Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-28T11:21:35Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Antônio Rangel Machado - 2015.pdf: 4325578 bytes, checksum: 74553bf431f6100c4577eec10eec4143 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-28T11:25:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Antônio Rangel Machado - 2015.pdf: 4325578 bytes, checksum: 74553bf431f6100c4577eec10eec4143 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-28T11:25:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - João Antônio Rangel Machado - 2015.pdf: 4325578 bytes, checksum: 74553bf431f6100c4577eec10eec4143 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The susceptibility of cockroaches to infection with pathogenic fungi can be associated to the host species and their stage/instar. The high resistance of elder nymphs of Periplaneta americana, a synanthropic species in tropical and subtropical regions, against Metarhizium anisopliae is still poorly understood and can be connected to behavioral, physiological and mechanical mechanisms. Fourth and fifth instar nymphs (N4 or N5), treated topically with conidia, removed mechanically part of the conidia from the cuticle, antennae and legs, immediately after treatment and in the following days. A small number (< 5%) of the conidia on the cuticle germinated in the first 24 hours, and quantitative germination of the remaining conidia reached 80% within the next 7 days. In most of the treated nymphs, the fungus failed to reach the hemolymph during the 10 days of the test, and in the others, the number of hyphal bodies ranged from 500 to 8 x 107 per μL hemolymph. Few nymphs (30%) died within 10 days after inoculation, and M. anispoliae developed in 50% of the cadavers. The results confirmed the high resistance of elder P. americana nymphs to M. anisopliae and highlighted the importance of the early stages of the infection during the contact and insect invasion by the fungus. Subsocial behavior patterns and specific physiological factors in the cuticle, not elucidated in this study, are resistance key issues and need to be considered when developing mycoinsecticides for P. americana and other cockroach control. / A susceptibilidade de baratas à infecção com fungos entomopatogênicos parece ser ligada a espécie hospedeira e estágio/estádio. A resistência elevada de ninfas mais velhas de Periplaneta americana, uma espécie sinantrópica em regiões tropicais e subtropicais, para Metarhizium anisopliae ainda está pouco entendida e pode ser ligada a mecanismos comportamentais, mecânicos e fisiológicos. Ninfas de quarto e quinto ínstar (N4 ou N5) tratadas topicamente com conídios removeram mecanicamente parte dos conídios da cutícula com as antenas e patas imediatamente após tratamento e nos próximos dias. Um número reduzido (< 5%) dos conídios na cutícula germinou nas primeiras 24 horas, e a germinação quantitativa dos conídios restantes chegou até 80% nos próximos 7 dias. Na maioria das ninfas tratadas, o fungo não conseguiu chegar na hemolinfa durante os 10 dias do teste, e nas outras, o número de corpos hifais variou entre 500 e 8 x 107 por μl de hemolinfa. Poucas ninfas (30%) morreram até 10 dias após inoculação, e M. anispoliae desenvolveu em 50% dos cadáveres. Os resultados confirmaram a grande resistência de ninfas mais velhas de P. americana para M. anisopliae e ressaltaram a importância das fases iniciais da infecção durante o contato e invasão do inseto pelo fungo. Padrões de comportamento subsocial e fatores fisiológicos específicos na cutícula, não esclarecidos nesse estudo, são questões chave de resistência e precisam ser considerados no desenvolvimento de micoinseticidas para controle de P. americana e de outras baratas.

In der vorliegenden Arbeit habe ich wichtige Teilmechanismen der Erregungs-Sekretionskopplung in der Speicheldrüse der Schabe Periplaneta americana (L.) untersucht. Die Speicheldrüse ist von dopaminergen und serotonergen Fasern innerviert (Baumann et al., 2002). Beide Transmitter stimulieren eine unterschiedliche Reaktion der Drüse: Dopamin (DA) stimuliert die P-Zellen der Acini und die Ausführgangzellen, während Serotonin (5-HT) die P- und C-Zellen der Acini stimuliert, nicht jedoch die Ausführgangzellen. Der Endspeichel ist nach einer DA-Stimulierung proteinfrei. Dagegen enthält er nach einer 5-HT-Stimulierung Proteine, die von den C-Zellen sezerniert werden (Just &amp; Walz, 1996). Im ersten Teil meiner Arbeit habe ich mittels Kapillarelektrophoretischer Analyse (CE-Analyse) die Elektrolytkonzentrationen im Endspeichel untersucht sowie die Raten der Flüssigkeitssekretion gemessen. Damit wollte ich klären, welche Transporter an der Sekretion des Primärspeichels und an dessen Modifikation beteiligt sind. Ausserdem wollte ich die Rolle der transportaktiven Epithelzellen der Ausführgänge für die Modifikation des Primärspeichels untersuchen. Dafür habe ich einen Vergleich der Elektrolytkonzentrationen im DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichel durchgeführt. Der Elektrolytgehalt des DA- und 5-HT-stimulierten Endspeichels unterscheidet sich nicht signifikant voneinander. Er ist nach beiden Stimulierungen hypoosmotisch zum verwendeten Ringer. Die Ausführgangzellen werden durch DA stimuliert und modifizieren den Primärspeichel durch eine netto-Ionenreabsorption. Meine Versuche zeigen jedoch, dass auch die während einer 5-HT-Stimulierung der Drüse unstimulierten Ausführgangzellen den Primärspeichel modifizieren. In einer nachfolgenden Versuchsreihe habe ich den Einfluss von Ouabain, einem Hemmstoff der Na+-K+-ATPase, und Bumetanid, einem Hemmstoff des NKCC, auf die Raten der Flüssigkeitssekretion sowie den Elektrolytgehalt des Endspeichels untersucht. Ich habe gefunden, dass die Aktivität der Na+-K+-ATPase wichtig für die Modifikation des DA-stimulierten Primärspeichels ist. Im Gegensatz dazu ist sie für die Modifikation des 5-HT-stimulierten Primärspeichels nicht von Bedeutung. Bezüglich der Flüssigkeitssekretion habe ich keinen Einfluss der Na+-K+-ATPase-Aktivität auf die DA-stimulierten Sekretionsraten gefunden, dagegen ist die 5-HT-stimulierte Sekretionsrate in Anwesenheit von Ouabain gesteigert. Die Aktivität des NKCC ist für beide sekretorische Prozesse, die Ionen- und die Flüssigkeitssekretion, wichtig. Eine Hemmung des NKCC bewirkt eine signifikante Verringerung der Raten der Flüssigkeitssekretion nach DA- und 5-HT-Stimulierung sowie in beiden Fällen einen signifikanten Abfall der Ionenkonzentrationen im Endspeichel. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich versucht, Änderungen der intrazellulären Ionenkonzentrationen in den Acinuszellen während einer DA- oder 5-HT-Stimulierung zu messen. Diese Experimente sollten mit der Methode des &quot;ratiometric imaging&quot; durchgeführt werden. Messungen mit dem Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 zeigten keinen globalen Anstieg in der intrazellulären Ca2+-Konzentration der P-Zellen. Aufgrund von Problemen mit einer schlechten Beladung der Zellen, einer starken und sich während der Stimulierung ändernden Autofluoreszenz der Zellen sowie Änderungen im Zellvolumen wurden keine Messungen mit Na+- und K+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Im dritten Teil dieser Arbeit habe ich die intrazellulären Signalwege untersucht, die zwischen einer 5-HT-Stimulierung der Drüse und der Proteinsekretion vermitteln. Dazu wurde der Proteingehalt im Endspeichel biochemisch mittels eines modifizierten Bradford Assay gemessen. Eine erstellte Dosis-Wirkungskurve zeigt, dass die Rate der Proteinsekretion von der zur Stimulierung verwendeten 5-HT-Konzentration abhängt. In einer Serie von Experimenten habe ich die intrazellulären Konzentrationen von Ca2+, cAMP und / oder cGMP erhöht und anschließend den Proteingehalt im Endspeichel gemessen. Ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert nur eine geringe Rate der Proteinsekretion. Dagegen kann die Steigerung der intrazellulären cAMP-Konzentration eine stärkere Proteinsekretion aktivieren, die sich nicht signifikant von der nach 5-HT-Stimulierung unterscheidet. Die cAMP-stimulierte Proteinsekretion kann durch gleichzeitige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration weiter gesteigert werden. Dagegen aktivierte eine Erhöhung der intrazellulären cGMP-Konzentration die Proteinsekretion nicht. Aufgrund dieser Ergebnisse postuliere ich die Existenz eines die Adenylatcyclase aktivierenden 5-HT-Rezeptors in der Basolateralmembran der C-Zellen. / The aim of this PhD-work was to investigate major mechanisms of excitation-secretion coupling in the salivary gland of the cockroach Periplaneta americana (L.). This salivary gland is innervated by dopaminergic and serotonergic fibres (Baumann et al., 2002). The two transmitters stimulate different processes in the gland: Dopamine (DA) stimulates the p-cells of the acini and the salivary duct cells, whereas 5-HT (serotonin) activates the p- and the c-cells of the acini, but not the salivary duct cells. Final saliva is completely protein-free after dopamine stimulation. It contains proteins, which are secreted by the c-cells of the acini, after a 5-HT-stimulation (Just &amp; Walz, 1996). In the first part of my work I measured the electrolytic composition of the final saliva by capillary electrophoretic analysis and measured the rates of fluid secretion, in order to answer the following questions: 1.) Which transporters affect the production of primary saliva and its modification? 2.) What is the function of the transport-active salivary duct cells for the modification of the primary saliva? Electrolytic composition of the DA- and 5-HT-stimulated final saliva is not significantly different from each other, and is hypoosmotic to the Ringer used. Salivary duct cells are stimulated by DA and modify the primary saliva by a netto ion-reabsorption. My experiments also show that the duct cells, which are unstimulated during a 5-HT-stimulation of the gland, modify the primary saliva. In the next series of experiments I investigated the effects of ouabain, an inhibitor of the Na+-K+-ATPase, and bumetanide, an inhibitor of the NKCC on the rates of fluid secretion and the electrolytic composition of the final saliva. I found, that the activity of the Na+-K+-ATPase is important for the modification of DA-stimulated primary saliva during its flow through the stimulated duct system. In contrast, it is not important for modification of the 5-HT-stimulated primary saliva. Inhibition of the Na+-K+-ATPase does not affect rates of DA-stimulated fluid secretion, but it increases the rates of 5-HT-stimulated fluid secretion. Activity of the NKCC is important for both secretory processes: the ion and the fluid secretion. Inhibition of the NKCC results in a significant drop in the rates of fluid secretion after DA- and 5-HT-stimulation, as well as a drop in electrolytic concentrations in the saliva. In the second part of my work, I tried to measure changes in the intracellular ionic concentrations (Ca2+, Na+, and K+) within the acinar cells during a DA- or 5-HT-stimulation. The experiments should be performed by ratiometric imaging. Measurements with the Ca2+-sensitive dye Fura-2 did not show any global increase in the intracellular Ca2+-concentration in the p-cells of the acini. Problems concerning a bad loading of the cells, a strong autofluorescence which changed during the time course of the stimulation, as well as changes in the cell volume were the reason, that no measurements using Na+- or K+-sensitive dyes were performed. In the third part of my work I investigated the intracellular signalling pathways, which activate protein secretion after 5-HT-stimulation of the gland. A modified Bradford Assay was used for measuring the protein content in the final saliva. In a dose-response curve I showed that rates of protein secretion are dependent on the 5-HT-concentrations used to stimulate the glands. In another set of experiments I increased the intracellular concentrations of Ca2+, cAMP and / or cGMP, and measured the protein content in the final saliva. An increase in the intracellular Ca2+-concentration activates only a low rate of protein secretion. After an increase in the intracellular cAMP-concentration a much higher rate of protein secretion can be activated, which is not significantly different from the 5-HT stimulated rate of protein secretion. The cAMP-stimulated protein secretion can be further increased by a simultaneous rise in the intracellular Ca2+-concentration. In contrast, cGMP does not activate protein secretion. Therefore I propose the expression of an adenylyl cyclase activating 5-HT-receptor in the basolateral membrane of the protein secreting c-cells.

La pomme de terre produit des glycoalcaloïdes comme la plupart des Solanacées. Deux composés, en particulier, l’α-solanine et l’α-chaconine, sont produits en plus grande quantité lorsque le tubercule est exposé à la lumière et subit des dégradations. Ces molécules sont toxiques et peuvent représenter un danger pour le consommateur et des nuisances pour l’environnement. Dans le cadre de cette thèse, les teneurs en α-solanine et α-chaconine dans la chaire de pomme de terre verdie, en germination ou en décomposition retrouvées sur les marchés d’Abidjan (Côte d'Ivoire) ont été analysées. Les résultats ont montré que la chaire de ces pommes de terre contient des quantités élevées de ces deux composés, dépassant 2 à 5 fois la limite recommandée. Pour des raisons de sécurité sanitaire, ces pommes de terre doivent être proscrites de l’alimentation humaine. En revanche, la teneur élevée en glycoalcaloïdes dans ces pommes de terre représente une source de solanidine, un précurseur pour la synthèse d'hormones et de composés pharmacologiquement actifs, qui mérite d’être exploitée. Dans cet objectif, nous avons développé une méthode chimio-enzymatique simple, comprenant un traitement acide partiel suivi d’une hydrolyse enzymatique par la β-glycosidase de la blatte Periplaneta americana dont le gène a été isolé à partir d’une librairie génomique de cDNA afin de détoxifier ces composés et produire la solanidine. / Potato produce glycoalkaloids as most plants of Solanaceae family. The principal glycoalkaloids, α-chaconine and α-solanine are produced in greater quantities when potato tubers are exposed to light and are subject to deteriorations. These compounds are toxic and can represent a real danger for the consumer and the environment where they are discharged during their degradation. In this work, the estimation of glycoalkaloids in the flesh of different types of decayed potatoes usually found in different market places of Abidjan (Ivory Coast) was evaluated. The results showed that turned green and also sprouting or rotting potato flesh contain high amounts of toxic solanine and chaconine, exceeding by 2 to 5-fold the recommended limit. For safety consideration, these decayed potatoes should be systematically set aside. The accumulation of α-chaconine and solanine in potatoes can be seen as an attractive source of solanidine that is an important precursor for hormone synthesis and some pharmacologically active compounds. To this end, we proposed herein a simple chemo-enzymatic protocol comprising a partial acidic hydrolysis followed by an enzymatic treatment with the β-glycosidase from Periplaneta americana whose gene was isolated from a cDNA genomic library in order to detoxify these compounds and produce solanidine.

In this thesis, we used the American cockroach study the relationship between animal personality and collective behaviour. These questions do not only regard domiciliary cockroaches or insects; in fact, the questions we discuss here have a large scope and concern most of the known gregarious species distributed in several taxa. One of our aims is to develop general tools, methods and analyses that could be used for the study of collective behaviour.We show evidence of personality in several behavioural traits and different contexts in the American cockroach. These behavioural differences were observed in a context without social interactions during the daytime (isolated condition) and nighttime (solitary exploration behaviour) and in a social context (rate of joining a shelter and sheltering time). Based on the short-term experiments, this personality can be understood as differences in the probability of joining a shelter. We show that the behavioural variability existing in a population of domiciliary cockroaches is very high. The composition of personalities within a group can lead to group personality – consistent differences in group behaviour. For instance, groups composed of different behavioural profiles show different collective dynamics. Regarding the long-term experiments, our results show that the individuals that were aggregated at a site that was repeatedly disturbed by a lighting stimulus during their resting period showed slow migration to a new shelter, which allowed the initial aggregation site to remain the site of choice for a few days. Moreover, the disturbance regime did not influence the group's global activity rhythm. At the individual level, we observed interindividual differences (personalities) in terms of their position prior to the disturbance but not for the different steps of the fleeing behaviour itself. In addition, we show that thigmotaxis affects the reaction time to the disturbance: individuals near the walls of the shelter react more slowly thanindividuals in the centre. Finally, an approach coupling modelling and experimental data shows that behavioural variability plays a secondary role during migration dynamics, thus highlighting the plasticity of personality traits depending on the context. / Un des comportements collectifs les plus répandus, qu’il s’agisse de vertébrés (mammifères, oiseaux, poissons), d’insectes ou encore de bactéries, est la tendance des individus à se regrouper. Les causes proximales de ces rassemblements ou agrégats, c'est-à-dire les mécanismes à leur origine, ont retenu moins d’attention que l’étude des causes ultimes. De plus, dans la plupart des études portant sur les processus d’agrégation, notamment chez notre organisme modèle, la blatte, la diversité des comportements individuels est souvent sous-estimée ou ignorée. L’objectif de cette thèse est l’étude du rôle des différences interindividuelles, également connues comme personnalité animale ou syndromes comportementales, dans les processus de prise de décision collective et notamment la formation des agrégats.Pour cela, nous avons utilisé des groupes de mâles de la blatte américaine Periplaneta americana. Ces insectes peuvent s’agréger dans un ou plusieurs abris et présenter des différences dans leur réponse au milieu, aux conspécifiques et dans le partage de l’information. Dans le cadre de prises de décisions collectives, nous avons mis en évidence une personnalité individuelle mais également au niveau du groupe. Celles-ci se manifestent dans la recherche d’un abri dont certains individus jouent un rôle clef. Nous avons montré que les groupes présentent une stabilité qui est observable au niveau de la dynamique d'agrégation et qui dépend de la distribution des personnalités au sein de ceux-ci. De plus, nous remarquons que ces différences de personnalités au sein des groupes affectent la prise de décision collective, notamment la vitesse du choix et le nombre total d’individus abrités. De manière surprenante, la composition des groupes n’affecte pas la probabilité que ceux-ci atteignent un consensus: la majorité des blattes étant agrégées sous le même abri.Concernant les influences croisées entre l’effet sociale et la personnalité des blattes, nous montrons que les effets sociaux tendent à supprimer les différences inter-individuelles et créent une corrélation entre le comportement de chaque individu et le comportement du groupe. De plus, nous observons que la présence de différentes personnalités dans un groupe augmente les amplifications sociales, celles-ci étant dues aux interactions entre les membres du groupe. Finalement, nous abordons la question du rôle de la personnalité sur le comportement de fuite lors des perturbations lumineuses et sur la dynamique d’émigration quand le site de repos est régulièrement perturbé. Nous avons montré l’existence de personnalités exprimées pendant la phase active nocturne et de différences interindividuelles au niveau du thigmotactisme pendant la journée (phase passive de repos et d’agrégation). Curieusement, ces différences inter-individuelles ne sont pas observées lors du comportement de fuite et au niveau de la dynamique global d’émigration. Dans la dernière partie de notre thèse, nous discutons, en particulier, des synergies et des conflits entre les différentes personnalités et les dynamiques collectives et avançons l’hypothèse que les phénomènes que nous avons mis en évidence sont partagés par de nombreuses espèces grégaires. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les récepteurs ionotropes du GABA (GABARs) sont inhibés par des insecticides tels que les phénylpyrazoles (fipronil). Deux facteurs susceptibles de modifier leur sensibilité au fipronil ont été examinés : 1) l'édition de l'ARNm d'une sous-unité de GABAR (RDL) et 2) la phosphorylation par la PKC. La sous-unité RDL de drosophile présente des mutations (A301êS/G et/ou T350êM) induisant une résistance aux insecticides, ainsi que des sites d'édition dont un dans le domaine N-terminal (R122êG). Les effets fonctionnels de l'édition R122êG ont été testés par expression de divers isoformes de la sous-unité RDL (mutés ou non, édités ou non) dans des ovocytes de xénope. Les résultats montrent que l'édition R122êG entraîne une réduction de la sensibilité des récepteurs RDL au GABA et au fipronil. Deux types de récepteurs (GABAR1 et GABAR2) sont exprimés à la surface des neurones DUM isolés de Periplaneta americana, les GABAR2 étant régulés positivement par la CaMKII. Ce modèle cellulaire a été utilisé pour étudier, par la technique du patch-clamp, la régulation des GABARs par la PKC et ses conséquences sur les effets du fipronil. Les GABAR2 apparaissent plus sensibles à l'inhibition par des PKC que les GABAR1, et la potentialisation de l'activité des GABAR2 par la CaMKII s'exerce via l'inhibition d'une PKC. Les GABAR2 étant plus sensibles au fipronil que les GABAR1, leur blocage sélectif par une PKC entraîne une réduction importante de l'inhibition exercée par le fipronil. Le clonage de la sous-unité RDL dans la chaîne nerveuse de la blatte et dans les neurones DUM révèle la présence de sites potentiels de phosphorylation par la PKC et la CaMKII ainsi que l'existence de deux variants différant par vingt résidus dans la boucle M3-M4.

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