Orientado: Samir Tufic Arbex / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-16T13:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Busato_MaraSilviaSaldini_M.pdf: 1388590 bytes, checksum: 749c054286b5fb42a673d377b55c9919 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informed. / Mestrado / Bases Farmacologicas para a Terapeutica Medicamentosa / Mestre em Odontologia

Orientador : Antonio C. M. Paiva / Tese (doutorado) - Universidade de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-18T02:06:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tahin_QuivoSchwartzburd_D.pdf: 3845427 bytes, checksum: 227dc9a5b3a817c33678150a3b0aec65 (MD5) Previous issue date: 1968 / Resumo: A composição de aminoácidos da pepsina caracteriza-se pelo grande número de resíduos dicarboxílicos e de resíduos com cadeias laterais apolares, e de raros resíduos básicos. Devido a isso, e à presença de uma fosfoserina, a enzima apresenta ponto isoelétrico menor do que 1,08. A atividade enzímica da pespsina (tanto a proteolítica como a peptidásica, como a esterásica) dá-se otimamente em pHs ácidos. A proteólise péptica de substratos nativos dá-se em pHs ótimos mais baixos do que os da proteólise péptica de substratos desnaturados e também mais baixos do que os verificados para a hidrólise péptica de peptídeos sintéticos ou de ésteres sintéticos. Uma das hipóteses para explicar a necessidade dos baixos pHs para a melhor ação catalítica da pepsina baseia-se na possível atração eletrostática entre a enzima, que em meio ácido se comportaria como um ânion, e o substrato protéico, que em meio ácido se comportaria como um cátion (pois geralmente o ponto isoelétrico dos substratos é acima de 4,0). Outra hipótese é a de que o passo limitante da proteólise péptica seria a desnaturação do substrato, favorecida pelo pH ácido. Estudamos neste trabalho o efeito do pH e da temperatura sobre a cinética da ação da pepsina sobre a ovalbumina nativa ou previamente desnaturada por ácido... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Orientador: Pedro L. O. Volpe / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-20T13:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Basilio_CarmelitaAparecida_D.pdf: 8571891 bytes, checksum: 0a50639f606b123c07a704e885789a2f (MD5) Previous issue date: 1994 / Doutorado

Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima. / Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability.

Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima. / Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

SERPA, R. Biofilmes de Trichosporon asahii e Trichosporon inkin: aspectos morfofisiológicos, sensibilidade a antifúngicos e inibição mediada por ritonavir. 2016. 118 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Médica) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-27T13:21:57Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-10-27T13:30:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-27T13:30:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_rserpa.pdf: 3087326 bytes, checksum: 35f76a6918f208a69d52ecd06bf86142 (MD5) Previous issue date: 2016-07-27 / In recent years, several studies have considered Trichosporon genus as emerging opportunistic pathogens in immunocompromised patients. Although the dynamics are not well understood, it is known that events associated with biofilm formation on these fungi play an important role in the infectious process. Thus, the present study analyzed morphophysiological aspects of biofilms produced by Trichosporon spp., as well as the role of a protease inhibitor on T. asahii and T. inkin cells and biofilms. In the first part of the study, we investigated the biofilm formation of T. inkin (n=7) in RPMI broth, CLED broth and Sabouraud broth at pH 5.5 and pH 7.0, with initial inoculum of 1x104, 1x105 and 1x106 cells/ml, incubated at 28°C and 35°C in static or shaking at 80 rpm. Biofilms were evaluated for their biomass and metabolic viability, viable cell counts, quantification of nucleic acids and proteinase activity. It was also investigated the sensitivity of the biofilm front of amphotericin B, caspofungin, fluconazole, itraconazole and voriconazole. To evaluate the inhibitory activity of ritonavir on the structure and functioning of T. asahii and T. inkin biofilms, biofilms were formed in the presence of ritonavir and evaluated for cell adhesion, structural development and proteinase activity. Additionally, ritonavir was assessed on mature biofilms, matrix composition and structural changes. Planktonic cells of T. asahii and T. inkin (n=2 each) were also investigated for sensitivity to ritonavir alone and in combination with antifungals. Finally, planktonic cells were pre-exposed to ritonavir and evaluated for biofilm formation capacity, susceptibility to antifungal agents, and changes in their surface hydrophobicity. Maximum biofilms growth in RPMI pH 7.0 for inoculation of 1x106 cells/ml and incubation at 35°C under stirring. Biofilms produced under these conditions are formed by dynamic communities associated with an extracellular matrix, and show increased viability and biomass over time, reaching stability after 48 hours of cultivation. During the development of biofilms occurs release of viable cells and nucleic acids into the surrounding environment. T. inkin biofilms produce more proteases and tolerate higher concentrations of antifungals that planktonic cells related. Due to the presence of proteases in the development of T. inkin biofilm, it was hypothesized that these enzymes could be considered important targets in controlling biofilms. The results showed that ritonavir decreased cell adhesion and formation of mature biofilms, and reduce protease activity and change the structure of biofilms. Ritonavir did not affect the viability of mature biofilms, but changed the composition of the extracellular matrix of biofilms, which showed different protein spectra compared to the control group. Ritonavir was able to inhibit planktonic growth of T. asahii and T. inkin approximately 50%. However, there was no synergism between ritonavir and tested antifungals. In planktonic cells, pre-exposure to ritonavir significantly reduced values of minimum inhibitory concentration of Amphotericin B in T. asahii and T. inkin, although not change the response to azoles. Preincubation with ritonavir reduced cell adhesion, but not the formation of mature biofilms, in addition to changing the hydrophobicity of the cell surface. The article detailed characteristics of T. inkin biofilms and showed the potential use of a protease inhibitor in controlling these biofilms. / Nos últimos anos, diversos estudos têm considerado os fungos do gênero Trichosporon como patógenos oportunistas emergentes em pacientes imunocomprometidos. Embora a dinâmica não seja bem compreendida, sabe-se que eventos associados à formação de biofilme nestes fungos têm papel importante no processo infeccioso. Desta forma, o presente estudo analisou aspectos morfofisiológicos dos biofilmes produzidos por T. inkin, bem como o papel de um inibidor de proteases sobre as células e biofilmes de T. asahii e T. inkin. Na primeira parte da pesquisa, foi investigada a formação de biofilmes de T. inkin (n=7) nos meios RPMI, Caldo CLED e Caldo Sabouraud, em pH 5,5 e pH 7,0, com inóculos iniciais de 1x104, 1x105 e 1x106 células/mL, incubados a 28°C e 35°C, de forma estática ou agitação a 80 rpm, por 48h. Os biofilmes formados foram avaliados quanto à biomassa e atividade metabólica, contagem de células viáveis, quantificação de ácidos nucléicos e atividade proteásica. Investigou-se ainda a sensibilidade dos biofilmes frente à anfotericina B, caspofungina, fluconazol, itraconazol e voriconazol. Para avaliação da atividade inibitória do ritonavir sobre a estrutura e o funcionamento dos biofilmes de T. asahii e T. inkin, biofilmes foram formados na presença de ritonavir e avaliados quanto à adesão celular, desenvolvimento estrutural e atividade proteásica. Adicionalmente, o ritonavir foi avaliado sobre biofilmes maduros, composição de matriz e alterações estruturais. Células planctônicas de T. asahii e T. inkin (n=2 cada) também foram investigadas quanto à sensibilidade ao ritonavir isolado e em combinação com antifúngicos. Por fim, células planctônicas foram pré-expostas ao ritonavir e avaliadas quanto à capacidade de formação de biofilmes, sensibilidade a antifúngicos e alteração na hidrofobicidade de suas superfícies. A produção de biofilmes foi máxima em RPMI pH 7,0, em inóculo de 1x106 células/mL, e incubação a 35°C, sob agitação. Os biofilmes produzidos nessas condições são formados por comunidades dinâmicas, associadas a uma matriz extracelular, e mostram aumento da atividade metabólica e biomassa ao longo do tempo, atingindo estabilidade após 48 h de cultivo. Durante o desenvolvimento dos biofilmes, ocorre liberação de células viáveis e ácidos nucléicos para o ambiente circundante. Os biofilmes de T. inkin produzem mais proteases e toleram maiores concentrações de antifúngicos que as células planctônicas relacionadas. Dada à presença de proteases durante o desenvolvimento do biofilme de T. inkin, foi hipotetizado que essas enzimas poderiam ser consideradas alvos importantes no controle dos biofilmes. Os resultados mostraram que o ritonavir diminuiu a adesão celular e formação de biofilmes maduros, além de reduzir a atividade proteásica e alterar a estrutura dos biofilmes. O ritonavir não interferiu na atividade metabólica de biofilmes maduros, mas alterou a composição da matriz extracelular dos biofilmes, as quais apresentaram diferentes espectros protéicos em comparação com o grupo controle. O ritonavir inibiu o crescimento planctônico de T. asahii e T. inkin a 100 μg/mL. Entretanto, não foi observado sinergismo entre o ritonavir e os antifúngicos testados. Em células planctônicas, a pré-exposição ao ritonavir reduziu significativamente os valores de concentração inibitória mínima da anfotericina B em T. asahii e T. inkin, embora não tenha alterado a resposta aos azólicos. A pré-incubação com ritonavir reduziu a adesão das células, mas não a formação de biofilmes maduros, além de alterar a hidrofobicidade da superfície celular. O presente artigo detalhou características dos biofilmes de T. inkin e mostrou o potencial do uso de um inibidor de proteases no controle dos biofilmes de T. asahii e T. inkin.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-10-21T12:19:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 bianca_santos_ioc_mest_2014.pdf: 1947622 bytes, checksum: 18745ca66f08f6dcb2537a2a4ad88419 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-06-10 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Foram realizados estudos para avaliar a eficácia do triflumuron, um inibidor de síntese de quitina, na alteração da biologia reprodutiva de fêmeas adultas de R. prolixus por tratamento oral, tópico ou contínuo (por contato). Todos os tratamentos utilizados foram capazes de induzir altos níveis de mortalidade associados a baixos níveis de ovipostura e redução da eclosão de ovos. O composto também mostrou ter influência sobre o sistema imune humoral, através da ativação do sistema profenoloxidase, assim como também resultou em alterações da digestão e/ou excreção destes insetos. Estas observações indicam o triflumuron como um potente inibidor do desenvolvimento em fêmeas adultas de R. prolixus e o credenciam para o uso em programas integrados de controle vetorial de triatomíneos transmissores da doença de Chagas Em outra etapa do trabalho, o foco foi direcionado a proteases de corpo gorduroso de machos adultos de R. prolixus, de onde foram caracterizadas duas proteases, uma cisteína proteinase, com propriedades catalíticas semelhantes a catepsinas L ou B, e uma metaloproteinase cujas funções, apesar de não confirmadas, mostram não fazer parte da cascata ativadora do sistema profenoloxidase / The efficiency of triflumuron, an inhibitor of chitin synthesis, in the reproductive biology of Rhodnius prolixus was studied through feeding, topic application or continuous exposure. All treatments induced, in a dose dependent manner, high mortality, low oviposition and eclosion of first instar nymphs. The drug showed effects in the insect humoral immune system, ac tivating the prophenoloxidase system, and in digestion and excretion. These observations show triflumuron as a potent developmental inhibitor in R. prolixus adult females and accredit it for the use in integrated control programs of hematophagous triatomin es, vectors of Chagas disease. Besides that, biochemical and physiological characterization of adult male fat body proteases showed two activities, one cistein proteinase, possibly a cathepsin L or B, and a metalloproteinase, which does not participate in the activation of the prophenoloxidase cascade.

Made available in DSpace on 2016-04-07T13:23:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 leonardo_matilde_ioc_dout_2013.pdf: 10262111 bytes, checksum: 343b14b4b2a15acbb6b250c4067d32ff (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os mosquitos Aedes albopictus (Skuse, 1894) e Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) apresentam significativa importância epidemiológica dentro da família Culicidae por serem os principais vetores da febre amarela e dos quatro sorotipos do vírus da dengue. As peptidases ou proteases são enzimas que clivam ligações peptídicas. No sistema digestivo de invertebrados as peptidases, especificamente aquelas da classe das serino-peptidases, são abundantes e participam de vários processos fisiológicos, desempenhando um papel principal na hidrólise de proteínas destinadas à nutrição. Estas enzimas podem apresentar características espécie-específicas e essas diferenças são respostas adaptativas a diferentes estilos de vida, ambientes e habilidade de sobrevivência entre as espécies. Neste trabalho descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas em extratos totais das formas pré-imaginais de A. aegypti e A. albopictus por enzimografia em uma dimensão. A estabilidade da expressão de peptidases nessas espécies foi avaliada pela comparação do perfil proteolítico de formas larvais obtidas de ovos de insetos recém coletados no ambiente com ovos de insetos mantidos em colônia por longo período. Foram também comparados os perfis proteolíticos das pupas com seus respectivos imagos, bem como a estabilidade térmica das peptidases detectadas. Observaram-se complexos perfis de serino-peptidases do tipo tripsina em ambas as espécies vetoras Contudo esses perfis apresentam diferenças espécie-específicas e também diferenças entre os distintos estágios evolutivos dentro de uma mesma espécie. Também, neste trabalho, descreve-se a caracterização das atividades proteolíticas detectadas no intestino médio de fêmeas de A. albopictus alimentadas com açúcar bem como o primeiro mapa proteô mico e a identificação de peptidases por eletroforese bi-dimensional e espectrometria de massas neste órgão. São discutidas aqui as estratégias usadas para analisar as peptidases expressas nesse tecido. As proteínas expressas no intestino médio de A. albopictus foram identificadas por similaridade com as sequencias de genoma de A. aegypti e distintas ferramentas bioinformáticas foram usadas para obter informação funcional de muitas dessas sequencias que estão pobremente anotadas. Foram identificadas 59 proteínas entre v Resumo as quais três serino-peptidases, e dessas, duas do tipo tripsina e uma quimiotripsina. Os resultados obtidos nos permitiram atribuir de maneira confiável um local de expressão para os genes de tripsina, tripsina alfa e quimotripsina. Em outras palavras, podemos afirmar que os genes acima mencionados se expressam no intestino médio de fêmeas adultas de A. albopictus alimentadas com açúcar. Este achado representa um pequeno, mas importante passo, para a atribuição funcional, ao nível de proteína, de genes codificantes para serino-peptidases do tipo tripsina e quimiotripsina no gênero Aedes / The mosquitoes Aedes albopictus (Skuse, 1894) and Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) have significant epidemiological importance within the family Culicidae because they are the main vectors of the yellow fever virus and the four serotypes of Dengue virus. Peptidases or proteases are enzymes that hydrolyze peptide bonds. In the digestive system of invertebrates, the peptidases, specifically those from the class of serine peptidases, are abundant and participate in various physiological processes, playing a major role in the hydrolysis of proteins destined to nutrition. These enzymes may have species-specific characteristics, and such differences reflect adaptive responses to different lifestyles and environments. In this work we describe the characterization, using zymography, of the proteolytic activities detected in total extracts of larval forms of A. aegypti and A. albopictus. The stability of expression of peptidases in these species was evaluated by comparing the proteolytic profile of larval forms obtained from eggs of newly collected insects to that from eggs of insect kept in colony for a long period. We also compared the proteolytic profiles of pupae as well as the thermal stability of the peptidases detected. Complex profiles of trypsin-like serine peptidases were observed in both species. However, these profiles differ between species and also differences between the different evolutionary stages were detected within the same species. Also, in this work, we describe the characterization of the proteolytic activities detected in the midgut of A. albopictus females fed on sugar as well as the first proteome map and proteomic identification of peptidases in this organ, using two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry. The strategies used to analyze the proteases expressed in this tissue are discussed here. The proteins expressed in the midgut of A. albopictus were identified by similarity with the genome sequences of A. aegypti and various bioinformatic tools were used to obtain functional information for many of these sequences that are poorly annotated. We identified 59 proteins including three serine peptidases, and among these, two types of trypsin-like and one chymotrypsin. The results obtained here allowed us to reliably assign a localization for the expression of trypsin, trypsin-alpha and chymotrypsin genes. In other words, we can say that the above mentioned genes are expressed in the midgut of adult females of A. albopictus fed with sugar. This finding represents a small but important step for the functional assignment, at the protein level, of the genes coding for trypsin-like and chymotrypsin serine peptidases of the Aedes genus.