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Prostaglandin E2, postulated to be immunosuppressive to the tumor bearing host, is produced and excreted in elevated quantities by many tumors. Arachidonic acid, the precursor molecule for PGE2, is released from membrane phospholipids by phospholipase A2. Phospholipase A2 has been proposed as the rate limiting enzyme in the production of prostaglandin E2.Phospholipase A2 from different sources varies in substrate specificities, pH optima, and Ca ++ concentration requirements. Therefore, the determination of its specific activity depends on the development of appropriate incubation, extraction, and identification methodologies.This study attempted to develop methodologies for determination of PLA2 activity using enzymes from snake venom, mouse liver, and normal and tumored mouse mammarytissue. The method of substrate preparation, kind of substrate, amount of protein, length of incubation, and addition of KC1 and deoxycholate were varied. Reaction products were extracted and isolated with hexame, and methylated with diazomethane. The methyl esters were identified by gas liquid chromatography. Quantitative analyses were based on proportionality of experimental peak areas to internal standard peak area.Activity could not be demonstrated with snake venom or liver PLA2 preparations. Low specific activity was obtained in some tumor and normal mammary tissue extracts. These studies will be used as a basis for developing an optimal assay system for PLA2 from normal and tumored mouse mammary tissue.

Univ., Diss.--Münster, 2004.

Thesis (Ph. D.)--University of Texas at Austin, 1998. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 195-227). Available also in a digital version from Dissertation Abstracts.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2006. / Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 156 p. : ill. (some col.). Includes abstract. Includes bibliographical references.

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Although cell membranes normally resist the hydrolysis of secretory phospholipase A2, a series of current investigations demonstrated that the changes in lipid order caused by increased calcium has a relationship with the susceptibility to phospholipase A2. To further explore this relationship, we setup ordinary differential equations models, statistic models and stochastic models to compare the response of human erythrocytes to the hydrolyzing action of secretory phospholipase A2 and the relationship between the susceptibility of hydrolysis and the physical properties of secretory phospholipase A2. Furthermore, we use models to determine the ability of calcium ionophore to increased membrane susceptibility.

L’arthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune systémique affectant près de 1% de la population mondiale. L’inflammation articulaire est caractérisée par une infiltration leucocytaire majoritaire de neutrophiles, la formation d’un pannus et la destruction du cartilage et de l’os. De nombreux acteurs cellulaires et moléculaires dont les plaquettes et leurs microparticules (MPs) ainsi que la phospholipase A2 sécrétée de type IIA (sPLA2-IIA) contribuent à cette pathologie. Récemment, nous avons mis en évidence que les plaquettes activées libèrent certes des MPs mais aussi des mitochondries libres que nous avons appelées freeMitos. Les MPs et les freeMitos sont détectées dans les fluides synoviaux de patients arthritiques. Au cours de nos recherches, nos résultats indiquent que la sPLA2-IIA hydrolyse les phospholipides membranaires des MPs et des freeMitos. Elle libère des lysophospholipides et des acides gras, dont l’acide arachidonique (AA). L’ADN mitochondrial est aussi relâché à la suite de l’hydrolyse des freeMitos par la sPLA2-IIA. Ces différents produits induisent la libération de leucotriènes et de cytokines pro-inflammatoires ainsi que la formation de neutrophil extracellular trap (NET) par les neutrophiles. La sPLA2-IIA cible aussi les MPs qui sont riches en enzymes du métabolisme de l’acide arachidonique (AA). Cet AA est majoritairement métabolisé en 12-Hydroxyeicosatetraenoic acide (12-HETE) par la 12-lipoxygénase (12-LO) des MPs. Le 12(S)-HETE issue de l’action concertée de la sPLA2-IIA et la 12-LO, induit l’internalisation des MPs par les neutrophiles in vitro et in vivo. Les MPs transfèrent leur cargaison en facteurs de transcription, en acides nucléiques et en mitochondries aux neutrophiles. Les MPs modulent le transcriptome et les fonctions du neutrophile. Les MPs et les produits d’hydrolyse par la sPLA2-IIA induisent une augmentation de la génération de leucotriènes, la formation de NETs et une résistance à l’apoptose. Ces deux enzymes sont aussi impliqués dans la sévérité de l’arthrite inflammatoire murine. En somme, nos études apportent une meilleure connaissance sur le contenu des MPs de plaquette. Un mécanisme finement régulé, d’internalisation des MPs par les neutrophiles, a été mis en évidence. / Rheumatoid arthritis is a systemic autoimmune disease affecting 1% of the world population. This pathology is characterized by a symmetric articular achievement where takes place a synovial hyperplasia accompanied with an infiltration of leukocytes, mainly neutrophils, and a destruction of cartilage and bone. Several cellular and molecular actors including platelets, platelet microparticles (MPs) and the secreted phospholipase A2 group IIA (sPLA2-IIA) contribute to this pathology. Recently, we highlighted that activated platelets produce also extracellular mitochondria (freeMitos) which we detected in the synovial fluids from arthritic patients. In our research, our results indicate that sPLA2-IIA hydrolyzes membrane phosopholipids of freeMitos and MPs, releasing lysophospholipids and arachidonic acid (AA). Mitochondrial DNA is also liberated after sPLA2-IIA hydrolysis. These products induce leukotrienes production, proinflammatory cytokine release and neutrophil extracellular trap (NET) formation by neutrophils. sPLA2-IIA also targets MPs that contain enzyme involved in AA metabolism. AA is mainly metabolized in 12-Hydroxyeicosatetraenoic acid (12-HETE) by 12-lipoxygenase (12-LO) from MPs. It induces MP internalization in the human and murin neutrophils. MPs transfer their elaborated cargo, rich in transcription factors, nucleic acids and mitochondria, to neutrophils. MPs modulate transcriptome and functions of neutrophils. MPs and the products of hydrolysis by sPLA2-IIA, induce increase of leukotrienes production, NET release and apoptosis resistance. 12-LO and sPLA2-IIA are involved in inflammatory murine arthritis severity. Our work brings a better knowledge on the content of the platelet MPs. It highlights a tightly regulated mechanism implicated in MP internalization in neutrophils.

L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est constitué d'une monocouche de cellules tapissant le fond de l'oeil et est localisée de façon apicale par rapport à la rétine neurale. Outre ses fonctions au niveau du cycle visuel, PEPR permet aussi la phagocytose des segments externes des bâtonnets (SEB) et la production de phagosomes. L'EPR digère ces phagosomes à l'aide d'enzymes telles les phospholipases A₂ (PLA₂) et recycle certaines de ses composantes tels les acides gras polyinsaturés (AGPI). Fait notable, plus de 60% des acides gras des phospholipides des SEB sont polyinsaturés. Ces membranes sont donc très susceptibles à l'oxydation. Il a déjà été démontré dans notre laboratoire que PEPR exprime une PLA₂ gamma cytosolique (cPLA₂ gamma). La spécificité et l'activité constitutive de cette PLA₂ suggèrent qu'elle pourrait participer au recyclage des AGPI. Les objectifs poursuivis dans cette partie de la thèse étaient de surexprimer, de purifier la cPLA₂ gamma et de caractériser ses propriétés enzymatiques et de liaison avec des modèles membranaires. Au niveau des interactions membranaires, nous avons d'une part démontré que la cPLA2-gamma recombinante était active, hydrolysant le L-DPPC en monocouche ainsi que le PAPC en vésicules (résultats non-montrés). Il s'agit selon nous de la première fois où une cPLA2-gamma recombinante issue d'un système prokaryote, dépourvue des modifications postraductionnelles associées à celle produite à partir du système eukaryote, notamment la farnésylation de son extrémité C-terminale et de nombreux sites potentiels de palmitoylation et d'un site de myristoylation (Tucker et al., 2005), était démontrée active. La vision chez les vertébrés commence avec l'absorption de lumière par les pigments visuels dans les cellules des photorécepteurs. Les pigments visuels, ou opsines, sont des récepteurs à sept hélices transmembranaires couplés aux protéines G localisés dans la membrane des disques des segments externes des bâtonnets et des cônes. Dans l'obscurité, le chromophore sensible à la lumière, le 11 cis retinal, est lié de manière covalente à l'opsine via un lien de base de Schiff à un résidu de lysine spécifique localisé au centre de la septième hélice alpha transmembranaire. La stimulation lumineuse a pour résultat Pisomérisation du 11-cis rétinal en tout-trans rétinal, ce qui cause un changement dans la conformation de la rhodopsine. La métarhodopsine II photoactivée résultante réagit avec la protéine G, appelée transducine, et déclenche la cascade de phototransduction qui mène à u l'hyperpolarisation des photorécepteurs et, finalement, à l'inhibition du relargage de neurotransmetteur au niveau de la terminaison synaptique. Après isomérisation du 11-cis-rétinal à la configuration tout-trans, la base de Schiff est hydrolysée et le chromophore photolyse se détache de l'opsine. Le tout-trans rétinal est alors réduit en tout-trans rétinol par une rétinol dehydrogenase (RDH) localisée dans la membrane discale des segments externes des photorécepteurs (Blaner et al, 1980; Nicotra et Livrea, 1982; Ishiguro et al, 1991; Palczewski et al, 1994). Les enzymes spécifiques responsables de cette réaction sont la RDH8 et la RDH 12 (Molday et al., 2009; Rattner et al., 2000; Maeda et al., 2006, Maeda et al. 2009). Six RDHs distinctes exprimées dans les photorécepteurs ont été récemment clonées. Leurs fonctions, in vivo, demeurent inconnues, mais elles ont toutes démontré leur capacité à réduire le tout-trans rétinal in vitro (Kasus-Jacobi et al. 2006). Plusieurs évidences suggèrent que cette réduction du tout-trans rétinal dans les cellules des photorécepteurs est cruciale pour le maintien du caractère fonctionnel et de l'intégrité structurale de la rétine. Cette réaction est la première étape d'une voie métabolique appelée le cycle visuel, lequel est essentiel pour une phototransduction soutenue. Cette voie intervient au niveau des photorécepteurs et de l'épithélium de pigment rétinien (EPR) et permet de recycler le tout-trans rétinal en 11-cis rétinal. Quand le tout-trans rétinol issu de la réduction du tout-trans rétinal est produit dans les photorécepteurs, il est transporté dans PEPR où il est estérifié par la lécithine rétinol acyl transferase (LRAT) et est emmagasiné sous forme de tout-trans rétinyl ester. Le tout-trans-rétinol peut aussi être acheminé à PEPR par la vascularisation choroïdienne, entrant dans PEPR via un processus récepteur-dépendant impliquant un complexe de protéine/transthyretin - protéine sérique liant le rétinol (SRBP) (Malpeli et al., 1996). Les rétinyl esters emmagasinés dans PEPR constituent le substrat pour Pisomérohydrolase (IMH), aussi appelée RPE65, une enzyme dont le rôle proposé serait de catalyser l'hydrolyse concertée du tout-trans rétinyl ester et l'isomérisation en 11-cis rétinol. L'oxydation du 11 cis-rétinol en 11-cis rétinal par la 11 cis rétinol dehydrogenase (RDH5) et/ou la RDH11 dans PEPR complète le cycle visuel. Le 11-cis rétinal est ensuite réacheminé vers les photorécepteurs où il se combine avec l'opsine pour régénérer la rhodopsine photosensible. La première étape du cycle visuel est importante parce qu'elle produit du tout-trans rétinol, utilisé pour approvisionner PEPR en Ill rétinyl ester. U ne s'agit cependant pas de Punique source de tout-trans-rétinol puisque celui en circulation dans l'organisme peut également être utilisé de façon alternative. À ce jour, on connaît encore peu de choses sur ces enzymes. Il est connu que des mutations de la RDH5 sont associées avec la maladie récessive rare fundus albipunctatus, alors que des mutations de la RDH 12 causent l'amaurose congénitale de Leber. Cependant le rôle physiologique exact de plusieurs autres isozymes de la RDH et de leur implication possible dans des pathologies de l'oeil demeurent toujours inconnus jusqu'à maintenant. L'objectif de ces travaux consistait à surexprimer et purifier la RDH 11 et une forme tronquée (N-delRDHll) pour ensuite mesurer ses interactions membranaires et, finalement, déterminer sa structure tridimensionnelle. Lors de cette étude, nous avons obtenu deux versions de la RDH-11, soit une version complète comportant les 318 acides aminés, ainsi qu'une version tronquée comportant une deletion des 26 premiers acides aminés en N-terminal que l'on appelera N-delRDHll tout au long de cette thèse. La version N-delRDHl 1 fut produite par génie moléculaire en raison du très faible niveau d'expression et de solubilité de la version complète de la RDH-11. Les meilleurs essais de purification ont produit une N-delRDHll d'une pureté supérieure à 95% et d'une concentration d'environ 1 mg/ml, ce qui nous a permis de tenter la cristallogénèse de cette protéine, malheureusement sans succès. Nous avons de plus démontré que la N-delRDH 11 surexprimée dans un système prokaryote était active, convertissant rapidement le tout-trans rétinal en rétinol. Or, il s'agit à notre connaissance de la première fois qu'une activité était démontrée pour une protéine issue d'un tel système d'expression. Les mesures effectuées en pression de surface ont permis d'établir comment la présence du segment N-terminal, sans être le seul élément nécessaire à la liaison membranaire, venait néanmoins accélérer grandement la cinétique de mobilisation de la protéine du coeur de phase jusqu'à l'interface. Cependant, ce segment N-terminal n'aurait pas d'effet significatif sur la pression d'insertion maximale (PIM) sous une monocouche de DOPE. Par ailleurs, les mesures de PIM avec les lipides comportant deux chaînes grasses 18:1 nous ont également permis de constater des différences significatives entre les différentes têtes polaires des phospholipides testés. / Les PIM les plus élevées ont été obtenues avec le DOPE (~ 44 mN/m) et les plus faibles avec le DOPC (~ 25 mN/m). Quant aux mesures faites en spectroscopic PM-IRRAS, nous avons d'une part confirmé que la N-delRDHll ainsi que la RDH 11 ont une structure secondaire à l'interface air-eau composée d'une proportion importante d'hélices-a, en accord avec les données que nous avions obtenues en solution par dichroïsme circulaire et spectroscopie infrarouge. Le maintien de la structure secondaire de la N-delRDHll à l'interface air-eau démontre également que l'intégrité de la protéine est préservée dans cet environnement. Ces mesures en PM-IRRAS ont de plus révélé un possible changement conformationnel de la N-delRDHll suite à la liaison de son substrat, le tout-trans rétinal, en plus de démontrer que la composition lipidique de la monocouche pouvait avoir un effet direct sur la stabilisation des hélices-a de la protéine.

L'activation des gamétocytes de Plasmodium falciparum par exposition à l'acide xanthurénique à basse température conduit à la sortie de gamètes mâles et femelles matures des érythrocytes de l’hôte, ce qui est essentiel pour la fertilisation et la formation ultérieure de zygotes. Les gamètes possèdent des vésicules cytosoliques contenant une protéine formant des pores connue sous le nom de PfPLP2. Durant la sortie, les vésicules ayant PfPLP2 sont redistribuées du cytoplasme des gamètes à la périphérie. Puis ces vésicules vont sécréter PfPLP2 permettant ainsi la sortie des gamètes par perforation de la membrane érythrocytaire. Dans cette étude, nous avons identifié le rôle d'une phospholipase de type patatine A2 (PfPATPL1) dans la sortie de gamètes de P. falciparum. Nous avons utilisé une approche de génétique inverse pour générer un knock-down conditionnel de PfPATPL1 par fusion à un domaine de déstabilisation (DD). Nous avons modifié l’expression PfPATPL1 dans les gamétocytes de stade V en supprimant le ligand de Shield-1, ce qui nous a permis de constater l’importance de PfPATPL1 durant les différentes étapes de la gamétogenèse, ainsi que dans l'arrondissement des gamétocytes, la sortie des gamètes et l'exflagellation des gamètes mâles. Nous avons également trouvé que PfPATPL1 est nécessaire pour la redistribution des vésicules portant PfPLP2 à la périphérie des gamètes pendant sortie. De plus, nous avons utilisé un inhibiteur connu de la phospholipase du nom de bromure de 4-bromophénacyle (4-BPB) pour étudier l'importance de l'activité de la PLA2 dans la gamétogenèse. Nous avons découvert que le traitement par le 4-BPB entraîne également des anomalies dans l'arrondissement des gamétocytes, inhibe la sortie des gamètes et l'exflagellation des gamètes mâles. Et que ce même traitement au 4-BPB entravait la redistribution des vésicules contenant PfPLP2 à la périphérie des gamètes. Lorsque les moustiques ont été nourris avec des gamétocytes traités au 4-BPB dans un test d'alimentation membranaire standard (SMFA), nous avons observé une diminution significative du taux d'infection des moustiques et une chute drastique de la densité des oocystes et du nombre de moustiques infectés. Ces données suggèrent que PfPATPL1 est important pour le développement des gamètes chez les moustiques et peut constituer une cible prometteuse pour les stratégies d'intervention de transmissivité. / The activation of Plasmodium falciparum gametocytes by exposure to low temperature and xanthurenic acid leads to the egress of mature male and female gametes from host erythrocytes, which is essential for fertilization and subsequent zygote formation. Gametes contain cytosolic vesicles bearing a pore forming protein known as PfPLP2. During egress, PfPLP2 containing vesicles gets redistributed from gamete cytoplasm to periphery. Subsequently, PfPLP2 is secreted from these vesicles leading to perforation of host erythrocyte membrane resulting in gamete egress. In this study, we have identified the role of a patatin-like phospholipase A2 (PfPATPL1) in P. falciparum gamete egress. We have taken a reverse genetics approach to generate a conditional knock down of PfPATPL1 by fusion to a destabilization domain (DD). We have knocked down PfPATPL1 in Stage V gametocytes by removal of Shield-1 ligand and found that PfPATPL1 is required during different steps of gametogenesis including gametocyte rounding up, gamete egress and male gamete exflagellation. We have also found that PfPATPL1 is needed for redistribution of PfPLP2 bearing vesicles to the gamete periphery during egress. Additionally, we have utilized a known inhibitor of phospholipase A2 known as 4- bromophenacyl bromide (4-BPB) to study the importance of PLA2 activity in gametogenesis. We have found that 4-BPB treatment also leads to defects in gametocyte rounding up, inhibits gamete egress and male gamete exflagellation. 4-BPB treatment also hampers the redistribution of PfPLP2 containing vesicles to gamete periphery. When the mosquitoes were fed with 4-BPB treated gametocytes in a standard membrane feeding assay (SMFA), we observed a significant decline in mosquito infection rate and a drastic drop in oocyst density and number of infected mosquitos. These data suggests that PfPATPL1 is important for gamete development in mosquitos and may serve as a promising target for transmmision intervention strategies.