Une approche thérapeutique innovante utilisant l'adjonction d'éléments de numéro atomique élevé à une radiothérapie de basse énergie semble offrir une voie prometteuse pour le traitement des tumeurs cérébrales résistantes. Une telle technique est notamment développée sur la ligne médicale de l'ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) utilisant un rayonnement monochromatique allant de 25 à 90 keV [Adam 2003, Adam 2006]. Des résultats encourageants ont été obtenus en traitant des souris cancéreuses après injection de nanoparticules d'or (AuNP) [Hainfeld 2004]. Cependant, les processus physiques et l'impact biologique issus de la photoactivation de nanoparticules sont encore aujourd'hui mal compris et ne peuvent être expliqués par des calculs de doses macroscopiques [Cho 2005, Zhang 2009]. Le but de ce travail est d'évaluer par simulation Monte Carlo l'augmentation locale de dose en présence de nanoparticules ainsi que les caractéristiques des électrons secondaires produits. Dans un premier temps, des simulations ont été réalisées en utilisant une géométrie cellulaire, de manière à comparer les données simulées aux expérimentations menées à l'ESRF. Des tests de clonogénicité ont été réalisés pour mesurer le taux de radiosensibilité des cellules pour une irradiation de 4 Gy (SER4Gy) en présence de gadolinium, pour différentes énergies d'irradiation (25 keV à 1250 keV). Ces études, expérimentales et numériques, ont permis l'évaluation de l'influence de la localisation du gadolinium au sein de la cellule et la forme de ce dernier (nanoparticules ou agent de contraste). D'autre part, une étude comparative a été menée pour caractériser le comportement d'une nanoparticule sous irradiation à une échelle nanométrique, en fonction de l'énergie de faisceau, du rayon de la nanoparticule et de l'élément lourd (or et gadolinium).

This dissertation thesis focuses on creating tools for the analysis and potential therapeutic intervention in the biological processes regulated by proteolysis. I focus on two important proteolytic enzymes: HIV-1 protease, which is indispensable for the polyprotein processing of the nascent virus and thus for the development of infectious viral particle, and glutamate carboxypeptidase II, a tumor marker and a neuropeptidase from the prostate and central nervous system. Rational design of inhibitors of these therapeutically relevant enzymes serves two purposes: firstly, protease inhibitors were shown to be powerful drugs (HIV protease is in fact the example of successful drug development driven by structural biology). Secondly, and in the context of this thesis perhaps more importantly, inhibitors of medicinally relevant proteases might serve as tools for the elucidation of basic biological questions concerning regulation, timing and spatiotemporal control of such key processes as virus maturation or cancer development. The experimental work described in this thesis summarizes my results in both these areas. Human Immunodeficiency Virus Protease Human immunodeficiency virus (HIV), a causative agent of AIDS, has been estimated to kill close to 40 million people during the past four decades with 1.5...

Une approche thérapeutique innovante utilisant l'adjonction d'éléments de numéro atomique élevé à une radiothérapie de basse énergie semble offrir une voie prometteuse pour le traitement des tumeurs cérébrales résistantes. Une telle technique est notamment développée sur la ligne médicale de l'ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) utilisant un rayonnement monochromatique allant de 25 à 90 keV [Adam 2003, Adam 2006]. Des résultats encourageants ont été obtenus en traitant des souris cancéreuses après injection de nanoparticules d'or (AuNP) [Hainfeld 2004]. Cependant, les processus physiques et l'impact biologique issus de la photoactivation de nanoparticules sont encore aujourd'hui mal compris et ne peuvent être expliqués par des calculs de doses macroscopiques [Cho 2005, Zhang 2009]. Le but de ce travail est d'évaluer par simulation Monte Carlo l'augmentation locale de dose en présence de nanoparticules ainsi que les caractéristiques des électrons secondaires produits. Dans un premier temps, des simulations ont été réalisées en utilisant une géométrie cellulaire, de manière à comparer les données simulées aux expérimentations menées à l'ESRF. Des tests de clonogénicité ont été réalisés pour mesurer le taux de radiosensibilité des cellules pour une irradiation de 4 Gy (SER4Gy) en présence de gadolinium, pour différentes énergies d'irradiation (25 keV à 1250 keV). Ces études, expérimentales et numériques, ont permis l'évaluation de l'influence de la localisation du gadolinium au sein de la cellule et la forme de ce dernier (nanoparticules ou agent de contraste). D'autre part, une étude comparative a été menée pour caractériser le comportement d'une nanoparticule sous irradiation à une échelle nanométrique, en fonction de l'énergie de faisceau, du rayon de la nanoparticule et de l'élément lourd (or et gadolinium). / An innovative approach using X-ray interactions with heavy elements seems to open a promising way of treatment for resistant cancers, such as high-grade gliomas. Such a technique is developed at the medical beam line of ESRF using monochromatic X-rays in the 25-90 keV range for the treatment of brain tumors [Adam 2003, Adam 2006]. The use of gold nanoparticles (AuNP) to treat mice bearing subcutaneous tumors led to encouraging results [Hainfeld 2004]. However, the physical processes and biological impact of the photon activation of nanoparticles are not yet well understood. The experimental results cannot be explained by macroscopic dose calculations [Cho 2005, Zhang 2009]. The aim of this work was to evaluate, at the sub-cellular level, the dose enhancement in presence of nanoparticles and the properties of the secondary electrons production using Monte Carlo simulations. In a first step, simulations were performed using cell geometry, in order to compare the simulated data to the experiments realized on the ID17 beamline of ESRF. Clonogenic assays have been performed on F98 cells to measure the “Sensitizer Enhancement Ratio” for an irradiation of 4 Gy (SER4Gy) in the presence of gadolinium, for several beam energies (25 to 80 keV). These experimental and numerical studies were done to evaluate the influence of the gadolinium location within the cell and its shape (nanoparticles or contrast agent). On the other hand, a comparative study has been performed to evaluate the behavior of a nanoparticle under irradiation at a nanometer scale. Electron spectra have been studied for two heavy elements - gold and gadolinium - and several beam energies from 25 keV to 2 MeV. Experiments have shown that gadolinium nanoparticles (GdNP) incubated during 5 h with the cells were strongly effective compared to non-incubated nanoparticles and contrast agent, for the same concentration of gadolinium. A part of radiosensitivity could possibly be explained by a biological action of GdNP on the cell cycle. Another part could be attributed to the important dose enhancement factor (DEF) calculated in the vicinity of GdNP, highlighted from two-dimension DEF maps. The DEF can reach two orders of magnitude within a few nanometers of the GdNP surface and is mainly due to high-linear energy transfer electrons (< 5 keV). By modeling the case of nanoparticles randomly distributed on the cell membrane (closest to the experimental case), we showed that a good correlation exists between the SER4Gy and the membrane DEF. On the other hand, the comparison of the two elements showed that GdNP could produce more electrons (of lower energy) than AuNP (with same mass), but that the local DEF due to AuNP was more important. Interesting results were obtained by comparing the local DEF with experimental results on plasmid DNA. However, it seems important to carry on these studies by taking into account the post-irradiation chemical processes in modeling.

Le traitement des gliomes de haut grade constitue aujourd'hui encore un réel enjeu médical. Les techniques actuellement disponibles sont principalement palliatives et permettent d'augmenter la survie des patients de quelques mois seulement. Une technique innovante de radiothérapie consiste à renforcer la dose déposée dans la tumeur grâce à l'injection d'atomes lourds de manière spécifique dans celle-ci au préalable d'une irradiation de photons de basse énergie (50-100 keV). Cette technique a fait l'objet d'essais précliniques et maintenant d'essais cliniques de phases I et II sur la ligne médicale du synchrotron Européen dont le rayonnement monochromatique et intense est particulièrement adapté pour l'application. L'utilisation d'un agent de contraste (AC) iodé (Z=53) injecté par voie veineuse permet d'améliorer le bénéfice de la radiothérapie mais n'est cependant pas suffisante pour l'élimination complète de la tumeur. En effet, l'accumulation passive d'atomes lourds dans la tumeur n'est pas assez importante et le caractère extracellulaire d'un AC ne maximise pas l'efficacité biologique de l'irradiation. Les nanoparticules (NPs) métalliques apparaissent comme un moyen efficace pour repousser ces limites. Dans le cadre de cette thèse, des études ont été conduites sur la lignée cellulaire de gliome F98 afin de caractériser la toxicité et l'internalisation de trois types de nanoparticules différents : nanoparticules de gadolinium (GdNPs 3 nm), d'or (AuNPs 13 nm) et de platine (PtNPs 6 nm). La survie cellulaire a également été évaluée après différentes conditions d'irradiation de photons monochromatiques en présence de ces nano-objets. La dépendance de la réponse cellulaire à l'énergie du rayonnement incident ainsi qu'à la distribution subcellulaire des NPs a permis de mettre en évidence plusieurs mécanismes mis en jeu dans ce traitement. A concentration identique, les NPs diminuent la survie cellulaire de manière plus importante qu'un AC, validant ainsi l'intérêt microdosimétrique des NPs. L'effet est préférentiel à basse énergie (keV) indiquant que la photoactivation des atomes lourds est en partie responsable la réponse cellulaire. Par ailleurs, les GdNPs et les PtNPs se sont aussi montrées efficaces pour diminuer la survie cellulaire en combinaison à une irradiation à haute énergie (1.25 MeV) indiquant qu'un mécanisme de radiosensibilisation différent de la photoactivation intervient également. Les études précliniques, ont montré que le recouvrement complet de la tumeur par les NPs constitue un point clé pour garantir le bénéfice thérapeutique du traitement. Dans cette optique, une méthode de tomographie à deux énergies développée au synchrotron, a été caractérisée dans le cadre de ce travail. L'étude a permis d'imager de manière quantitative et simultanée la tumeur (mise en évidence par un AC iodé) et son recouvrement par des GdNPs (injectées par voie directe) chez le rongeur porteur d'un gliome. La correspondance entre la distribution de l'AC et la tumeur a également été étudiée à l'aide de techniques d'imagerie à haute résolution (IRM, tomographie X par contraste de phase et histologie).

Influenza A Viren besitzen ein segmentiertes, einzelsträngiges RNA-Genom, welches in Form viraler Ribonukleoprotein (vRNP)-Komplexe verpackt ist. Während das virale Genom im Zellkern repliziert wird, finden Assemblierung und Knospung reifer Viruspartikel an der apikalen Plasmamembran statt. Für die Virusbildung müssen die einzelnen viralen Komponenten hierher gebracht werden. Während intrinsische apikale Signale der viralen Transmembranproteine bekannt sind, sind der zielgerichtete Transport und der Einbau des viralen Genoms in neuentstehende Virionen noch wenig verstanden. In dieser Arbeit wurden potentielle Mechanismen des vRNP-Transportes untersucht, wie die Fähigkeit der vRNPs mit Lipidmembranen zu assoziieren und die intrinsische subzellulären Lokalisation des viralen Nukleoproteins (NP), eines Hauptbestandteils der vRNPs. Es konnte gezeigt werden, dass vRNPs nicht mit Lipidmembranen assoziieren, was mittels Flotation aufgereinigter vRNPs mit Liposomen unterschiedlicher Zusammensetzung untersucht wurde. Die Ergebnisse deuten jedoch darauf hin, dass das virale M1 in der Lage ist, Bindung von vRNPs an negativ-geladene Lipidmembranen zu vermitteln. Subzelluläre Lokalisation von NP wurde des Weiteren durch Expression fluoreszierender NP-Fusionsproteine und Fluoreszenzphotoaktivierung untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass NP allein nicht mit zytoplasmatischen Strukturen assoziiert, stattdessen aber umfangreiche Interaktionen im Zellkern eingeht und mit hoher Affinität mit bestimmten Kerndomänen assoziiert, und zwar den Nukleoli sowie kleinen Kerndomänen, welche häufig in der Nähe von Cajal-Körperchen und PML-Körperchen zu finden waren. Schließlich wurde ein experimenteller Ansatz etabliert, welcher erlaubt, den Transport vRNP-ähnlicher Komplexe mittels Fluoreszenzdetektion aufzuzeichnen und Einzelpartikelverfolgungsanalysen durchzuführen. Unterschiedliche Phasen des vRNP-Transportes konnten beobachtet werden und ein 3-Phasen-Transportmodell wird skizziert. / Influenza A viruses have a segmented single-stranded RNA genome, which is packed in form of viral ribonucleoprotein (vRNP) complexes. While the viral genome is replicated and transcribed in the host cell nucleus, assembly and budding of mature virus particles take place at the apical plasma membrane. Efficient virus formation requires delivery of all viral components to this site. While intrinsic apical targeting signals of the viral transmembrane proteins have been identified, it still remains poorly understood how the viral genome is transported and targeted into progeny virus particles. In this study, potential targeting mechanisms were investigated like the ability of vRNPs to associate with lipid membranes and the intrinsic ability of the viral nucleoprotein (NP) – which is the major protein component of vRNPs – for subcellular targeting. It could be shown that vRNPs are not able to associate with model membranes in vitro, which was demonstrated by flotation of purified vRNPs with liposomes of different lipid compositions. Results indicated, however, that the matrix protein M1 can mediate binding of vRNPs to negatively charged lipid bilayers. Intrinsic subcellular targeting of NP was further investigated by expression of fluorescent NP fusion protein and fluorescence photoactivation, revealing that NP by itself does not target cytoplasmic structures. It was found to interact extensively with the nuclear compartment instead and to target specific nuclear domains with high affinity, in particular nucleoli and small interchromatin domains that frequently localized in close proximity to Cajal bodies and PML bodies. An experimental approach was finally established that allowed monitoring the transport of vRNP-like complexes in living infected cells by fluorescence detection. It was possible to perform single particle tracking and to describe different stages of vRNP transport between the nucleus and the plasma membrane. A model of three-stage transport is suggested.

Les tumeurs intracrâniennes font partie des pathologies les plus fréquentes en neurologie après les accidents vasculaires cérébraux et les démences. On estime leur incidence à 10 nouveaux cas par an pour 100000 personnes. Les glioblastomes en sont la forme la plus virulente et malgré les avancées médicales des dernières années leur pronostic demeure très pessimiste. En effet, la médiane de survie est de l'ordre de 12 mois et le taux de survie à 5 ans est seulement de 2%.<br />L'un des enjeux actuels de la recherche en neuro-oncologie est de mettre au point de nouveaux traitements à visée curative. C'est le cas de la thérapie de photoactivation du platine par irradiation synchrotron (PAT-Plat), technique qui a été développée au cours des dernières années et qui a montré des effets curatifs chez des rats porteurs du gliome F98.<br />Dans ce travail de thèse, nous avons cherché à mieux caractériser les effets de la PAT-Plat et de ses différentes modalités (chimiothérapie à base de cisplatine et radiothérapie synchrotron) sur les tissus et la vascularisation cérébrale saine ainsi que sur le gliome F98. La microscopie biphotonique intravitale a été utilisée comme méthode d'observation et notre étude a donné lieu au développement de plusieurs méthodes (observation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BHE), imagerie de la vascularisation tumorale, marquage des astrocytes et des fibres élastiques en intravital).<br />Nous avons ainsi démontré qu'une irradiation synchrotron (15Gy/79keV) n'entraînait pas d'effets secondaires à court terme (rupture de la BHE, diminution de la perfusion, gliose, ...) dans le cortex pariétal de souris nude. Nous avons également mis en évidence qu'un effet de synergie entre le cisplatine et l'irradiation était à l'origine des effets spectaculaires de la PAT-Plat. Enfin, nous avons souligné qu'outre son action sur les cellules tumorales, la thérapie entraînait une diminution de la perfusion des vaisseaux angiogéniques.

Visual pigments are light sensitive receptors in the eye that form the basis of sensory visual transduction. This thesis presents three studies that explore visual pigment proteins in vertebrates using a number of computational and experimental methods in an evolutionary framework. The objective is not only to identify, but also to experimentally investigate the functional consequences of genetic variation in vertebrate visual pigments. The focus is on great bowerbirds (Chlamydera nuchalis), which are a model system in visual ecology due to their spectacular behaviour of building and decorating courtship bowers. There are 4 chapters: Chapter 1 introduces background information on visual pigments and vision in birds. Among visual pigment types, the short-wavelength-sensitive (SWS1) pigments have garnered particular interest due to the broad spectral range among vertebrates and the importance of UV signals in communication. Chapter 2 investigates the evolutionary history of SWS1 in vertebrates with a view toward its utility as a phylogenetic marker. Chapter 3 investigates SWS1 evolution and short-wavelength vision in birds, with particular focus on C. nuchalis and its SWS1. The evolution of spectral tuning mechanisms mediating UV/violet vision in passerines and parrots is elucidated in this chapter using site-directed mutagenesis, protein expression, and phylogenetic recreation of ancestral opsins. While cone opsins mediate colour vision in bright light, the rhodopsin visual pigment contained in rod photoreceptors is critical for dim light vision. Detailed characterization of rhodopsin function has only been conducted on a few model systems. Chapter 4 examines C. nuchalis RH1 using a number of functional assays in addition to absorbance spectra, including hydroxylamine sensitivity and the rate of retinal release. This chapter includes an investigation into the role of amino acid mutations typical of dim-light adapted vertebrates, D83N and A292S, in regulating functional properties of bovine and avian RH1s using site-directed mutagenesis. Together these chapters describe naturally occurring mutations in visual pigments and explore the way they can influence visual perception. These represent one of the few investigations of visual pigments from a species that is not a model lab organism and form a significant contribution to the field of visual pigment biochemistry and evolution.

Notre équipe de recherche a récemment développé les premiers inhibiteurs d’une enzyme à DDE, la transposase MOS1, une enzyme analogue à l’intégrase du VIH-1. Ces molécules, de type bisfurylmaléimides, ont également montré une efficacité contre les activités enzymatiques de l’intégrase du VIH. En se basant sur ces résultats, nous avons entrepris la synthèse de nouveaux bisfurylmaléimides dans le but d’identifier de nouveaux inhibiteurs de l’intégrase et de proposer de nouvelles molécules dans la lutte contre le virus responsable du SIDA. L’originalité de notre démarche est l’utilisation de la transposase MOS1 comme modèle pour concevoir nos molécules. Les méthodologies utilisées pour accéder à ces molécules font essentiellement appel à la chimie catalysée par des métaux de transition mais aussi à des réactions de chimie hétérocyclique telles que des réactions de Mitsunobu, de Knoevenagel ou encore de Horner-Wadsworth-Emmons. L’ensemble des molécules synthétisées a fait l’objet d’une évaluation de leurs activités inhibitrices sur la transposase MOS1 et l’intégrase du VIH-1. Leurs propriétés antivirales contre le VIH ont également été évaluées. Parallèlement à ces travaux, nous nous sommes intéressés à la réactivité du noyau maléimide dans des réactions de couplage pallado-catalysées et plus particulièrement dans des couplages de Sonogashira. / Our research team has recently developed the first inhibitors of a DDE enzyme, MOS1 transposase, an enzyme similar to the HIV-1 integrase. These molecules, having a bisfurylmaleimide structure, also showed efficacy against enzymatic activities of HIV integrase. Based on these results, we undertook the synthesis of new bisfurylmaleimides in order to identify new integrase inhibitors and propose new molecules in the fight against the virus that causes AIDS. The originality of our approach is the use of MOS1 transposase as a model for designing our molecules. Methodologies used to access these molecules are essentially involving chemistry catalyzed by transition metals but also reactions of heterocyclic chemistry such as Mitsunobu, Knoevenagel or Horner-Wadsworth-Emmons reactions. All synthesized molecules has been evaluated for their inhibitory activities on the MOS1 transposase and HIV-1 integrase. Their antiviral properties against HIV were also evaluated. Parallel to this work, we investigated the reactivity of the maleimide core in palladium-catalyzed cross-coupling reactions especially in Sonogashira couplings.

Das Thema der Arbeit ist experimentelle Bestimmung der Ausbeute durch Photoaktivierung von Mo-92 mittels Bremsstrahlung des supraleitenden Elektronenlinearbeschleuniger ELBE im Forschungszentrum Dresden-Rossendorf. Mo-92 ist der p-Kern mit der größten Isotopenhäufigkeit und wird in astrophysikalischen Netzwerkrechnungen deutlich unterproduziert. Untersucht wurde dabei insbesondere der (gamma,p)- und (gamma,n)-Kanal, wobei für letzteren wegen der Halbwertszeit des Endkerns (Isomer) von 65 s eine Rohrpost verwendet wurde. Die Aktivierung erfolgte an zwei verschiedenen Bestrahlungsplätzen. Am Kernphysikmessplatz konnte die Photonenfluenz absolut mittels Kernresonanzfluoreszenz an B-11 bestimmt werden. Im Elektronenstrahlfänger wurde die Photodesintegrationsreaktion Au-197(gamma,n) zur Normierung verwendet. Die Endpunktsenergie wurde über den Deuteronenaufbruch durch Messung der Protonenspektren mit Si-Detektoren bestimmt. Die Ergebnisse wurden mit der integralen Ausbeute mit Hauser-Feshbach-Modellrechnungen verglichen. Parasitär konnte auch die Ausbeute der Aktivierung des in natürlichem Mo enthaltenen Isotops Mo-100 untersucht und mit früheren Photoneutronenexperimenten verglichen werden.

Die kosmische Nukleosynthese 35 protonenreicher stabiler Nuklide zwischen Selen und Blei kann nicht durch Neutroneneinfangprozesse erklärt werden. Es wird angenommen, dass diese Kerne in explosiven Szenarien, wie Supernova-Explosionen durch Protoneneinfang oder Photodesintegrationsprozesse, erzeugt werden, jedoch sind die solaren Häufigkeiten dieser sogenannten p-Kerne noch nicht verstanden. Der p-Kern mit der größten Isotopenhäufigkeit, 92Mo, wird in Nukleosynthese-Netzwerkrechnungen deutlich unterproduziert. Eine mögliche Ursache könnten unpräzise Reaktionswirkungsquerschnitte sein, da die meisten Wirkungsquerschnitte nur aus Modellrechnungen bekannt sind. Daher war es naheliegend, die Photodesintegrationswirkungsquerschnitte von 92Mo mit der Methode der Photoaktivierung an der Strahlungsquelle ELBE im Forschungszentrum Dresden-Rossendorf zu überprüfen. Durch die hohe Intensität der Bremsstrahlung von bis zu 10^9 MeV^-1cm^-2s^-1 im Energiebereich bis zu 20 MeV konnten im Rahmen dieser Arbeit erstmals nicht nur die (γ,n)-, sondern auch die (γ,p)-Reaktionen an 92Mo bei astrophysikalisch relevanten Energien untersucht werden. Durch die Messungen an zwei Bestrahlungsplätzen konnten systematische Unsicherheiten reduziert werden. Insbesondere wurde eine präzise Bestimmung der Photonenfluenz vorgenommen: Am Kernphysikmessplatz erfolgte die Bestimmung mittels Kernresonanzfluoreszenz an 11B. Im Elektronenstrahlfänger wurde die Photodesintegrationsreaktion 197Au(γ,n) zur Normierung der Photonenfluenz verwendet, nachdem sie zuvor am Kernphysikmessplatz überprüft wurde. Die Reaktion 92Mo(γ,n)91mMo, mit einer Halbwertszeit des Endkerns von 65 s, war dank einer Rohrpost zugänglich, mit der die Proben in weniger als 10 s von der Bestrahlungsstation zum Zerfallsmessplatz transportiert werden können. Die Messungen dieser Arbeit bestätigen im wesentlichen die Hauser-Feshbach-Modellrechnungen bezüglich der Photodesintegrationsreaktionen (γ,n) und (γ,p). Die Unterproduktion der Mo- und Ru-Isotope ist daher nicht erklärbar durch ungenaue Wirkungsquerschnitte. Zur Nukleosynthese dieser Kerne müssen andere astrophysikalische Prozesse, z.B. neutrinoinduzierte Reaktionen beitragen. Die gemessenen Photoaktivierungsausbeuten haben eine hohe Empfindlichkeit auf die Photonenstärkefunktion. ÄAnderungen der Dipolriesenresonanzparameter wirken sich stärker auf berechnete Ausbeuten aus, als ÄAnderungen der Kernniveaudichte oder der Parameter des optischen Modells. Durch gleichzeitige Messung der Photodesintegration am Kern 100Mo konnten Unsicherheiten in der Normierung von Photoneutronenexperimentdaten aus der Positronenannihilation im Flug geklärt werden.