As fosfolipases A2 (PLA2s) catalisam a hidrólise de ácidos graxos na posição sn-2 das membranas fosfolipídicas e liberam, como subprodutos, ácidos graxos livres. As PLA2s do grupo IIA são encontradas em peçonhas de serpentes da família Viperidae e desempenham diversas atividades apresentando potencial miotóxico, neurotóxico, hemolítico, edematogênico, citotóxico, hipotensivo, anticoagulante, inibição/ativação da agregação plaquetária, bactericida e pró-inflamatório. Esse trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização funcional de uma PLA2 isolada da peçonha de Bothrops jararaca. Para a purificação dessa proteína, denominada BJ-PLA2-I, foram necessários três passos cromatográficos consecutivos: cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200, cromatografia de troca iônica em Source TM 15Q/50mL e cromatografia de troca iônica em MonoQ TM 5/50 GL. A BJ-PLA2-I apresentou elevado grau de pureza por SDS-PAGE e por cromatografia de fase reversa C18, em HPLC. Apresentou ainda, características ácidas, com pI em torno de 4,4 e teve a sua massa molecular determinada por dois métodos, obtendo-se valores bem próximos de 14,8 kDa (SDS-PAGE) e 14,2 kDa (MALDI-TOF). Esse fato é comum considerando que a espectrometria de massas é um método mais preciso e determina de maneira mais exata a massa molecular. O sequenciamento N-terminal da BJ-PLA2-I resultou em 60 resíduos de aminoácidos. O alinhamento múltiplo com outras fosfolipases A2 de serpentes do mesmo gênero mostrou similaridade entre elas, mostrando identidade de 100% com a BJ-PLA2, fosfolipase A2 Asp-49, também isolada da Bothrops jararaca. Esse dado levanta a hipótese de que a BJ-PLA2-I purificada neste trabalho e a BJ-PLA2 se tratam da mesma proteína, entretanto essa hipótese só poderá ser confirmada quando a sequência completa da BJ-PLA2-I for obtida. Outros dados encontrados neste trabalho reforçam essa hipótese, isso porque, avaliando a atividade fosfolipásica, o efeito sobre as plaquetas e o pI, tanto a BJ-PLA2-I quanto a BJ-PLA2 apresentaram características semelhantes. A BJ-PLA2-I, sendo uma Asp-49, mostrou alta atividade catalítica e efeito inibidor da agregação plaquetária induzida por ADP (20,5 ?g/mL inibiu 50 % da agregação plaquetária). Ela também foi capaz de induzir a migração leucocitária após a administração de diferentes concentrações (5, 10 e 20 ?g/mL) da BJ-PLA2-I. Esse dado também foi encontrado no ensaio em que a concentração de 10 ?g/mL foi fixada e variou-se o tempo de 2, 4 e 24 horas, observando-se principalmente a migração de neutrófilos. Além disso, verificou-se a liberação das citocinas IL-6 e IL-1?, de proteínas totais e de prostaglandina E2 na reação inflamatória induzida pela BJ-PLA2-I. No entanto, não foi observado a produção de TNF-?, IL-10 e leucotrieno B4. A BJ-PLA2-I caracterizou-se como uma PLA2 pró-inflamatória, produzindo inflamação local aguda. A BJ-PLA2-I foi avaliada quanto ao seu potencial antitumoral em três linhagens celulares distintas (PBMC, HL-60 e HepG2). Observou-se que a enzima em questão possui baixo potencial antitumoral para a linhagem HL-60, reduzindo o número de células tumorais em apenas cerca de 20% nas concentrações testadas. Verificou-se pequena alteração na viabilidade celular das células de PMBC, nas maiores concentrações testadas (160 e 80 ?g/mL) e, na linhagem HepG2 não foi encontrada nenhuma alteração. Concluindo, as informações adquiridas neste trabalho são de suma importância para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos nas atividades biológicas desempenhadas pelas PLA2s. Além disso, a BJ-PLA2-I pode servir como modelo molecular para a formulação de fármacos mais eficazes a serem utilizados no tratamento de várias doenças. / Phospholipases A2 (PLA2s) catalyze the hydrolysis of fatty acids in the sn-2 position of membrane phospholipids, releasing free fatty acids as by-products. PLA2s of group IIA are found in snake venoms of the Viperidae family and perform various activities, including myotoxic, neurotoxic, hemolytic, edematogenic, cytotoxic, hypotensive, anticoagulant, inhibition/activation of platelet aggregation, bactericidal and proinflammatory effects. This work aimed at the isolation and functional characterization of a PLA2 isolated from Bothrops jararaca venom. For the purification of this protein, called BJ-PLA2-I, three consecutive chromatographic steps were used (size exclusion chromatography on Sephacryl S-200, ion exchange chromatography on Source 15Q/50 mL, ion exchange chromatography on MonoQ 5/50 GL). Confirmation of the purity of BJ-PLA2-I was evaluated by SDS-PAGE and reverse phase HPLC using a C18 column. BJ-PLA2-I has acidic characteristics, with pI around 4.4, and its molecular mass was determined by two methods, obtaining values close to 14.8 kDa (SDS-PAGE) and 14.2 kDa (MALDI-TOF). The N-terminal sequencing of BJ-PLA2-I resulted in 60 amino acid residues. Multiple alignment with other phospholipases A2 of snakes of the same genus showed high similarity between them, showing 100% identity with BJ-PLA2, an Asp-49 phospholipase A2 previously isolated from Bothrops jararaca venom. This finding raises the possibility that the PLA2 purified in this work is the same protein previously described (BJ-PLA2), however, this assumption can only be confirmed when the complete sequence of BJ-PLA2-I is obtained. Other data obtained in this study support this hypothesis, considering that the phospholipase activity, the effect on platelets and pI of both BJ-PLA2-I and BJ-PLA2 showed to be similar. BJ-PLA2-I, being an Asp-49 PLA2, showed high catalytic activity and inhibitory effect on the platelet aggregation induced by ADP (20.5 ?g/mL inhibited 50% of the platelet aggregation). It was also able to induce leukocyte migration after the administration of different concentrations (5, 10 and 20 ?g/mL) of BJ-PLA2-I. This fact was also found when the concentration of 10 ?g/mL was fixed and response times were varied (2, 4 and 24 hours), observing especially neutrophil migration. Furthermore, there was a release of IL-6 and IL-1?, total proteins and prostaglandin E2 in the inflammatory reaction induced by BJ-PLA2-I, however, the production of TNF-?, IL-10 and leukotriene B4 was not observed. BJ-PLA2-I was characterized as a proinflammatory PLA2 producing acute local inflammation. BJ-PLA2-I was evaluated for its antitumor potential on three different cell lines (PBMC, HL-60 and HepG2). It was observed that this enzyme showed a low antitumor potential on HL-60 tumor cell line, reducing the number of tumor cells in only about 20% at the concentrations tested. There was little change in cell viability of PBMC cells in the higher concentrations tested (80 and 160 ?g/mL), but no change was found on HepG2 tumor cell line. In conclusion, the information obtained in this work are of utmost importance for better understanding the mechanisms involved in the biological activities induced by PLA2s. Furthermore, BJ-PLA2-I may serve as a molecular model for the formulation of more effective drugs to be used in the treatment of various diseases.

Adaptation to chronic hypoxia activates endogenous signaling cascades, which lead to cardiac protection against acute ischemia/reperfusion (I/R) injury. The molecular mechanism of this phenomenon has not been fully clarified yet. However, it was proved that reactive oxygen species (ROS) take part in cardioprotective signaling pathway inducted by chronic hypoxia. The high level of ROS must be precisely regulated by antioxidative system of a cell. The aim of diploma thesis was to examine the effect of intermittent hypobaric hypoxia (IHH, 7 000 m) on relative amount of antioxidative enzymes (peroxiredoxin 6 - PRX6, thioredoxin 1 and 2 - TRX1 and TRX2, thioredoxin reductase 1 - TRXR1) and also enzymes of iron metabolism (heme oxygenase 1 and 2 - HO1 and HO2, aconitase 1 and 2 - ACO1 and ACO2), which participate in regulation of cell redox state. Moreover, we studied the effect of adaptation to IHH and an antioxidant tempol on relative amount of calcium-independent phospholipase A2 (iPLA2). iPLA2 can remove peroxidized fatty acids from membrane phospholipids. On the other hand, iPLA2 can damage cell in I/R conditions. All enzymes were studied in homogenates from normoxic and IHH adapted rat left ventricular myocardium by Western blot. Adaptation to IHH caused a decrease of PRX6 and on the opposite an increase of...

INTRODUÇÃO: Os transtornos mentais psicóticos são condições frequentes na população geral e estão associados a grande morbidade e disfuncionalidade. Apesar disso, as bases fisiopatológicas destes transtornos ainda estão em investigação. Estudos neuropatológicos post-mortem e de neuroimagem in vivo sugerem haver comprometimento da microestrutura de substância branca (SB) cerebral nestas condições clínicas, associado a alterações da conectividade cerebral. No entanto, nenhuma investigação prévia de neuroimagem avaliou especificamente se tais anormalidades microestruturais podem ser dependentes do estado clínico do paciente, i.e., se tais alterações podem variar de acordo com a fase da doença. Outra linha de investigação biológica em psicoses aponta para alterações na atividade da fosfolipase A2 (PLA2), uma enzima essencial a diversas funções na homeostase cerebral, incluindo manutenção de membrana celular, mielinização e atividade inflamatória. Estudos prévios sugerem haver relação entre alterações na atividade desta enzima e as fases da esquizofrenia. Entretanto, não há estudos translacionais que tenham avaliado como tais alterações se relacionam com anormalidades microestruturais de SB em pacientes psicóticos. OBJETIVOS: Investigar a hipótese de que alterações de microestrutura de SB presentes em pacientes em fase aguda do primeiro episódio psicótico (PEP) sejam potencialmente reversíveis após estabilização clínica; investigar também possíveis alterações estado-dependentes da atividade de PLA2 no PEP; e examinar interações entre manifestações clínicas, microestrutura de SB cerebral e atividade de PLA2 na fisiopatologia do PEP. METODOLOGIA: Pacientes em PEP não afetivo foram avaliados em dois períodos no tempo: durante a fase aguda da doença (T0); após remissão estável de sintomas (T1). Um grupo controle de voluntários saudáveis (CS) também foi avaliado longitudinalmente. Para investigar alterações de microestrutura de SB estado-dependentes, análises voxel-a-voxel de mapas cerebrais de índices de anisotropia (fractional anisotropy, FA) e difusividade (trace, TR) foram conduzidas, assim como o cálculo de correlações entre tais índices de DTI, variáveis clínicas e atividade de PLA2. A atividade dos três principais subgrupos de PLA2 em plaquetas foi estimada através de um método radioenzimático. RESULTADOS: 25 pacientes PEP e 51 CS foram avaliados em T0, com coleta de dados clínico-demográficos, ressonância magnética (RM) e amostra de sangue. Destes, 21 PEP e 36 CS realizaram a segunda aquisição de RM. No baseline (T0), os pacientes PEP apresentaram redução difusa de FA (p < 0,05, FDR), afetando principalmente SB fronto-límbica e fascículos associativos, projetivos e comissurais. As análises longitudinais demonstraram que a remissão clínica se associou a aumentos de FA em tratos de SB acometidos em T0 (p < 0,001, não corrigido), além de robustas correlações inversas entre aumentos de FA e redução sintomas ao longo do tempo (p < 0,05, FDR). As análises de PLA2 não demostraram efeitos estado-dependentes ou correlações consistentes com os índices de DTI. CONCLUSÃO: Alterações da microestrutura de SB afetando tratos cerebrais essenciais para a integração de informação perceptual, cognição e emoções são detectáveis logo após o início do PEP e podem ser parcialmente revertidas em relação direta com a remissão de sintomas psicóticos agudos. Nossos achados reforçam a visão de que anormalidades de SB de tratos cerebrais são um componente neurobiológico central nos transtornos psicóticos agudos, e que a recuperação de tal patologia de SB pode levar à melhora clínica. Por outro lado, a atividade de PLA2 não parece ter associação direta com o estado de doença ou moderar as alterações microestruturais dinâmicas de SB aqui observadas. Estudos com amostras maiores e com um maior número de avaliações ao longo do tempo são necessários para confirmar e ampliar os resultados aqui apresentados / INTRODUCTION: Psychotic disorders are frequent conditions in the general population and are associated to severe morbidity and functional impairment. Notwithstanding, the pathophysiological basis of such disorders is still under investigation. Post-mortem neuropathologic investigations and in vivo neuroimaging studies have pointed to the occurrence of abnormalities in the microstructure of brain white matter (WM) in such clinical conditions, which are associated to changes in brain connectivity. However, no previous neuroimaging investigation has specifically examined whether such microstructural abnormalities would be state-dependent, i.e., whether such changes could relate to the illness phase. Another field of biological investigation in psychosis points to changes in the activity of phospholipase A2 enzyme (PLA2), which is essential to several functions implicated in brain homeostasis, such as the maintenance of cellular membrane, myelination and inflammatory activity. Previous studies suggest the existence of a relationship between changes on PLA2 activity and schizophrenia phase. Nonetheless, no translational study to date has examined the potential interplay between PLA2 activity and WM microstructural abnormalities in psychotic patients. OBJECTIVES: To investigate the hypothesis that WM microstructural changes observed in patients during the acute first-episode psychosis (FEP) are potentially reversible following clinical remission; to investigate possible state-dependent changes in PLA2 activity in FEP; and to examine interactions between clinical manifestations, brain WM microstructure and PLA2 activity in the pathophysiology of FEP. METODOLOGY: Patients with non-affective FEP were evaluated in two time points: during the acute phase (T0) and following sustained remission (T1). A control group of healthy volunteers (HC) was also longitudinally studied. In order to investigate state-dependent WM microstructure changes, voxelwise analyses of brain maps of anisotropy (fractional anisotropy, FA) and diffusivity (trace, TR) indexes were conducted, as well as correlations between such DTI metrics, clinical variables and PLA2 activity. The activity of the three main PLA2 subgroups was assessed in platelets using a radioenzymatic method. RESULTS: 25 FEP and 51 HC were evaluated at T0 (clinical and demographic data, MRI scanning, and blood collection). Out of these, 21 FEP and 36 HC also underwent a second MRI acquisition. At baseline (T0), FEP patients presented widespread reduction of FA (p < 0.05, FDR), affecting mainly fronto-limbic WM and associative, projective and commissural fasciculi. Longitudinal analyses showed that clinical remission was associated with FA increase in WM tracts that were affected at T0 (p < 0.001, uncorrected), besides robust inverse correlations between FA increase and symptoms reduction over time (p < 0.05, FDR). PLA2 analyses failed to show state-dependent effects or consistent correlations to DTI indexes. CONCLUSION: WM changes affecting brain tracts critical to the integration of perceptual information, cognition and emotions are detectable soon after the onset of FEP and may partially reverse in direct relation to the remission of acute psychotic symptoms. Our findings reinforce the view that WM abnormalities are a key neurobiological feature of acute psychotic disorders, and that recovery from such WM pathology can lead to amelioration of symptoms. In the other hand, it seems that PLA2 activity has no direct relationship to the disease state or modulatory effects on the dynamic WM changes observed herein. Studies with larger samples and with more time points evaluations are necessary to confirm and expand the findings reported herein

INTRODUÇÃO: Os transtornos mentais psicóticos são condições frequentes na população geral e estão associados a grande morbidade e disfuncionalidade. Apesar disso, as bases fisiopatológicas destes transtornos ainda estão em investigação. Estudos neuropatológicos post-mortem e de neuroimagem in vivo sugerem haver comprometimento da microestrutura de substância branca (SB) cerebral nestas condições clínicas, associado a alterações da conectividade cerebral. No entanto, nenhuma investigação prévia de neuroimagem avaliou especificamente se tais anormalidades microestruturais podem ser dependentes do estado clínico do paciente, i.e., se tais alterações podem variar de acordo com a fase da doença. Outra linha de investigação biológica em psicoses aponta para alterações na atividade da fosfolipase A2 (PLA2), uma enzima essencial a diversas funções na homeostase cerebral, incluindo manutenção de membrana celular, mielinização e atividade inflamatória. Estudos prévios sugerem haver relação entre alterações na atividade desta enzima e as fases da esquizofrenia. Entretanto, não há estudos translacionais que tenham avaliado como tais alterações se relacionam com anormalidades microestruturais de SB em pacientes psicóticos. OBJETIVOS: Investigar a hipótese de que alterações de microestrutura de SB presentes em pacientes em fase aguda do primeiro episódio psicótico (PEP) sejam potencialmente reversíveis após estabilização clínica; investigar também possíveis alterações estado-dependentes da atividade de PLA2 no PEP; e examinar interações entre manifestações clínicas, microestrutura de SB cerebral e atividade de PLA2 na fisiopatologia do PEP. METODOLOGIA: Pacientes em PEP não afetivo foram avaliados em dois períodos no tempo: durante a fase aguda da doença (T0); após remissão estável de sintomas (T1). Um grupo controle de voluntários saudáveis (CS) também foi avaliado longitudinalmente. Para investigar alterações de microestrutura de SB estado-dependentes, análises voxel-a-voxel de mapas cerebrais de índices de anisotropia (fractional anisotropy, FA) e difusividade (trace, TR) foram conduzidas, assim como o cálculo de correlações entre tais índices de DTI, variáveis clínicas e atividade de PLA2. A atividade dos três principais subgrupos de PLA2 em plaquetas foi estimada através de um método radioenzimático. RESULTADOS: 25 pacientes PEP e 51 CS foram avaliados em T0, com coleta de dados clínico-demográficos, ressonância magnética (RM) e amostra de sangue. Destes, 21 PEP e 36 CS realizaram a segunda aquisição de RM. No baseline (T0), os pacientes PEP apresentaram redução difusa de FA (p < 0,05, FDR), afetando principalmente SB fronto-límbica e fascículos associativos, projetivos e comissurais. As análises longitudinais demonstraram que a remissão clínica se associou a aumentos de FA em tratos de SB acometidos em T0 (p < 0,001, não corrigido), além de robustas correlações inversas entre aumentos de FA e redução sintomas ao longo do tempo (p < 0,05, FDR). As análises de PLA2 não demostraram efeitos estado-dependentes ou correlações consistentes com os índices de DTI. CONCLUSÃO: Alterações da microestrutura de SB afetando tratos cerebrais essenciais para a integração de informação perceptual, cognição e emoções são detectáveis logo após o início do PEP e podem ser parcialmente revertidas em relação direta com a remissão de sintomas psicóticos agudos. Nossos achados reforçam a visão de que anormalidades de SB de tratos cerebrais são um componente neurobiológico central nos transtornos psicóticos agudos, e que a recuperação de tal patologia de SB pode levar à melhora clínica. Por outro lado, a atividade de PLA2 não parece ter associação direta com o estado de doença ou moderar as alterações microestruturais dinâmicas de SB aqui observadas. Estudos com amostras maiores e com um maior número de avaliações ao longo do tempo são necessários para confirmar e ampliar os resultados aqui apresentados / INTRODUCTION: Psychotic disorders are frequent conditions in the general population and are associated to severe morbidity and functional impairment. Notwithstanding, the pathophysiological basis of such disorders is still under investigation. Post-mortem neuropathologic investigations and in vivo neuroimaging studies have pointed to the occurrence of abnormalities in the microstructure of brain white matter (WM) in such clinical conditions, which are associated to changes in brain connectivity. However, no previous neuroimaging investigation has specifically examined whether such microstructural abnormalities would be state-dependent, i.e., whether such changes could relate to the illness phase. Another field of biological investigation in psychosis points to changes in the activity of phospholipase A2 enzyme (PLA2), which is essential to several functions implicated in brain homeostasis, such as the maintenance of cellular membrane, myelination and inflammatory activity. Previous studies suggest the existence of a relationship between changes on PLA2 activity and schizophrenia phase. Nonetheless, no translational study to date has examined the potential interplay between PLA2 activity and WM microstructural abnormalities in psychotic patients. OBJECTIVES: To investigate the hypothesis that WM microstructural changes observed in patients during the acute first-episode psychosis (FEP) are potentially reversible following clinical remission; to investigate possible state-dependent changes in PLA2 activity in FEP; and to examine interactions between clinical manifestations, brain WM microstructure and PLA2 activity in the pathophysiology of FEP. METODOLOGY: Patients with non-affective FEP were evaluated in two time points: during the acute phase (T0) and following sustained remission (T1). A control group of healthy volunteers (HC) was also longitudinally studied. In order to investigate state-dependent WM microstructure changes, voxelwise analyses of brain maps of anisotropy (fractional anisotropy, FA) and diffusivity (trace, TR) indexes were conducted, as well as correlations between such DTI metrics, clinical variables and PLA2 activity. The activity of the three main PLA2 subgroups was assessed in platelets using a radioenzymatic method. RESULTS: 25 FEP and 51 HC were evaluated at T0 (clinical and demographic data, MRI scanning, and blood collection). Out of these, 21 FEP and 36 HC also underwent a second MRI acquisition. At baseline (T0), FEP patients presented widespread reduction of FA (p < 0.05, FDR), affecting mainly fronto-limbic WM and associative, projective and commissural fasciculi. Longitudinal analyses showed that clinical remission was associated with FA increase in WM tracts that were affected at T0 (p < 0.001, uncorrected), besides robust inverse correlations between FA increase and symptoms reduction over time (p < 0.05, FDR). PLA2 analyses failed to show state-dependent effects or consistent correlations to DTI indexes. CONCLUSION: WM changes affecting brain tracts critical to the integration of perceptual information, cognition and emotions are detectable soon after the onset of FEP and may partially reverse in direct relation to the remission of acute psychotic symptoms. Our findings reinforce the view that WM abnormalities are a key neurobiological feature of acute psychotic disorders, and that recovery from such WM pathology can lead to amelioration of symptoms. In the other hand, it seems that PLA2 activity has no direct relationship to the disease state or modulatory effects on the dynamic WM changes observed herein. Studies with larger samples and with more time points evaluations are necessary to confirm and expand the findings reported herein

La neteja del moc i dels patògens dels pulmons, i el transport de gàmets i embrions en els òrgans reproductius de les femelles són funcions clau en els epitelis ciliats, tals com aquells que es troben presents en les vies respiratòries i l'oviducte. La taxa de transport mucociliar és funció de la freqüència de batut ciliar (CBF) i aquesta freqüència és augmentada per increments en la concentració de Ca2+ intracelul·lar. El canal catiònic "transient potential vanilloid 4" (TRPV4) intervé en l'entrada de Ca2+ en resposta a estímuls mecànics i osmòtics. L'expressió del TRPV4 en l'epiteli ciliat de les vies respiratòries i de l'oviducte és confirmada mitjançant la localització per immunofluorescència del canal iònic a la membrana apical de l'epiteli ciliat i polaritzat, allà on la senyalització de Ca2+ és requerida per la regulació de la CBF. Cèl·lules ciliades de la tràquea de ratolins TRPV4-/- no expressen el canal TRPV4, no responen a l'activador específic del TRPV4, el 4&#945;-phorbol 12,13-didecanoate (4&#945;-PDD) i presenten respostes de Ca2+ reduïdes a temperatures mitjanes (~25ºC- 8ºC), un altre estímul dels canals TRPV4. L'activació dels canals TRPV4 per solucions altament viscoses i per hypotonicitat depèn de l'activació de la via de la fosfolipasa A2(PLA2)i la subseqüent producció de àcid epoxieicosatrienoic (EET). En condicions de baixa activació de la PLA2, estímuls mecànics i hipotònics alliberen ATP per a l'activació de la via de la fosfolipasa C (PLC)-inositol trifosfat (IP3) per contribuir a l'activació dels canals TRPV4. Descrivim que el metabòlit IP3 sense ser un agonista per ell mateix, sensibilitza el TRPV4 per a l'activació de EET, essent aquest un mecanisme general. L'acoblament funcional entre els canals TRPV4 de la membrana plasmàtica i els receptors de IP3 (IP3R) és necessari tant per iniciar com mantenir la senyalització oscil·latòria del Ca2+ desencadenada per estímuls viscosos i hipotònics. Un dels principals activadors de la CBF, la adenosina-5'-trifosfat (ATP), desencadena una resposta cel·lular mediada per Ca2+ en la que es desencadena tant l'alliberament de Ca2+ des dels dipòsits intracel·lulars com l'entrada de Ca2+. És destacable la contribució de el TRPV4 en l'augment de la CBF mediada per ATP. És més, el nostre treball implica als canals TRPV4 exclusivament en l'entrada de Ca2+ activada per receptor (ROCE). Tot plegat, aquesta tesi doctoral mostra el paper dels canals TRPV4 en l'acoblament d'estímuls fisiològics tipus mecànic, osmòtic i químic a la regulació de la CBF en l'epiteli ciliat destinat al transport mucociliar. / Clearance of mucus and pathogenic agents from lungs and the transport of gametes and embryos in the female reproductive organs are key functions of ciliated epithelia such as those present in the airways and the oviduct. The rate of mucociliary transport is a function of ciliary beat frequency (CBF) and this, in turn, is increased by increases in intracellular calcium. Transient potential vanilloid 4 (TRPV4)cation channel mediates Ca2+ influx in response to mechanical and osmotic stimuli. TRPV4 expression in ciliated epithelia from airways and oviduct is confirmed by immunofluorescence localization of the channel at the apical membrane of the polarized ciliated epithelia, where the Ca2+ signalling is required for CBF regulation. Ciliated tracheal cells from TRPV4-/-mice show no TRPV4 expression, neither increases in intracellular Ca2+ and CBF in response to the TRPV4-specific activator 4&#945;- phorbol 12,13- idecanoate (4&#945;-PDD), and reduced responses to mild temperatures (~25ºC - 38ºC), another TRPV4-activating stimulus. TRPV4 gating by high viscous loads and hypotonicity depends on phospholipase A2 (PLA2) pathway activation and subsequent production of epoxyeicosatrienoic acid (EET). Under conditions of low PLA2 activation, mechanical and hypotonic stimuli use extracellular ATP release-mediated activation of phospholipase C (PLC)-inositol triphosphate(IP3)signalling to support TRPV4 gating. We describe that IP3, without being an agonist itself, sensitizes TRPV4 to EET activation. Besides, the functional coupling between plasma membrane TRPV4 channels and IP3 receptors (IP3R) is required to initiate and maintain the cellular oscillatory Ca2+ signal triggered by high viscous loads and hypotonic stimuli. One of the main CBF activators, adenosine-5'-triphosphate (ATP), triggers both Ca2+ release from intracellular Ca2+ stores and Ca2+ entry. Interestingly, TRPV4 contributes to ATP-induced increase in CBF. Furthermore, our work implicates TRPV4 channel exclusively in receptor-operated Ca2+ entry. Collectively, this PhD thesis shows the role of TRPV4 channels coupling physiologically relevant mechanical, hypotonic and chemical stimuli to CBF regulation in motile ciliary epithelia.

The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. Title from PDF of title page (University of Missouri--Columbia, viewed on April 29, 2010). Vita. Thesis advisor: Grace Y. Sun. "May 2008" Includes bibliographical references.