Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCERP.pdf: 7686183 bytes, checksum: 7089a44583b91163644fe84b338f17b7 (MD5) Previous issue date: 2006-10-04 / In this work classical molecular dynamics was used to study the pure ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate, [BMIM]+[BF4]-, and some solutions based in it. The OPLS-AA force field and CHelpG derived charges were used to represent the interactions. The results obtained for the pure liquid agreed well with theoretical and experimental data available. The diffusion of ions in this liquid was investigated through the solvation of KCl salt. The result showed that the diffusion of K+ and Cl- are small when compared with the diffusion observed in aqueous solution. The results obtained for K+ and Cl- ions are also small compared to the diffusion regime observed for the ionic pair [BMIM]+[BF4]- in water. The solvation of an oligopeptídeo, formed by six alanines, aminoacids in this liquid was investigated at two temperatures, 300K and 400K. The effect of water molecules in the oligopeptide neighborhood was also investigated. The spc-model (Simple Point Charge) was used to represent the water molecules. Compared to the peptide behavior in water the results obtained in the ionic liquid showed that the peptide structure was constrained. It was also observed that the presence of water molecules near the oligopeptide increased its conformational mobility. The effect media polarization on the electronic structure of ionic liquid components was analyzed investigating the dipole momentum distribution for 1,4-dimethylimidazolio cation in both isolated and in condensed phase. The dipole distribution for chloride in condensed phase was also performed. / Neste trabalho foi utilizada dinâmica molecular clássica para estudar tanto o líquido iônico tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazólio puro quanto algumas soluções baseadas nele. Para representar as interações foi empregado o campo de forças OPLS-AA com cargas parciais derivadas da metologia CHelpG. Os resultados obtidos para o líquido puro concordam com os dados teóricos e experimentais disponíveis na literatura. A difusão de íons neste líquido iônico foi investigada por meio da dissolução de um par iônico sal KCl. Os resultados obtidos mostram que a difusão dos íons K+ e Cl- é muito pequena se comparada à difusão destas espécies em solução aquosa. A difusão dos íons do cloreto de potássio no líquido iônico também foi muito pequena se contrastada com o regime difusicional observado para as espécies [BMIM]+ e [BF4]- diluídas em água. A solvatação de um oligopeptídeo, formado por seis alaninas, neste líquido foi investigada em duas temperaturas, 300K e 400K. O efeito causado pela presença de moléculas de água na vizinhança do oligopeptídeo também foi analisado. As moléculas de água forma representadas como modelo spc ( Simple Point Charge). Comparado com o comportamento do oligopeptídeo em água, observou em líquido iônico uma maior rigidez estrutural do oligopeptídeo. Foi também observado que a presença de moléculas de água próximas à molécula biológica aumenta a mobilidade conformacional desta. O efeito de polarização sobre a estrutura eletrônica do líquido iônico foi analisado por meio do estudo da distribuição do momento de dipolo do cátion 1,4-dimetilimidazólio isolado e em fase condensada. A distribuição do momento de dipolo para o ânion cloreto em fase condensada também foi investigada.

O peptídeo liberador de gastrina (GRP) age como potente mitógeno em tecidos neoplásicos pela ativação do seu receptor (GRPR), que é super expresso em estágios avançados de neuroblastoma humano. GRPR knockdown ou antagonistas de GRPR mostraram inibir o crescimento de neuroblastoma. Investigou-se, em condições experimentais, que os antagonistas de GRPR podem promover, em vez de inibir o crescimento de células de neuroblastoma. O antagonista do GRPR, RC-3095 em 0,1 nM inibiu, enquanto a concentração de 100 nM estimulou a proliferação de células de neuroblastoma murino Neuro2a, in vitro. Os efeitos proliferativos de RC -3095 no crescimento celular foram impedidos pelo inibidor de deacetilase de histona (HDI), butirato sódico (NAB). Estes resultados fornecem a primeira evidência de que um antagonista do GRPR pode estimular o crescimento de células cancerosas, e sugerem que o GRPR pode interagir com os mecanismos epigenéticos na regulação do crescimento de células do neuroblastoma.

Submitted by Carolina Reis Zambom null (carolinarz@gmail.com) on 2018-03-20T17:16:52Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Carol_versão correçãotodos_versãofinalpósdefesa-edit.pdf: 2874016 bytes, checksum: 09ff8b1558d91035a2e106afc33f8bd8 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-03-23T17:38:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 zambom_cr_me_araiq_int.pdf: 2737311 bytes, checksum: 4eca302db8e9f1efe9d15f6049d7aa9a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-23T17:38:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 zambom_cr_me_araiq_int.pdf: 2737311 bytes, checksum: 4eca302db8e9f1efe9d15f6049d7aa9a (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Atualmente aproximadamente 75-88% das infecções fúngicas são causadas por espécies de Candida, que geram um custo de 1,7 bilhões de dólares para a saúde pública, somente nos EUA. Candida albicans é o principal microrganismo causador da candidíase bucal, uma infecção da mucosa oral do organismo humano. A patogenicidade dessa espécie está relacionada com a formação de biofilmes, que agem como um revestimento impermeável e protetor, e tornam o microrganismo resistente a medicamentos convencionais. Neste caso, os antifúngicos mais comumente utilizados, não apresentam ação eficaz. Por esse motivo, a busca por novas opções de tratamento e por novos medicamentos está em constante desenvolvimento, principalmente na área da biotecnologia. Um exemplo disso são os peptídeos antifúngicos da família das Histatinas, entre eles a Histatina-5. Trata-se de um peptídeo naturalmente encontrado na saliva humana, mas que sofre rápida degradação quando presente na cavidade bucal, que é seu local de ação. Diante disto, o objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de lipossomas de diferentes composições lipídicas, na intenção de proteger o peptídeo e melhorar sua ação, preservando seu potencial antifúngico. Para isso foi sintetizado o peptídeo 0WHistatina-5, um análogo do peptídeo Histatina-5, que contém o aminoácido triptofano em sua sequência. Foi utilizado o método de síntese em fase sólida, seguido de clivagem e purificação, com confirmação da massa molecular utilizando HPLC e ESI-MS. Os lipossomas foram produzidos pelo método de hidratação do filme lipídico, em 3 composições lipídicas diferentes, denominadas de F1, F2 e F3. F1 possui somente DPPC e Chol em sua composição, F2 contém, além desses componentes, PEG e F3 contém DPPC, Chol e POPG. Os lipossomas foram submetidos a processo de extrusão e sonicação para padronização do tamanho das vesículas, e estudo da melhor técnica para sua produção. Os lipossomas foram caracterizados por espalhamento de luz dinâmico determinação da eficiência de encapsulação, cinética de liberação, estabilidade e avaliação da atividade antifúngica. O método de síntese do peptídeo 0WHistatina-5 foi adequado e o processo de purificação possibilitou a obtenção do peptídeo com alto grau de pureza. Os lipossomas obtidos por extrusão apresentaram tamanho médio na faixa de 100 nm, enquanto os lipossomas obtidos por sonicação apresentaram tamanho menor, na faixa de 90 nm. Os lipossomas contendo 0WHistatina-5, apresentaram aumento em seu tamanho médio, indicando que o peptídeo está contido no compartimento interno aquoso dos lipossomas. A eficiência de encapsulação foi maior para os lipossomas obtidos por sonicação, sendo de 34,5% para a formulação F1, que contém DPPC e Chol em sua composição. A composição lipídica dos lipossomas está relacionada com a sua eficiência de encapsulação, e a presença de colesterol dificultou a encapsulação do peptídeo. A estabilidade das formulações também está relacionada com sua composição, sendo a formulação F3, obtida por sonicação e com POPG em sua formulação, a que apresentou melhor estabilidade quando armazenada por 60 dias a temperatura de 4°C. As formulações desenvolvidas apresentaram capacidade de liberar o peptídeo pelo tempo total de 96 horas, com o primeiro pico de liberação após 5 horas, e novo aumento do conteúdo liberado após 30 horas. O ensaio antimicrobiano foi realizado utilizando C. albicans ATCC 10231, e demostrou que no tempo de 4 horas a inibição para F1 foi de 66,5%. Assim, este trabalho demonstrou que a utilização de sistemas nanoestruturados é de grande importância para viabilizar a aplicação do peptídeo Histatina-5 em estudos terapêuticos, e em estudos in vivo no futuro. / Currently, approximately 75-88% of fungal infections are caused by Candida species, which generate a cost of $ 1.7 billion for public health in the US. Candida albicans is the main microorganism that causes oral candidiasis, an infection of the oral mucosa of the human organism. The pathogenicity of this species is related to the formation of biofilms, which act as an impermeable and protective coating, and make the microorganism resistant to conventional drugs. In this case, the most commonly used antifungals, have no effective action. For this reason, the search for new treatment options and new drugs is in constant development, especially in the biotechnology area. The antifungal peptides of the Histatin family, including Histatin-5, are an example. The Histatin-5 is a peptide naturally found in human saliva, but it undergoes rapid degradation when present in the oral cavity, which is its place of action. For this reason, this work aimed at developing liposomes of different lipid compositions, in order to protect the peptide, improve its action, and preserve its antifungal potential. For this, the peptide 0WHistatin-5, an analog of the peptide Histatin-5, was synthesized, which contains the amino acid tryptophan in its sequence. Therefore, the peptide was synthesized manually by the solid phase synthesis method, followed by cleavage and purification. The molecular weight was confirmed by using HPLC and ESI-MS. The liposomes were produced by the lipid film hydration method, with three different lipid compositions, named F1, F2 and F3. F1 has only DPPC and Chol in its composition, F2 contains, in addition to these components, PEG and F3 contains DPPC, Chol and POPG. The liposomes were submitted to extrusion and sonication processes, in order to standardize their vesicle size, and determine the best technique for their production. The dynamic light scattering technique was used to characterize the liposomes, which were tested for encapsulation efficiency, release kinetics, stability and evaluation of the antifungal activity. The synthesis method of the Histatin-5 was adequate and the purification process allowed to obtain the peptide in high purity. The liposomes obtained by extrusion presented average size in the range of 100 nm, while the liposomes obtained by sonication presented a smaller size, in the range of 90 nm. Liposomes loaded with Histatin-5 showed an increase in their mean size, which indicated that the peptide was contained in the intern aqueous compartment of the liposomes. The encapsulation efficiency was higher for the liposomes obtained by sonication. The F1 formulation presented an encapsulation efficiency of 34.5%, which contains DPPC and Chol in its composition. The lipid composition of the liposomes was related to their encapsulation efficiency, and the presence of cholesterol hindered the encapsulation of the peptide. The stability of the formulations was also related to their compositions. The F3 formulation obtained by sonication and containing POPG presented a higher stability when stored for 60 days at 4°C. The formulations showed the ability to release the peptide in the total period of 96 hours. The first release peak was observed after 5 hours, and a further increase of the released content was verified after 30 hours. The antimicrobial assay was performed using C. albicans ATCC 10231. It demonstrated that the inhibition for F1 was 66.5% after four hours of incubation, and it was maintained at 30% until the end of the experiment. Thus, this work conclusions showed that the use of nanostructured systems is of great importance to enable the application of Histatin-5 in therapeutic studies, and in vivo studies in the future. / 132393/20166

Submitted by JULIANE ROSA POIATI null (jpoiati@yahoo.com.br) on 2017-07-26T13:28:20Z No. of bitstreams: 1 Tese Pronta recente.docx: 323161 bytes, checksum: 961cdd07383986392eeebc8675ed5302 (MD5) / Rejected by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-07-26T19:10:07Z (GMT) / Submitted by JULIANE ROSA POIATI null (jpoiati@yahoo.com.br) on 2017-07-27T00:19:47Z No. of bitstreams: 1 Tese Pronta recente.pdf: 1203025 bytes, checksum: 3f33e46e228494eaa8c4c9ba0d1246d1 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-07-31T14:34:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 poiati_jr_dr_bot.pdf: 1203025 bytes, checksum: 3f33e46e228494eaa8c4c9ba0d1246d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-31T14:34:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 poiati_jr_dr_bot.pdf: 1203025 bytes, checksum: 3f33e46e228494eaa8c4c9ba0d1246d1 (MD5) Previous issue date: 2017-05-26 / Objetivo: Determinar o valor da concentração do BNP que se associa à presença de hipertrofia do ventrículo esquerdo (VE) em mulheres com pré-eclâmpsia (PE). Métodos: Realizou-se estudo observacional, descritivo e transversal em gestantes com diagnóstico de pré-eclâmpsia, que receberam assistência obstétrica no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu - Unesp. Foram excluídas do estudo gestantes portadoras de patologia clínica ou gestacional associada a alterações cardiovasculares (diabetes, hipertensão arterial crônica, cardiopatias, colagenoses, nefropatias). Considerando a prevalência de hipertrofia concêntrica do VE nessa população de 27% e assumindo a margem de erro de 10% e confiabilidade de 95%, o tamanho amostral calculado foi de 76 gestantes. No momento do diagnóstico de PE as gestantes selecionadas foram submetidas à coleta de sangue venoso para determinação da concentração sérica de BNP e ao exame de ecocardiograma para identificação de hipertrofia concêntrica do VE. As correlações entre o índice de massa do VE (iMVE) e entre a espessura relativa da parede (ER) e o BNP foram realizadas pelo teste de Spearman. O ponto de corte da concentração do BNP, que identifica hipertrofia concêntrica do VE, foi estabelecido pela curva ROC, utilizando-se o programa estatístico SPSS for Windows. Resultados: A hipertrofia concêntrica do ventrículo esquerdo foi diagnosticada em 48,7% das gestantes. O ponto de corte do valor da concentração do BNP, que identifica a hipertrofia concêntrica do VE, foi 203pg/mL (sensibilidade de 88%, especificidade de 80%, valor preditivo positivo de 69%, valor preditivo negativo de 93% e acurácia de 83%). A área sob a curva foi 0,87 (IC 95%= 0,79 – 0,95). A correlação entre o iMVE e a ER com a concentração do BNP foi significativa (iMVE: r=0,49; p<0,0001; ER: r=0,50; p<0,0001). Conclusões: O presente estudo encontrou correlação positiva entre os valores de BNP e hipertrofia do VE, além de determinar o ponto de corte (203 pg/ml) para o diagnóstico dessa condição. Utilizar o BNP como rastreamento de hipertrofia do VE pode ajudar na racionalização da indicação do ecocardiograma para confirmação diagnóstica. / Objective: To determine BNP concentration value associated with the presence of left ventricular hypertrophy (LV) in women with pre-eclampsia (PE). Methods: An observational, descriptive and cross-sectional study was performed in pregnant women diagnosed with preeclampsia, who have received obstetric care at Botucatu Medical School Clinical Hospital - Unesp. Pregnant women with clinical or gestational pathology associated with cardiovascular alterations such as diabetes, chronic hypertension, heart diseases, collagenosis, nephropathies were excluded from the study. Considering the prevalence of LV concentric hypertrophy in this population of 27% and assuming the margin of error of 10%, as well as reliability of 95%, the calculated sample size was of 76 pregnant women. At the moment of PE diagnosis the selected pregnant women were submitted to both venous blood collection (in order to determine BNP serum concentration) and to echocardiogram examination (to identify LV concentric hypertrophy). Correlations between LV mass index (iMVL), relative wall thickness (WT) and BNP were performed with Spearman test. The cut off of BNP concentration, which identifies LV concentric hypertrophy, was established with ROC curve, using the statistical program SPSS for Windows. Results: Left ventricular concentric hypertrophy was diagnosed in 48.7% of the pregnant women. The cut off value of BNP concentration, which identifies LV concentric hypertrophy, was 203pg / mL (sensitivity 88%, specificity 80%, positive predictive value 69%, negative predictive value 93%, and accuracy 83%). The area under the curve was 0.87 (95% CI = 0.79-0.95). The correlation between iMVL and WT with BNP concentration was significant (iMVE: r=0,49; p<0,0001; ER: r=0,50; p<0,0001). Conclusions: The present study found a positive correlation between BNP values and LV hypertrophy. Moreover, it determined the cut off (203 pg / ml) for the diagnosis of this condition. Therefore, using BNP as a screening method for LV hypertrophy may help to rationalize echocardiographic indication for diagnosis confirmation.

Submitted by JOÃO AUGUSTO OSHIRO JUNIOR (joaooshiro@yahoo.com.br) on 2017-08-31T18:02:19Z No. of bitstreams: 1 TESE JOAO AUGUSTO OSHIRO Jr_28 ago 2017_CORRIGIDA_FM com a ficha catalográfica.pdf: 3397335 bytes, checksum: 441e5684373bdd28dc8eb198a113eebe (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-09-01T14:36:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oshirojunior_ja_dr_arafcf.pdf: 3397335 bytes, checksum: 441e5684373bdd28dc8eb198a113eebe (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-01T14:36:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oshirojunior_ja_dr_arafcf.pdf: 3397335 bytes, checksum: 441e5684373bdd28dc8eb198a113eebe (MD5) Previous issue date: 2017-08-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A técnica de Regeneração Óssea Guiada (ROG) auxilia a restauração do tecido ósseo impedindo a concorrência entre as células do tecido ósseo e as células dos tecidos moles pelo uso de membranas; entretanto, não existe no mercado uma membrana osteoindutora. O peptídeo de crescimento osteogênico (OGP) atua como estimulador hematopoiético, promovendo a diferenciação osteoblástica e é um bom candidato para ser incorporado em membranas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver membranas a partir de materiais híbridos contendo OGP para otimizar a ROG. Para o desenvolvimento das membranas, foram utilizadas misturas de três polímeros, sendo dois à base de polióxido de etileno (POE) de massa molecular 500 e 1900 g mol-1 e um à base de polióxido de propileno (POP) de massa molecular 400 g mol-1. Diferentes métodos de esterilização foram utilizados. A caracterização dos materiais foi realizada pelas técnicas de calorimetria exploratória diferencial (DSC), espalhamento de raios-x a baixo ângulo (SAXS), análise mecânica dinâmica (DMA), determinação do pH e microscopia de força atômica (MFA). O OGP foi sintetizado pelo método em fase sólida, purificado por HPLC e caracterizado por espectrometria de massas. Os resultados de esterilização revelaram que a radiação gama a 24 kGy não alterou a estrutura do material, confirmado pelo DSC. A técnica de SAXS revelou a homogeneidade estrutural da matriz, assim como, a nano distância entre os entre os “nós” de silício. Os resultados de DMA mostraram que as membranas não sofreram ruptura, quando submetidas à aplicação de uma elevada intensidade de força (15N). Os resultados de pH permaneceram entre 7,38 e 7,64 durante 48 horas, faixa que não ocasiona efeitos citotóxicos. Os perfis cromatográficos confirmaram o grau de pureza do OGP obtido. O OGP nas membranas foi incorporado na concentração de 66,25x10-10mol. Os resultados de liberação monstraram que as membranas ureasil-POP400/PEO500 e ureasil-POP400/POE1900 liberaram após 48 horas, 7 e 21% respectivamente. A MFA demonstrou que todos os materiais são mesoporosos, mas o ureasil-POP400/POE1900 com OGP possui poros maiores (2,8 µm). Teste de biocompatibilidade in vitro não mostrou nenhum efeito citotóxico. A Análise Histológica revelou que ureasil-POP400/POE1900 promoveu inflamação local após 30 dias semelhante à membrana comercial de colágeno. A cicatrização do tecido ósseo revelou que a resposta do ureasil-POP400/POE1900 é semelhante a membrana comercial. Os resultados obtidos permitem concluir que as membranas híbridas contendo o OGP apresentam características que as tornam potenciais candidatas para o tratamento de defeitos ósseos de tamanhos críticos. / The Guided Bone Regeneration (GBR) technique helps to restore bone tissue through the principle of cellular selectivity, i.e., excluding the epithelium and connective tissues from the damaged area by the use of membranes; However, there is no osteoinductive membrane on the market. The osteogenic growth peptide (OGP) acts as a hematopoietic stimulator, promoting osteoblastic differentiation and is a good candidate to incorporated into membranes. Therefore, the objective of this work was to develop membranes from hybrid materials containing OGP to optimize GBR. For development of the membranes, blends of three polymers were used, being two poly oxide ethylene (POE) of molecular weight 500 and 1900 g mol-1 and one based on poly oxide propylene (POP) of molecular mass 400 g Mol-1. Different methods of sterilization were used. The characterization of the materials was performed by differential scanning calorimetry (DSC), small angle x-ray scattering (SAXS), dynamic mechanical analysis (DMA), pH determination and atomic force microscopy (AFM). OGP was synthesized by the solid phase method, purified by HPLC and characterized by mass spectrometry. Sterilization results revealed that gamma radiation at 24 kGy did not change the structure of the material, as confirmed by the DSC. The SAXS technique revealed the structural homogeneity of the matrix, as well as the nano distance between the "nodes" of silicon. The DMA results showed that the membranes were not ruptured when submitted to a high force intensity (15N). The pH results remained between 7.38 and 7.64 for 48 hours, a range that did not cause cytotoxic effects. The chromatographic profiles confirmed the purity of the obtained OGP. The OGP in the membranes was incorporated in the concentration of 66,25x10-10mol. The release results showed that the ureasil-POP400/PEO500 and ureasil-POP400/POE1900 membranes released after 48 hours, 7 and 21% respectively. AFM showed that all materials are mesoporous, but ureasil-POP400/POE1900 with OGP has larger pores (2.8 μm). In vitro biocompatibility test showed no cytotoxic effect. Histological analysis revealed that ureasil-POP400/POE1900 promoted local inflammation after 30 days similar to commercial collagen membrane. Healing of bone tissue revealed that the ureasil-POP400/POE1900 response is similar to commercial membrane. The results obtained allow conclude that hybrid membranes containing OGP have characteristics that make them potential candidates for the treatment of critically bone defects.

A hidrólise enzimática de penas residuais da indústria avícola constitui uma alternativa ao descarte irregular e uma fonte rica em aminoácidos para a produção de rações animais. A presença de queratinases em linhagens bacterianas probióticas, pode, concomitantemente, permitir um melhor aproveitamento de rações contendo queratina, devido a possibilidade de suplementação da dieta de animais monogástricos com tais microrganismos. Igualmente, proteases queratinolíticas possuem ampla utilização na indústria. Neste contexto, uma protease queratinolítica da linhagem probiótica FTC01PR01 de Bacillus subtilis foi purificada através de cromatografia líquida (Sephadex G-75 e DEAE Sepharose) e caracterizada por ensaio de proteólise em azocaseína com diversos interferentes, revelando uma serinoprotease com, aproximadamente, 31 kDa e atividade ótima a 60 °C em pH neutro e alcalino. Embora a enzima não seja termoestável, constatou-se que sua atividade é alterada na presença de íons manganês, apresentando estimulação em temperatura de 37 °C e aumento da termotolerância à 55°C. O crescimento do microrganismo em substratos queratinosos demonstrou eficiência para degradação de farinha de pena e penas brancas seguido por menor degradação de penas melânicas. Sendo constituído exclusivamente de α-queratina, o cabelo humano não sofreu proteólise. A enzima pode ser aplicada na indústria para a degradação de materiais recalcitrantes bem como a produção de ração animal. A efetividade do microrganismo in vivo para aumentar a digestibilidade da farinha de pena aliada a função probiótica, demanda mais estudos. / Enzymatic hydrolysis of waste feathers constitute an alternative to irregular disposal and a rich source of aminoacids for animal feed production. The presence of keratinases in probiotic bacterial strains may, concomitantly, allow better use of keratin-based feeds, due to the possibility of diet supplementation with beneficial microorganisms. In this context, a keratinolytic protease of Bacillus subtilis FTC01PR01 was purified by liquid chromatography (Sephadex G-75 and DEAE Sepharose) and characterized by azocasein proteolysis assay, revealing a serine protease with, approximately 31 kDa, and optimal activity at 60 ° C on neutral and alkaline pH. Although the enzyme was not thermostable, it’s activity was altered in presence of manganese ions, with stimulation at temperature of 37 °C and increased thermal tolerance at 55 °C. Microorganism growth on keratin substrates demonstrated efficiency for feather meal and white feathers degradation, followed by less degradation of melanized feathers. As a source of pure α-keratin, human hair was not degraded. The enzyme may be applied in industry for recalcitrant materials degradation and animal feed production. The effectiveness of the microorganism to increase the feather meal digestibility; ally to the probiotic function, demand further studies.

Esta tese apresenta resultados do estudo de interações entre biomoléculas e membranas compostas de lipídio. Duas classes de biomoléculas foram utilizadas, em primeiro lugar fragmentos de DNA que se inserem na camada aquosa entre as membranas, e peptídeos, que se inserem na parte hidrofóbica da membrana. As membranas de lipídio são constituídas basicamente por lecitina de soja, organizada em vesículas ou fases lamelares. Foram preparados complexos de lipídios e DNA com fragmentos de 150 pares de base, onde variou-se a composição das membranas na fase lamelar, com a adição de um co-surfactante comercial composto de uma mistura de ácidos graxos. Com essa abordagem foi possível alterar as propriedades elásticas da fase lamelar onde os fragmentos de DNA se inserem. Técnicas de espalhamento de raios-X foram aplicadas para a caracterização estrutural de duas composições distintas da fase lamelar hospedeira, revelando uma variedade de polimorfismos, como já havia sido observado para outras composições. Foi demonstrado que a transição entre os diferentes arranjos dos fragmentos de DNA está correlacionada a mudanças nas propriedades elásticas da fase lamelar hospedeira. No estudo da interação entre peptídeos e membranas, foram utilizadas vesículas e fases lamelares compostas apenas de lecitina. Os peptídeos utilizados foram duas sequências curtas de aminoácidos: L,L-difenilalanina (FF) e a cisteína-difenilalanina (CFF). A propriedade de auto-organização da FF tem sido reconhecida como elemento chave para a formação de fibras amilóides envolvidas em doenças neurodegenerativas como Alzheimer e Parkinson. Experimentos de FTIR demonstraram que os peptídeos se situam na interface da bicamada interagem mais fortemente com os grupos fosfato do lipídio. A incorporação do peptídeo FF promove alterações nas propriedades elásticas das membranas e, no caso das vesículas, observa-se uma transição multilamelar-unilamelar induzida pelo aumento da concentração de peptídeo. Com a presença do peptídeo CFF essa transição ocorre para concentrações baixas, provavelmente devido a ligações de hidrogênio entre o peptídeo e a membrana, alterando assim a entropia local da membrana. Observou-se ainda, com técnicas de dicroísmo circular e espalhamento de raios-X (WAXS) que, mesmo para essas sequências curtas, os peptídeos se agregam formando estruturas cristalinas que contribuem para a alteração das interações entre membranas e desestabilização da estrutura lamelar. / This thesis presents results of the study of interactions between biomolecules and membranes composed of lipid. Two classes of biomolecules were studied, first fragments of DNA inserted into the aqueous layer between membranes and second, peptides that are inserted into the hydrophobic part of the membrane. Lipid membranes are basically constituted by soy lecithin, which is a biocompatible lipid, organized into vesicles or lamellar phases. Lipid and DNA complexes were prepared with 150 bp DNA fragments, varying the composition of the membranes in the lamellar phase, with the addition of a commercial commercial co-surfactant composed of a mixture of fatty acids. With this approach, it was possible to change the elastic properties of the lamellar phase where the DNA fragments are inserted. X-ray scattering techniques were applied for the structural characterization of two distinct compositions of the host lamellar phase, revealing a variety of polymorphisms, as had already been observed for other compositions. It has been shown that transitions between the different arrangements of the DNA fragments are correlated to changes in the elastic properties of the host lamellar phase. In the study of the interaction between peptides and membranes, vesicles and lamellar phases composed only of lecithin were used. The peptides used were two short amino acid sequences; L, L-diphenylalanine (FF) and cysteine diphenylalanine (CFF). The self-association property of FF has been recognized as a key element for the formation of amyloid fibers involved in neurodegenerative pathologies such as Alzheimer\'s and Parkinson\'s disease. FTIR experiments have shown that the peptides are at the interface of the bilayer and interact more strongly with the phosphate groups of the lipid. The incorporation of FF peptide promotes changes in the elastic properties of the membranes and in the case of the vesicles, a multilamellar-unilamellar transition is observed induced by the increase of the peptide concentration. With the presence of CFF peptide this transition occurs at low concentration, probably due to hydrogen bonds between peptide and membrane which change the local entropy of the membrane. It is also observed with circular dichroism and X-ray scattering (WAXS) techniques that, even for these short sequences, the peptides aggregate forming crystalline structures that contribute to the modification of membrane interactions and destabilization of the lamellar structure.

Filmes de Langmuir são usados como modelos simplificados de membranas celulares, cujas propriedades podem ser correlacionadas com efeitos fisiológicos de moléculas de interesse biológico, como os peptídeos antimicrobianos (PAMs). Nesta dissertação investigamos a interação do peptídeo Aureína 1.2, na forma de monômero (AU), dímero ((AU)2K) e com variações na porção N-terminal (KAU e DAU), com filmes de Langmuir obtidos do extrato lipídico da bactéria Escherichia coli. Todos os peptídeos injetados em concentrações de 20 a 200nM se incorporaram ao filme de Langmuir, causando expansão nas isotermas de pressão superficial, que foi significativamente maior para o dímero. O módulo de compressibilidade do filme de E. coli à pressão superficial correspondente à de uma membrana real praticamente dobrou, de cerca de 40mN/m para 80nM/m para o dímero, ao passo que para os outros peptídeos a alteração não foi significativa. Dos espectros de reflexão e absorção no infravermelho com modulação de polarização (PM-IRRAS), observou-se que todos os peptídeos interagiram tanto com as caudas quanto com as cabeças polares das moléculas do extrato de E. coli no filme de Langmuir. Diferentemente dos resultados de pressão e compressibilidade, não há tendência de um peptídeo ter interação mais relevante do que os outros. O maior efeito do dímero na expansão e compressibilidade do filme de Langmuir não se refletiu numa maior atividade bactericida contra E. coli, pois sabe-se da literatura que a atividade é maior para a Aureína 1.2 (AU). Provavelmente porque essa atividade deve depender da camada externa de lipopolissacarídeos de uma bactéria Gram-negativa. / Langmuir films are used as simplified cell membrane models whose properties can be correlated with physiological effects of molecules of biological interest, such as antimicrobial peptides (AMPs). In this dissertation we report on the interaction of Aurein 1.2 peptide as monomer (AU), dimer ((AU)2K) and modified peptide in the N-terminal portion (KAU and SAD), with Langmuir films obtained from a lipid extract of Escherichia coli. All peptides injected at concentrations from 20 to 200nM were incorporated into the Langmuir film, causing the surface pressure isotherm to expand, particularly for the dimer. The compressibility modulus of the E. coli Langmuir film at the surface pressure corresponding to an actual membrane nearly doubled, from about 40mN/m to 80nM/m for the dimer, whereas for the other peptides the change was not significant. From the polarization-modulated infrared reflection - absorption spectra (PM-IRRAS), we observed that all peptides interacted with both tails and polar heads of the molecules of E. coli extract in the Langmuir film. Unlike the results of pressure and compressibility, there was no tendency of a peptide having more relevant interaction than the others. The larger effect of the dimer in the expansion and compressibility of the Langmuir film was not reflected in a higher bactericidal activity against E. coli, since it is known from literature that the activity is higher for Aurein 1.2 (AU). Probably because this activity should depend on the outer layer of lipopolysaccharides of Gram-negative bacteria.

Baseado nos algoritmos de hidrofilicidade e flexibilidade obtidos pelo uso do \"software\" ProtScale, acessível no endereço http://au.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl, foram selecionados sete peptídeos, potencialmente antigênicos, das proteínas de Schistosoma mansoni, entre elas, catepsina B (Sm 31), \"heat shock protein\" de 70 kDa (HSPSm-70), \"cathodic circulating antigen\" (CCA), e uma seqüência da fase de leitura aberta do clone ET03. Estes peptídeos, produzidos por síntese química, foram denominados P1, P2, P3, P4, P5, P6 e P7. Em seguida, os peptídeos foram testados isoladamente contra \"pool\" de soros humanos positivos e negativos. Após vários testes, os peptídeos P1, P2, P3, P6 e P7, que apresentaram imunorreatividade quando ensaiados por método imunoenzimático, foram usados na padronização de um método imunoenzimático de ELISA, utilizando placas Costar 3590, que passou a ser denominado ELISA-Peptídeo (ELISA-Pp). Este método foi avaliado empregando-se 192 amostras de soro, divididas em quatro grupos: (A) 23 amostras de soro, coletadas de pacientes residentes no Nordeste do Brasil, portadores de esquistossomose aguda, com ovos de S. mansoni nas fezes; (B) 30 amostras de soro, coletadas de pacientes residentes no Norte do Brasil, portadores de esquistossomose crônica, com ovos de S. mansoni nas fezes; (C) 39 amostras de soro, coletadas de indivíduos residentes no Norte do Brasil, portadores de outras parasitoses, mas não esquistossomose; (D) 100 amostras de soro, coletadas de indivíduos residentes em Campinas-SP, negativos pelo exame coproparasitológico. Os resultados obtidos foram analisados comparativamente com os encontrados por outras metodologias imunodiagnósticas: reação de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos IgM contra tubo digestivo de verme (RIF-IgM), método imunoenzimático para detecção de anticorpos IgM contra antígenos polissacarídeos (ELISA-IgM) ou anticorpos IgG contra extrato total de vermes (ELISA-IgG). A sensibilidade do ELISA-Pp foi de 86,6%, quando avaliado frente a soros de pacientes que apresentaram ovos de S. mansoni nas fezes e de 79,3%, considerando como esquistossomótico aqueles pacientes com sorologia positiva pelos métodos de RIFI-IgM e ELISA-IgM. A especificidade do ELISA-Pp foi de 94,2% e 94,7%, respectivamente, considerando como grupo controle, não esquistossomótico, indivíduos com resultado de exame parasitológico de fezes negativo para ovos de S. mansoni ou indivíduos com sorologia negativa pelo ELISA-IgM e RIFI-IgM. O valor preditivo positivo apresentado pelo ELISA-Pp foi de 85,2% enquanto para os outros métodos sorológicos variou de 63,4% a 78,6%. O valor preditivo negativo do ELISA-Pp foi em média 3% inferior aos obtidos pelos outros métodos sorológicos. Comparando-se os resultados obtidos pelo ELISA-Pp com os dos outros métodos sorológicos, melhor concordância foi demonstrada com os resultados do ELISA-IgM (Índice Kappa=0,75). Os índices de reatividade para detecção de anticorpos IgG e IgM foram significantemente maiores (P < 0,05) nos pacientes com esquistossomose aguda (grupo A) do que crônica (grupo B). No presente estudo, ELISA-Pp demonstrou bom desempenho (eficácia diagnóstica = 81,0%), entretanto novos estudos são necessários para avaliação de sua aplicabilidade em inquéritos soroepidemiológicos. / Based on algorithms of hidrophilicity and flexibility, obtained by the use of the ProtScale software, disposable at the site http://au.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl, seven potentially antigenic peptides were selected from different Schistosoma mansoni proteins: cathepsin B (Sm31), heat shock protein (SmHSP-70), cathodic circulating antigen (CCA) and the polypeptidic sequence of the open reading frame (ORF) of the ET-03 clone. The peptides were produced by chemical synthesis and denominated as P1, P2, P3, P4, P5, P6 and P7. These were independently tested against two pools of human sera, one positive and one negative for schistosomiasis. The peptides P1, P2, P3, P6 and P7, that presented better reactivity when assayed by an immunoenzymatic method, were chosen to be used as antigen for the standardization of an ELISA method, by utilizing Costar 3590 micro plates, and it was called Peptide-ELISA (Pp-ELISA). This method was evaluated on 192 serum samples, divided in four groups: (A) 23 samples from patients with acute schistosomiasis and positive for S. mansoni eggs in fecal examination, who were living in a Brazilian Northeast state; (B) 30 samples from patients with chronic schistosomiasis and positive for S. mansoni eggs, who were living in a Brazilian North state; (C) 39 samples from individuals with other parasite infection, but no schistosomiasis, living in a Brazilian North state; (D) 100 samples from clinically healthy individuals who presented negative results for coproparasitologic method, living in Campinas, São Paulo State. The serological data obtained by Pp-ELISA were comparatively analyzed with the results obtained by other immunodiagnostic methods: immunofluorescence test for detection of IgM antibodies against gut associated antigens (IgM-IFT); ELISA for detection of IgM antibodies against gut associated polysaccharide antigens (IgM-ELISA) or for detection of IgG antibodies against worm crude antigens (IgG-ELISA). The sensitivity of Pp-ELISA was of 86,6%, considering as schistossomiasis patients only the ones who presented S. mansoni eggs in stool examination, and 79,3%, when a serological criterion was used for definition of schistosomiaisis patients, with positive results for both IgM-IFT and IgM-ELISA. The specificity of the Pp-ELISA was respectively 94,2% or 94,7%, considering as control group, without schistosomiasis, S. mansoni egg negative individuals in stool examination or serologically negative individuals by both tests, IgM-IFT and IgM-ELISA. The positive predictive value for Pp-ELISA was 85,2%, while for the other serologic methods varied from 63,4% to 78,6%. The negative predictive value for Pp-ELISA was as a rule 3% lower than the indices obtained for other serologic methods. When the results of Pp-ELISA were compared with the ones obtained by other serologic methods, better concordance was demonstrated with IgM-ELISA (Kappa indice = 0,75). The reactivity indices for detection of IgG and IgM antibodies were significantly higher (P < 0,05) in acute (group A) than chronic schistosomiasis patients (group B). In this study the Pp-ELISA presented a good performance (Diagnostic efficacy = 81,0%), however further studies must be necessary for evaluation of its applicability on seroepidemiologic surveys.

O peptídeo liberador de gastrina (GRP) age como potente mitógeno em tecidos neoplásicos pela ativação do seu receptor (GRPR), que é super expresso em estágios avançados de neuroblastoma humano. GRPR knockdown ou antagonistas de GRPR mostraram inibir o crescimento de neuroblastoma. Investigou-se, em condições experimentais, que os antagonistas de GRPR podem promover, em vez de inibir o crescimento de células de neuroblastoma. O antagonista do GRPR, RC-3095 em 0,1 nM inibiu, enquanto a concentração de 100 nM estimulou a proliferação de células de neuroblastoma murino Neuro2a, in vitro. Os efeitos proliferativos de RC -3095 no crescimento celular foram impedidos pelo inibidor de deacetilase de histona (HDI), butirato sódico (NAB). Estes resultados fornecem a primeira evidência de que um antagonista do GRPR pode estimular o crescimento de células cancerosas, e sugerem que o GRPR pode interagir com os mecanismos epigenéticos na regulação do crescimento de células do neuroblastoma.