Modifications of perineuronal nets to regulate plasticity Heleen Merel van 't Spijker Perineuronal nets (PNNs) are macromolecular structures formed by neurons after closure of critical periods of plasticity. During development, the central nervous system (CNS) goes through critical periods of plasticity; a period when substantial changes occur to adapt to the environment, during which many synapses are formed and also discarded. When a region of the CNS has finished its development and reached an efficient neuronal circuit, the capacity for plasticity needs to be reduced to preserve the formed circuit. PNNs are formed around neurons during this period of reduced plasticity. PNNs consist of a backbone of hyaluronan, bound by chondroitin sulfate proteoglycans (CSPGs). Here, I present my studies on the possible modifications of PNNs to regulate plasticity. Firstly, I have investigated the potential use of 4-methylumbelliferone (4-MU) to reduce PNN formation in vivo. 4-MU reduces the formation of hyaluronan. Since hyaluronan is the backbone of PNNs, I hypothesized 4-MU treatment would reduce PNN formation. For this study, I developed a method to orally administer 4-MU to rats. Subsequently, I investigated whether 4-MU treatment can improve recovery of rats after spinal cord injury, both with behavioural tests and with immunohistochemistry. Secondly, I have investigated a new binding partner of PNNs, neuronal pentraxin 2 (Nptx2). Nptx2 is secreted by neurons and regulates AMPA receptor diffusion. Nptx2 knockout mice show a prolonged critical period of plasticity in the visual cortex. Here, I have identified Nptx2 as a new binding partner of PNNs. Nptx2 is found in isolated PNN protein preparations and is removed from the surface of neurons by digestion of PNNs with chondroitinase ABC. I also determined Nptx2 facilitates PNN formation in vitro. Addition of Nptx2 to the medium of cortical neurons leads to an increase of neurons that start to form PNNs, as well as an increase in size and density of PNNs. These findings indicate Nptx2 may be used as a modulator of PNNs. Thirdly, I investigated the interaction between Nptx2 and PNNs. I developed a sandwich ELISA to determine which glycan chains from PNNs bind to Nptx2. Nptx2 binds to chondroitin sulfate E and hyaluronan. To investigate the binding properties of Nptx2, I performed quartz crystal microbalance with dissipation monitoring for Nptx2 films. Furthermore, I developed crystals of purified Nptx2 and hyaluronan for x-ray crystallography. The here presented results provide new insights in potential approaches to modulate PNN formation. Both lines of research provide a further understanding of the factors which regulate PNNs and may allow for the development of treatments for PNN related disorders.

In der vorliegenden Dissertation wurden Neurone untersucht, die von einer speziellen Form der extrazellulären Matrix, dem perineuronalen Netz (PN), umgeben sind. Neurone mit einem PN zeichnen sich durch eine geringe Vulnerabilität bei neurodegenerativen Erkrankungen aus. Da das PN mit hoher Affinität Eisen bindet, war zu klären, ob das PN den Eisenhaushalt der Neurone beeinflusst und diese mit einer protektiven Eigenschaft gegenüber Eisen-induzierten oxidativen Stress ausstattet. Es wurde die Eisenkonzentration und der Gehalt an Eisentransport- und Eisenspeicherproteinen von Neuronen mit PN und Neuronen ohne PN in der Ratte untersucht. Dabei kamen quantitative Methoden wie die ortsaufgelöste Ionenstrahlmikroskopie und die Objektträger-basierte Laser Scanning Zytometrie sowie Western Blot Analysen und quantitative Real-Time-PCR zum Einsatz. Die Untersuchungen zeigen, dass Neurone, die mit einem PN umgeben sind, eine höhere Konzentration an Eisen sowie Eisentransport- und Eisenspeicherproteinen besitzen als Neurone ohne ein PN. Das PN könnte so den Eisenhaushalt der Neurone beeinflussen und diese mit einer protektiven Eigenschaft gegenüber Eisen-induziertem oxidativen Stress ausstatten.

La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative induisant des troubles cognitifs, et particulièrement des troubles de la mémoire. L'utilisation des souris modèles de la MA a permis de mettre en évidence des altérations de l'activité des réseaux neuronaux hippocampiques et corticaux qui seraient à l'origine des troubles cognitifs. Ainsi,les patients atteints de la MA et des souris transgéniques modèles de la pathologie ont un dysfonctionnement des interneurones exprimant la parvalbumine (PV), à l'origine de la perturbation des oscillations gamma et des troubles cognitifs. Au cours de cette thèse, nous avons fait l'hypothèse que les souris Tg2576, modèles de la MA, présentent une altération progressive des interneurones PV, et de leur matrice extracellulaire spécifique, les PNN. Cela aurait pour conséquence une altération de l'activité cérébrale (hypersynchronie, perturbation de la puissance des oscillations gamma et de leur couplage avec les oscillations thêta), qui sous-tendrait les troubles cognitifs. Ce travail a permis de montrer que les souris Tg2576 présentent effectivement des perturbations des oscillations gamma au cours d'une tâche cognitive. D'autre part, l'activation spécifique des neurones PV par optogénétique permet la génération d'oscillations gamma chez nos souris anesthésiées. Cependant nous n'avons pas pu combiner cette approche à la réalisation tâche cognitive. Nous avons par ailleurs observé une diminution du nombre de neurones PV hippocampiques et de leur PNN à un âge précoce de la pathologie, qui peut toutefois être restauré par un séjour transitoire dans un environnement enrichi. Enfin nous avons mis en évidence que les souris Tg2576 présentent des activités épileptiformes particulièrement au cours du sommeil paradoxal (SP), ainsi qu'une perturbation des oscillations gamma et de leur couplage avec les oscillations thêta dès l'âge de 1.5 mois pendant le SP. Ainsi, les travaux de cette thèse permettent de mieux caractériser l'impact de la MA sur les neurones PV et sur les phénomènes oscillatoires associés à leur fonction. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder inducing cognitive dysfunction, in particular memory loss. The use of murine models of AD have highlighted alterations of the neural activity of hippocampal and cortical networks leading to alteration of brain oscillations and spontaneous epileptic activities. Interestingly, it has also been found in AD patients and AD mice that GABAergic interneurons expressing parvalbumin (PV) are dysfunctioning, inducing a decrease in gamma oscillations associated with cognitive deficit. Thus, we hypothesized that Tg2576 mice exhibit progressive alteration of PV interneurons, and their specific extracellular matrix (PNN). These would induce aberrant cerebral activity (hypersynchrony, alteration of gamma oscillations and their association with theta oscillations) sustaining cognitive deficits. This work demonstrates that Tg2576 mice exhibit an alteration of gamma power during a cognitive task. On the other hand, the specific activation of PV neurons allows the generation of gamma oscillation in our anesthetized mice, however we haven't been able to try enhancing gamma during a cognitive task. We have also observed a decrease in the number of hippocampal PV neurons and their PNN at an early age of pathology, which can be restored by a transient stay in an enriched environment. Finally, we demonstrate that Tg2576 mice exhibit epileptiform activities, particularly during paradoxical sleep (PS), as well as an alteration of gamma oscillations and their coupling with theta oscillations during PS, as early as 1.5 months of age. Thus, these results allow to better characterize the impact of AD on PV neurons and the oscillatory phenomena associated with their function.

Les réseaux neuronaux sont hautement sensibles aux stimuli sensoriels pendant une fenêtre temporelle dite période critique (PC). Un des acteurs clé de la consolidation de ces réseaux est le Perineuronal Net (PNN), une matrice extracellulaire qui s’accumule au cours de la PC majoritairement autour des interneurones parvalbumin-positifs (PV). La dégradation des PNNs chez l’adulte restaure une plasticité structurale, typique de la PC. Ce projet de recherche vise à déterminer i) les propriétés neurophysiologiques des neurones PV et glutamatergiques dans la couche 4 du cortex visuel primaire de souris au cours du développement ii) de quelle façon ces propriétés sont altérées par l’accumulation des PNN. Nous avons montré, au cours du développement, une augmentation de l’excitabilité des deux types de neurones. La dégradation in vivo des PNN augmente la transmission glutamatergique et GABAergique spécifiquement sur les PV, récapitulant un état juvénile. Dégrader les PNN chez l’adulte n’affecte pas les connections unitaires inhibitrices en couche 4. Afin de comprendre les mécanismes impliqués au niveau du circuit, nous avons exprimé l’opsine sensible à la lumière ChR2 dans les neurones glutamatergiques du thalamus visuel projetant sur la couche 4 du cortex. Ainsi, une absence de PNN augmente le recrutement spécifique des PV par le thalamus, entrainant une augmentation de l’inhibition feedforward. Ces résultats sont en accord avec des expériences réalisées in vivo, au cours desquelles nous avons mesuré les potentiels évoqués en réponse à des stimuli visuels suite à une dégradation des PNN et qui indiquent une augmentation du recrutement de l’inhibition. / The maturation of sensory processing undergoes a critical period (CP), during which cortical neural circuits are sculpted and changed by experience. The closure of CP is paralleled by the accumulation of extracellular perineuronal nets (PNN) around parvalbumin (PV)-positive interneurons. The degradation of PNNs in adult animals was shown to re-open the structural plasticity typical of the CP. We aimed at defining i) the neurophysiological properties of PV cells and principal neurons in layer 4 of primary visual cortex (V1) during the establishment of the CP ii) how these properties are altered by PNN accumulation. We found a robust age-dependent increase of input-output firing relationships in both cell types. Importantly, in vivo PNN removal in adult V1 increased both excitatory and inhibitory transmission selectively onto PV, leaving their excitability intact, and recapitulating younger states. In addition, triggering plasticity in vivo by monocular deprivation did not boost the increased activity onto PV cells. Interestingly, paired recordings in layer 4 showed no changes of inhibitory unitary connections, with or without PNNs. In order to understand the circuit mechanisms underlined, we expressed the light-sensitive opsin ChR2 in the visual thalamus. We found that PNN removal increases the recruitment of PV cells by thalamocortical fibers leading to an increase of feedforward inhibition. These results are in agreement with V1 recordings in vivo of visually evoked potentials in response of increasing contrast. Indeed, PNN disruption caused a reduction of the slope of the contrast sensitivity curve, indicating a higher recruitment of inhibition.

In der vorliegenden Dissertation wurden Neurone untersucht, die von einer speziellen Form der extrazellulären Matrix, dem perineuronalen Netz (PN), umgeben sind. Neurone mit einem PN zeichnen sich durch eine geringe Vulnerabilität bei neurodegenerativen Erkrankungen aus. Da das PN mit hoher Affinität Eisen bindet, war zu klären, ob das PN den Eisenhaushalt der Neurone beeinflusst und diese mit einer protektiven Eigenschaft gegenüber Eisen-induzierten oxidativen Stress ausstattet. Es wurde die Eisenkonzentration und der Gehalt an Eisentransport- und Eisenspeicherproteinen von Neuronen mit PN und Neuronen ohne PN in der Ratte untersucht. Dabei kamen quantitative Methoden wie die ortsaufgelöste Ionenstrahlmikroskopie und die Objektträger-basierte Laser Scanning Zytometrie sowie Western Blot Analysen und quantitative Real-Time-PCR zum Einsatz. Die Untersuchungen zeigen, dass Neurone, die mit einem PN umgeben sind, eine höhere Konzentration an Eisen sowie Eisentransport- und Eisenspeicherproteinen besitzen als Neurone ohne ein PN. Das PN könnte so den Eisenhaushalt der Neurone beeinflussen und diese mit einer protektiven Eigenschaft gegenüber Eisen-induziertem oxidativen Stress ausstatten.