A tendência da indústria em produzir alimentos mais saudáveis, com menos gordura vem aumentando sensivelmente. O desafio do melhoramento nos dias atuais é melhorar a qualidade da carcaça dos frangos juntamente com a redução nos teores de gordura, que é uma exigência do mercado consumidor. A leptina é um hormônio polipeptídico secretado principalmente pelo tecido adiposo com um importante papel na regulação da ingestão de alimentos, metabolismo de energia e reprodução. O gene da leptina e seu receptor vem sendo objeto de intensa investigação representando excelentes genes candidatos para deposição de gordura na carcaça nos programas de seleção assistida por marcadores. A função desses genes tem sido intensamente estudada em mamíferos, porém, em aves poucos estudos foram realizados. O presente trabalho teve como objetivo investigar a ocorrência de polimorfismos no gene da leptina e de seu receptor em galinhas, e avaliar os efeitos desses polimorfismos sobre características de desempenho e carcaça. Duas linhagens de aves, uma de corte (TT) e uma de postura (CC) foram utilizadas para desenvolver a população referência F2 empregada no presente estudo. A polução referência foi desenvolvida no sistema de Melhoramento Genético de Aves da Embrapa Suínos e Aves, em Concórdia/SC. Foram desenhados primers para amplificar o gene da leptina e os íntrons 8 e 19 do do gene do receptor da leptina. Entretanto, após diversas tentativas não foi possível amplificar o DNA genômico e cDNA do gene da leptina. No íntron 8 do gene do receptor da leptina o SNP C352T foi genotipado por seqüenciamento em 247 animais da população F2. O alelo T foi associado ao maior rendimento de carcaça (P=0,0165), rendimento de peito (P=0,0137), gramas de proteína bruta (P=0,0112) e cinza na carcaça (P=0,0150), enquanto o alelo C foi associado somente ao rendimento de fígado (0,0102). No íntron 19 o SNP G915A foi genotipado por PCR-RFLP em 137 animais da população F2. O alelo A foi associado ao consumo de ração (P=0,0339)), o alelo G ao rendimento de pulmão (P=0,287) e os alelos A e G quando em homozigose foram associados com rendimento de coxas e sobrecoxas (0,0302). Por ocorrerem em região de íntron, provavelmente esses SNPs não estão envolvidos diretamente com as características associadas, mas podem estar ligados a outra mutação localizada na região regulatória do gene do receptor da leptina ou em outro gene próximo. No futuro outros polimorfismos deverão ser explorados, em regiões codificadoras desse gene, para serem utilizados como marcadores associados a características de desempenho e carcaça em aves. Em adição o gene do receptor da leptina foi localizado no mapa de ligação do cromossomo 8 da população de aves da Embrapa, o próximo passo será realizar a análise de QTL incluindo os SNPs estudados como marcadores. / The trend of industry in producing healthier nourishment, with less fat has raised sensibly. The challenge of animal breeding in the current days is to improve carcass quality of chickens with concomitant reduction in the fat content, witch is a consumer\'s demand. Leptin is a polypeptide hormone secreted mainly by adipocytes with an important role in the regulation of food ingestion, energy metabolism energy and reproduction. The leptin (LEP) and its receptor (LEPR) genes are being subject of intense investigation representing excellent candidate genes for fat deposition in the carcass in marker assisted selection programs. The function of those genes has been intensely studied in mammals, however, in birds few studies were accomplished. The present work aimed to investigate the occurrence of polymorphisms in the LEP and LEPR genes in Chickens, and also evaluate the effects of those polymorphisms on performance and carcass traits. Two chicken lines, a broiler (TT) and a layer line (CC) were used to develop an F2 reference population used in the present study. The reference population was developed in the Poultry Genetic Breeding System at Embrapa Suínos e Aves, in Concórdia/SC. Primers were designed for the PCR amplification of the LEP gene leptina and introns 8 and 19 of the LEPR gene. However, after several attempts it was not possible to amplify the genomic DNA or cDNA of the leptin gene. In the intron 8 of the LEPR gene, SNP C352T was genotyped by DNA sequencing of 247 animals of the F2 population. The T allele was associated with greater carcass yield (P=0,0165), breast yield (P=0,0137), grams of crude protein (P=0,0112) and ashes in the carcass (P=0,0150), while the C allele was associated only to liver yield (0,0102). The SNP G915A in the intron 19 was genotyped by PCR-RFLP of 137 animals from the F2 population, the allele A was associated to the feed intake (P=0,0339), the allele G to the lung yield (P=0,287), and the alleles A and G, when in homozigose, were associated with drumstick and thigh yield (0,0302). Because these SNP are located within an intron area, they are not likely directly involved with the associated characteristics, but they can be linked the other mutation located in the regulatory area of the LEPR gene. In the future other polymorphisms should be explored, in the coding regions of this gene, so they can be used as markers associated to performance and carcass characteristics in poultry. In addition, the LEPR gene was located in the ligation map of the chromosome 8 for the Embrapa population. The next step will be to accomplish the analysis of QTL including the SNPs studied as markers.

La liaison peptidique au sein d’un peptide ou d’une protéine est d’ordinaire plane et en conformation trans pour la majorité des acides aminés. La situation est un peu différente en amont d’une proline : la barrière thermodynamique qui s’oppose à la rotation de la liaison amide est plus faible et la tendance de la liaison à rester plane est un peu moins grande. Cette liaison AA-Pro peut donc adopter une conformation cis, entraînant la formation d’un coude prononcé dans une chaîne peptidique à son niveau. Ce travail décrit la synthèse et la réactivité chimique de nouveaux analogues bis-azotés de la proline en solution permettant de favoriser la conformation cis d’une liaison AA-ΨPro. L’impact conformationnel que peut engendrer ces résidus au sein de pseudopeptides est également exposé. Dans un premier temps, une nouvelle voie d’accès à la α-azaproline énantiomériquement pure et orthogonalement protégée a été mise au point en exploitant des travaux antérieurs concernant la synthèse d’α-hydrazinoesters et de N-aminodipeptides. L’étude de la réactivité de cette pseudoproline a permis de définir les meilleures conditions de formations de pseudotripeptides de formule P1-AA1-δ-azaPro-AA3-P3. Elle a également orienté les travaux, dans un second temps, vers la synthèse de pseudopeptides incorporant un motif acide pyrazolique. Enfin, la structure des composés préparés a été analysée par RMN, IR et par modélisation moléculaire. L’examen des P1-AA1-δ-azaPro(Boc)-AA3-P3 a révélé la formation par liaison hydrogène d’un pseudocycle en C7, favorisant la conformation trans de la liaison AA1-δ-azaPro, alors que l’absence de la fonction Boc favorise la conformation cis de cette liaison. / The peptidic bond in a peptide or a protein is usually flat and in trans conformation for the majority of amino acids. The situation is a little bit different upstream the proline: the thermodynamic barrier which opposes the rotation of the amide bond is weaker and the tendency of the bond to remain flat is lesser. So, this AA-Pro bond can adopt a cis conformation, leading to the formation of a turn in the peptidic chain. This work describes the synthesis and the chemical reactivity of new bis-nitrogen analogous of proline in solution to facilitate the cis conformation of a AA-PΨPro bond. The conformational impact that these residues may generate in pseudopeptides is also exposed.Initially, a new access road to the orthogonally protected and enantiomerically pure δ-azaproline has been developed by exploiting previous work on the synthesis of α- hydrazinoesters and N-aminodipeptides. The study of the reactivity of this pseudoproline helped define the best conditions for forming pseudotripeptides of formula P1-AA1--δ-azaPro-AA3-P3. It also guided the work, in a second step, towards the synthesis of pseudopeptide incorporating a pyrazole acid motif. Finally, the structure of the prepared compounds was analyzed by NMR, IR and molecular modeling. Examination of the P1-AA1-δ-azaPro(Boc)-AA3-P3 revealed the formation of a pseudocycle C7 by a Hydrogen bond, favoring the trans conformation of the AA1-δ-azaPro bond, while the absence of Boc function seems to favor the cis conformation of this bond.

Les récepteurs couplés aux protéines G représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires. Parmi eux, nous avons choisi d’étudier deux récepteurs apparentés : les récepteurs de la prokinéticine 1 et 2. Ces deux récepteurs ont pour ligands des hormones de nature peptidique, divisées en deux sous-groupes : les prokinéticines 1 et 2. Ces deux prokinéticines sont impliquées dans plusieurs processus physiologiques en se liant à leurs récepteurs PKR1 et PKR2. Il a été récemment montré que la prokinéticine 2 pouvait stimuler la prolifération et la différenciation des cellules souches progénitrices cardiaques, via les récepteurs PKR1 et PKR2. Il a également été reporté que l’activation de PKR1 protège les cardiomyocytes et les cellules progénitrices cardiaques de l’apoptose. Afin d’étudier ces effets nous avons synthétisé des agonistes non-peptidiques du récepteur PKR1. Nous avons donc poursuivi les études de pharmacomodulation d’une première famille de composés et développé une seconde famille d’agonistes potentiels originaux, déterminée par des études de modélisation moléculaire. Une sonde fluorescente a été synthétisée afin d’évaluer la liaison de nouveaux composés. Au cours de ces travaux nous avons découvert une nouvelle réaction multi-composante permettant la synthèse d’un composé dihydropyrrole polyfonctionnel. Nous nous sommes alors intéressés à son mécanisme et à sa limitation chimique dans le but de former de nouveaux hétérocycles fonctionnalisés. / The G protein-coupled receptors represent the largest familly of membrane receptors. Among them,we choose to study two related receptors: prokineticin receptors 1 and 2. These two receptors have peptidic hormone ligands, divided in two sub-groups: prokineticins 1 and 2. Both prokineticins are involved in many physiological processes by binding to their receptors PKR1 and PKR2. It has recently been shown that prokineticin 2 could stimulate proliferation and differentiation of cardiac progenitor cells. It was also reported that activation of PKR1 protects cardiomyocytes and cardiac progenitor cells from apoptosis. To investigate these effects we synthesized non-peptidic receptor PKR1. We continued pharmacodulation studies of a first familly of compounds and developped a second familly of original potential agonists, determined by molecular modeling studies. A fluorescent probe was synthesized to access the binding of novel compounds. During this work we discovered a new multi-component reaction for the synthesis of a polyfunctional dihydrpyrrol compound. We then interested in the mechanism and its chemical limitation in order to form new functionalized heterocycles.

Les récepteurs à la vasopressine V1bR et à la sérotonine 5HT3R jouent des rôles physiologiques importants dans la détection des signaux extracellulaires, les mécanismes de transmission nerveuse et diverses pathologies dont le cancer, le diabète et des maladies des SNC et SNP. Mes études avaient pour but de générer ou trouver des modulateurs peptidiques de ces deux récepteurs. Pour le V1bR, j’ai développé plusieurs anticorps de type VHH et les ai caractérisés aux plans biochimique et fonctionnel. L’un de ces VHHs agit comme un agoniste allostérique complet et spécifique du V1bR humain (hV1bR). In vitro ce VHH est capable d’activer les voies de signalisation de l’inositol phosphate et des MAP kinases et d’induire l'internalisation du hV1bR. Dans des îlots pancréatiques surexprimant le hV1bR, il induit une augmentation du Ca2+ intracellulaire et une sécrétion d'insuline. Pour le 5HT3R, j’ai criblé par SPR 31 venins de serpents sur des récepteurs recombinants immobilisés et mis en évidence une interaction à partir d’un de ces venins. Suite à purification par chromatographie liquide et identification par spectrométrie de masse, j’ai identifié une toxine préalablement caractérisée comme une enzyme à activité Ca2+-dépendante. Cette toxine interagit avec les 5HT3R A et AB indépendamment du Ca2+ et avec des valeurs de Kd ≤ 10 nM. L’analyse fonctionnelle par électrophysiologie suggère qu’elle agit comme un PAM de l’activité canal du 5HT3R. Des images de ME en coloration négative montrent la toxine fixée sur le domaine extracellulaire du 5HT3R, à distance du site pour la 5HT. Le VHH et la toxine pourraient être utilisés comme outils pharmacologiques et/ou agents thérapeutiques. / The vasopressin V1bR and serotonin 5HT3R receptors play important physiological roles in the detection of extracellular signals, in the mechanisms for neuronal transmission, and in various pathologies including cancer, diabetes, and CNS and PNS diseases. My studies were aimed at generating or finding peptidic modulators of these two receptors. For the V1bR, I developed several antibodies of the VHH type and characterized them biochemically and functionally. One of these VHHs acts as a complete allosteric agonist specific for the human V1bR (hV1bR). In vitro this VHH is able to activate the signaling pathways of inositol phosphate and MAP kinases and to induce the internalization of hV1bR. In pancreatic islets overexpressing hV1bR, it induces an increase in intracellular Ca2+ and a secretion of insulin. For the 5HT3R, using SPR I screened 31 snake venoms on immobilized recombinant receptors and for one of these venoms, evidenced an interaction. Following purification by liquid chromatography and identification by mass spectrometry, I identified a toxin previously characterized as an enzyme with Ca2+-dependent activity. This toxin interacts with the 5HT3R A and AB independently of Ca2+ and with Kd values ≤ 10 nM. Functional analysis by electrophysiology suggests that it acts as a PAM of the 5HT3R channel activity. Images recorded by negative staining EM show that the toxin binds to the 5HT3R extracellular domain, at a distance from the 5HT binding site. Both this VHH and this toxin could be used as pharmacological tools and / or therapeutic agents.

Suite à la première thèse sur le greffage et l’adsorption physique successives de sélecteurs chiraux dans des tubes ouverts en électrochromatographie capillaire (ECC ou CEC) chirale, menée par le Dr Guillaume Pédéhontaa-Hiaa au sein de l’équipe du laboratoire COBRA (IUT d’Evreux), nous avons développé des phases stationnaires chirales covalentes (CSPs) à base de cyclodextrines (CDs) en tubes ouverts et des CSPs sur supports monolithiques pour l’emploi en CEC. Nous avons ainsi évalué les paramètres électrochromatographiques et la stabilité de ces CSPs en séparant une variété de racémiques neutres et chargés. L’influence de la température d’analyse, le potentiel appliqué ainsi que la nature et le pH des électrolytes sur la qualité des électrochromatogrammes ont été étudié en CEC chirale. Cette étude se divise en deux grandes parties. La première concerne les CSPs élaborées sur colonnes à tubes ouverts pour l’OT-CEC. Il s’agit initialement de graver la surface interne d’un capillaire de silice de 50 μm de diamètre interne à l’aide d’une solution de bifluorure d’ammonium dans le but premier d’augmenter considérablement sa surface spécifique et d’immobiliser en surface une grande quantité de sélecteurs chiraux à base de β-CD. Nous avons alors décrit des greffages covalents de CDs anioniques (Scc-β-CD et CM-β-CD) et d’un polymère anionique de CDs (p-CM-β-CD-) en surface de capillaire de gel de silice gravée et modifiée chimiquement par l’aminopropyltriéthoxysilane (APTEOS). Les greffages des sélecteurs ont été reproduits dans les mêmes conditions que dans la thèse rapportée précédemment en électrophorèse. L’originalité de la construction de ces CSPs réside dans la rapidité et la simplicité du couplage dit péptidique à température ambiante, des sélecteurs carboxylés sur des colonnes préalablement gravées. Ce greffage nécessite des agents de couplage peptidique solubles dans l’eau tels que 1-Ethyl-3-(diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) et le N-Hydroxysuccinimide (NHS). Il peut aussi être obtenu de manière moins efficace avec d’autres agents solubles en milieu organique tels que le O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N’,N’-tétraméthyluronium tétrafluoroborate et la triéthylamine (TBTU/TEA). Chaque étape menant aux CSPs a été caractérisée par une étude de flux électroosmotique (FEO) en OT-CEC. Des analyses en AFM et en MEB nous renseignent d’avantage sur le succès du procédé « etching » de nos capillaires. La deuxième grande partie de cette étude traite de la synthèse in-situ de CSPs sur des colonnes de type polymères monolithes organiques et un monolithe hybride à base de sol gel. Des post modifications de surface de ces supports monolithiques nous ont permis d’immobiliser de façon covalente et non covalente des sélecteurs de β-CD en surface des volumes macroporeux. Deux collaborations ont vu le jour pour atteindre ces objectifs. La première eut lieu avec le Dr Thuy Tran et le Pr Myriam Taverna de la Faculté de Pharmacie de Chatenay Malabry (UMR 8612), durant laquelle nous avons reproduit une colonne monolithe organique de type méthacrylate, porteuse de groupements phosphate dans l’optique d’adsorber physiquement en surface le polymère cationique de CDs (p-CD+) que nous a transféré le Pr Benjamin Carbonnier et d’évaluer les capacités de discrimination chirale de cette nouvelle CSP en m-CEC. La seconde collaboration a eu lieu avec le Dr Mohamed Guerrouache et le Pr Benjamin Carbonnier au sein du laboratoire ICMPE de Thiais, où nous avons synthétisé des colonnes monolithiques organiques à base d’acrylates dans le but de greffer en surface de façon covalente et non covalente les CDs et polymères de CDs et d’évaluer ces nouvelles CSPs en m-CEC. La troisième phase stationnaire monolithique employée est celle décrite par le Dr Huihui Yang qui décrit un monolithe hybride porteur de groupements sulfonates nous permettant par la suite d’immobiliser électrostatiquement le p-CD+ sur le réseau poreux et d’évaluer cette nouvelle CSP en m-CEC. / New chiral stationary phases have been prepared for Open Tubular and monolithic columns used in electrochromatography capillary. In order to separate racemic mixtures such as flavonoïd, Hidantoïn derivatives, Binaphtalene-2, 2-hydrogenophosphate and others chiral solutes, we use the β-cyclodextrin forms as chiral selector. Besides, β-cyclodextrin seems to be the most efficient chiral selector in chromatography since it is able to complex and dissolve optical organic isomers in an aqueous media, this chiral selector is able to dissolve even lipophilic molecule with high weight. The complexation is based on interactions with β-cyclodextrin. This study aims to elaborate new chiral stationary phase for CEC using β-cyclodextrin polymers and β-cyclodextrin derivatives. Two approaches were used: Firstly, covalent stationary phases coating with carboxymethyl-β-cyclodextrin polymers and oligomers containing carboxyl’s group had been experimented for open tubular and monolithic column in CEC. Then a non-covalent coating cationic polymer of β-cyclodextrin’s derivatives was immobilized (polytrimethyl ammonium β-CD) on continuous organic monoliths bearing anionic’s group. Prior to the covalent coating of the CD’s chiral selector for OT-CEC and m-CEC, we needed to modify the silicate surface and the monolithic surface with a primary amine silicate1,2 (aminopropyltriethoxysilane) and EDA, an amino-organic moiety (Ethylene diamine). The stability of the bonded organic moiety (APTEOS, EDA) were studied by CEC at different pH with constant ionic strength’s buffer. In this way, graft of carboxymethyl-β-cyclodextrin polymer on silica inner surface modified by APTEOS and on NAS-co-EDMA surface modified by EDA succeeded in activating and covalently coupling reagent as EDC and NHS (1-ethyl-3(-3-dimethtylaminopropyl) carbodiimide and N-hydroxysuccinimide, respectively3) with carboxymethyl’s group of carboxymethyl-β-cyclodextrin . The resultant stationary phase lead to stable chiral stationary phases, easier to prepare starting by coupling the selector to the amine’s group using EDC and NHS. In order to optimize enantio-separations by increasing the specific surface of open tubular columns, we reproduce the etching process to bared capillaries with ammonium bifluoride solution, referred to Pesek’s process4. By this mean, we increase dramatically the specific surface of bared capillaries before anchoring CDs polymers to silicate surfaces modified by APTEOS. Finally due to etching process, we obtain a covalent bonded Chiral Stationary Phase (CSP) which led to more efficient and resolvent enantio-separations by CEC. To describe, in another way, the non-covalent coating of CSP, we immobilised a cationic polymer (polytrimethyl ammonium β-CD+) on two kind of continuous organic and silica hybrid monoliths bearing sulfonate5 and phosphate’s groups. Based on precedent results for OT-CEC enantio-separation with LbL stationary phase7, using successive layers charged polymers to separate racemic mixture in CEC, we decided to adsorb a polycationic polymer hydrosoluble onto the silica hybrid monolith column to form chiral stationary phase (CSP) polytrimethyl ammonium β-cyclodextrin. This way of modification for monolithic surface by chiral selectors is nowadays highly efficient and attractive for CEC. The effect of the matrix and the coating’s nature are discussed by comparing the chromatographic parameters.