Le tricyanofurane est un groupement extrêmement électro-attracteur grâce à trois groupements nitriles conjugués. Cette caractéristique électronique nous a permis de synthétiser de nouvelles sondes fluorescentes intéressantes pour l’imagerie biologique : de petites molécules possédant un caractère dipolaire très marqué qui leur confère une fluorescence très décalée vers le rouge.Une première application de ce genre de molécules est la détection du pH intracellulaire à l’aide de groupement phénol conjugué au tricyanofurane. Grâce à une rétro-synthèse judicieuse, il a été possible de développer une famille complète possédant une très large gamme de pKa couvrant tous les pH intracellulaires possibles. En fonctionnalisant ces sondes, il est possible de cibler certains organites tels les mitochondries. En remplaçant le groupement hydroxyle par un ester pinacolboronique, ces sondes sont sensibles au peroxyde d’hydrogène. Ce type de sondes est appelé OFF/ON car la sonde est initialement non-fluorescente et la fluorescence est restaurée par l’action du peroxyde d’hydrogène. Une étude de la fluorescence à l’état solide a aussi été menée sur des molécules présentant une émission intense dans le rouge. Celles-ci ont été utilisées pour créer des sondes enzymatiques solubles en milieu physiologique qui libèrent un fluorophore insoluble après activité enzymatique. Ce fluorophore, après précipitation émet une fluorescence non présente avant activation. / Tricyanofuran is a strong electro-withdrawing group due to its three conjugated nitrile groups. This electronic characteristic was used to synthetize new fluorescent probes for biological imaging: small molecules owing a strong dipolar behavior that strongly shifts the fluorescence to the red. A first application of this kind of molecules is intracellular pH detection with a phenol moiety conjugated to the tricyanofuran. Thanks to a convenient retro-synthesis, a large family was developed displaying a large range of pKa spanning all the possible intracellular pHs. When these probes are functionalized, it is possible to target organelles such as mitochondria. When the hydroxyl group is replaced by a pinacolboronic ester, it is possible to detect hydrogen peroxide. This kind of probe is called turn-on probe because the probe is initially non-fluorescent and emission is restored by the reaction with hydrogen peroxide.Solid-state fluorescence was also studied on molecules presenting a strong and red fluorescence. This kind of molecules has then been used to design enzymatic probes soluble in physiological medium. After enzymatic cleavage, a non-soluble fluorophore is liberated and, after precipitation, leads to a strong emission.

Cette thèse issue d'une collaboration entre l'Université Lyon 1 et Sanofi Pasteur (SP) porte sur l'étude du procédé de dépolymérisation et d'activation d'un polyoside capsulaire. Cette réaction est la première étape du couplage d'un vaccin (Menactra®) antiméningococcique conjugué (polyoside du méningocoque de groupe C conjugué à l'anatoxine diphtérique). L'objectif de ce travail, réalisé dans le cadre d'un programme d'amélioration de la conformité et de la robustesse des procédés de SP, est la compréhension du mécanisme et l'optimisation des paramètres clés de cette réaction. Le procédé de couplage de ce vaccin tel qu'il est décrit par SP comporte 3 étapes clés : la dépolymérisation/activation du polyoside par le peroxyde d'hydrogène, la dérivatisation par un "linker" et le greffage à la protéine. Si les 2 dernières étapes sont des réactions chimiques bien connues, la première qui permet, à la fois de réduire la masse molaire du polyoside et de générer des groupements réducteurs, est plus obscure. Une stratégie a été élaborée afin de comprendre cette réaction. Dans un premier temps, l'étude poussée du procédé a permis d'identifier les paramètres impactant la cinétique de dépolymérisation et l'activité réductrice. Ensuite, l'analyse structurale, par diverses techniques, du polyoside dépolymérisé a confirmé l'activation. Enfin, la caractérisation de modifications chimiques de macromolécules étant relativement complexe, de plus petits modèles (monomère, tétramère) ont été utilisés et ont permis d'établir un mécanisme réactionnel de la dépolymérisation du polyoside. A partir de ces résultats, plusieurs solutions ont été proposées à l'industriel pour améliorer le rendement et/ou la robustesse du procédé / This PhD work, initiated by Sanofi Pasteur in collaboration with the University of Lyon 1, concerns the study of the Menactra® vaccine, a glycoconjugate vaccine produced by covalently coupling Neisseria meningitidis serogroups A, C, W135, Y capsular polysaccharides to diphtheria toxoid. The objective was to better understand the chemistry involved in the conjugation process of the vaccine, in order to improve the process robustness and the overall conjugated yields with particular emphasis on the serogroup C. The conjugation process can be divided into 3 key steps: depolymerization/activation by hydrogen peroxide, derivatization, and conjugation. While the 2 last steps of the process are well known in bioconjugation chemistry, the exact mechanism of the first step, which serves 2 purposes, first to reduce the polysaccharide molecular weight and second, to generate the reducing groups on the polysaccharide chain, is poorly understood. An overall strategy for the characterization of the serogroup C polysaccharide depolymerization process was successfully applied to understand this reaction. We first provided a process description of this step, identified and optimized the key process parameters. Then, the structural comparison of the polysaccharide before and after the depolymerization obtained with specified analytical methods gave important information on the mechanism. Finally, well defined sialic and tetrasialic acids were reacted with H2O2 to complete the elucidation of this complex mechanism. From these results, several solutions were proposed to the industrial to improve the yield and the robustness

L’H2O2, produit en grande quantité dans la thyroïde, est depuis longtemps suspecté de jouer un rôle dans la pathogenèse des nodules et des cancers thyroïdiens. En effet, dans une situation pathologique où la production d'H2O2 serait excessive ou lors d’un défaut de protection par les enzymes de détoxification, l’H2O2 pourrait devenir toxique. In vitro, des quantités modérées d’H2O2 sont capables de provoquer des dégâts à l'ADN similaires à ceux induits par une irradiation de 1 Gy et peuvent même provoquer des réarrangements RET/PTC trouvés dans la plupart des carcinomes papillaires de la thyroïde. <p>La première partie de ce travail visait à mieux comprendre les mécanismes de protections qui pourraient être impliqués dans la défense contre les effets néfastes de l’H2O2 ainsi que le rôle de l’H2O2 dans la cancérogenèse thyroïdienne. Nous avons utilisé des cultures primaires de thyrocytes humains et nous les avons comparées à des lignées cellulaires de diverses origines ainsi qu’à des cultures primaires de lymphocytes T. Les résultats obtenus après traitement à l’H2O2 ont été comparés à ceux obtenus après irradiation, agent carcinogène connu. <p>Nous avons montré, grâce à une méthode fluorimétrique, que le thyrocyte était capable de dégrader de façon très efficace l’H2O2.<p>L’utilisation de L-buthionine-sulfoximine (BSO), un agent qui déplète la cellule en glutathion, a conduit à un abaissement du seuil d’observation des cassures de l’ADN (test des comètes) induites par l’H2O2 dans le thyrocyte ;ce qui suggère que la glutathion peroxydase (GPx) est impliquée dans la protection des thyrocytes en réponse à une agression par l’H2O2. Ceci a été confirmé par une augmentation de l'activité enzymatique de la GPx dans le thyrocyte une heure après une exposition à de l’H2O2 et pas après irradiation. <p>Une augmentation de l’expression de l’Hème oxygénase 1 (HMOX1) a été confirmée par RT-qPCR dans le thyrocyte après un traitement à l’H2O2. Ces résultats concordaient avec les résultats précédemment obtenus par microarray. <p>Les cinétiques de réparation de l'ADN ont montré que les dégâts à l'ADN étaient réparés plus lentement quand ils étaient provoqués par l’H2O2 que par l’irradiation. Les lymphocytes T sont incapables de réparer les dommages causés à l'ADN par l’H2O2. <p>Un pré-traitement des thyrocytes avec de l’H2O2 ralentit la réparation des dégâts à l’ADN induits par l’irradiation ce qui suggère une inhibition des enzymes de réparation en cas de stress oxydant. <p>La deuxième partie du travail a consisté à étudier la réaction de Fenton dans la thyroïde. En effet, un excès de fer libre a été suspecté d’être un facteur favorisant dans la génération de divers cancers dont le cancer thyroïdien. En présence d’H2O2, un excès de fer libre entraine la génération de radicaux hydroxyl, hautement réactifs (réaction de Fenton). <p>Nous avons mesuré les dégâts à l’ADN des thyrocytes pré-incubés avec des concentrations de FeSO4 compatibles avec la survie et traités avec l’H2O2. Une augmentation des dégâts à l’ADN et un ralentissement de leur réparation ont été observés dans les cellules. Les dégâts induits par l’irradiation n’étaient pas influencés par la présence de FeSO4. <p>Enfin, la troisième et dernière partie du travail a consisté à étudier les effets d’une irradiation causée par l’iode131 (I131) et de les comparer à ceux produits par une irradiation γ sur des thyrocytes humains en culture primaire ainsi que sur des lignées thyroïdiennes de rats (FRTL5 et PCCl3). L’irradiation par l’I131 produit moins de dégâts à l’ADN sur le thyrocyte, par le test des comètes, qu’une irradiation γ (Cs137) à doses irradiantes absorbées équivalentes. Un effet dose-réponse de l’irradiation par I’131 sur les lignées cellulaires (FRTL5 et PCCl3) est observé avec des activités radioactives faibles et des temps d’incubation courts.<p>En conclusion, le thyrocyte a développé plusieurs mécanismes de protection efficaces contre le stress oxydant, en particulier contre l’H2O2. Une augmentation du stress oxydant suite à un excès d’H2O2, de fer libre ou d’un défaut d’un des mécanismes de protection pourrait favoriser l'apparition de cancers sporadiques de la thyroïde.<p><p><p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les radiations ionisantes sont une cause établie de cancers de la thyroïde mais un nombre croissant de travaux évoque aussi le rôle potentiel du peroxyde d’hydrogène (H2O2) dans la pathogenèse des cancers thyroïdiens spontanés. Si les cassures double-brin de l’ADN (DSBs) sont considérées comme l’une des causes primaires de cancer, leur induction par l’H2O2 était plus controversée.<p><p>Lors de ce travail, nous avons voulu tester in vitro, dans différents modèles thyroïdiens, l’hypothèse selon laquelle l’H2O2 produit en grandes quantités in vivo pour oxyder l’iodure et synthétiser les hormones thyroïdiennes pouvait endommager l’ADN. <p>Les dégâts provoqués à l’ADN ont été évalués par le test des comètes (en milieu alcalin pour les cassures simple-brin (SSBs) et en milieu neutre pour les cassures double-brin de l’ADN) et quantitativement comparés à ceux produits par l’irradiation.<p>Nous avons montré dans une lignée cellulaire thyroïdienne de rat (PCCl3) que des concentrations non létales d’H2O2 (0.1 – 0.5 mM) tout comme l’irradiation (1 - 10 Gy) provoquaient une augmentation dépendante de la dose du nombre de SSBs et de DSBs. <p>L'induction de DSBs a été confirmée par la mesure du taux de phosphorylation de l’histone H2AX sur Sérine 139. L’induction de DSBs par l’H2O2 a également été observée dans des cultures primaires de thyroïdes humaines et dans des tranches de thyroïde de porcs.<p>L’utilisation de L-buthionine-sulfoximine (BSO), un agent qui empêche le renouvellement du glutathion cellulaire, a conduit à un abaissement du seuil d’observation des cassures de l’ADN induites par l’H2O2. <p>Nous avons également observé que les dommages de l’ADN étaient réparés plus lentement lorsqu’ils étaient provoqués par l’H2O2 plutôt que par l’irradiation. <p><p>Dans un second temps, nous avons exploré au niveau moléculaire les conséquences d’une exposition à 1 Gy d’irradiation γ ou à une concentration non létale d’H2O2 (0.05 – 0.2 mM) dans des cultures primaires de thyroïdes humaines et dans des lymphocytes T issus d’un même donneur. Nous avons étudié par micro-arrays les modifications du profil d’expression génétique de ces 2 types cellulaires afin de caractériser la spécificité de la réponse transcriptionnelle en fonction de la nature de l’agression, du type et de l’importance du dommage engendré ainsi que du type cellulaire.<p>Les 2 types cellulaires répondent de manière similaire à l’irradiation en termes de nombre de gènes régulés, avec un large recouvrement de réponses transcriptionnelles caractérisées par une forte sur-représentation de gènes impliqués dans l’apoptose et dans la réparation des dommages de l’ADN.<p>En revanche, la réponse transcriptionnelle à l’H2O2 est différente dans les 2 types cellulaires.<p>D’une part, les lymphocytes T qui montrent un dommage à l’ADN pour de plus faibles concentrations d’H2O2 que les thyrocytes présentent une réponse transcriptionnelle 1000 fois supérieure à celle observée dans les thyrocytes. D’autre part, les quelques gènes régulés dans les thyrocytes ne le sont pas dans les lymphocytes T. Il s’agit de gènes impliqués dans la défense contre les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ces résultats suggèrent l’existence de mécanismes de protection anti-oxydante spécifiquement développés dans les cellules thyroïdiennes.<p><p>En conclusion, ce travail a montré que l’H2O2, à des concentrations non létales, provoque des SSBs mais également des DSBs dans différents modèles thyroïdiens in vitro. La quantité de DSBs produite par l’H2O2 est comparable à celle observée après irradiation mais la vitesse de leur réparation est plus lente. D’autre part, en comparaison avec les lymphocytes T, les thyrocytes semblent particulièrement résistants aux effets de l’H2O2 et dotés de mécanismes de protection particulièrement performants et probablement partiellement inductibles contre les ROS.<p>Ces données soutiennent notre hypothèse de départ selon laquelle la production d’H2O2 dans la thyroïde pourrait jouer un rôle dans l’étiopathogénie des tumeurs thyroïdiennes, en particulier en cas de défenses anti-oxydantes altérées.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La thyroïde capte et concentre l’iodure afin de produire les hormones thyroïdiennes T3 et T4. L’iodure est capté au pôle basolatéral du thyrocyte par le symporteur Na+/I- (NIS) et transporté jusqu'au pôle apical de la cellule où il est oxydé par la thyroperoxydase (TPO). La forme oxydée de l’iodure se lie à des résidus tyrosyls de la thyroglobuline (Tg), contenue dans la thyroïde, qui couplés donneront naissance à la T3 et la T4. L’iodation et le couplage sont possibles grâce à la thyroperoxydase et à la présence d’un système générateur d’H2O2. Celui-ci est composé des protéines à sept hélices transmembranaires Duox1 et Duox2 présentant 83% de similitude de séquence entre elles et possédant deux motifs EF-hand ainsi qu’un site de liaison au FAD et quatre sites de liaison au NADPH. Dans la thyroïde humaine, l’ARN messager de Duox2 est plus exprimé que celui de Duox1. Jusqu'il y a peu de temps, nous n'avions à notre disposition aucun anticorps spécifique de l’une ou l’autre des Duox. Il n'était donc pas possible de déterminer si cette différence d’expression se retrouve au niveau protéique. Les PCCl3 sont une lignée de thyrocytes de rat possédant un système générateur d’H2O2 fonctionnel. Contrairement aux cultures primaires de thyrocytes humains, ces cellules peuvent être transfectées facilement. L’introduction de siRNAs spécifiques de Duox1 ou Duox2 de rat, via des vecteurs plasmidiques, a permis de démontrer que le peroxyde d’hydrogène produit par les PCCl3 est principalement généré par Duox1. En effet, l’inhibition de l’expression de Duox1 est directement corrélée à la diminution de production d’H2O2. Cette inhibition n’interfère pas avec d’autres fonctions de la cellule thyroïdienne puisque les cellules invalidées pour Duox1 sont toujours capables de capter l’iodure. De plus, la réintroduction de l’expression de Duox1 par transduction lentivirale permet de restaurer la production de peroxyde d’hydrogène.<p>Faute d’une maturation correcte des protéines Duox à la membrane plasmique, il a longtemps été impossible de reconstituer un système générateur d’H2O2 actif par transfection de Duox1 et/ou Duox2 en système hétérologue. En 2006, les protéines activatrices des protéines Duox1 et Duox2, respectivement appelées DuoxA1 et DuoxA2, ont été identifiées. Leur co-expression avec les enzymes Duox permet à ces dernières de migrer à la membrane et d’être actives. La distribution tissulaire des protéines DuoxA est parallèle à celle des Duox. La découverte des protéines activatrices a permis d’étudier spécifiquement la régulation de l’activité de Duox1 et de Duox2. La production d’H2O2 de Duox1 est positivement régulée par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la protéine kinase A (PKA). La génération d’H2O2 de Duox2 est sous le contrôle de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ conduisant à l’activation de la protéine kinase C (PKC). L’activation de Duox2 est également corrélée à une modification de l’état de phosphorylation de la protéine. Dans les thyrocytes humains, le récepteur de la TSH est couplé aux protéines Gs et Gq/11. La TSH liée à son récepteur est donc capable d’activer la voie de l’AMPc et la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Dans les thyrocytes humains en culture primaire, l’activation de la PKA et de la PKC mène également à une augmentation de la phosphorylation des protéines Duox. <p>En conclusion :1) Duox1 est majoritairement responsable de la production d’H2O2 dans la lignée de thyrocytes de rat PCCl3 ;2) l’activité de Duox1 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est régulée positivement par la voie de l’AMPc via des phosphorylations par la PKA ;3) l’activité de Duox2 humain co-exprimé avec son activateur en cellules Cos-7 est stimulée par la voie des phosphatidylinositols-Ca2+ via des phosphorylations par la PKC ;4) les thyrocytes humains expriment les deux protéines Duox. La production d’H2O2 est augmentée suite à l’activation de la voie de l’AMPc et de la voie des phosphatidylinositols-Ca2+. Les protéines Duox sont phosphorylées au niveau basal et cette phosphorylation est augmentée suite à l’activation de la PKA ou de la PKC.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'objectif de la thèse est d'expérimenter et de valider de nouvelles voies d'exfoliation des feuillets de graphène dans des élastomères de type silicone (PDMS) et des thermoplastiques de type polyéthylène (PE). Ce projet s'appuie sur des étapes de modifications chimiques des feuillets de graphite oxydé (GO) dont la polarité initiale n'offre pas une compatibilité satisfaisante avec les matrices étudiées. Différentes approches ont été explorées : la synthèse du GO greffé PDMS a été réalisée avec succès par greffage directe d'un PDMS fonctionnalisé triéthoxysilane et par une réaction d'hydrosilylation catalytique de GO modifiés vinyltriméthoxysilane en présence de polyméthylhydrogénosiloxane. Une étude des propriétés viscoélastiques de suspensions de GO et GO modifié/PDMS a montré l'importance de l'interaction charge-charge sur la formation d'un réseau percolant. Le seuil de percolation rhéologique du GO a été obtenu à 1,75 %wt avec Af~60. En se basant sur le greffage radicalaire du pentadécane par abstraction d'atomes d'H par un peroxyde à haute température, il a été possible d'extrapoler cette réaction pour procéder au greffage d'un PE de faible masse molaire (Mn~2000). De plus, des PE fonctionnalisés thiol et azoture de Mn similaire ont aussi été greffés sur des dérivés du graphite par addition radicalaire et de Michael. Après sélection d'une charge présentant une conductivité en poudre proche du graphite et une bonne affinité pour les milieux alcanes, un nano-composite à base de PEBD présentant des propriétés électriques convenables pour une application de blindage électromagnétique (4.105 Ω.cm à 25%wt) a été réalisé et ceci sans utiliser d'agents réducteurs toxiques / The aim of this thesis was to experiment and validate new means of graphene exfoliation in an elastomer matrix such as silicone (PDMS) and a thermoplastic matrix such as polyethylene (PE). Because of the low affinity of graphene oxide for these matrices due to its high polarity, its chemical modification was carried out. Different approaches were explored: the grafting of PDMS onto GO was carried out with success by a direct functionalization with a PDMS terminated triethoxysilane and by a catalytic hydrosilation reaction of a PDMS terminated Si-H onto vinyltrimethoxysilane modified GO. The viscoelastic behavior of GO and modified GO/PDMS suspensions showed the importance of the filler-filler interaction on the formation of a percolating network. The rheological percolation threshold of the GO/PDMS suspension was obtained at ~1.75 wt% with an aspect ratio (Af) of ~60. In addition, the grafting of PE onto GO was studied with the high temperature radical grafting of pentadecane formed by a hydrogen atom abstraction with a peroxide, which was then extrapolated to a low molecular PE (Mn~2000). Moreover, thio and azide functionnalized PE with a similar Mn were also grafted onto graphite derivatives by a radical and a Michael addition. After choosing the filler which presented the closest electrical conductivity to the one of graphite powder and a good affinity for a heptane media, a LDPE based nano-composite that presented suitable electrical properties for an electromagnetic shielding application (4 105 Ω.cm at 25 wt%) was obtained and this without any use of toxic reducing agents

Le développement de technologies électrosynthétiques pour la production de H2O2 est attrayant du point de vue de la durabilité. L’utilisation de dioxyde de carbone et/ou d’espèces carbonatées comme médiateurs dans l’oxydation de l’eau en peroxyde est apparue comme une voie viable pour y parvenir, mais de nombreuses questions demeurent quant au mécanisme qui doit être abordé avant que des systèmes pratiques n’émergent. À cette fin, ce travail combine des méthodes électrochimiques et spectroscopiques pour étudier les voies de reaction possibles et les facteurs influençant l'efficacité de cette réaction. Nos résultats électrochimiques indiquent que le CO32- est l'espèce clé qui subit une oxydation électrochimique, avant de réagir avec l'eau loin de la surface du catalyseur vers la production de H2O2. Grâce à des expériences spectroélectrochimiques infrarouges et Raman, nous avons noté que l'épuisement du CO32- est un facteur clé qui limite la sélectivité du procédé. À son tour, l'application de l'électrolyse pulsée peut augmenter cela, avec un ensemble initial de paramètres optimisés augmentant la sélectivité de 20 % à 27 %. Dans l’ensemble, ces travaux contribuent à ouvrir la voie au développement futur d’un système électrosynthétique H2O2 pratique. / The development of electrosynthetic technologies for H2O2 production is appealing from a sustainability perspective. The use of carbon dioxide and/or carbonate species as mediators in water oxidation to peroxide has emerged as a viable route to do so but still many questions remain about the mechanism that must be addressed before practical systems emerge. To this end, this work combines electrochemical and spectroscopic methods to investigate possible reaction pathways and factors influencing the efficiency of this reaction. Our electrochemical results indicate that CO32- is the key species that undergoes electrochemical oxidation, prior to reacting with water away from the catalyst surface en route to H2O2 production. Through spectroelectrochemical infrared and Raman experiments, we noted that CO32- depletion is a key factor that limits the selectivity of the process. In turn, showed how the application of pulsed electrolysis can augment this, with an initial set of optimized parameters increasing the selectivity from 20% to 27%. In all, this work helps pave the way for future development of practical H2O2 electrosynthetic system.

L’endothéline-1 (ET-1) est un peptide vasoactif extrêmement puissant qui possède une forte activité mitogénique dans les cellules du muscle lisse vasculaire (VSMCs). Il a été démontré que l’ET-1 est impliquée dans plusieurs maladies cardio-vasculaires, comme l’athérosclérose, l'hypertension, la resténose après l'angioplastie, l’insuffisance cardiaque et l'arythmie. L’ET-1 exerce ses effets via plusieurs voies de signalisation qui incluent le Ca2+, les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPKs) y compris les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) et la voie de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB). Plusieurs études ont démontré que les dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) peuvent jouer un rôle important dans la signalisation d’ERK1/2 et de PKB induite par plusieurs facteurs de croissance et hormones. Nous avons précédemment montré que l'ET-1 produit des ROS qui agissent comme médiateur de la signalisation cellulaire induite par l’ET-1. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2), une molécule qui appartient à la famille des ROS, peut activer les voies de la MAPK et de la PKB dans les VSMCs. Par ailleurs, nos résultats suggèrent également que le Ca2+ et la calmoduline (CaM) sont essentiels pour la phosphorylation d’ERK1/2, de p38 et de PKB induite par le H2O2 dans les VSMCs. La Ca2+/CaM-dependent protein kinases II (CaMKII) est une sérine/thréonine protéine kinase multifonctionnelle activée par le Ca2+/CaM. Il a été montré que la CaMKII est impliquée dans les voies de signalisation induite par le H2O2 dans les cellules endothéliales. Cependant, le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de la proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) induite par l’ET-1 et le H2O2, de même que son rôle dans l’effet hypertrophique et prolifératif de l’ET-1 dans les VSMCs demeure inexploré. Le monoxyde d’azote (NO) est une molécule vasoactive impliquée dans la régulation de plusieurs réponses hormonales. Le NO peut moduler la signalisation contrôlant la croissance cellulaire induite par plusieurs agonistes d’où son rôle protecteur dans le système vasculaire. Des études ont montré que le NO peut inhiber la voie de Ras/Raf/ERK1/2 et la voie de PKB induite par le facteur de croissance endothélial (EGF) et l’angiotensine II (Ang II). Beaucoup d’autres travaux ont mis en évidence un cross-talk entre les voies de signalisation activées par l’ET-1 et le NO. La capacité du NO à inhiber la signalisation intracellulaire induite par l’ET-1 dans les VSMCs demeure inconnue. Le travail présenté dans cette thèse vise à déterminer le rôle du système Ca2+-CaM-CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 et le H2O2 ainsi que son rôle dans la croissance et la prolifération cellulaire induites par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également testé le rôle du NO dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 ainsi que la synthèse protéique induite par l’ET-1. Dans la première partie de notre étude, nous avons examiné le rôle de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs en utilisant trois approches différentes i.e. l'usage d'inhibiteurs pharmacologiques, un peptide auto-inhibiteur de la CaMKII (CaMKII AIP) et la technique de siRNA. Nous avons démontré que la CaMKII est impliquée dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Des études précédentes ont montré à l’aide d’inhibiteurs pharmacologiques comme le KN-93 que l'Ang II et les agents induisant une augmentation de la concentration en Ca2+ intracellulaire comme l’ionomycine, provoquent la phosphorylation d’ERK1/2 via la CaM dans les VSMCs. Cependant, en utilisant différentes approches, nos études ont montré pour la première fois une implication de la CaMKII dans la phosphorylation d’ERK1/2 et de PKB induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Nous avons également rapporté pour la première fois, un rôle crucial de la CaMKII dans la pathophysiologie vasculaire associée à l’ET-1 puisque l’activation de la CaMKII joue un rôle important dans l’hypertrophie et la croissance cellulaire. Dans la deuxième partie, à la lumière des études précédentes qui montraient que les ROS agissent comme médiateurs de la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs, nous avons examiné si la CaMKII est également impliquée dans l’activation des voies d’ERK1/2 et de PKB induite par le H2O2. En utilisant des approches pharmacologiques et moléculaires, nous avons montré, comme pour l’ET-1, que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par le H2O2. Nous avons précédemment montré que la transactivation du récepteur de type I de l’insulin-like growth factor (IGF-1R) est nécessaire à l’activation de PKB induite par le H2O2. Pour cette raison, nous avons examiné l'effet de l'inhibition de la CaMKII par l’inhibiteur pharmacologique ou par le knock-down de la CaMKII sur la phosphorylation d’IGF-1R induite par le H2O2. Les résultats démontrent que la CaMKII joue un rôle critique en amont de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et d’IGF-1R induite par le H2O2. Dans la troisième partie de notre étude, nous avons également examiné le mécanisme moléculaire par lequel le NO exerce ses effets anti-mitogéniques et anti-hypertrophiques dans la signalisation induite par l’ET-1. En testant l'effet de deux différents donneurs de NO (S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP), sodium nitroprusside (SNP)) et un inhibiteur de NO synthase, le N (G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) dans la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1, nous avons observé que le NO a un effet inhibiteur sur la signalisation induite par l’ET-1 dans les VSMCs. Par ailleurs, le 8-Br-GMPc, un analogue du GMPc, a un effet similaire à celui des deux donneurs du NO, tandis que l’oxadiazole quinoxaline (ODQ), un inhibiteur de la guanylate cyclase soluble, inverse l'effet inhibiteur du NO. Nous concluons que le NO diminue la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1 d’une manière dépendante du GMPc. Le NO inhibe aussi les effets hypertrophiques de l’ET-1 puisque le traitement avec le SNAP diminue la synthèse des protéines induite par l’ET-1. En résumé, les études présentées dans cette thèse démontrent que l’ET-1 et le H2O2 sont des activateurs de la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 dans les VSMCs et que la CaMKII s’avère nécessaire pour ce processus, en agissant en amont de l’activation de IGF-1R induite par le H2O2 dans les VSMCs. Elles montrent également que le NO inhibe la phosphorylation d’ERK1/2, de PKB et de Pyk2 induite par l’ET-1. Enfin, nos travaux suggèrent aussi que l’activation de la CaMKII stimule la synthèse des protéines et de l’ADN induites par l’ET-1 alors que le NO inhibe la synthèse des protéines induite par ET-1. Mots clés: Endothéline ; Peroxyde d'hydrogène ; CaMKII ; Monoxyde d’azote ; Système vasculaire ; PKB; ERK1/2; IGF-1R; Hypertrophie. / Endothelin-1 has emerged as an extremely potent vasoactive peptide exhibiting potent mitogenic activity in vascular smooth muscle cells (VSMCs). A critical role of ET-1 in many cardiovascular diseases, such as atherosclerosis, hypertension, restenosis after angioplasty, heart failure and arrhythmia has been suggested. ET-1 exerts its effects through multiple signaling pathways which include Ca2+, mitogen-activated protein kinases (MAPKs) including extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) and phosphatidylinositol 3-kinase (PI-3K)/protein kinase B (PKB)/Akt pathways. Several studies have also demonstrated that reactive oxygen species (ROS) may play an important role in mediating the signals of several growth factors and peptides hormones linked to these pathways. We have previously reported that ET-1 generates ROS which mediates ET-1-induced signaling. H2O2, an important ROS molecule, activates both MAPKs and PKB signaling in VSMCs. In addition, we have also suggested that Ca2+ and CaM are essential to trigger H2O2-induced ERK1/2, p38 and PKB phosphorylation in A-10 VSMCs. Ca2+/calmodulin (CaM)-dependent protein kinase II (CaMKII) is a multifunctional serine/threonine protein kinase which is believed to transduce the downstream effects of Ca2+/CaM, and has been shown to be involved in H2O2-induced signaling in endothelial cells. However, a role of CaMKII in mediating ET-1 and H2O2-induced ERK1/2, PKB, Pyk2 phosphorylation, as well as its effect on hypertrophic and proliferative responses of ET-1 in VSMCs remains unexplored. Interestingly, a role of CaMKII in several cardiovascular diseases has been reported and studies showing that pharmacological inhibition of CaMKII, by using KN-93, prevent arrhythmic activity improved vascular dysfunction in diabetes or in Ang II-induced hypertension. Nitric oxide (NO) is also an important reactive species and vasoactive molecule involved in the regulation of several hormone-mediated responses. NO has been suggested to modify growth-promoting signaling events and thus may serve as a vascular protective agent. Studies have shown that NO can attenuate EGF and Ang II-induced Ras/Raf/ERK1/2 as well as increase in PKB phosphorylation signaling pathways. There is also evidence for a potential cross-talk between ET-1 and NO, however not much information on the ability of NO to modify ET-1-induced signaling in VSMCs is available. Therefore, the work presented in this thesis has investigated the role of CaMKII system in ET-1 and H2O2-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation, as well as in cell growth and proliferation evoked by ET-1 in VSMCs. We also investigated the role of NO in ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation as well as protein synthesis. In the first part of our studies, by using three different approaches, i.e. use of pharmacological inhibitors, a CaMKII AIP (autoinhibitor peptide) and siRNA techniques, we have investigated the involvement of CaMKII in ET-1-induced ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. We have demonstrated that CaMKII mediates the effect of ET-1 on ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. By using pharmacological inhibitor alone such as, KN-93, earlier studies have reported that AngII and Ca2+ elevating agents, such as ionomycin, exert their effects on ERK1/2 phosphorylation via CaM-dependent pathways in VSMC. However, by using multiple approaches, our studies, have provided the first evidence to suggest an involvement of CaMKII in mediating the effect of ET-1 on ERK1/2 and PKB phosphorylation in A-10 VSMC. We have also reported for the first time, a crucial role of CaMKII in vascular pathophysiology related to ET-1 by regulating the growth and hypertrophic events by using the technique of [3H]leucine and [3H]thymidine incorporation. In the second part, in view of earlier studies showing that ROS mediates ET-1-induced signaling events in VSMC, we have also investigated if CaMKII is also implicated in H2O2-induced activation of ERK1/2 and PKB pathways. By using both pharmacological and molecular approaches, we show that similar to ET-1, CaMKII serves as a critical upstream component in triggering H2O2-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation in VSMC. Furthermore, since we have previously reported that IGF-1R transactivation is needed for H2O2-induced PKB activation, we have investigated the effect of CaMKII inhibition and knocking-down on IGF-1R phosphorylation evoked by H2O2. Taken together, these results demonstrate that CaMKII plays a critical upstream role in mediating the effect of H2O2 on ERK1/2, PKB and IGF-1R phosphorylation. In the third part of our studies, we have investigated the molecular mechanism by which NO exerts its anti-mitogenic and anti-hypertrophic effect on ET-1-induced signaling. By testing the effect of two different NO donors (SNAP and SNP) and L-NAME, an inhibitor of NO synthase, in ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation, we observed that NO has an inhibitory effect in ET-1-induced signaling in VSMC. In addition, 8-Br-cGMP, an analogue of cGMP, exerted similar effect to that of NO donors whereas, oxadiazole quinoxalin (ODQ), an inhibitor of soluble guanylyl cyclase (sGC), reversed the inhibitory effect of NO. We conclude that NO, in a cGMP-dependent manner, attenuated ET-1-induced phosphorylation of ERK1/2, PKB and Pyk2 and also antagonized the hypertrophic effects of ET-1, since SNAP treatment decreased the protein synthesis induced by ET-1. In summary, the studies presented in this thesis demonstrate that both ET-1 and H2O2 induce ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation in VSMC and CaMKII activation is required for these events. We have also shown that CaMKII phosphorylation is upstream of H2O2-induced IGF-1R transactivation in VSMC. We have also provided evidence that NO attenuates ET-1-induced ERK1/2, PKB and Pyk2 phosphorylation. Finally, we have established that CaMKII activation stimulates ET-1-evoked protein and DNA synthesis, yet NO attenuates protein synthesis induced by ET-1. Keywords : Endothelin; Hydrogen peroxide; CaMKII; Nitric oxide; Vascular; Protein Kinase B; Extracellular Signal-Regulated Kinase1/2; IGF-1R; Growth.

Au cours de la grossesse, une perfusion placentaire adéquate est indispensable au bon développement du fœtus. Dans certaines maladies comme la prééclampsie, celle-ci est altérée, compromettant ainsi la vie du fœtus, mais aussi celle de sa mère. Le retrait du placenta mène à la disparition des symptômes de la prééclampsie, suggérant un rôle central de ce dernier dans la maladie. Le placenta étant dépourvu d’innervation autonome, le tonus vasculaire placentaire doit être sous le contrôle de facteurs humoraux et tissulaires. Les vaisseaux placentaires sont très réactifs aux prostanoïdes. Le rapport thromboxane A2 (TXA2)/prostacycline (PGI2) est fortement augmenté dans les placentas de grossesses avec prééclampsie. De plus, le taux d’isoprostane, marqueur du stress oxydatif, est accru dans les placentas de femmes avec prééclampsie. Finalement, la prééclampsie s’accompagne d’un stress oxydatif placentaire marqué. Les espèces réactives de l’oxygène sont connues d’une part, pour oxyder l’acide arachidonique (AA), formant ainsi des isoprostanes et d’autre part, pour augmenter la production de TXA2 dans différents tissus, suite à l’activation des cyclooxygénases (COXs). Nous proposons que : 1. les prostanoïdes sont parmi les molécules endogènes qui contrôlent le tonus vasculaire placentaire. 2. la maladie modifie la réponse aux isoprostanes dans les vaisseaux placentaires. 3. l’induction d’un stress oxydatif placentaire entraîne une réponse vasoactive par activation de la voie du métabolisme de l’AA. Nous avons tout d’abord montré, dans des placentas obtenus de grossesses normotensives, que l’U-46619, un mimétique de la TXA2, de même que l’isoprostane, 8-iso-prostaglandine E2 (8-isoPGE2), ont augmenté fortement la pression de perfusion dans les cotylédons perfusés in vitro et la tension dans les anneaux d’artères chorioniques suspendus dans des bains à organe isolé. En revanche, dans les artères chorioniques de placentas obtenus de grossesses avec prééclampsie, ces réponses étaient modifiées puisque la réponse maximale à l’U-46619 était augmentée et celle à la 8-isoPGE2 diminuée. D’autre part, nous avons montré que les réponses maximales aux deux prostanoïdes étaient augmentées dans les vaisseaux placentaires de grossesse normale ou avec prééclampsie issus d’une délivrance prématurée par rapport à ceux d’une délivrance à terme. Ceci suggère une évolution de la réactivité des artères placentaires au cours du 3e trimestre de grossesse. En outre, les vaisseaux placentaires ont répondu aux prostanoïdes de façon semblable qu’ils aient été issus d’un accouchement vaginal ou d’une césarienne élective. Ceci indique que les prostanoïdes placentaires n’interviennent pas dans le processus de délivrance. D’un autre côté, l’utilisation de bloqueurs spécifiques des récepteurs TP à la TXA2, le SQ29,548 et l’ICI192,605, et des récepteurs EP à la prostaglandine E2, l’AH6809, nous ont permis de mettre en évidence le fait que l’U-46619 et la 8-isoPGE2 pouvaient agir de façon non-sélective sur l’un ou l’autre des récepteurs. Ces résultats supportent donc nos 2 premières hypothèses : les prostanoïdes font partie des molécules endogènes qui peuvent contrôler le tonus vasculaire placentaire et la prééclampsie modifie la réponse aux isoprostanes dans les artères chorioniques d’une manière compatible avec l’augmentation de la production de ces substances qui elle, est probablement le résultat du stress oxydatif. En revanche, en ce qui concerne les substances capables de jouer la contrepartie vasodilatatrice, l’utilisation d’un inhibiteur des synthases de monoxyde d’azote, le L-NAME, et celle d’inhibiteurs des COXs, l’ibuprofène, l’indométacine et le N-2PIA, ne nous a pas permis de mettre en évidence un quelconque rôle du monoxyde d’azote ou des prostanoïdes vasodilatatrices à ce niveau. Finalement, nous avons montré que l’induction d’un stress oxydatif dans les cotylédons perfusés in vitro et les artères chorioniques entraînait une vasoconstriction marquée. Celle-ci semble résulter de l’action des prostanoïdes puisqu’un blocage des récepteurs TP ou des COXs diminuait significativement la réponse maximale au peroxyde d’hydrogène. Les prostanoïdes impliquées dans la réponse au stress oxydatif proviendraient essentiellement d’une activation des COXs puisque l’étude ne nous permet pas de conclure à une quelconque implication des isoprostanes dans cette réponse. Ces observations confirment donc notre hypothèse que, dans le placenta, le stress oxydatif possède des propriétés vasoactives par activation du métabolisme de l’AA. En résumé, les résultats obtenus dans les placentas de grossesses normotensives et avec prééclampsie suggèrent que les prostanoïdes sont des molécules d’importance dans la régulation du tonus vasculaire placentaire. Le fait que la prééclampsie modifie la réponse aux prostanoïdes pourrait expliquer pourquoi la perfusion placentaire est altérée chez ces patientes. En outre, il apparaît évident qu’il existe un lien étroit entre le stress oxydatif et la voie de synthèse des prostanoïdes placentaires. Cependant d’autres études sont nécessaires pour mieux comprendre la nature de ce lien, qui pourrait, d’une certaine façon, jouer un rôle important dans le développement de la prééclampsie. / Throughout pregnancy, appropriate placental perfusion is essential for the fœtus to grow properly. In disease such as preeclampsia, placental perfusion is impaired, compromising the fœtus and mother’s lives. Placenta delivery leads to a complete disappearance of the clinical symptoms of preeclampsia. This suggests that the placenta plays a central role in the disease. Placenta being devoid of autonomous innervation, placental vascular tone needs to be under the control of humoral and tissular factors; placental arteries are very reactive to prostanoids. The thromboxane A2 (TXA2)/prostacyclin (PGI2) ratio is increased in placenta from preeclamptic women. Furthermore, in placenta from preeclamptic pregnancies, isoprostane rate is increased, which is a marker of oxidative stress. Finally, preeclampsia is characterised by an important oxidative stress. Reactive oxygen species are known to form isoprostane through the oxidation of arachidonic acid (AA) and to increase TXA2 production in various tissues following an activation of the cyclooxygenases (COXs). We postulate that: 1. prostanoids are among the endogenous molecules that control placental vascular tone. 2. preeclampsia alters responses to isoprostanes in placental vessels. 3. induced placental oxidative stress leads to vasoactive responses through the activation of the AA metabolism. We first showed in placentas from normotensive pregnancies that the TXA2 mimetic U-46619 and the isoprostane 8-isoprostaglandin E2 (8-isoPGE2) markedly increased perfusion pressure in in vitro perfused cotyledons, as well as tension in isolated chorionic arteries. However, in placentas obtained from women with preeclampsia, those responses were altered in chorionic arteries. Indeed, maximal response to U-46619 was raised by preeclampsia, while the one to 8-isoPGE2 was decreased. We then showed that preterm delivery increased maximal responses to both prostanoids compared to term delivery. This observation suggests that placental arteries reactivity evolves along the 3rd trimester of pregnancy. Nevertheless, it appeared that delivery mode had no effect on vascular responses to prostanoids, suggesting that placental prostanoids are not involved in the delivery process. The use of specific blockers of the TXA2 TP receptors, SQ29,548 and ICI192,605, and of the prostaglandin E2 EP receptors, AH6809, revealed that U-46619 and 8-isoPGE2 could mediate their effects by acting on both receptors in a non-selective manner. Therefore, these results support our two first postulates: prostanoids could be the endogenous substances controlling the placental vascular tone and preeclampsia alters responses to isoprostanes in chorionic artery rings in a way compatible with the increased production of these substances possibly through the associated oxidative stress. Moreover, we were unable to identify any vasodilator substances capable of counteracting the effects of vasoconstrictors in the placental circulation. Indeed, blocker of nitric oxide synthases, L-NAME, as well as blockers of COXs, ibuprofen, indometacin and N-2PIA, did not reveal any effect of nitric oxide and vasodilator prostanoids at this level. Finally, we showed that induction of oxidative stress in in vitro perfused cotyledons and in isolated chorionic artery rings led to marked vasoconstriction. This would result from the action of prostanoids since a blockade of TP receptors or COXs significantly decreased maximal response to hydrogen peroxide. Prostanoids involved in this response would essentially come from COX activation. Indeed, the present results did not show any concrete involvement of isoprostane substances in the response to oxidative stress. Consequently, these observations confirm our hypothesis that, in the placenta, oxidative stress presents some vasoactive properties through the activation of the AA metabolism. In summary, results obtained in placentas from normotensive and preeclamptic pregnancies suggest that prostanoids are important in the regulation of the placental vascular tone. Furthermore, responses to prostanoids in chorionic arteries are altered by preeclampsia, which could explain why the placental perfusion is impaired in the disease. Moreover, it seems clear that there is a close relationship between oxidative stress and synthesis of placental prostanoids. However, more investigations are needed to better understand the nature of this relationship, which, in some way, could play an important role in the development of preeclampsia.

In vivo, la pression artérielle au niveau des artères cérébrales est pulsée, alors que ex vivo, l’étude de la fonction cérébrovasculaire est majoritairement mesurée en pression statique. L’impact de la pression pulsée sur la régulation du tonus myogénique et sur la fonction endothéliale cérébrale est inconnu. Nous avons posé l’hypothèse selon laquelle en présence d'une pression pulsée physiologique, la dilatation dépendante de l’endothélium induite par le flux et le tonus myogénique seraient optimisés. L’objectif de notre étude est d’étudier ex vivo l’impact de la pression pulsée sur le tonus myogénique et la dilatation induite par le flux dans les artères cérébrales de souris. Nous avons utilisé un artériographe pressurisé couplé à un système générant une onde pulsée de fréquence et d’amplitude réglables. Les artères cérébrales moyennes (≈160 μm de diamètre) ont été isolées de souris C57BL6 âgées de 3 mois et pressurisées à 60 mm Hg, en pression statique ou en pression pulsée. En pression statique, le tonus myogénique est faible mais est potentialisé par le L-NNA (un inhibiteur de la eNOS) et la PEG-catalase (qui dégrade le H2O2), suggérant une influence des produits dilatateurs dérivés de la eNOS sur le tonus myogénique. En présence de pression pulsée (pulse de 30 mm Hg, pression moyenne de 60 mm Hg, 550 bpm), le tonus myogénique est significativement augmenté, indépendamment du L-NNA et de la PEG-catalase, suggérant que la pression pulsée lève l’impact de la eNOS. En pression statique ou pulsée, les artères pré-contractées se dilatent de façon similaire jusqu’à une force de cisaillement de 15 dyn/cm2. Cette dilatation, dépendante de l’endothélium et de la eNOS, est augmentée en condition pulsée à une force de cisaillement de 20 dyn/cm2. En présence de PEG-catalase, la dilatation induite par le flux est diminuée en pression statique mais pas en pression pulsée, suggérant que la pression statique, mais pas la pression pulsée, favorise la production de O2 -/H2O2. En effet, la dilatation induite par le flux est associée à une production de O2 -/H2O2 par la eNOS, mesurable en pression statique, alors que la dilatation induite par le flux en pression pulsée est associée à la production de NO. Les différences de sensibilité à la dilatation induite par le flux ont été abolies après inhibition de Nox2, en condition statique ou pulsée. La pression pulsée physiologique régule donc l’activité de la eNOS cérébrale, en augmentant le tonus myogénique et, en présence de flux, permet la relâche de NO via la eNOS. / While in vivo arterial blood pressure in cerebral arteries is pulsatile, in vitro cerebral arterial function is generally assessed under a static pressure. Thus, whether pulse pressure regulates cerebral endothelial shear stress sensitivity and myogenic tone is unknown. We hypothesized that a physiological pulse pressure induces a better flow-mediated dilation and optimized myogenic tone. The aim of this study was to test in vitro the impact of pulse pressure on myogenic tone and eNOS-dependent flow-mediated dilation in mouse cerebral arteries. Using a custom computer-controlled pneumatic system generating a pulse pressure (used at 30 mm Hg, rate of 550 bpm) coupled to an arteriograph, isolated posterior cerebral arteries from 3-month old C57Bl/6J mice were pressurized at 60 mm Hg, either in static or pulse pressure conditions. Shear stress from 2 to 20 dyn/cm2 was applied and flow-mediated dilation measured. Without pulse pressure, myogenic tone was low but potentiated by both L-NNA (eNOS inhibitor) and PEG-catalase (catalyses H2O2), suggesting an influence of eNOS-derived dilator products on myogenic tone. Pulse pressure significantly increased myogenic tone, independently of L-NNA and PEG-catalase, suggesting that pulse pressure prevents the impact of eNOS. In both static and pulse pressure conditions, cerebral arteries did not dilate to shear stress in the presence of L-NNA or after endothelial denudation, confirming the endothelial origin of the dilatory response. Up to 15 dyn/cm2, shear stress elicited similar flow-mediated dilation in static and pulse pressure conditions; at 20 dyn/cm2, however, flow-mediated dilation were higher in the presence of pulse pressure. PEG-catalase reduced flow-mediated dilation in static but not in pulse pressure, suggesting that in static conditions eNOS is responsible for O2 -/H2O2 production. Indeed, eNOS-derived O2 -/H2O2 production was measured during flow-mediated dilation in static pressure, while pulse pressure promoted eNOS-derived NO production. Differences in flow-mediated dilation between static and pulse pressure conditions were abolished after Nox2 inhibition. In conclusion, pulse pressure modulates cerebrovascular eNOS activity: at rest, pulse pressure inhibits eNOS, increasing myogenic tone. In the presence of flow, pulse pressure permits a shear stress-dependent eNOS-derived NO release, leading to higher flow-mediated dilation.