Orientador: Mirna Lucia Gigante / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:38:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Henrique_VivianeSoccioMonteiro_D.pdf: 1578287 bytes, checksum: 701e35fa0f63acfe70512383a04328f3 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os objetivos deste trabalho foram avaliar o comportamento da fase aquosa do queijo Prato durante sua maturação e o efeito do pH sobre a proteólise, a firmeza e a capacidade de derretimento do queijo. Para avaliar o efeito do tempo de maturação sobre a fase aquosa do queijo, após a fabricação, amostras foram aleatoriamente escolhidas diariamente, até o quinto dia de maturação, e avaliadas quanto à quantidade de fase aquosa liberada por centrifugação. A fase aquosa foi avaliada quanto aos teores de sólidos totais, nitrogênio total, frações nitrogenadas e perfil eletroforético. Os resultados indicaram que a fase aquosa liberada por centrifugação diminuiu significativamente durante os primeiros 5 dias de maturação evidenciando um rápido aumento da capacidade de retenção de água da matriz protéica. Através do perfil eletroforético evidenciou-se o aumento de frações caseicas (as1-I-caseína e g-caseína) e de proteínas intactas (b-caseína e as1-caseína) na fase aquosa do queijo com 5 dias de maturação. Estes resultados sugerem que, além da proteólise, o comportamento da fase aquosa do queijo no período inicial da maturação pode ser também responsável pela melhoria da funcionalidade do queijo, uma vez que afeta a hidratação da matriz protéica. Para estudar o efeito do pH sobre a proteólise, a firmeza e a capacidade de derretimento do queijo Prato durante a maturação utilizou-se um método de alteração do pH pós-fabricação. Os queijos utilizados para a troca de pH e posterior avaliação da proteólise foram ralados e os utilizados para a avaliação da firmeza e da capacidade de derretimento foram fatiados (6,5 x 5,0 x 3,0 cm). Em ambos os casos, as amostras foram divididas em 3 porções que foram submetidas aos tratamentos de alteração do pH utilizando-se um dessecador com prateleiras. A primeira porção foi exposta a atmosfera de amônio para aumentar o pH; a segunda porção foi exposta ao vapor de ácido acético para abaixar o pH; a terceira porção serviu de controle. Após a alteração do pH as amostras foram imediatamente embaladas a vácuo e armazenadas a 12 °C. Para avaliar a proteólise amostras foram aleatoriamente escolhidas após 1, 8, 15, 22, 29, 44 e 58 dias de maturação e avaliadas quanto ao pH, sólidos totais, nitrogênio total, nitrogênio solúvel em pH 4,6, nitrogênio solúvel em TCA 12% e perfil eletroforético. A avaliação do efeito do pH sobre a firmeza e a capacidade de derretimento foi realizada após 8 dias de maturação. A melhor condição do teste de derretimento para o queijo Prato foi previamente definida como sendo 130 °C/ 10 minutos. Os resultados indicaram que os índices de extensão e profundidade de maturação aumentaram significativamente ao longo do tempo, porém, aumentaram menos para o pH mais baixo, quando, comparado aos demais tratamentos. O perfil eletroforético evidenciou que nos queijos de menor pH a degradação da *S1 e da *-caseínas ocorreu mais lentamente e menos extensivamente do que nos queijos controle e de mais alto pH. Além disso, observou-se que existe uma correlação linear positiva entre pH e a firmeza dos queijos. Não se observou associação significativa entre o pH e a capacidade de derretimento dos queijos / Abstract: The objectives of this study were to evaluate the evolution of the aqueous phase of Prato cheese in the initial stages of ripening and the independent effect of pH on proteolysis, firmness and melting ability of the cheese. To evaluate the effect of ripening time on the aqueous phase of the cheese after manufacture, samples were randomly taken every day up to the fifth day of ripening and subsequently evaluated for the amount of aqueous phase separated by centrifugation. The aqueous phase was evaluated for the level of total solids, total nitrogen, nitrogen fractions and electrophoretic profile. The results indicated that the aqueous phase separated by centrifugation significantly decreased over the first five days of ripening, thereby evidencing a rapid increase of the water binding capacity of the protein matrix. The electrophoretic profile evidenced an increase of the levels of casein fractions (as1-I-casein and g-casein) and intact proteins (b-casein and as1-casein) in the aqueous phase of cheese after 5 days ripening. These results suggest that, in addition to proteolysis, the evolution of the aqueous phase of cheese in the initial stages of ripening may also contribute to improving the functionality of cheese, as a result of the effect the aqueous phase has on the degree of hydration of the protein matrix. A post-manufacture pH change methods was used to study the independent effect of pH on proteolysis, firmness and melting ability of Prato cheese during ripening. The cheeses submitted to post-manufacture pH change and subsequent evaluation of proteolysis were grated, whereas those used for evaluation of firmness and melting ability were sliced (6,5 x 5,0 x 3,0cm). In both cases, the cheese samples were divided into 3 equal portions and submitted to pH change treatments in a desiccator with shelves. The first portion was exposed to ammonium hydroxide to raise the pH; the second portion was exposed to acetic acid to lower the pH; the third portion was used as control (no treatment). Immediately after the pH change procedure was completed, the samples were vacuum packed and stored at 12°C. To evaluate the effect on proteolysis, randomly selected samples were submitted to analysis after 1, 8, 15, 22, 29, 44 and 58 days ripening and evaluated for pH, total solids, total nitrogen, nitrogen soluble at pH 4,6, nitrogen soluble in 12% trichloroacetic acid (TCA) and electrophoretic profile. Evaluation of the effect of pH on firmness and melting capacity was performed after 8 days ripening. 130°C/10 minutes had previously been determined as the optimal temperature/time test condition for the melting test of Prato cheese. The results indicated that both the ripening extension index and the ripening depth index significantly increased with time, but the increase was less intense in the case of the low pH cheeses. The electrophoretic profile showed that degradation of *S1 and *-caseins occurred at a slower rate and less extensively in the low pH cheeses as compared to the cheese samples of the control and high pH groups. Furthermore, statistical analysis showed that there is a positive linear correlation between pH and the degree of firmness of the cheeses investigated. No significant association was found between pH and the melting ability of the cheeses / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Submitted by Nathália Neves (nathalia.neves@ufpe.br) on 2015-03-04T18:11:03Z No. of bitstreams: 2 dissertacao_cristian alves_DEFINITIVA.pdf: 1182951 bytes, checksum: 13d22944e79580c62bcdbeaca77359ca (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-04T18:11:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_cristian alves_DEFINITIVA.pdf: 1182951 bytes, checksum: 13d22944e79580c62bcdbeaca77359ca (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-03-01 / CNPq / Objetivo: analisar a influência do baixo peso ao nascer (PN) sobre variáveis antropométricas, de composição corporal e indicadores metabólicos em crianças dos 8 aos 10 anos. Método: Um total de 99 crianças, de ambos os sexos, oriundos de escolas públicas município de Vitória de Santo Antão (PE – Brasil) foram divididas em dois grupos de acordo com o peso ao nascer (PN) (BPN < 2.500g, n = 24, e peso normal ao nascer, PNN, ≥ 2.500 g ≤ 4.850 g, n = 75). As variáveis antropométricas e de composição corporal incluem a massa corporal, altura, altura sentado, IMC, dobras triciptal, subescapular, supra-ilíaca, geminal, percentual de gordura, massa magra e gorda. Os indicadores metabólicos incluem a pressão arterial, IGF-1, peptídeo-C, colesterol, triglicerídeos, HDLc e LDLc. Resultados: Na comparação entre médias das variáveis estudadas, os grupos BPN e PNN foram iguais. Na análise de correlação bivariada, o PN se correlacionou com o IGF-1, apresentando comportamento de associações diferente nos grupos, no grupo PNN foi assinalada uma correlação positiva (r: 0,502) e no grupo BPN uma correlação negativa (r: -0,462) o que pode esta relacionado a compensação devido ao menor crescimento intra-uterino. Nas correlações por grupo, BPN e PNN, entre variáveis antropométricas e composição corporal com indicadores bioquímicos, foram assinaladas diferenças entre os grupos em todas as variáveis estudadas, exceto colesterol. Conclusão: Os grupos não apresentam diferenças médias, mas apresentam associações diferentes nas variáveis analisadas. O grupo PNN apresentou associações que seguiram padrões normativos, diferindo do grupo de BPN, especialmente nas associações dos indicadores metabólicos de pressão sistólica e peptídeo-C, com destaque para o IGF-1

Peptídeos antimicrobianos são vistos como alternativas promissoras a serem empregadas pela iindústria farmacêutica no controle de infecções causadas por microrganismos, como também na indústria alimentícia, onde podem desempenhar papéis como conservantes naturais de alimentos. Plantaricina149 é um membro deste grupo, sendo composto por 22 resíduos de aminoácidos, com natureza catiônica e atividade inibitória sobre algumas bactérias patogênicas. Neste trabalho, foram sintetizados diferentes peptídeos análogos à Plantaricina149 para investigar suas ações sobre microrganismos (bactérias e fungos), a fim de correlacionar estes estudos com a ação lítica do peptídeo em modelos de membrana diversos (monocamadas e vesículas fosfolipídicas). A interação de Plantaricina149 com estes sistemas foi monitorada pelas espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência, ensaios de tensão superficial, calorimetria e ressonância plasmônica de superfície, e mostrou ser altamente específica para superfícies fosfolipídicas que apresentam densidade de cargas negativas, tais como a membrana celular de bactérias. A interação eletrostática inicial que se estabelece entre o peptídeo e os fosfolipídios é de extrema importância, sendo capaz de induzir uma estruturação helicoidal na região C-terminal do peptídeo, enquanto a região Nterminal contribui com as interações hidrofóbicas necessárias para a penetração do peptídeo nas camadas fosfolipídicas levando a ruptura das mesmas. De forma semelhante, a atividade antimicrobiana de Plantaricina149a (e alguns de seus análogos) também mostrou ser resultado das interações das duas regiões da molécula, e foi afetada com a retirada ou modificação da região N-terminal do peptídeo. Com a deleção desta região, o peptídeo passou a ter somente ação bacteriostática sobre Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, perdendo a capacidade bactericida. / Antimicrobial peptides are seen as promising alternatives to be employed in pharmaceutical industry for controlling infections caused by microorganisms, and also in food industry, where they can play roles as natural food preservatives. Plantaricina149 is a member of this group, constituted of 22 amino acid residues, cationic in nature and presenting inhibitory activity against some pathogenic bacteria. In this work, different Plantaricina149 analog peptides were synthesized to investigate their action against microorganisms (bacteria and fungi), with the aim of correlating these studies with the lytic action of the peptide on several membrane models (phospholipid monolayers and vesicles). The Plantaricina149 interaction with these systems was monitored by circular dichroism and fluorescence spectroscopies, surface tension assays, calorimetry and surface plasmon resonance, and showed to be highly specific to phospholipid surfaces that present negative charge density, such as the bacteria cell membrane. The initial peptide-phospholipids electrostatic interaction is extremely important, and it is capable of inducing a helical structure in the peptide C-terminal region, while the Nterminal region contributes with the hydrophobic interactions needed to the peptide penetration in the phospholipid layers and to the disruption of them. Similarly, the Plantaricina149 antimicrobial activity has also proved to be a result of the interactions from the two regions of the molecule, and it was strongly affected by the removal or modification of the peptide N-terminal region. Promoting the deletion of this region has left the peptide only with a bacteriostatic action against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, removing its bactericide ability.

A imagem molecular oferece a perspectiva de detectar doenças bem antes de os sintomas surgirem. A vasculatura tumoral é vital no crescimento do tumor e na disseminação de metástases, sendo assim alguns radiofármacos são dirigidos para a angiogênese. O glioma, tumor cerebral de baixa incidência porém alta mortalidade, requer um diagnóstico precoce para favorecimento da abordagem terapêutica. O objetivo desse estudo foi o desenvolvimento de novo radiofármaco para diagnóstico por imagem de glioma, baseado em peptídeos angiogênicos (GX1 e GX1-RGD) marcados com o radioisótopo tecnécio-99m. O desempenho dos conjugados peptídicos mostraram-se bastante parecidos em diversas avaliações. Eles foram radiomarcados com alta pureza radioquímica (>96%) e estáveis em soro até pelo menos 4h. Ambos são hidrofílicos e com baixa ligação às proteínas plasmáticas. A biodistribuição em animais sadios demonstrou alta excreção renal e depuração sanguínea rápida para ambos os radiotraçadores. Nos estudos in vitro, o 99mTc-HYNIC-PEG4-c(GX1) apresentou picos de ligação aos 60 min e o 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) aos 120 min, nas células endoteliais HUVEC, usadas como controle, e nas células tumorais das linhagens U87MG e T98G. A captação tumoral nos animais foi mais acentuada para células U87MG, especialmente para o 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) (2,87 ± 0,53% DI/g) aos 60 min p.i., com boa visualização em imagens adquiridas por gama-câmara e micro-SPECT/CT. Estudos realizados com os peptídeos conjugados à nanopartículas magnéticas para visualização em ressonância magnética também demonstraram especificidade dos produtos em tecidos tumorais. O desempenho do 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) foi superior que o do traçador GX1, quanto à captação no glioma humano, podendo ser considerado como um promissor radiofármaco para diagnóstico de gliomas. / Molecular imaging offers the prospect of detecting diseases well before the symptoms appear. The tumor vasculature is vital in the tumor growth and dissemination of metastasis, thus some radiopharmaceuticals are directed to angiogenesis. The glioma, a brain tumor of low incidence but high mortality, requires an early diagnosis for favoring therapeutic approaches. The aim of this study was the development of a new radiopharmaceutical for imaging diagnosis of glioma, based in angiogenic peptides (GX1 and RGD-GX1) radiolabeled with technetium-99m radioisotope. The peptidic conjugates showed very similar performance in several evaluation. They were radiolabeled with high radiochemical purity (>96%) and are stable in the blood serum at least for four hours. Both are hydrofilic and had minimal binding to plasma protein. The biodistribution in healthy mice at many times, showed high renal excretion and fast blood clearance for both radiotracers. At in vitro studies, the 99mTc-HYNIC-PEG4-c(GX1) exhibit binding peaks at 60 min and the 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) at 120 min, at HUVEC endotelial cells, used as control, and at tumor cell lines U87MG and T98G. The animal tumor uptake was more pronounced for U87MG cells, specially for 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) (2.87 ± 0.53% DI/g) at 60 min p.i., with good visualization in images acquired with gama-camara and micro-SPECT/CT. Studies performed with peptides conjugate to magnetonanoparticles for MRI visualization also demonstred the peptides specificity in tumor tissue.The 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) performance was superior to the GX1 tracer, regarding the glioma uptake, and may be consider as a promisser radiopharmaceutical for glioma diagnosis.

A imagem molecular oferece a perspectiva de detectar doenças bem antes de os sintomas surgirem. A vasculatura tumoral é vital no crescimento do tumor e na disseminação de metástases, sendo assim alguns radiofármacos são dirigidos para a angiogênese. O glioma, tumor cerebral de baixa incidência porém alta mortalidade, requer um diagnóstico precoce para favorecimento da abordagem terapêutica. O objetivo desse estudo foi o desenvolvimento de novo radiofármaco para diagnóstico por imagem de glioma, baseado em peptídeos angiogênicos (GX1 e GX1-RGD) marcados com o radioisótopo tecnécio-99m. O desempenho dos conjugados peptídicos mostraram-se bastante parecidos em diversas avaliações. Eles foram radiomarcados com alta pureza radioquímica (>96%) e estáveis em soro até pelo menos 4h. Ambos são hidrofílicos e com baixa ligação às proteínas plasmáticas. A biodistribuição em animais sadios demonstrou alta excreção renal e depuração sanguínea rápida para ambos os radiotraçadores. Nos estudos in vitro, o 99mTc-HYNIC-PEG4-c(GX1) apresentou picos de ligação aos 60 min e o 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) aos 120 min, nas células endoteliais HUVEC, usadas como controle, e nas células tumorais das linhagens U87MG e T98G. A captação tumoral nos animais foi mais acentuada para células U87MG, especialmente para o 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) (2,87 ± 0,53% DI/g) aos 60 min p.i., com boa visualização em imagens adquiridas por gama-câmara e micro-SPECT/CT. Estudos realizados com os peptídeos conjugados à nanopartículas magnéticas para visualização em ressonância magnética também demonstraram especificidade dos produtos em tecidos tumorais. O desempenho do 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) foi superior que o do traçador GX1, quanto à captação no glioma humano, podendo ser considerado como um promissor radiofármaco para diagnóstico de gliomas. / Molecular imaging offers the prospect of detecting diseases well before the symptoms appear. The tumor vasculature is vital in the tumor growth and dissemination of metastasis, thus some radiopharmaceuticals are directed to angiogenesis. The glioma, a brain tumor of low incidence but high mortality, requires an early diagnosis for favoring therapeutic approaches. The aim of this study was the development of a new radiopharmaceutical for imaging diagnosis of glioma, based in angiogenic peptides (GX1 and RGD-GX1) radiolabeled with technetium-99m radioisotope. The peptidic conjugates showed very similar performance in several evaluation. They were radiolabeled with high radiochemical purity (>96%) and are stable in the blood serum at least for four hours. Both are hydrofilic and had minimal binding to plasma protein. The biodistribution in healthy mice at many times, showed high renal excretion and fast blood clearance for both radiotracers. At in vitro studies, the 99mTc-HYNIC-PEG4-c(GX1) exhibit binding peaks at 60 min and the 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) at 120 min, at HUVEC endotelial cells, used as control, and at tumor cell lines U87MG and T98G. The animal tumor uptake was more pronounced for U87MG cells, specially for 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) (2.87 ± 0.53% DI/g) at 60 min p.i., with good visualization in images acquired with gama-camara and micro-SPECT/CT. Studies performed with peptides conjugate to magnetonanoparticles for MRI visualization also demonstred the peptides specificity in tumor tissue.The 99mTc-HYNIC-E-[c(RGDfk)-c(GX1)]) performance was superior to the GX1 tracer, regarding the glioma uptake, and may be consider as a promisser radiopharmaceutical for glioma diagnosis.

O câncer de mama representa um importante problema de saúde pública. O microambiente onde as células neoplásicas se encontram desempenha importante papel na tumorigênese e progressão tumoral. Nosso Laboratório estuda o efeito da laminina, importante glicoproteína da matriz extracelular (MEC) e seus peptídeos dentro da biologia tumoral. Nesse projeto detectamos, in vitro e em amostras de câncer de mama humano, peptídeos derivados da clivagem proteolítica da laminina no câncer de mama. Inicialmente analisamos a distribuição das cadeias da laminina-111 no câncer de mama humano. Análise imuno histoquímica demonstrou aumento da marcação para as cadeias alfa1, beta1 e gama1 da laminina em tumores de mama. Células derivadas de câncer de mama (MDA-MB-231 e MCF-7) foram crescidas sobre Matrigel (substrato enriquecido em laminina). Células de mama normal MCF-10A serviram como grupo controle. Amostras controles e tratadas foram submetidas a eletroforese, immunoblot e espectrometria de massas (LC-MS/MS). Immunoblot mostrou a clivagem das cadeias da laminina in vitro e no câncer de mama humano, com a geração de fragmentos de menor massa molecular. Exploramos a liberação de peptídeos gerados pela clivagem da laminina em amostras de células tumorais em cultura e no câncer de mama humano. Análise proteômica mostrou que as bandas derivadas da laminina exibiram a presença de 31 peptídeos, entre eles C16 (KAFDITYVRL) e C28 (RVTLNRL). Previamente já demonstramos que o peptídeo C16 possui alta relevância na regulação tumoral. Diferentes peptídeos foram sintetizados e suas atividades biológicas avaliadas. Entre eles, C16 e C28 aumentaram significantemente a adesão, proliferação, secreção e ativação de MMPs além de invasão de células derivadas do câncer de mama (MDA-MB-231) e também de células derivadas de fibrossarcoma (HT1080). Investigamos também a ação do peptídeo C16 sobre as células tumorais MDA-MB-231 injetadas em zebrafish para avaliação do desenvolvimento tumoral in vivo. C16 promoveu aumento da área tumoral in vivo em comparação aos grupos controles. Concluímos que as cadeias alfa1, beta1 e gama1 da laminina estão aumentadas no câncer de mama. A clivagem da laminina possivelmente ocorre através da atividade de MMPs. As cadeias da laminina que são clivadas in vitro e no câncer de mama humano, geram fragmentos que contém peptídeos com funções biológicas evidentes. Entre os peptídeos observados, detectamos o peptídeo C16 in vitro e in vivo<i/>, também detectamos o peptídeo C28 in vitro. O peptídeo C16 é um grande regulador da invasão de células MDA-MB-231 e células HT1080, além de promover o desenvolvimento tumoral in vivo. Já o peptídeo C28 promove a proliferação de células MDA-MB-231 e HT1080. / Breast cancer represents an important public health problem. The microenvironment plays an important role in tumorigenesis and tumor progression. Our laboratory studies the effect of laminin, an important extracellular matrix glycoprotein (ECM) and its peptides in tumor biology. In this project we detected, in vitro and in human breast cancer samples, peptides derived from proteolytic cleavage of laminin. We initially analyzed the distribution of laminin-111 chains in human breast cancer. Immunohistochemistry demonstrated increased laminin alpha1, beta1 and gamma1 chains in breast tumors. Cells derived from breast cancer (MDA-MB-231 and MCF-7) were grown on Matrigel (laminin-enriched substrate). Normal breast cells MCF-10A served as a control group. Control and treated samples were subjected to electrophoresis, immunoblot and mass spectrometry (LC-MS/MS). Immunoblot showed cleavage of the laminin chains in vitro and in human breast cancer, with generation of lower molecular mass fragments. We explored the release of peptides, generated by laminin cleavage in tumor cell samples in culture and in human breast cancer. Proteomic analysis showed that the bands derived from laminin exhibited the presence of 31 peptides, among them C16 (KAFDITYVRL) and C28 (RVTLNRL). We have previously demonstrated that the C16 peptide has high relevance in tumor regulation. Different peptides were synthesized, and their biological activities were analyzed. Among them, C16 and C28 peptides, significantly increased adhesion, proliferation, secretion and activation of MMPs and cell invasion in breast cancer cells (MDA-MB-231) as well as fibrosarcoma-derived cells (HT1080). In addition, we investigated the action of the C16 peptide on zebrafish-injected MDA-MB-231 tumor cells for evaluation of tumor development in vivo. C16 promoted increase in tumor area in vivo compared to control groups. We conclude that, laminin alpha1, beta1 and gamma1 chains are increased in breast cancer. Laminin chains that are cleaved in vitro and in human breast cancer, generate fragments containing peptides with obvious biological functions. Among the peptides observed, we detected the C16 peptide in vitro and in vivo, we also detected the C28 peptide in vitro. C16 peptide is a major regulator of the invasion of MDA-MB-231 cells and HT1080 cells, in addition C16 promotes tumor development in vivo. C28 peptide promotes the proliferation of MDA-MB-231 and HT1080 cells.

Peptídeos antimicrobianos são vistos como alternativas promissoras a serem empregadas pela iindústria farmacêutica no controle de infecções causadas por microrganismos, como também na indústria alimentícia, onde podem desempenhar papéis como conservantes naturais de alimentos. Plantaricina149 é um membro deste grupo, sendo composto por 22 resíduos de aminoácidos, com natureza catiônica e atividade inibitória sobre algumas bactérias patogênicas. Neste trabalho, foram sintetizados diferentes peptídeos análogos à Plantaricina149 para investigar suas ações sobre microrganismos (bactérias e fungos), a fim de correlacionar estes estudos com a ação lítica do peptídeo em modelos de membrana diversos (monocamadas e vesículas fosfolipídicas). A interação de Plantaricina149 com estes sistemas foi monitorada pelas espectroscopias de dicroísmo circular e fluorescência, ensaios de tensão superficial, calorimetria e ressonância plasmônica de superfície, e mostrou ser altamente específica para superfícies fosfolipídicas que apresentam densidade de cargas negativas, tais como a membrana celular de bactérias. A interação eletrostática inicial que se estabelece entre o peptídeo e os fosfolipídios é de extrema importância, sendo capaz de induzir uma estruturação helicoidal na região C-terminal do peptídeo, enquanto a região Nterminal contribui com as interações hidrofóbicas necessárias para a penetração do peptídeo nas camadas fosfolipídicas levando a ruptura das mesmas. De forma semelhante, a atividade antimicrobiana de Plantaricina149a (e alguns de seus análogos) também mostrou ser resultado das interações das duas regiões da molécula, e foi afetada com a retirada ou modificação da região N-terminal do peptídeo. Com a deleção desta região, o peptídeo passou a ter somente ação bacteriostática sobre Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa, perdendo a capacidade bactericida. / Antimicrobial peptides are seen as promising alternatives to be employed in pharmaceutical industry for controlling infections caused by microorganisms, and also in food industry, where they can play roles as natural food preservatives. Plantaricina149 is a member of this group, constituted of 22 amino acid residues, cationic in nature and presenting inhibitory activity against some pathogenic bacteria. In this work, different Plantaricina149 analog peptides were synthesized to investigate their action against microorganisms (bacteria and fungi), with the aim of correlating these studies with the lytic action of the peptide on several membrane models (phospholipid monolayers and vesicles). The Plantaricina149 interaction with these systems was monitored by circular dichroism and fluorescence spectroscopies, surface tension assays, calorimetry and surface plasmon resonance, and showed to be highly specific to phospholipid surfaces that present negative charge density, such as the bacteria cell membrane. The initial peptide-phospholipids electrostatic interaction is extremely important, and it is capable of inducing a helical structure in the peptide C-terminal region, while the Nterminal region contributes with the hydrophobic interactions needed to the peptide penetration in the phospholipid layers and to the disruption of them. Similarly, the Plantaricina149 antimicrobial activity has also proved to be a result of the interactions from the two regions of the molecule, and it was strongly affected by the removal or modification of the peptide N-terminal region. Promoting the deletion of this region has left the peptide only with a bacteriostatic action against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa, removing its bactericide ability.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-08Bitstream added on 2014-06-13T20:29:34Z : No. of bitstreams: 1 silva_avr_me_rcla.pdf: 1706887 bytes, checksum: eda68ea29b93397b581e427121535611 (MD5) / Neste trabalho estudou-se a estrutura, função e mecanismo de ação do peptídeo antibacteriano Protonectarina-MP (isolado de veneno da vespa social Protonectarina sylveirae) tendo seu resíduo C-terminal nas formas ácida (-OH) e amidada (-NH2). Os peptídeos foram sintetizados, utilizando-se a estratégia Fmoc, purificados por cromatografia líquida de alta performance. O monitoramento do material sintético foi feito por espectrometria de massas ESI-MS e por seqüenciamento através de Química Degradativa de Edman. A estrutura secundária foi investigada pelo uso de espectroscopia de dicroísmo circular e modelagem molecular. Atividade lítica (extravasamento) e interação do resíduo de triptofano em vesículas foram investigadas pelo uso de espectrômetro de fluorescência. Foram realizados ensaios sobre as interações desses peptídeos em meio de vesículas zwitteriônicas e aniônica, formando complexos proteolipossomos que foram submetidos à troca isotópica H/D monitorada por espectrometria de massas ESI-MS e MS/MS. Além disso, foram realizados ensaios biológicos de atividade hemolítica, de desgranulação de mastócito, de liberação da enzima citoplasmática Lactato Desidrogenase e de atividade antimicrobianas. Os dados de CD revelam uma tendência dos peptídeos se estruturarem em hélice-α em ambiente hidrofóbico e em ambiente de membranas. Porém, o mesmo não pode ser observado em meio aquoso. Os modelos obtidos para ambos os peptídeos por modelagem molecular mostram uma estruturação em hélice-α anfipática. Nos ensaios de atividade lítica em vesículas, os peptídeos apresentaram um processo com cooperatividade positiva, com curvas de dose-resposta que mostram uma dependência sigmoidal com a concentração do peptídeo. Os resultados da fluorescência do triptofanos mostram um deslocamento da emissão para a região de onda do azul para o peptídeo... / In the present work was studied the structure, function and mechanism of action of the antibacterial peptide Protonectarina-MP (isolated from venom of social wasp Protonectarina sylveirae) with its carboxyamidation (-NH2) and carboxyl-free (-OH) Cterminal forms. The peptides were manually synthesized on-solid phase by using Fmoc strategy and purified under HPLC. The homogeneity of the synthetic material was analyzed by ESI mass spectrometry and Edman Degradation Chemistry. The secondary structure was investigated through circular dichroism (CD) spectroscopy and molecular modeling. Lytic activity and peptides interaction with the membranes was also investigated through tryptophan emission, by fluorescence spectrometry. The interaction of peptides with zwitterionic and anionic vesicles was investigated through the combination of H/D exchange and ESI-mass spectrometry. Some biological activities, like: mast cell degranulation, release of cytoplasmic enzyme lactate dehydrogenase, hemolysis and antibiosis were investigated for both peptides. The CD spectra revealed that the peptides in hydrophobic environments or in presence of biological membranes have the tendency to form helix conformations; however, organized structures were not observed in aqueous or buffer solutions. The models obtained by molecular modeling show that both peptides form an amphipathic α-helix. The peptides presented a positive cooperative process in the lytic activity of vesicles, with dose-response curves presenting a sigmoidal dependence with the peptide concentration. The results of the fluorescence of tryptophans showed a shift of the emission wavelength to the blue region of the peptide Protonectarina-MP (-NH2), which was not observed for its analogue presenting the C-terminal residue in free acid form. This is indicating a greater interaction of the amidated peptide in membranes, when compared to the peptide... (Complete abstract click electronic access below)

A síntese em fase sólida é o método mais utilizado na obtenção de peptídeos em laboratório. Em geral, as diferentes etapas do processo são realizadas em temperatura ambiente. De fato, até o início desta década, temperaturas elevadas (>40ºC) eram empregadas apenas esporadicamente nas etapas de acoplamento. Em 1993, entretanto, Rabinovich e Rivier propuseram a realização de todas as etapas do processo a 75ºC. Em 1996, Saneei e colaboradores tentaram automatizar o processo a 40-50ºC, apesar de não ter sido feita nenhuma avaliação sistemática prévia. Em 1997, Varanda & Miranda descreveram o primeiro estudo sistemático feito com o objetivo de investigar aspectos, vantagens, desvantagens e limitações da SPFS em altas temperaturas. O presente trabalho teve como objetivo ampliar os conhecimentos sobre o método através da avaliação de três importantes aspectos considerados problemáticos na SPFS convencional: racemização, agregação e síntese de peptídeos longos. Para tanto, vários peptídeos foram escolhidos como modelos de estudo. Todos eles foram sintetizados por SPFS convencional (usando protocolos de rotina de nosso laboratório) e por SPFS em alta temperatura (empregando as condições experimentais descritas por Varanda & Miranda em 1997). Os materiais brutos foram comparados em: 1- suas recuperações a partir de suas peptidil-resinas correspondentes; 2- suas qualidades. RP-HPLC, determinação do conteúdo de aminoácidos e CE foram os métodos de análise empregados. Os produtos e subprodutos majoritários foram isolados para caracterização química por análise de aminoácidos de seus hidrolisados totais e por espectrometria de massas. Os resultados obtidos demonstraram que no aspecto racemização a SPFS em alta temperatura, nas condições experimentais empregadas, mostrou-se equivalente à SPFS convencional: a incidência de estereoisômeros contaminantes nos peptídeos brutos foi inferior a 1%. O estudo do aspecto agregação evidenciou que se por um lado as condições experimentais empregadas para a SPFS em alta temperatura levaram a uma suposta minimização, por outro os peptídeos brutos obtidos foram de qualidade muito inferior a daqueles provenientes da síntese convencional: interrupções do crescimento das cadeias em resíduos de glutamina levaram à formação significativa de peptídeos contaminantes delatados. Se a agregação está ou não relacionada ao favorecimento destas reações secundárias é questão ainda não respondida. A síntese da CCK-22 humana não sulfatada sugeriu que o método de SPFS em alta temperatura é adequado à sua obtenção com bom rendimento e em tempo reduzido. Entretanto, a síntese da CCK-33 correspondente, um protótipo de peptídeo longo de seqüência complexa, evidenciou que, para a obtenção deste tipo de composto, a mistura 25%DMSO/tolueno pode não ser o solvente ideal comum para as etapas de desproteção, neutralização e acoplamento. Nestas condições, a mistura DIC/HOBt pode também não ser a melhor opção. / Stepwise solid-phase synthesis (SPPS) is the method of choice to prepare peptides. Although deprotection, neutralization and acetylation have been generally carried out at room temperature, the couplings have not. Indeed, elevated temperatures have been used to enhance coupling efficiency in conventional SPPS. The idea of performing all the synthetic steps at high temperatures, shortening the peptide chain build-up process, has not been explored until the 90s. In 1993, Rabinovich & Rivier proposed some modifications to the conventional SPPS protocols and achieved some peptide syntheses by performing deprotection, neutralization, coupling and acetylation at 75 ºC. In 1996, Saneei and co-workers tried to automate the entire synthetic process at 40-50 ºC. In 1997, Varanda & Miranda reported the first systematic study on SPPS at elevated temperatures. These authors determined optimized synthesis conditions of unsulfated cholecystokinin-12 by investigating aspects of the methodology such as temperature, solvent systems, resins compatibility, type of resins, peptide-resins swelling properties and, also, coupling agents efficiencies. The main goal of the present work was to evaluate SPPS at elevated temperature in three different aspects: racemization, aggregation and applicability to the synthesis of long and complex. peptides. For that, we chose some model peptides and synthesized them manually using conventional SPPS (our laboratory\'s routine protocols) and SPPS at elevated temperature (Varanda & Miranda\'s protocols). The crude peptides were compared in their recoveries from the corresponding peptidyl-resins after final cleavage and full deprotection and in their qualities. RP-HPLC, CE and amino acid analyses were the techniques employed in the comparisons. The major products and by-products were isolated and characterized using amino acid analysis and mass spectrometry. The results can be summarized as follows: 1- no significant contamination resulting from racemization has been detected in the crude peptides. The amounts of stereoisomers present on the crude peptides were always lower than 1% independently of the SPPS method employed or the analytical technique used for comparison; 2- no final conclusion could be taken regarding to the aggregation phenomenon. Under the experimental conditions employed for SPPS at elevated temperature, some couplings were definitely favoured. Despite that, the crude materials obtained showed low purities. Isolation and characterization of the major contaminants led us to conclude that the occurrence of undesired chain termination have also been favoured. Whether aggregation is related to that or not is to be investigated. 3- the SPPS at elevated temperature protocol employed showed to be suitable for the synthesis of unsulfated human CCK-22. The same can not be said for the unsulfated human CCK-33, a large and complex peptide. Thus, we concluded that for the preparation of this type of compound 25%DMSO/toluene and/or its combination with DIC/HOBt may not be a good choice.

A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença que atinge primariamente os pulmões, podendo também ocorrer de forma sistêmica e, é causada pelo fungo termo dimórfico Paracoccidioides spp. Os principais medicamentos para o tratamento da PCM são quimioterápicos poliênicos, compostos sulfanilamídicos e os azóis. Uma possível ferramenta para tratar e/ ou prevenir a PCM é o uso de vacinas para a geração de resposta imune principalmente do tipo Th1, produtora de IFN-gama, citocina com papel importante para o controle da doença. Um dos candidatos vacinais mais estudados para a PCM, é a vacina com base no peptídeo P10, formado por 15 resíduos de aminoácidos (aa), derivado da glicoproteína de 43 kDa de P. brasiliensis. Com o objetivo de se aprimorar o efeito imunomodulador do peptídeo P10, foi proposto neste trabalho a sua complexação com nanopartículas poliméricas de quitosana. A quitosana foi escolhida em função das suas características físico-químicas e biológicas tais como biocompatibilidade e mucoadesividade, características essenciais para o trabalho em questão. As nanopartículas de quitosana complexadas com o peptídeo P10 em diferentes concentrações foram produzidas a partir da técnica de gelificação iônica e, posteriormente caracterizadas em função do seu tamanho, índice de poli dispersão (PDI) e potencial Zeta (potencial Z). A eficiência de encapsulação foi avaliada utilizando-se o Qubit&trade; Protein Assay Kit e a toxicidade verificada por ensaios de hemólise e viabilidade celular de macrófagos murinos, da linhagem J774.16. As nanopartículas apresentaram tamanho médio de 220 nm, PDI abaixo de 0,5 e potencial Zeta de + 20 mV. A eficiência de encapsulação foi maior que 90% e não houve citotoxicidade nas primeiras 24 horas. O tratamento com as nanopartículas contendo diferentes concentrações do peptídeo P10 foi eficiente na redução da carga fúngica pulmonar, durante a PCM murina. Estes resultados mostram que a nanopartícula é estável e apresenta as características físico-químicas desejáveis para este trabalho, sendo elas capazes de reduzir de 4 a 20 vezes a concentração usual padrão do peptídeo P10. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a disease caused by the thermo-dimorphic fungal species of Paracoccidioides spp. that mainly affects the lungs and can also occur systemically. The main drugs for the treatment of PCM are polyene chemotherapeutics, sulfanilamidic compounds and azoles. As an alternative for treating and / or preventing PCM, the use of vaccines has been explored, allowing the generation of a Th1-type immune response, with IFN-&gamma;production, important for the control of the disease. One of the most studied vaccine candidates is the P10 peptide-based vaccine, consisting of 15 amino acids (aa), which is derived from the 43 kDa glycoprotein of P. brasiliensis. In order to improve the immunomodulatory effect of P10 peptide, the complexation with chitosan polymer nanoparticles is being proposed in this project. Chitosan was chosen according to its physico-chemical and biological characteristics such as: biocompatibility and mucoadhesiveness, essential characteristics for this project. The nanoparticles complexed with P10 peptide at different concentrations were produced from the ionic gelation technique and their size, poly dispersion index (PDI), and Zeta potential (Z potential) were analyzed. The encapsulation efficiency was assessed using the Qubit&trade; Protein Assay Kit and the toxicity verified by hemolysis and cell viability assays with murine J774.16 macrophages. The nanoparticles obtained presented a size of approximately 220 nm, PDI below 0.5 and Zeta potential of approximately + 20 mV. The encapsulation efficiency was greater than 90% and there was no cytotoxicity in the first 24 hours. Treatment with the nanoparticles containing different concentrations of P10 peptide was efficient in reducing lung fungal load during murine PCM. These results show that the nanoparticle is stable and presents the physicochemical characteristics desirable in this project, being able to reduce from 4 to 20 the usual standard concentration of the peptide P10 peptide.