Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

Resíduos ricos em queratina são produzidos em grande quantidade por atividades agroindustriais, como é o caso das penas oriundas de abatedouros de aves, e seu acúmulo pode ocasionar problemas ambientais. Microrganismos queratinolíticos e suas queratinases são objeto de interesse biotecnológico, apresentando inúmeras aplicações. Este estudo avaliou o potencial queratinolítico de Bacillus sp. P45, a otimização da produção de queratinases, e a caracterização de uma queratinase extracelular. Esta linhagem degradou aproximadamente 90% das penas após 72 h de cultivo em caldo contendo 1% (m/v) de penas inteiras, sendo observadas a produção de proteases e queratinases extracelulares e o aumento do conteúdo de proteínas solúveis e de grupos tiol. A produção de queratinases extracelulares foi avaliada utilizando diferentes substratos, e o maior rendimento ocorreu em meio contendo farinha de penas (FP). A adição de carboidratos inibiu a produção de enzimas em meio FP, possivelmente através de repressão catabólica; contudo, a adição de NH4Cl ocasionou incremento na produção. Utilizando experimento fatorial 22 observou-se que a variável FP foi mais significativa para a produção de enzimas do que NH4Cl, sendo estabelecidas as concentrações 43-50 g/L de FP e 1,8-8,6 g/L de NH4Cl para produção máxima de queratinases. A queratinase bruta apresentou atividade ótima a 50 °C e pH 7,0, sendo amplamente inibida por EDTA. Uma queratinase extracelular foi purificada e caracterizada como uma serino protease similar à subtilisina. Esta enzima, com aproximadamente 26 kDa, apresentou atividade ótima a 55 °C e pH 8,0, baixa estabilidade térmica e a capacidade de hidrolisar diversos substratos protéicos, como caseína e farinha de penas; a hidrólise de queratinas nativas ocorreu de forma restrita, possivelmente pela presença de pontes dissulfeto. Tetrapeptídeos contendo aminoácidos aromáticos e hidrofóbicos na posição P1 foram hidrolisados preferencialmente. A enzima apresentou maior atividade e estabilidade térmica na presença de cálcio (3 mM) ou magnésio (4 mM). A inativação térmica seguiu, aparentemente, uma cinética de primeira ordem, e os parâmetros cinéticos e termodinâmicos obtidos indicam que o íon cálcio é essencial para a estabilidade térmica da enzima. / Keratin-rich wastes are produced in high amounts by agroindustrial activities, as in the case of feathers derived from poultry processing, and its accumulation might result in environmental problems. Keratinolytic microorganisms and its keratinases are biotechnologically interesting targets, presenting several applications. This study evaluated the keratinolytic potential of Bacillus sp. P45, the optimization of keratinase production, and the characterization of an extracellular keratinase. This strain degraded almost 90% of feathers after 72 h of cultivation in broth containing 1% (m/v) of whole feathers, with the observed production of proteases and keratinases, and the increase on the contents of both soluble protein and thiol groups. Extracellular keratinase production was evaluated with different growth substrates, and the higher enzyme yield occurred in media containing feather meal (FM). Addition of carbohydrates to FM medium inhibited enzyme production, possibly through catabolite repression; however, addition of NH4Cl caused a higher keratinase production. From a 22 factorial design it was observed that the FM variable was most significant for enzyme production than NH4Cl, with 43-50 g/L of FM and 1.8-8.6 g/L of NH4Cl as the concentrations for maximal keratinase production. Crude keratinase showed optimum activity at 50 °C and pH 7.0, being largely inhibited by EDTA. An extracellular keratinase was purified, and characterized as a subtilisin-like serine protease. This enzyme, with approximately 26 kDa, presented optimum activity at 55 °C and pH 8.0, low thermal stability, and the ability to hydrolyze various protein substrates, such as casein and feather meal; only a limited hydrolysis of the native keratin substrates was observed, possibly due to the presence of disulfide bridges. Tetrapeptides containing aromatic and hydrophobic amino acid residues at position P1 were preferably hydrolyzed. The enzyme showed higher activity and thermal stability in the presence of calcium (3 mM) or magnesium (4 mM). Thermal inactivation followed an apparent first-order kinetics, and the obtained kinetic and thermodynamic parameters indicate that calcium ion is essential for enzyme thermal stability.

Resíduos ricos em queratina são amplamente disponíveis como subprodutos de agroindústrias, e por sua recalcitrância tornam-se um problema ambiental e econômico por seu acúmulo e difícil manejo. Bactérias que hidrolisam a queratina, através da produção de queratinases, têm mostrado grande potencial biotecnológico. Este trabalho tem como objetivo selecionar, identificar e caracterizar um novo isolado bacteriano, proveniente de solos brasileiros, que seja produtor de queratinases úteis como biodegradadoras de penas, bem como caracterizar sua ação enzimática. Bactérias com atividade proteolítica e produtoras de proteína solúvel a partir de substratos queratinosos foram selecionadas e identificadas através do sequenciamento do 16S do DNAr. O extrato bruto de três linhagens Gram negativas foi caracterizado ao longo de 120 horas de cultivo. Dos 32 isolados, os maiores degradadores de penas foram as bactérias do gênero Bacillus, porém as características do extrato bruto das Gram negativas Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 e Serratia marcescens P3 também apresentam promissoras utilizações industriais. Ensaios enzimáticos e zimograma revelaram a produção de uma única protease queratinolítica por isolado, com características de metaloprotease. Utilizando técnicas de planejamento fatorial foi possível gerar um modelo validado estatisticamente para a otimização da produção enzimática. A utilização de sistema aquoso bifásico foi eficiente para a purificação da enzima produzida pela linhagem P3, gerando banda única em SDS-PAGE com massa molecular de aproximadamente 53 kDa. O sequenciamento da protease queratinolítica da linhagem P3, através de espectrômetro de massas, revelou homologia com metaloproteases dependentes de zinco semelhantes às serralisinas. Apesar das serralisinas serem comumente associadas a fatores de virulência, a importância das patogenias causadas por Serratia parece ser menor do que a causada por outras bactérias. Portanto, a enzima de P3, que é facilmente desnaturada por tratamento térmico, pode também ser utilizada biotecnologicamente em processos controlados. / Keratin-rich wastes are widely available as an agroindustrial byproduct. Since these residues are difficult to degrade, they cause economical and environmental problems due to its accumulation and difficult management. Bacteria with keratin-degrading abilities, through keratinase production, have shown several biotechnological applications. This work aimed to select, identify and characterize a novel bacterial isolate from Brazilian soils, which is keratinase producer, useful for feather degradation and characterize its enzymatic activity. Bacteria with proteolytic activity and soluble protein production when cultivated with keratinous wastes were selected and identified based on 16S rDNA gene sequencing. Crude supernatant of three Gram negative strains were characterized over 120 hours of cultivation. Among 32 isolates, the bacteria from Bacillus genus showed higher feather hydrolyses. Although, the characterization of the crude extract produced by the Gram negative Aeromonas hydrophila K12, Chryseobacterium indologenes A22 and Serratia marcescens P3 also revealed their promising use in industrial processes. Enzymatic assays and zimogram analyses indicated the production of a unique proteolytic enzyme by each strain, which have presented metalloprotease characteristics. By using factorial design, a statistically validated model was generated for the optimization of enzymatic production. An aqueous two-phase system was effective for the purification of P3 enzyme, resulting in a single band of approximately 53 kDa on SDS-PAGE. The sequencing of strain P3 keratinolytic protease through mass spectrometry revealed homology with zinc-dependent metaloproteases of the serralysin family. In spite of serralysins being commonly related to virulence factors, the pathogenies caused by Serratia seems to be less concerning than the ones caused by other bacteria. Thus, the enzyme of P3, which is easily denatured by heat treatment, may also be biotechnologically useful in controlled processes.

Orientador: Sergio Roberto Peres Line / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-21T03:06:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DellaColetta_Ricardo_M.pdf: 1863333 bytes, checksum: 44c85001fc634c2cd4363b8f4868e6bc (MD5) Previous issue date: 1996 / Resumo: A participação das metaloproteinases durante o desenvolvimento dental ainda não está bem estabelecida. Neste trabalho foram realizados estudos no intuito de caracterizar e detenninar o sítio principal de atuação dos grupos de metaloproteinases associadas ao germe dental' do primeiro molar em desenvolvimento. Verificou-se a presença de enznnas gelatinolíticas e caseinolíticas com comportamento, quanto à ação de inibidores específicos, ação colagenolítica e peso molecular, semelhante ao das enzimas pertencentes. ao grupo das metaloproteinases. A análise nos diversos períodos do desenvolvimento do germe dental mostrou que a maturação dental é acompanhada por um aumento na secreção dessas proteinases. Quando analisado o sítio de atuação dessas metaloproteinases, observou-se maior ação gelatinolítica na. papila dental quando comparado com o órgão do esmalte. A ação caseinolítica foi maior no órgão do esmalte. Estes resultados indicam que enzimas pertencentes ao grupo das metaloproteinases estão associadas ao desenvolvimento e crescimento do órgão dental. A presença de caseínases, principalmente no órgão do esmalte, pode estar relacionada ao processo de mineralização dental / Abstract: The participation of metalloproteinases during the tooth development is not well established. This work was performed in order to determine and characterize the expression of metalloproteinases during the rat first molar development. Gelatinolytic and caseinolytic activities were analyzed by zymography on polyacrylamide gels containing one of the substracts. The maturation of the rat first molar was accompanied by changes in the expression of metalloproteinases. Gelatinolytic activity increased progressively from day O to 15, while caseinolytic activity increased rapidly from day 3 to 10, decreasing on day 15. Mechanical separation of compartments of tooth genn showed that caseinolytic activity was restricted, mainly in the enamel organ whi1e gelatinolytic activity was localized mainly in the papillae. All the enzymes detected were inhibited by 1,10phenanthroline, which is a specific inhibitor for metalloproteinases. These data suggest that matrix metalloproteinases pIay an important role in the developmtmt and maturation of tooth germ / Mestrado / Biologia e Patologia Buco-Dental / Mestre em Ciências

Orientador: Marcelo Cristianini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-27T06:02:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arasaki_LeticiaHarumi_M.pdf: 18571902 bytes, checksum: 189d2c3a59ee931f6a4e385373d18c97 (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Os resíduos da indústria pesqueira representam problemas ambientais e um desperdício significativo de um material com alto teor protéico. A carne escura de atum é descartada juntamente com outros tipos de resíduos, que incluem as vísceras, a cabeça, a cauda e os espinhos. A hidrólise enzimática de proteínas é uma alternativa para o reaproveitamento do resíduo e em alguns casos aumentar seu valor agregado, já que este processo pode melhorar algumas propriedades funcionais de proteínas. O objetivo deste trabalho foi utilizar a Metodologia de Superfície de Resposta para estudar os efeitos do pH, temperatura e relação enzimalsubstrato no grau de hidrólise de carne escura de atum, utilizando as enzimas proteolíticas comerciais Proteinase 1.5L (Prozyn) e Savinase@(Novo Nordisk). A carne escura de atum apresentou a seguinte composição centesimal: 64,63% de umidade, 26,88% de proteínas, 5,79% de lipídios e 1,85% de cinzas. Utilizando-se a enzima Proteinase 1.5L, foi realizado um planejamento experimental 23 para estudar os efeitos das variáveis independentes pH, temperatura e relação enzimalsubstrato. Os intervalos estudados foram: pH de 6,75 a 7,25, temperatura de 40 a 60°e e relação enzima substrato de 0,1 a 0,3 %. Dentro das faixas estudadas, a variável de maior efeito no processo foi o pH, seguido da relação enzimalsubstrato. Observou-se que a temperatura não influenciou o processo significativamente (p<0,05). Foi então realizado um segundo planejamento experimental completo 22 para estudar os efeitos do pH e relação enzimalsubstrato no grau de hidrólise. Os intervalos estudados foram: pH de 6,6 a 7,4 e relação enzima substrato de 0,06 a 0,34 %. A variável de maior efeito no processo foi o pH. O processo foi considerado como ótimo na região onde houve um maior grau de hidrólise, onde o pH variou de 6,6 a 6,7 e a relação enzimalsubstrato de 0,30 a 0,34%. Para o estudo da obtenção do hidrolisado protéico utilizando a enzima Savinase@ foi realizado um planejamento experimental completo 23 para avaliar os efeitos do pH, temperatura e relação enzimalsubstrato. Os intervalos estudados foram: pH de 8,5 a 9,5, temperatura de 36,6 a 53,4°C e relação enzima substrato de 0,03 a 0,37 %. Foi observado que as três variáveis dentro da faixa estudada influenciaram significativamente o processo. A variável de maior efeito no processo foi a relação enzima/substrato, seguida da temperatura e do pH. O processo foi considerado como ótimo na região onde houve um maior grau de hidrólise, onde o pH variou de 9,4 a 9,5, a temperatura de 52 a 53,4°C e a relação enzima/substrato de 0,28 a 0,37 %. Foi obtido um modelo matemático para cada enzima estudada para descrever o processo de hidrólise nas regiões estudadas. Tais modelos foram validados comparando-se dados experimentais com resultados esperados pelo modelo. Foram obtidas superfícies de resposta que descrevem o processo nas regiões estudadas. Dois métodos de secagem foram comparados para a obtenção do hidrolisado em pó: um utilizando um secador de jorro cônico e outro uma estufa com circulação forçada. Comparando-se os hidrolisados produzidos com a Proteinase 1.5L, o produto seco em estufa apresentou uma solubilidade maior do que o seco em secador de jorro cônico. Para os\ hidrolisados produzidoscom a Savinase@,o processo de secagem não influiu significativamente na solubilidade dos produtos. / Abstract: Fish processing wastes represent environmental problems and a meaningful waste of high protein material. Tuna dark meat is wasted as other kind of wastes, which include offal, head, tail and bones. Protein enzymatic hydrolysis is an alternative way to add value to by-products, as this process improves some of their functional properties. The objective of this work was to study the effects of pH, temperature and enzyme/substrate ratio using Response Surface Methodology on the degree of hydrolysis of tuna dark meat using the commercial enzymes Proteinase 1.5L and Savinase@. Tuna dark meat showed the following chemical composition: 64,63% moisture, 26,88% protein, 5,79% fat and 1,85% of ash. Using the enzyme Proteinase 1.5L, an experimental design 23 was used to evaluate the effects of the independent variables pH, temperature and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis of tuna dark meat. The parameters studied were pH from 6,75 to 7,25, temperature from 40 to 60°C and enzyme/substrate ratio from 0,1 to 0,3%. The factor of highest eftect on the reaction was the pH, followed by the enzyme/substrate ratio. It was observed that the temperature didn't influence the process significantly. Therefore, a second experimental design 22elaborated to study the effect of pH and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis. The parameters studied were pH 6,6 to 7,4 and enzyme/substrate ratio 0,06 to 0,34%. The factor of highest effect was the pH. The process was considered optimum in the region where there was a highest degree of hydrolysis, the pH varied from 6,6 to 6,7 and the enzyme/substrate ratio from 0,30 to 0,34%. An experimental design 23 was used to evaluate the effects of the independent variables pH, temperature and enzyme/substrate ratio on the degree of hydrolysis of tuna dark meat using the enzyme Savinase@,The intervals studied were: pH 8,5 to 9,5, temperature 36,6 to 53,4°C and enzyme/substrate ratio trom 0,03 to 0,37. It was observed that the three factors influenced the process significantly . The factor of highest effect on the reaction was the enzyme/substrate ratio. The process was considered optimum in the region where there was a highest degree of hydolysis, where the pH varied from 9,4 to 9,5, the temperature trom 52 to 53,4°C and enzyme/substrate ratio from 0,28 to 0,37%. A mathematical model was obtained for each enzyme to describe the hydrolysis reaction in the studied areas. Such models were considered predictive in the region studied. Two drying methods to obtain a dried product were compared: fIuidized bed and conventional oven. Comparing the protein hydrolysates produced with Proteinase 1.5L, the sample dried in the oven showed higher solubility than the one dried in the fIuidized bed. For the protein hydrolysate obtained with Savinase@,the drying method did not influence significantly the product solubility. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Humberto de Araujo Rangel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T08:16:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_MarcosGarcia_M.pdf: 1468128 bytes, checksum: 509b553e635606c76700ca3af2c9578d (MD5) Previous issue date: 1977 / Resumo: A atividade proteinásica de uma fração solúvel, rotulada como FS, obtida a partir de lisados da forma epimastigota de T. cruzi foi investigada em diferentes pH, utilizando diferentes tampões e o método de Anson modificado. A atividade proteolítica em pH 7,0 foi particularmente investigada utilizando-se diferentes substratos protéicos. A caracterização da proteinase neutra foi tentada utilizando-se os métodos de detecção de atividade proteolítica em gel de agarose, após eletroforese, imunoeletroforese simples e imunoeletroforese cruzada. Os resultados obtidos mostram que: 1. A FS exibe atividade proteolítica em uma ampla faixa de pH (entre 1,0 e 9,0), ocorrendo picos de atividade na zona ácida (pH 2,6 a 3,6), na zona alcalina (pH 8,5) e a zona neutra. 2. A atividade proteinásica da zona neutra apresentou um ótimo de atividade em pH 7,0, quando se utilizou tampão fosfato e homoglobina bovina ou humana como substratos. Um mesmo Km foi encontrado para as duas hemoglobinas que quando testadas frente a diferentes concentrações de FS, obteve-se uma relação praticamente linear entre dose e efeito quando os valores de 'delta¿DO se situam entre 0 e 0,500. 3. A proteinase neutra é capaz de agir sobre SNC, SAB, SAH e GGH, não alterando contudo o motivo antigênico desses substratos... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Not informed. / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Juan Alberto Coch Frugoni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-15T08:46:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribas_IsabelMariadoAmaral_M.pdf: 2674577 bytes, checksum: 7f74ce897b742083f99274d66e0c265e (MD5) Previous issue date: 1978 / Resumo: Realizaram-se alguns estudos experimentais de atividade enzimática proteolítica do extra do aparelho digestivo da corvina (Micropogon furnieri), segundo o seguinte plano de trabalho: 1) provas da exietência de atividades enzimáticas proteolítica ; 2) Influência do pH a temperatura constante ; Influência da temperatura a pH constante. Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Some experimental studies of the proteolitic enzimatic activity of extracts from the digestive system of the croaker (Micropogon furnieri) were made according to the follwing plan: 1) Evidence of the proteolitic enzymatic activity ; 2) Influence of pH at a constant temperature ; 3) Influence of temperature at a constant pH. Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-05-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 1 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:27Z : No. of bitstreams: 2 Publico-00268a.pdf: 1567152 bytes, checksum: edde41fc5183eb2ec3800911222b1493 (MD5) Publico-00268b.pdf: 2029279 bytes, checksum: 0ce31c253ab625a6b402e5c0b4abffe0 (MD5) / O vírus da febre aftosa (FMDV), um patógeno que afeta animais no mundo todo, possui um RNA genômico de fita simples que, após infectar a célula, é imediatamente traduzido numa única poliproteína. Esta poliproteína produzida é processada durante a síntese em várias proteínas maduras através de peptidases codificadas pelo próprio vírus. A primeira clivagem da poliproteína viral é realizada pela Lbpro entre sua própria região C-terminal e a região N-terminal da proteína VP4. Lbpro também cliva especificamente dois homólogos dos fatores eucarióticos de iniciação (eIF) 4G, resultando na supressão da translação proteica do hospedeiro realizadas através dos mRNAs cap-dependentes. Consequentemente, o RNA do FMDV, que inicia a tradução via IRES, e não requer o eIF4G intacto, pode usar livremente a maquinaria de síntese protéica do hospedeiro para tradução viral. Nós usamos uma série de peptídeos fluorogênicos desenhados especificamente para examinar a especificidade por substratos, efeitos do pH e força iônica sobre a atividade catalítica da Lbpro e sua mutante sLbpro. Comparadas com outras cisteínos peptidases, como a papaína e catepsinas, Lbpro e sLbpro possuem muitas caracteríticas únicas como alta sensibilidade à sais e um sítio de ligação ao substrato muito específico, extendendo-se até a posição P7. Análises de dados estruturais mostraram que Lbpro liga os resíduos P1-P3 do substrato em uma conformação extendida, enquanto os resíduos P4-P7 são ligados numa curta hélice 310. A especificidade da Lbpro, revelada através dos peptídios substituídos pode ser explicada para todas as posições, exceto para P5. / Foot-and-mouth disease virus (FMDV), a global animal pathogen, possesses a single-stranded RNA genome that, on release into the infected cell, is immediately translated into a single polyprotein. This polyprotein product is cleaved during synthesis by proteinases contained within it into the mature viral proteins. The first cleavage is performed by the leader protease (Lbpro) between its own C-terminus and the N-terminus of VP4. Lbpro also specifically cleaves the two homologues of the cellular eukaryotic initiation factor (eIF) 4G, resulting in shut-off of host capdependent mRNA translation. Consequently, FMDV RNA, which initiates translation via IRES, and does not require intact eIF4G, can freely use the host protein synthesis machinery for viral protein synthesis. We used a panel of specifically designed fluorogenic peptides to examine the substrate specificity, effects of pH and ionic strength on Lbpro activity and of its shorter mutant sLbpro. Compared with other cysteine peptidases, how papain and the cathepsins, Lbpro and sLbpro possesses several unusual characteristics, including a high sensitivity to salt and a very specific substrate binding site extending up to P7. Indeed, almost all substitutions investigated were detrimental to Lbpro and sLbpro activity. Analysis of structural data showed that Lbpro binds residues P1 to P3 in an extended conformation whereas residues P4 to P7 are bound in a short 310 helix. The specificity of Lbpro as revealed by the substituted peptides could be explained for all positions except P5. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 geovane_lopes_ioc_mest_2014.pdf: 4146940 bytes, checksum: 332c9cbd56d1a1690235d637c48eaeef (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar e identificar peptidases ativas presentes nos intestinos de machos e fêmeas de Anopheles aquasalis bem como identificar as proteínas expressas no intestino e gônadas de fêmeas dessa espécie. Para a caracterização proteolítica foram usadas distintas abordagens bioquímicas que permitiram reunir um grupo importante de informações sobre a expressão de enzimas proteolíticas nesta espécie de mosquito. Usando o substrato fluorogênico Z-Phe-Arg-AMC em solução e a técnica de enzimografia por SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina foi possível observar um perfil proteolítico composto por serina peptidases do tipo tripsina no intestino de machos e fêmeas de An. aquasalis. Estas enzimas apresentam maior atividade proteolítica na faixa de pH alcalino e ampla estabilidade térmica, sendo ativas entre 25 °C \2013 80 °C, com maior atividade entre 37 °C \2013 50 °C. Diferenças qualitativas e quantitativas na expressão das peptidases também foram detectadas. Foi observado que o perfil proteolítico difere entre macho e fêmea, sugerindo com isso que a expressão de algumas dessas enzimas é sexo-específica Para análise proteômica do intestino e gônadas de fêmeas alimentadas com açúcar usou-se uma abordagem \201Cbottom-up\201D acoplada à análise bioinformática de dados para identificação das proteínas expressas. A análise do intestino foi feita através de um procedimento de digestão em solução sem pré-fracionamento das proteínas, ao passo que a análise das gônadas foi feita usando um protocolo de digestão em gel após fracionamento das proteínas por SDS-PAGE. Usando estas estratégias, um total de 137 e 995 proteínas foram identificadas no intestino e gônadas, respectivamente. As proteínas foram identificadas usando os programas ProLuCID e/ou PEAKS, e uma base de dados \201Ccustomizada\201D incluindo todas as sequencias de Culicídeos depositadas na base de dados UniProt (81,000 sequencias, em outubro de 2013). As identificações foram posteriormente analisadas com relação ao enriquecimento de termos de ontologia gênica e foram classificadas de acordo com seu processo biológico e função molecular, usando o módulo GeneOntology da plataforma PatternLab. A caracterização proteômica revelou para o intestino (i) a presença de várias serina peptidases do tipo tripsina, corroborando a expressão e atividade das enzimas observadas na enzimografia; (ii) a expressão de vários genes codificantes para quimiotripsina, embora a sua atividade não tenha sido detectada pela enzimografia; e para as gônadas (iii) proteínas associadas à vitelogênese; e (iv) a expressão massiva de proteínas implicadas na preparação do tecido para reprodução Finalmente, até o presente, esta é a primeira caracterização abrangente da atividade proteolítica de machos e fêmeas de An. aquasalis bem como a primeira caracterização proteômica do intestino e gônadas de fêmeas desta espécie alimentadas com açúcar. Os resultados obtidos neste trabalho além de fornecerem informações sobre a localização tecidual de proteínas no mosquito e abrirem diversas vias de estudo da biologia e fisiologia deste vetor, contribuem também para a anotação funcional do genoma desta espécie, visto tratar-se de uma espécie com genoma ainda não concluído / The aim of this study was to characterize and identify active peptidases from the midgut of males and females of Anopheles aquasalis and to identify protein expressed in the midgut and gonads of females of this species. The different bioche mical approaches used for the proteolytic characterization allowed gather ing a group of important information about the expression of proteolytic enzymes in this mosquito species. Using the fluorogenic substrate Z - Phe - Arg - AMC for in - solution enzymatic assays and by zymographic analyses (SDS - PAGE co - polymerized with gelatin) it was possible to observe a proteolytic profile composed of trypsin - like serine peptidases in the midgut of male and female A n . aquasalis . These pepti dases exhibit high proteolytic activity at a w ide range of alkaline pH and thermal stability, being active between 25° C - 80 ° C, with more activity between 37° C - 50° C. Qualitative and quantitative differences in the expression of peptidases were also detected. It was observed that proteolytic profile differs between males and females, thereby suggesting that the expression of some of these enzymes is sex - specific. For proteomic analysis of the midgut and gonads of females fed on sugar it was used a "bo ttom - up" proteomic approach coupled with bioinformatic s data analysis to identify tissue - specific expressed protein s . The midgut analysis was taken through an in - solution digestion procedure without pre - fractionation of the proteins, while the analysis of gonads was made using an in - gel digestion protocol after fractionation of proteins by SDS - PAGE. Using these strategies, a total of 137 and 995 proteins were identified in the midgut and gonads, respectively. Proteins were identified using the ProLuCID and/ or PEAKS software , and a customized database including all Culicidae protein sequences deposited at the UniProt database (81,000 sequences, in October 2013). Protein identifications were further analyzed for the enrichment of gene ontology terms and were c lassified according to their biological process and molecular function using the GeneOntology module of the PatternLab platform. The proteomic characterization of midgut revealed (i) the presence of various t rypsin - like serine peptidases , confirming the ex pression and activity of these enzymes observed by zymography, (ii) the expression of several chymotrypsin coding genes, although its activity was not detected by zymography . Proteomics of gonads from female fed with sugar revealed (iii) the expression of proteins associated with vitellogenesis and (iv) the massive expression of proteins involved in tissue preparation for reproduction process. F inally, to the present , t his is the first characterization of the proteolytic activity of males and females midgut s of An. aquasalis well as the first proteomic characterization of the midgut and gonads of A n . aquasalis females fed with sugar. The results obtained in this work in addition to providing information about the cellular localization of proteins in the mosq uito , open several avenues of study of the biology and physiology of this vector, and also contribute to the functional annotation of the genome of this species with genome not yet completed

Made available in DSpace on 2016-05-19T13:16:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ellen_altoe_ioc_mest_2013.pdf: 1397353 bytes, checksum: 107b103e24982f28206bdb6e9749cd60 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A gp63, metalopeptidase altamente abundante na superfície de Leishmania, contribui para uma infinidade de funções bem estabelecidas na interação deste parasito com o hospedeiro mamífero. No entanto, apesar desta molécula ser abundantemente expressa na superfície das formas promastigotas, encontradas no inseto vetor, pouco é conhecido sobre as funções desempenhadas por essa metalopeptidase no flebotomíneo. Nosso grupo de pesquisa, utilizando abordagens bioquímicas, tem demonstrado que moléculas de gp63 de vários tripanosomatídeos não patogênicos ao homem estão implicadas na adesão ao intestino de insetos hospedeiros. Aqui, nós analisamos o papel da gp63 na interação de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, com os seus respectivos insetos hospedeiros, Lutzomyia intermedia e Lu. longipalpis e com a linhagem celular derivada de Lu. longipalpis (LL5). Os intestinos dissecados de insetos foram prétratados ou não com o fosfoglicano (PG) puro derivado do lipofosfoglicano e colocados para interagir com os parasitos. Em paralelo, promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram pré-tratados com anticorpo anti-gp63 ou com inibidores da metalopeptidase. Depois disso, os parasitos foram colocados para interagir com os intestinos dissecados de insetos ou com as células LL5 Como esperado, o PG praticamente elimina a capacidade dos parasitos de se ligarem ao intestino dos insetos. Todos os tratamentos relacionados com a gp63 também provocaram uma diminuição acentuada nestes ensaios de ligação. Além disso, o sobrenadante de cultura de L. braziliensis foi concentrado por precipitação com sulfato de amônio e analisado por SDS-PAGE e SDS-PAGE-gelatina. Observamos uma degradação proteolítica, por volta de 63 kDa, que corresponde à enzima gp63 já identificada e caracterizada em várias espécies de Leishmania. Esses resultados em conjunto demonstram uma possível participação da gp63 na interação com o inseto vetor e nos estimulam a continuar estudando o papel dessa metalopeptidase no ciclo de vida de Leishmania / The highly abundant surface metallopeptidase of Leishmania, gp63, contributes to a myriad of well-established functions in the interaction of this parasite with the mammalian host. However, despite this molecule being abundantly expressed on the surface of promastigote forms, found in the insect vector, little is known about the functions performed by this metallopeptidase in the phlebotomine. Our research group, using biochemical approaches, has demonstrated that gp63 molecules from several not pathogenic trypanosomatids to man are implicated in the adhesion to guts of insect hosts. Here, we analyzed the role of gp63 in the interaction of Leishmania braziliensis and Leishmania infantum with their respective insect hosts, Lutzomyia intermedia and Lu. longipalpis and with the cell line derived from Lu. longipalpis (LL5). The dissected insect guts were pretreated or not with purified phosphoglycan (PG) derived from the lipophosphoglycan and placed to bind with the parasites. In parallel, promastigotes of L. braziliensis and L. infantum were pretreated with anti-gp63 antibodies or with metallopeptidase inhibitors. Thereafter, the parasites were placed to interact with dissected insect guts or with the LL5 cells. As expected, PG virtually eliminates parasites ability of bind to the insect guts. All treatments related to gp63 also provoked a pronounced decrease in these binding assays. Moreover, the culture supernatant of L. braziliensis was concentrated by precipitation with ammonium sulfate and analyzed by SDS-PAGE and SDS-PAGE-gelatin. We observed a proteolytic degradation around 63 kDa, which corresponds to the gp63 enzyme already identified and characterized in several Leishmania species. These results together demonstrate a possible role of gp63 in the interaction with the insect vector and stimulate us to continue studying the role of this metallopeptidase in the life cycle of Leishmania.