrical properties. Afterwards, HaCaT keratinocytes were cultured on the PU/PLLA reinforced PPy membranes under electrical intensities of 100 and 200 mV mm⁻¹ for 6 or 24 hr. The electrically stimulated cells exhibited a considerably increased proliferative ability. Meanwhile, secretions of the IL-6, IL-1α, IL-8, GROα, FGF2 and VEGF-A increased as well. Interestingly, the 24 hr ES induced a "stimulus memory" by showing a significant rise in colony forming efficiency (CFE) 6 days post-ES. Additionally, the expressions of keratin 5, keratin 14, keratin 10 and keratin 13 were significantly modulated by ES. Finally, the phosphorylation of ERK1/2 kinases was regulated by ES. The overall results demonstrated that the proliferation, differentiation, and protein expression of human skin keratinocytes can be activated through appropriate ES to benefit skin wound healing. Moreover, the PU/PLLA reinforced soft PPy membrane may server as a conductive wound dressing to facilitate ES to wound.

Il est présentement difficile de tester les médicaments anti-psoriasiques sur de nombreux échantillons de peaux pathologiques en raison de problèmes éthiques, de disponibilité et de variations interindividuelles. Ainsi, les formulations de médicaments proposées à la population atteinte de psoriasis ne sont pas bien adaptées à leur situation réelle. La pénétration cutanée de drogues est une méthode qui offre un grand potentiel et qui plus est particulièrement attrayante comparativement aux méthodes conventionnelles d'injection ou d'administration orale. Le principal objectif de notre étude est de présenter un nouveau modèle de substituts cutanés pathologiques faits à partir de cellules de patients psoriasiques et selon la méthode d'auto-assemblage, afin de tester la pénétration de différentes molécules et de vérifier si le substitut est similaire au tissu pathologique in vivo. En comparaison à la peau normale humaine et à la peau de souris, une fonction barrière efficiente a été observée pour les substituts de peau faits à partir de cellules de patients sains lorsque les molécules suivantes ont été appliquées: l'acide benzoïque, la caféine et l'hydrocortisone. Il est connu dans la littérature que les peaux de patients psoriasiques sont plus perméables. Cette même caractéristique a été observée pour les substituts cutanés préparés à partir de cellules de patients psoriasiques. Ces tests de pénétration cutanée sont un premier pas vers la validation d'un modèle de substituts cutanés pathologiques, précisément psoriasiques, en vue de pouvoir le considérer en tant qu'outil efficace pour des études dermopharmacologiques d'agents anti-psoriasiques.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2022 / La greffe de peau autologue chez les grands brûlés est une technique répandue, mais souvent limitée lorsque le patient présente une petite surface disponible pour le prélèvement des greffons. Les substituts de peaux bilamellaires autoassemblés (PRB) permettent de pallier cette limitation, mais leur production est longue. Le but de cette étude est donc d'optimiser la méthode pour réduire le délai nécessaire avant la première greffe. Pour cela, nous souhaitons développer une technique de décellularisation et d'entreposage de dermes allogéniques produits par autoassemblage. Notre hypothèse est que les PRB produites avec les dermes reconstruits décellularisés (DRD) sont comparables aux PRB préparées avec le protocole du LOEX (Germain et al., 2018) présentement en essai clinique. Nos objectifs sont de trouver les conditions permettant d'éliminer les résidus allogéniques des dermes décellularisés et de les recellulariser de manière à soutenir la différenciation épidermique et la formation de la jonction dermoépidermique. Nous avons déterminé que l'utilisation de deux cycles de choc osmotique avec 0,4 mg/mL de DNAse permet de réduire la quantité résiduelle d'ADN allogénique en dessous de 50ng/mg de tissu sec. L'entreposage d'un mois permet de complémenter cette décellularisation en diminuant la dose de DNAse nécessaire à 0,2mg/mL. En testant différentes populations pour la formation matricielle et densités de fibroblastes pour la recellularisation de DRD, nous avons déterminé que la recellularisation d'une matrice riche en collagène avec une faible densité de fibroblastes (10 000 f/cm$^2$) permet d'obtenir des PRB similaires histologiquement aux PRB standards. Cette recellularisation permet également de regagner les glycosaminoglycanes et l'épaisseur perdues lors de la décellularisation. En conclusion, la méthode de décellularisation utilisée est efficace pour l'atteinte des seuils établis par la littérature et complémentée par l'entreposage des DRD. La recellularisation de ces matrices permet l'obtention de PRB de manière accélérée par rapport à la méthode classique. Le tout est adapté pour une translation clinique. / Autologous skin grafting in burn patients is a widespread technique, but often limited when patients have a small area available for graft harvesting. Self-assembled skin substitutes (SASS) can overcome this limitation, but their production is time consuming. The aim of this study is therefore to optimize the method in order to reduce the time required before the first graft. To this end, we aim to develop a technique for decellularization and storage of allogeneic dermis produced by the self-assembly approach. Our hypothesis is that SASS produced with decellularized reconstructed dermis (DRD) are comparable to autologous SASS prepared with the LOEX protocol(Germain et al., 2018) currently in clinical trial. Our objectives are to find conditions to remove allogeneic residues from decellularized dermis and recellularize it in a way that supports epidermal differentiation and dermal-epidermal junction formation. We determined that the use of two cycles of osmotic shock with 0.4 mg/mL DNAse reduces the residual amount of allogeneic DNA below 50 ng/mg of dry tissue. Storage for one month helps this decellularization by reducing the dose of DNAse required to 0.2 mg/mL. By testing different fibroblast populations and densities for recellularization, we determined that recellularization of a collagen-rich matrix with a low fibroblast density (10 000 f/cm2) yields SASS histologically similar to standard SASS. This recellularization also allows the retrieval of the glycosaminoglycans and thickness lost during decellularization. In conclusion, the decellularization method used is effective in meeting the thresholds established in the literature and is complemented by DRD storage. The recellularization of these matrices allows the obtention of SASS in an accelerated manner compared to the conventional method. This is suitable for clinical translation.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. [122]-127. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.