Hialuronidases são responsáveis pela hidrólise de hialuronan, o principal componente da matriz intersticial. Estas enzimas são ubíquas nas peçonhas de serpentes, contudo suas concentrações e características podem variar entre as espécies. Embora estudos indiquem a presença de atividade hialuronidásica na peçonha de Crotalus durissus terrificus e a hialuronidase apresente importante papel no envenenamento local e sistêmico, a enzima ainda não havia sido estudada. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização funcional e estrutural da hialuronidase (CdtHya1) presente na peçonha de serpente Crotalus durissus terrificus. CdtHya1 foi purificada por cromatografia de troca iônica seguida de filtração molecular e interação hidrofóbica (recuperação proteica = 0,23%), consistindo no primeiro estudo de isolamento e caracterização de uma hialuronidase crotálica. Os 44 primeiros aminoácidos do seu N-terminal foram determinados por degradação de Edman e mostraram compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras hialuronidases depositadas em bancos de dados. CdtHya1 é uma glicoproteína e apresentou atividade máxima a 37°C, pH 5,5 e na presença de NaCl 0,2 mol/L. Seu monômero de 64,5 kDa foi estimado por SDS-PAGE sob condições redutoras. A atividade específica da peçonha solúvel foi 145 unidades turbidimétricas reduzidas por miligrama (UTR/mg), contra 5.066 UTR/mg para CdtHya1. A enzima apresentou Kcat de 3.781,0 min-1 sobre hialuronan e em torno de 400 min-1 sobre os sulfatos de condroitina A, B e C, indicando maior atividade sobre hialuronan. Cátions divalentes (Ca2+ e Mg2+) e NaCl 1 mol/L reduzem significativamente a atividade enzimática. A enzima pura (32 UTR/40 ?L) diminuiu o edema provocado pela injeção subplantar de tampão, crotoxina ou fosfolipase A2 (PLA2), aumentando a difusão destes pelos tecidos dos camundongos. CdtHya1 potencializou a ação da crotoxina, como evidenciado pela morte de camundongos até o final do ensaio de edema de pata. A enzima nativa pura foi submetida a ensaios cristalográficos preliminares onde foram obtidos os primeiros cristais, constituindo assim um passo importante para a determinação da primeira estrutura tridimensional de hialuronidase de peçonha de serpente. Este estudo relata o procedimento de purificação da CdtHya1, a primeira hialuronidase isolada de peçonhas crotálicas com alta atividade antiedematogênica. / Hyaluronidases are responsible for hyaluronan hydrolysis, the major component of the interstitial matrix. These enzymes are ubiquitous in snake venoms, however their concentrations and characteristics may vary between species. Although studies indicate the presence of hyaluronidase activity in the Crotalus durissus terrificus venom and hyaluronidase presents important role in local and systemic envenoming, the enzyme has not been studied yet. The objectives of this study focused on the isolation and functional and structural characterization of hyaluronidase (CdtHya1) presents in Crotalus durissus terrificus snake venom. CdtHya1 was purified by ion exchange chromatography followed by molecular filtration and hydrophobic interaction (protein recovery = 0.23%), consisting in the first study on the isolation and characterization of a crotalic hyaluronidase. Its first 44 N-terminal amino acids were determined by Edman degradation and showed to share a high level of sequence identity against other hyaluronidases deposited in data banks. CdtHya1 is a glycoprotein and it showed maximum activity at 37 °C, pH 5.5 and in the presence of 0.2 mol/L NaCl. Its monomer of 64.5 kDa was estimated by SDS-PAGE under reducing conditions. The soluble venom specific activity was 145 turbidity reducing units per milligram (TRU/mg), against 5,066 TRU/mg for CdtHya1. The enzyme showed Kcat of 3,781.0 min-1 on hyaluronan and about 400 min-1 on chondroitin sulphates A, B or C, indicating higher activity on hyaluronan. Divalent cations (Ca2+ and Mg2+) and 1 mol/L NaCl significantly reduce the enzyme activity.The pure enzyme (32 TRU/40 ?L) decreased the edema caused by subplantar injections of buffer, crotoxin or phospholipase A2 (PLA2), increasing their diffusion through mice tissues. CdtHya1 potentiated crotoxin action, as evidenced by mice death by the end of the paw edema assay. The pure native enzyme was subjected to preliminary crystallographic studies where the first crystals were obtained, thus providing an important step in determining the first three-dimensional structure of hyaluronidase snake venom. This study reports the purification procedure of CdtHya1, the first hyaluronidase isolated from crotalic venoms with high antiedematogenic activity.

A caracterização proteômica de venenos de serpentes contribui significativamente para o avanço das Ciências na área Biomédica. Várias destas moléculas, utilizadas como instrumentos de investigação de mecanismos celulares e moleculares, estão envolvidas em diversos processos fisiopatológicos e de intoxicação. No entanto, os venenos de serpentes ainda requerem caracterização funcional e/ou biológica adicionais. As fosfolipases A2s (PLA2s) são enzimas que induzem vários efeitos farmacológicos, e geralmente, correspondem a maior porcentagem do conteúdo protéico dos venenos de serpentes. Desta forma, o isolamento e a caracterização bioquímica, funcional e estrutural de PLA2s poderão gerar informações importantes para o melhor entendimento dos efeitos farmacológicos e de intoxicação ocasionados por estas proteínas. Este trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica, enzimática, funcional e estrutural da primeira PLA2 Asp49 ácida, denominada Bpir-I-PLA2, isolada do veneno da serpente Bothrops pirajai, espécie endêmica da região Sul do Estado da Bahia e atualmente, integrante da Lista Nacional das Espécies da Fauna Brasileira Ameaçadas de Extinção. O isolamento da Bpir-I-PLA2 foi realizada através de dois passos cromatográficos, envolvendo inicialmente cromatografia de troca iônica, seguida de HPLC de fase reversa. Quanto submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida para proteínas ácidas, Bpir-I-PLA2 apresentou alto grau de homogeneidade. A massa molecular relativa, determinada através de eletroforese em gel de poliacrilamida com agente desnaturante, foi de aproximadamente 28.000 para a forma de dímero e 14.500 para o monômero. A focalização isoelétrica demonstrou uma única banda para a fosfolipase A2, revelando pI aproximado de 4,9. A região N-terminal de Bpir-I-PLA2, seqüenciada através do método de degradação de Edman, apresentou elevada homologia entre outras PLA2s de venenos de serpentes. A composição de amioácidos da proteína corroborou com sua característica ácida, apresentando um elevado conteúdo de aminoácidos carregados negativamente. A enzima apresentou elevada atividade fosfolipásica e induziu edema moderado in vivo. Além disso, Bpir-I-PLA2 foi capaz de inibir a agregação plaquetária e a coagulação do plasma, e também induzir efeito hipotensor in vivo e citotóxico sobre células tumorais, bactérias, fungos e leishmanias. O tratamento da enzima com o reagente brometo de p-bromofenacila neutralizou as atividades enzimática, inibitória sobre a agregação plaquetária, anticoagulante, hipotensora e antitumoral. A moderada atividade edematogênica foi parcialmente inibida. O cDNA contendo 366 bp (BPIR-A) que codifica a proteína Bpir-I-PLA2 foi clonado e a proteína recombinante, expressa. Bpir-I-PLA2 recombinante apresentou a mesma sequência de aminoácidos, estrutura secundária, atividade fosfolipásica e efeito inibitório sobre plaquetas, observados para a proteína nativa Bpir-I-PLA2, sugerindo que a recPLA2 foi eficientemente expressa e purificada. Devido à baixa toxicidade demonstrada, a Bpir-I-PLA2 pode tornar-se uma ferramenta importante nos estudos das desordens da coagulação, como também um potencial modelo para a elaboração de novos fármacos para uso na clínica-médica. / The proteomic characterization of snake venoms significantly contributes to science advance in the biomedical area. Several venom toxins are used as instruments for the investigation of cellular and molecular mechanisms, and are involved in a number of physiopathological and intoxication processes. Nevertheless, snake venoms still require further functional and/or biological characterization. Phospholipases A2 (PLA2s) are enzymes that induce several pharmacological effects and usually correspond to the major percentage of snake venom protein contents. Being so, the isolation and characterization of PLA2s could generate important information for the better understanding of the pharmacological and toxic effects caused by these proteins. This work describes the isolation and biochemical, enzymatic and functional characterization of the first acidic Asp49 PLA2 (named Bpir-I-PLA2) from the venom of Bothrops pirajai snake, an endemic species from the south region of state of Bahia and that nowadays is part of the national list of Brazilian fauna species threatened of extinction. The isolation of Bpir-I-PLA2 was carried out by two chromatographic steps, an ion-exchange chromatography followed by reverse phase HPLC. When submitted to polyacrylamide gel electrophoresis for acidic proteins, Bpir-I-PLA2 showed high homogeneity level. The relative molecular mass, determined by polyacrylamide gel electrophoresis with denaturating agent, was of approximately 28,000 for the dimmer and 14,500 for the monomer. With high phospholipase activity and pharmacological effects, characteristic of acidic isoforms, Bpir-I-PLA2 did not present myotoxic activity and showed to be little edematogenic. However, the enzyme acts inhibiting platelet aggregation, delaying plasma clotting time and inducing hypotension, antitumoral effects, antibacteria, antifungal and parasiticide actions. The treatment of the enzyme with the reagent p-bromofenacil brometo neutralized the enzymatic activities, inhibition of aggregation platelet, anticoagulant, hypotensive and antitumoral. The moderate activity edematogenic was inhibited partially. The cDNA (BPIR-A) that codes the protein Bpir-I-PLA2 was cloned and the protein recombinant, expressed. Bpir-I-PLA2 recombinant presented the same sequence of amino acids, structures secondary, phospholipase activity and inhibitory effects on platelet of the native protein, suggesting that recPLA2 was efficiently express and isolated. Due to its low toxicity, Bpir-I-PLA2 could become an important tool in the study of the disorders of the clotting as well as a potential model for the elaboration of new drugs for use in the clinic-doctor.

Os envenenamentos ofídicos constituem um problema relevante de saúde pública em diversas regiões do mundo, particularmente em países da zona tropical e neotropical. A fisiopatologia do acidente ofídico é constituída por uma série de eventos complexos tanto a nível local quanto sistêmico, e o soro antiofídico é o único tratamento utilizado. No entanto, os efeitos tóxicos locais induzidos durante o envenenamento por serpentes, principalmente do gênero Bothrops, não são eficientemente neutralizados pela soroterapia tradicional. Por esta razão, procuram-se alternativas complementares, como as plantas medicinais antiofídicas que são usadas por comunidades que não têm acesso a soroterapia. A flora brasileira possui uma ampla variedade de plantas medicinais com potencial antiofídico, as quais têm sido pouco estudadas cientificamente. Neste estudo foram realizados ensaios in vitro e in vivo de neutralização de peçonhas ofídicas com o extrato aquoso das entrecascas de Anacardium humile (EAAh), e, o isolamento e a caracterização fitoquímica de um inibidor de miotoxinas, o ácido gálico (AG). Para os ensaios de inibição, foram utilizadas soluções contendo peçonha bruta ou toxina isolada misturadas com diferentes quantidades de extrato vegetal que foram previamente incubadas por 30 min a 37°C. Também foi realizada administração do extrato após o envenenamento em diferentes intervalos de tempo para os testes de inibição da miotoxicidade. Observou-se que EAAh tem atividade inibitória sobre os efeitos tóxicos (letalidade, miotoxicidade, e hemorragia) e farmacológicos/enzimáticos (edema, atividade fosfolipásica e coagulante) induzidos pelas peçonhas de serpentes dos gêneros Bothrops, Crotalus, Lachesis e das toxinas isoladas. O extrato vegetal inibiu 100% a letalidade induzida pela peçonha de C. d. terrificus e sua principal neurotoxina, a crotoxina. O EAAh foi submetido a fracionamento cromatográfico analítico, e em condições polares foi possível identificar e isolar o ácido gálico, o qual demonstrou tempo de retenção e espectros de ressonância magnética nucleares similares ao padrão comercial e a dados de literatura deste mesmo composto, respectivamente. O ácido gálico isolado foi capaz de inibir a atividade miotóxica induzida pela peçonha bruta de B. jararacussu e sua principal miotoxina, a bothropstoxina-I, uma PLA2-símile Lys49. A análise dos espectros de dicroísmo circular e os estudos de interação por modelagem molecular sugerem que o ácido gálico forma um complexo com a BthTX-I de B. jararacussu em seu sítio ativo, inibindo sua atividade tóxica. A ligação do ácido gálico com as miotoxinas não modificou nem a forma e nem a intensidade dos espectros de dicroísmo circular, não induzindo alterações significativas na porcentagem dos diversos domínios que constituem a estrutura secundária destas proteínas. O ácido gálico assim como outros taninos, tem revelado-se um bom inibidor das ações tóxicas de peçonhas de serpentes e está relacionado com a ação inibitória do extrato de Anacardium humile. / Ophidian envenomations are a significant problem of public health in several regions of the world, particularly in tropical and neotropical countries. The pathophysiology of snakebite accidents is constituted by a complex series of events both locally and systemically, and the antivenom serum is the only treatment used. However, local toxic effects induced during envenomation by snakes, especially from the genus Bothrops, are not effectively neutralized by the traditional serum therapy. For this reason, additional alternatives are made necessary, such as the use of medicinal plants that are used by communities with no access to serum therapy. The Brazilian flora possesses a wide variety of medicinal plants with antiophidian potential, which have been little-studied scientifically. In the present study, we performed in vitro and in vivo neutralization of snake venoms with the aqueous extract of inner bark of Anacardium humile (EAAh), and the isolation and phytochemical characterization of an inhibitor of myotoxins, the gallic acid (GA). For the inhibition assays, we used solutions containing crude venom or isolated toxin mixed with different amounts of plant extracts that were previously incubated for 30 min at 37°C. Administration of the extract after envenomation was also performed at different time intervals for myotoxicity inhibition assays. It was observed that EAAh has inhibitory activity against the toxic (lethality, myotoxicity and hemorrhage) and pharmacological/enzymatic effects (edema-inducing, coagulant and phospholipase activities) induced by snake venoms of the genera Bothrops, Crotalus, Lachesis and isolated toxins. The plant extract inhibited 100% of the lethality induced by C. d. terrificus venom and its major neurotoxin, crotoxin. The EAAh was subjected to analytical chromatographic separation, and in polar conditions, it was possible to identify and isolate the gallic acid, which showed retention time and nuclear magnetic resonance spectra similar to the commercial standard and to literature data of this same compound, respectively. Gallic acid alone was able to inhibit the myotoxic activity induced by crude venom of B. jararacussu and its main myotoxin, BthTX-I, a Lys49 PLA2-like enzyme. The analysis of circular dichroism spectra and interaction studies by molecular modeling suggest that gallic acid forms a complex with BthTX-I in its active site, which inhibits its toxic activity. The binding of gallic acid to myotoxins did not change neither the form nor the intensity of circular dichroism spectra, not inducing significant changes in the percentage of the various domains that form the secondary structure of these proteins. The gallic acid and other tannins have been showed to be good inhibitors of the toxic effects of snake venoms, and our study showed that this acid is related to the inhibitory action of the Anacardium humile extract.

Os avanços tecnológicos vêm contribuindo cada vez mais nas áreas biológicas e científicas oferecendo ferramentas computacionais e sistemas específicos que em análise de dados in silico fornecem resultados rápidos e confiáveis. O presente projeto propõe o desenvolvimento de um portal na Internet para instalação e utilização de um banco de dados laboratoriais das principais serpentes brasileiras com seus respectivos venenos e antivenenos naturais, e a análise dos dados obtidos em ensaios farmacológicos, e bioquímicos. Utilizando a via de comunicação e interação mais simples atualmente, a Internet permite o compartilhamento de dados entre comunidades de pesquisadores, viabilizando recursos e tempo, além de permitir uma significante interação entre pesquisadores de todo o mundo, principalmente brasileira, na troca de informações e compartilhamento de dados. Dados elementares relacionados às serpentes foram armazenados no banco de dados, bem como as atividades tóxicas, farmacológicas e enzimáticas dos componentes dos venenos, e ainda, as aplicações biotecnológicas dos produtos que podem ser obtidos destes venenos, abrangendo ainda dados clínicos e valores estatísticos dos acidentes ofídicos. Aspectos bioquímicos dos ensaios realizados em laboratório permitiram a construção de uma ferramenta para análise comparativa de estruturas primárias de PLA2s, depositadas em bancos de dados internacionais. Além da interatividade entre pesquisadores, em Fóruns de Discussões, o sistema conta com listas dos principais artigos publicados em periódicos indexados, e devidamente atualizados periodicamente, com revisões bibliográficas. / Technological advances have been contributing, more and more, with biological and scientific areas, offering computational tools and specific systems which in silico data analysis supply reliable and fast results. The present project considers the development of an Internet portal for installation and use of laboratory data base for the main Brazilian serpents, with its respective venom and natural anti-venom, and the analysis of obtained data in pharmacological assays and biochemists. Using the easiest way of communication and interaction, the Internet allows sharing of data and information between communities of researchers around the world, especially for Brazilian researchers, making resources and time possible. Elementary data about serpents have been stored in the data base, as well as toxic, pharmacological and enzymatic activities of venom components, besides biotechnological applications of the products that can be obtained from these venom, enclosing clinical data and statistical values of ophidian accidents. Biochemists aspects of the assays carried through in laboratory allowed the construction of a comparative analysis tool for primary structures of PLA2s, deposited in international data bases. Beyond interactivity between researchers, in discussion forums, the system counts with lists of main articles published in indexed periodic, duly and constantly updated with bibliographical revisions.

O tratamento atual indicado para casos de envenenamentos por peçonhas é a administração intravenosa de antivenenos, produzidos através da hiperimunização de animais. Entretanto, os antivenenos disponíveis podem, algumas vezes, não proteger os pacientes e causar reações de hipersensibilidade. Fosfolipases A2 (PLA2), L-aminoácido oxidases (LAAO), metalo e serinoproteases são os principais componentes de peçonhas ofídicas e contribuem para a neurotoxicidade, hemorragia, hemólise, miotoxicidade, cardiotoxicidade e formação de edemas. Foram empregados ensaios para avaliar as atividades das enzimas presentes na peçonha de serpentes da espécie Lachesis muta rhombeata e aquele para atividade de protease foi otimizado. A tecnologia de Phage display foi empregada para a seleção de fagos-anticorpos capazes de reconhecer a peçonha bruta. Os fagos foram amplificados em Escherichia coli TG1 e usados para infectar E. coli HB2151, a qual produz fragmentos de anticorpos humanos solúveis. Estes foram purificados e utilizados em testes de inibição de alguns dos componentes tóxicos da peçonha. Os testes de atividade para PLA2, protease e Laminoácido oxidase foram padronizados com sucesso e as 3 proteínas mostraram elevada atividade enzimática. Após otimização, a quantidade de peçonha necessária para o ensaio de protease foi reduzida em 25 vezes. A massa molecular de PLA2 foi estimada em 17 kDa e as massas moleculares de proteases foram estimadas em 40, 35 e 24 kDa, através de zimogramas. O método de bio panning foi eficiente para a seleção de fagos-anticorpos contra a peçonha bruta. Diversos fragmentos de anticorpos foram purificados e incubados com a peçonha bruta para testar suas capacidades de neutralização sobre cada enzima. Cinco clones demonstraram-se hábeis em inibir a PLA2 através da inibição da hemólise. O clone 4E inibiu 100% da hemólise durante as duas horas de ensaio quando pré-incubado na proporção 2:1 (scFv:peçonha). Os clones 2C e 4E inibiram 100% durante uma hora quando pré-incubados na proporção 1:1 e os clones 2F e 9F inibiram a hemólise parcialmente. Outros testes serão conduzidos para a seleção de clones capazes de neutralizar as demais enzimas, os quais, juntamente com os clones já selecionados, serão analisados através de ensaios in vivo. Espera-se que eles possam contribuir para a construção de um novo antiveneno capaz de superar algumas das dificuldades associadas às técnicas de imunoterapia convencionais / The current treatment for animal envenoming is the intravenous administration of antivenoms, produced by animal hyperimmunization. Unfortunately, available antivenoms sometimes do not protect patients and may cause hypersensitivity reactions. Phospholipases A2 (PLA2), L-amino acid oxidases, metallo and serine proteases are considered the most important snake venom components and contribute to neurotoxicity, hemorrhage, hemolysis, myotoxicity, edematogeny and cardiotoxicity. Assays for evaluating the enzymes present in Lachesis muta rhombeata venom were developed and the protease one was optimized. Phage display technology was used to select phage antibodies able to recognize the crude venom. Phages were amplified in Escherichia coli TG1 and used to infect E. coli HB2151, which produces human antibody fragments. Inhibition tests aiming the neutralization of some toxic components of the venom were performed using purified antibody fragments. Activity assays for evaluating PLA2, protease and L-aminoacid oxidase were successfully performed and all enzymes showed high activity levels. The molecular mass of PLA2 was estimated in 17 kDa and the molecular mass of proteases were estimated in 40, 35 and 24 kDa, by zymography. After optimizing the conditions for proteolytic assay, it was possible to use 25 times less venom than it was necessary at first. The bio panning method was efficient for selecting specific phage antibodies against the crude venom. Several clones were selected to infect HB2151 and to produce soluble antibody fragments, which were purified and incubated with the venom to test their inhibition capacity over each enzyme. Five clones demonstrated ability to neutralize PLA2 by inhibiting hemolysis. The clone 4E could inhibit 100% of hemolysis for over 2 hours when preincubated at the ratio 2:1 (scFv:venom). Clones 2C and 4E could inhibit 100% for 1 hour when preincubated at the ratio 1:1 and clones 2F e 9F could inhibit partially. Other tests will be performed to select clones able to neutralize other enzymes and, together with the clones already selected, will be evaluated by in vivo experiments. It is expected that they may contribute to the construction of a potential new antivenom able to overcome some of the problems associated with conventional immunotherapy

Os efeitos da MT-I, uma fosfolipase A2 isolada do veneno de Bothrops asper (VBa), foram avaliados em mastócitos (MC) em cultura, quanto à: i) desgranulação e liberação de prostaglandina E2 (PGE2); ii) papel da atividade catalítica na desgranulação; iii) papel da PLD, PLC, cPLA2, iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi, Gαq e do cálcio na desgranulação; iv) expressão gênica de citocinas Th1 e Th2, e v) alterações ultraestruturais em MC. Os resultados mostraram que a MT-I, em concentrações não citotóxicas, causou a desgranulação de MC. Este efeito foi parcialmente dependente da atividade catalítica e dependente da cPLA2, PLC, PLD e PI3K, mas não da iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi e Gαq. O cálcio intra e extracelular (CRAC e LTCC) estão envolvidos neste efeito da MT-I. Ainda, a MT-I induziu a síntese e liberação da PGE2, expressão de genes de citocinas Th1 e Th2, aumento do número de vesículas citoplasmáticas e de endocitose dependente de clatrina. O VBa também causou a desgranulação de MC sugerindo que a MT-I é relevante para este efeito. / The effects of Myotoxin-I (MT-I), a phospholipase A2 (PLA2) from Bothrops asper venom (BaV) in cultured mast cells (MC) were evaluated focusing: i) degranulation and prostaglandin E2 (PGE2) release; ii) role of PLA2 catalytic activity in degranulation; iii) role of PLD and PLC, cPLA2 and iPLA2, PI3K, MAPK, PKC, PTK, ERK1/2, Junk, Gαi and Gαq protein and calcium in degranulation; iv) gene expression of Th1 and Th2 cytokines, and v) MC ultrastructural alterations. Results showed that MT-I, at non-cytotoxic concentrations, caused MC degranulation. This effect was partially dependent on its catalytic activity and dependent on cPLA2, PLC, PLD and PI3K, but not iPLA2, ERK1/2, p38MAPK, PKC, MEK, Junk, Gαi nor Gαq. Both intra and extracellular calcium (CRAC and LTCC) are involved in MT-I-induced degranulation. Furthermore, MT-I induced synthesis and release of PGE2, gene expression of Th1 and Th2 cytokines, increased numbers of cytoplasmic vesicles and clathrin-dependent endocytosis. BaV also caused MC degranulation suggesting that MT-I is relevant for this effect.

Neste estudo foram avaliados os efeitos da subunidade CB (FLA2 isolada do veneno da serpente C. d. terrificus) em células endoteliais quanto: 1) síntese de PGI2 e mecanismos e 2) mecanismos inibitórios sobre moléculas de adesão. Os resultados mostraram que a liberação de PGI2 induzida pela CB depende de COX-1, PGIS, cFLA2, ERK1/2, mas não de COX-2, NF-kB, p38, JNK, iFLA2, receptor IP, AC ou PKA. Em adição, a CB aumentou os níveis de PGIS, mas não de COX-1 ou COX-2. Ainda, a CB inibiu a expressão de ICAM-1 e VCAM-1, mas não de PECAM-1, induzidas pelo LPS. Em relação aos mecanismos da ação inibitória da CB, foi demonstrado que o PPAR-α e -β/δ, IP, AC, PKA e a PGI2 são relevantes para inibição de ICAM-1, mas não de VCAM-1, induzida pelo LPS. Além disso, a CB inibiu a expressão gênica de ICAM-1, VCAM-1, TNF-α e IL-6, induzida pelo LPS. Este estudo evidenciou importantes vias na ação inibitória da FLA2 crotálica, em um evento fundamental da resposta inflamatória e trouxe a melhor compreensão das atividades biológicas desencadeadas por esta FLA2 em células endoteliais. / In this study the effect of CB, a phospholipase A2 (PLA2) isolated from Crotalus durissus terrificus snake venom, in cultured endothelial cells was investigated, with focus on: i) biosynthesis of prostacyclin (PGI2) and related mechanisms, and ii) inhibitory mechanisms on expression of ICAM-1, VCAM-1 and PECAM-1 adhesion molecules. Results showed that COX-1, PGI2 synthase (PGIS), cPLA2, ERK1/2 and MEK1/2, but not COX-2, NF-kB, p38, JNK, iPLA2, IP receptor, cyclase adenylate nor PKA, are involved CB-induced PGI2 biosynthesis. In addition, CB up-regulated PGIS, but not COX-1 nor COX-2 protein levels. Moreover, CB was able to inhibit LPS-induced ICAM-1 and VCAM-1, but not PECAM-1 protein expression. PPAR-α and -β/δ, IP receptor, cyclase adenylate, PKA and PGI2, but not PPAR-γ, are essential for CB-induced inhibition of ICAM-1. Furthermore, CB inhibited LPS-induced gene expression of ICAM-1, VCAM-1, TNF-α and IL-6. Inhibition of these cytokines by CB may be related to down regulation of both VCAM-1 and ICAM-1 seen in endothelial cells incubated with this venom PLA2.

We have carried out structural studies on bovine pancreatic phospholipase A2 (BPLA2) and two proteins involved in molybdenum cofactor (Moco) biosynthesis pathway. In addition, molecular-dynamics simulations and other analyses have been performed to corroborate the findings obtained from the crystal structures. Crystal structures of the three active-site mutants (H48N, D49N and D49K) of BPLA2 were determined to understand the mechanism by which the mutant H48N is able to catalyze the reaction of phospholipid hydrolysis and to see the effect of the loss of Ca 2+ ion in the active site of D49N and D49K mutants. We found that Asp49 could possibly play the role of a general base instead of His48 in the case of the H48N mutant. In the case of D49N and D49K mutants, the active site of the enzyme is perturbed, whereas the overall tertiary structure of these mutants is intact. In addition, a total of 24 invariant water molecules were identified in all of the crystal structures of BPLA2 available in its archive, PDB. Out of these, four water molecules are essential for the catalytic activity, whereas, the remaining water molecules play a role in the stability of the enzyme. In addition, structural studies on two proteins MoaC and MogA involved in Moco biosynthesis pathway have been carried out. For the first time, crystal structure of MoaC bound with GTP molecule has been reported. The gene id TTHA0341, which is mentioned as MoaB in the CMR database, was annotated as MogA based the comparative analysis of sequences and structures (with the present work and the structures available in the literature). The role of N-and C-termini of MoaB and MogA proteins were proposed that these residues might stabilize the substrate and/or product molecule in the active site. In addition, the residues involved in the oligomerization are compared with MD simulations. The molecular docking studies show that MoaB proteins show more preference to GTP than ATP. The comparison of the two active (MPT and AMP-binding) sites revealed that MPT-binding site is preferred over AMP-binding site for nucleotide binding.

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carregari_VictorCorasolla_D.pdf: 3134117 bytes, checksum: 3177d146a01c9214975aac2e9aebd929 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os venenos de serpentes são uma mistura complexa de moléculas funcionais sendo em sua maior parte proteínas. Para a perpetuação da espécie, e sendo selecionadas a partir do processo de seleção natural, as serpentes apresentam uma alta variabilidade de mutações gênicas responsáveis por expressar proteínas e componentes dos venenos ocorrendo um processo denominado de microevolução, com isso criou diversas toxinas com uma alta complexidade funcional e uma alta similaridade estrutural. Essas toxinas são responsáveis por uma grande variedade de efeitos farmacológicos que geram alterações fisiológicas e com isso imobilizando a presa (neurotoxicidade e miotoxicidade) impedindo a fuga do local de ataque, tendo componentes nos venenos que também iniciam a digestão da presa facilitando a alimentação da serpente. Estas toxinas têm sido utilizadas como ferramentas moleculares para uma melhor compreensão de processos fisiológicos. Através da identificação de modificações químicas em aminoácidos específicos e sequenciamento de "de novo" através de espectrometria de massas de PLA2s isoladas a partir do veneno de serpentes, foi possível correlacionar estrutura e função destas enzimas e elucidar certos mecanismos de ações farmacológicas específicas. As modificações químicas através dos reagentes p-BPB e AA da Bbil-TX foram identificadas e confirmadas por espectrometria de massas, apresentando um alto grau de eficiência e especificidade dos reagentes por aminoácidos específicos (lisina para o AA e histidina para o p-BPB). Após três etapas de purificação de uma nova PLA2 K49 isolada do veneno de Bothriopsis taeniata, denominada Btt-TX, esta foi submetida a duas diferentes enzimas de clivagem (tripsina e Lys-C) e os peptídeos gerados aplicados a um sistema de LC MS/MS aplicando-se diferentes métodos de fragmentação dos peptídeos digeridos como CID/HCD/ETD, com isso foi possível obter uma variedade de padrões complementares dos peptídeos fragmentados, sendo feito o sequenciamento "de novo" automático através da sobreposição dos peptídeos gerados pela combinação destas diferentes metodologias, permitindo obter 100% de cobertura da sequencia de aminoácidos. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal / Abstract: The snake venoms are a complex mixture of functional molecules and in the most part of proteins. For the preservation of the species and suffering a natural selection process, the snakes show high genic variability responsible for the protein expressions and compounds present in the venom, occurring an microevolution process, in this way several toxins with a high functional complexity and structural similarity was created. These toxins are responsible for various pharmacological effects that produces many physiological disturbs (neurotoxicity and myotoxicity) which immobilize the prey keeping near from the local of the attack and having some venom components that start the digestion of the prey. Toxins are often used as a molecular tool to get a better comprehension of physiological process. Through identification of chemical modifications in specific amino acids and make a "de novo" sequence by mass spectrometry on isolated PLA2s from snake venom correlating function and structure of these enzymes trying to elucidate some specific pharmacological actions. All the chemical modification at the Bbil-TX by the reagents p-BPB and AA was identified and proved by mass spectrometry, showing a high level of efficacy and specificity of the reagents from specific amino acids (lysine for the AA and histidine for the p-BPB). After the purification of a new PLA2 K49 isolated from the Bothriopsis taeniata snake venom, called Btt-TX, submitting it to two different cleavage enzymes (trypsin and Lyc-C) and the generated peptides injected to an LC MS/MS system. Applying different fragmentation mode, such as, CID/HCD/ETD, it was possible obtain a variety of additional and complementary patterns of fragmented peptides. With the obtained data we did the "de novo" automatic sequence through the overlapping of the generated peptides from all the fragmentation methods, allowing to have 100%. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal. Our structure/function studies showed that the C-terminal region and the presence of the highly hydrophobic amino acid residues as well as the lisines presence are responsible for the anchorage and disrupt membrane, promoting the myotoxic effetc. The N-terminal loss in the Btt-TX, prove the importance of this region in anchoring with the cell membrane and increasing interaction with amino acids of these PLA2s, allowing a better interaction with the lisines increasing the penetration efficiency of the hydrophobic amino acids on C-terminal region / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus e seus componentes desencadeiam importantes efeitos biológicos que envolvem direta e/ou indiretamente, componentes do sistema circulatório. Contudo, não há estudos específicos na literatura sobre os efeitos do veneno crotálico ou de suas toxinas, em células endoteliais. As células endoteliais constituem a camada de revestimento interna dos vasos sanguíneos, denominada endotélio. Este tecido é metabolicamente ativo, com função protetora do sistema cardiovascular e desempenha papel central na regulação da função circulatória, através do controle da coagulação, permeabilidade e do tônus vascular. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt), do seu componente majoritário, a crotoxina (CTX) e de suas subunidades, fosfolipase A2 (CB) e crotapotina (CA), sobre células endoteliais, em cultura, quanto à: i) viabilidade e proliferação celular; ii) integridade das monocamadas; iii) produção de óxido nítrico, de prostaciclina e mecanismos envolvidos neste efeito. Os resultados obtidos demonstram que o veneno de Crotalus durissus terrificus afetou a viabilidade e a integridade de células endoteliais em cultura, de modo tempo-dependente e apenas na maior concentração, sugerindo sua baixa toxicidade sobre as células endoteliais. A subunidade CB, mas não a CTX nem a crotapotina, reproduziu os efeitos causados pelo VCdt. Em concentrações não citotóxicas, tanto o veneno quanto as toxinas não alteraram a proliferação celular nem a produção basal de óxido nítrico pelas células endoteliais. Por outro lado, o veneno e a subunidade CB, mas não a CTX nem a CA causaram aumento significativo da produção de prostaciclina, via COX-1 e COX-2, sendo que a expressão protéica da isoforma COX-2 foi induzida por estes agentes. Além disso, foi demonstrado que a fosfolipase citosólica é relevante para o aumento da produção de prostaciclina, induzido pela CB. Adicionalmente, foi demonstrado que a atividade catalítica da subunidade CB é essencial para os efeitos descritos. Isto reforça a sugestão de que a subunidade fosfolipásica, isoladamente, possa contribuir para os efeitos do veneno total no endotélio. Nesse sentido, se houver alguma fração desta enzima na sua forma livre, no veneno total, sugere-se que ela contribua, de modo significativo, para os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus no endotélio. / Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) and their components induces systemic effects, which interfere with blood vessel system. Endothelial cells (EC) are central elements for haemostasis, regulating blood vessel-wall permeability, blood fluidity and adhesion properties of circulating leukocytes. However, there is no available data on the effects of this venom and its components on endothelial cells. In this study, the effects of CdtV, crotoxin (CTX) which is formed by two distinct subunits named crotapotin (CA) and phospholipase A2 (CB), on endothelial cells in vitro were investigated, analyzing EC viability and proliferation, EC monolayers integrity, release of both nitric oxide and prostacyclin (PGI2). CdtV, at the highest concentration, time-dependently decreased the viability of EC and the integrity of cell monolayers. The CB subunit, but not CTX nor CA, reproduced the effects caused by crude venom. In contrast, neither EC proliferation nor release of oxide nitric were affected by non-cytotoxic concentrations of CdtV or isolated toxins. However, at the same experimental condition, both CdtV and CB increased the prostacyclin release by endothelium through activation of COX-1 and -2 enzyme systems. Moreover, these toxins upregulated protein expression of COX-2 isoform, but did not alter constitutive expression of COX-1. On the other hand, neither CTX nor CA affected basal production of PGI2. Inhibition of cytosolic PLA2 (cPLA2) by AACOCF3 significantly reduced PGI2 increments caused by both CdtV and CB implying that cPLA2 cooperates for the synthesis of PGI2 induced by them. Inhibition of the catalytic activity of CB abrogated its ability to induce the release of PGI2, thus suggesting the importance of the phospholipase A2 enzyme activity for this effect. These findings provide evidence that CdtV and CB can directly activate EC and up-regulate cyclooxygenase pathways for production of prostacyclin, an important mediator of vasodilation and inflammation. Moreover, CB through its catalytic activity may significantly contribute for the stimulatory effect of CdtV in EC. Therefore, these findings indicate novel regulatory mechanisms for both CdtV and venom secretory PLA2 in endothelial cells.