Rhodopsin ist der Photorezeptor der Stäbchenzellen in der Retina von Vertebraten und wird als Prototyp für die gesamte Gruppe der GPCRs beforscht. Trifft ein Photon auf das Protein, so wird der über eine Schiffbase kovalent gebundene Chromophor von seiner 11-cis- in die All-trans-Konfiguration isomerisiert und setzt infolgedessen den Aktivierungsprozess in Gang. Dieser mündet in der aktiven Rezeptorkonformation, die das G-Protein Transducin aktivieren kann und dadurch eine Kaskade weiterer Aktivierungsschritten einleitet, die letztlich ein Nervensignal verursachen. Das Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der späten Aktivierungsschritte und ihrer Ursache-Wirkungs-Beziehungen. Zu diesem Zweck wurden Blitzlichtphotolyse, Elektronenspinresonanz (EPR) mit Spinlabeling (SDSL), UV/vis-Spektroskopie, FTIR-Spektroskopie und Fluoreszenzspektroskopie angewandt. Kinetische Messungen wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, um die Abfolge der mit den unterschiedlichen Techniken zugänglichen Aktivierungsschritte aufzuklären. Nach der Bildung des absorptionsspektroskopisch definierten Meta-II-Zustands bewegt sich die Helix TM6 in einem späteren Schritt als ganzes nach außen und markiert damit den Übergang von Meta-IIa zu Meta-IIb. Dadurch wird die bis dahin in der Membran verborgene D(E)RY-Region für das Umgebungsmedium zugänglich und nimmt ohne Zeitverzögerung ein Proton auf, wodurch der Meta-IIb*H+-Zustand gebildet wird. Die verfügbaren Daten sprechen dafür, dass das D(E)RY-Motiv bei der Aktivierung des Transducins sowohl die Alpha- als auch die Gamma-Untereinheit desselben bindet. Die Bindung von zu Transducin-Abschnitten analogen Peptiden kann dann erfolgen, wenn die Helix TM6 im nach außen bewegten Zustand ist, und führt zur Abgabe von bis zu zwei Protonen vom aktivierten Rhodopsin. Sowohl das D(E)RY- und das NPxxY(x)5,6F-Motiv als auch die beiden Zustände Meta-IIb und Meta-IIb*H+ könnten relevant für den sequenziellen Transducin-Aktivierungsmechanismus sein. / Rhodopsin is the photoreceptor in the rod cells of the vertebrate retina. It is considered as a prototype of the whole group of GPCRs. Upon absorption of a photon the chromophore, which is covalently bound through a Schiff base, is isomerized from its 11-cis into the all-trans configuration. This initiates the activation process and finally results in the active receptor conformation which is capable of activating the G protein transducin and thereby triggers a cascade of further activation steps which finally cause a nerve signal. The aim of this work was the clarification of the late activation steps and their cause-and-effect chain. For this purpose flash photolysis, electron paramagnetic resonance (EPR) with spin labeling (SDSL), UV/vis spectroscopy, FTIR spectroscopy and fluorescence spectroscopy were applied. Kinetic measurements were executed under identical conditions in order to elucidate the sequence of activation steps, which are accessible with the different techniques. After formation of the spectroscopically defined Meta-II state helix TM6 moves outward as a rigid body, thereby marking the transition from Meta-IIa to Meta-IIb. Therefore the D(E)RY region, which is until then buried in the membrane, gets accessible to the surrounding solution. It consequently takes up a proton without delay, thus forming the Meta-IIb*H+ state. Available data argue for the D(E)RY motif binding both the Alpha and the Gamma subunit of transducin during activation of the latter. The binding of peptides which are analogous to sections of transducin is possible when helix TM6 is in the outward position. It causes the release of up to two protons from the activated rhodopsin. Both the D(E)RY motif and the NPxxY(x)5,6F motif as well as both the states Meta-IIb and Meta-IIb*H+ are potentially relevant for the sequential transducin activation mechanism.

Sensorische Photorezeptorproteine vermitteln vielfältige Lichtreaktionen in allen Domänen des Lebens. Oftmals dienen verschiedene, durch helikale ‚Linker’ gekoppelte, Module der Lichtperzeption (Sensor) und der Umwandlung in ein biologisches Aktivität (Effektor). Der Zusammenbau chimärer Photorezeptoren aus unterschiedlichen Sensoren und Effektoren ermöglicht die präzise und minimalinvasive Regulation zellulärer Signalwege mit Hilfe von Licht, zu therapeutischen oder analytischen Zwecken. Eine große Herausforderung stellt dabei die korrekte Fusion der Linker beider Module dar, die Kommunikation zwischen Sensor und Effektor erlaubt. Die vorliegende Arbeit nimmt sich diesem Problem an und untersucht Strategien zum effizienten Bau chimärer Photorezeptorproteine. Ein rationaler, auf Sequenz- und Strukturhomologie der parentalen Proteine basierender Ansatz wurde maßgeblich durch unzureichendes Verständnis der funktionellen Mechanismen dieser modularen Proteinen erschwert. Die neuentwickelte und PATCHY-Methode umgeht dieses Hindernis, indem sie eine Bibliothek von Chimären aller Kombinationen der parentalen Linker generiert, welche anschließend mittels bakterieller Testsysteme nach funktionalen Varianten durchsucht wird. Angewendet auf die Fusion eines LOV-Blaulichtsensors und eines Histidinkinase-Effektors fanden sich sowohl lichtaktivierte, als auch zu lichtreprimierte Chimären, deren Linkerlängen jeweils einer Heptadenperiodizität folgten. Dass weniger als 5% aller Linkerkombinationen zu lichtregulierten Chimären führten, deutet zudem auf eine feine Abstimmung von Linkersequenz und Proteinfunktion hin. Die systematische Analyse von Fusionsvarianten mit PATCHY dient daher nicht nur der Entwicklung chimärer Rezeptorproteine zur Manipulation zellulärer Prozesse. Sondern sie zeigt darüber hinaus, komplementär zum rationalen Ansatz, molekulare Faktoren auf, die zur Modulkompatibilität und Signaltransduktion modularer Rezeptorproteine beitragen. / Sensory photoreceptor proteins mediate diverse responses to ambient light in all domains of life. Often distinct modules coupled by helical linkers enable light perception (sensor) and biological output function (effector). Rewiring different sensor and effector modules into photoreceptor chimeras allows using light to control target cellular processes with high spatiotemporal accuracy and minimal invasiveness for therapeutic or analytical purposes. Thereby, a major design challenge is fusing the linkers from both modules in a way that preserves signal transduction within the chimera. The present study tackles this issue and explores strategies for engineering photoreceptor chimeras. An initial rational-design approach guided by sequence and structure homology of the parent proteins was greatly hampered by insufficient knowledge of signaling mechanisms within these modular proteins. A novel and easy-to-use brute-force strategy, termed PATCHY (primer-aided truncation for the creation of hybrid enzymes) circumvents this problem by generating a complete library of fusion variants between target modules harboring all combinations of the parent linkers. Screening fusion libraries of a LOV (light-oxygen-voltage) blue-light sensor coupled to a histidine-kinase effector yielded light-induced and light-repressed chimeras, each group complying with a heptad periodicity of linker lengths. With less than 5% of all possible variants exhibiting light regulation, a delicate fine-tuning of linker sequence and protein function became evident. Thus, systematic testing of fusion variants with PATCHY not only facilitates the development of photoreceptor chimeras for manipulating cellular processes. Complementary to rational design, it also reveals molecular cues determining module compatibility and signal transduction in modular signal receptors.

Studies demonstrate neuro-retinal damage in patients with diabetes and no clinically visible diabetic retinopathy. It is unknown which retinal regions are most vulnerable to diabetes. We hypothesized that the standard and slow-flash (sf-) multifocal electroretinogram (mfERG) and adaptive optics (AO) imaging will localize retinal regions of vulnerability. Fifty-five adolescents with diabetes and 54 controls underwent mfERG testing to isolate predominately retinal bipolar cell activity and sf-mfERG testing to isolate three oscillatory potentials (OPs) from intraretinal amacrine and interplexiform cells. Greatest mfERG delays were in the superior temporal quadrant and at 5°-10° eccentricity. Greatest sf-mfERG delays were found at different eccentricities for each OP. Twenty adolescents with diabetes and 14 controls underwent AO imaging. No significant differences in cone photoreceptor density were found; however, patients showed a trend towards reduced density in the superior nasal region. Inner retinal structures may be more susceptible to damage by diabetes than outer retinal structures.

Studies demonstrate neuro-retinal damage in patients with diabetes and no clinically visible diabetic retinopathy. It is unknown which retinal regions are most vulnerable to diabetes. We hypothesized that the standard and slow-flash (sf-) multifocal electroretinogram (mfERG) and adaptive optics (AO) imaging will localize retinal regions of vulnerability. Fifty-five adolescents with diabetes and 54 controls underwent mfERG testing to isolate predominately retinal bipolar cell activity and sf-mfERG testing to isolate three oscillatory potentials (OPs) from intraretinal amacrine and interplexiform cells. Greatest mfERG delays were in the superior temporal quadrant and at 5°-10° eccentricity. Greatest sf-mfERG delays were found at different eccentricities for each OP. Twenty adolescents with diabetes and 14 controls underwent AO imaging. No significant differences in cone photoreceptor density were found; however, patients showed a trend towards reduced density in the superior nasal region. Inner retinal structures may be more susceptible to damage by diabetes than outer retinal structures.

Vision impairment and blindness are in industrialized countries primarily caused by the degeneration of the retina, the light sensing tissue inside the eye. The degeneration, occurring in diseases like age-related macular degeneration (AMD) or retinitis pigmentosa (RP), can be caused by environmental factors as well as genetic defects and thus shows diverse pathologies. In all conditions, the light detecting photoreceptors (rods and/or cones) are dying caused by either direct photoreceptor damage or as a secondary effect following degeneration of supporting cells. Although promising treatment approaches are currently under investigation, up to date it is not possible to cure these diseases. Amongst these therapeutic strategies, pre-clinical studies evaluating the replacement of degenerated cells by transplantation of new photoreceptors demonstrated promising results. First studies conducted the specific enrichment and transplantation of primary photoreceptors derived from postnatal mice and their sufficient integration and differentiation into mature photoreceptors in wild-type as well as degenerated mouse retinae. Recent experiments additionally proved the recovery of some dim-light vision after transplantation in mice lacking night sight. The in vitro differentiation of whole eye cups containing photoreceptors, out of human or mouse ES or iPS cells, peaked in the transplantation of ES-derived photoreceptors into wild-type as well as degenerated mice and the integration and maturation of these cells. These observations are encouraging, but prior to a save implementation of this strategy into a clinical routine, several further hurdles need to be challenged. Collection of photoreceptors out of whole retinal tissues prior to transplantation was shown to be an important step to reach high integration rates. Additionally, transplantation of photoreceptors derived from stem cells comprises the risk of tumor formation after transplantation and thus also requires depletion of inadvertent cells. Therefore, we established the enrichment of photoreceptors using the cell surface marker dependent method magnetic-activated cell sorting (MACS). For identification of suitable target-specific surface markers, we characterized young transplantable mouse photoreceptors using microarray analysis and screened their transcriptome. Amongst others, ecto-5´nucleotidase (Nt5e, termed CD73) was identified being a rod photoreceptor specific cell surface protein. Thus, we enriched young photoreceptors with CD73-dependent MACS with sufficient purity and transplanted these cells into the subretinal space of wild-type mice. In contrast to unsorted retinal cells, enriched photoreceptors integrated in significantly higher number into the host retina, proving that MACS is a suitable alternative for specific photoreceptor enrichment. Testing other proteins, identified as photoreceptor specific, for MACS suitability and the translation of this approach to photoreceptors, derived from mouse as well as human iPS or ES cells, should be the focus of consecutive investigations. The integration of grafted cells into the retina is a complex process dependent on a variety of influencing factors. Transplantation experiments in aging wild-type mice and a rod-depleted mouse model, containing a retina composed of cone and cone-like photoreceptors, indicated that the activation of Müller glia cells facilitates integration of transplanted photoreceptors. Besides that, reduced outer limiting membrane (OLM) integrity, increased subretinal graft distribution or reduced retinal cell density are further suggested as potential cell engraftment enhancers. These factors might open up important possibilities of host retina manipulation to increase cell integration rates. Although retinal transplantation experiments were in addition to mice also performed using pigs or rats as hosts, the transplantation of enriched single photoreceptors, following the protocols successfully established in mice, has not been performed in other species. Nevertheless, transferring this technique is important and would allow better predictions for future application in human patients. Therefore, we transferred our protocol, using CD73 based MACS, to the rat and successfully enriched rat photoreceptors with sufficient purity. We subsequently transplanted these cells into the subretinal space of rats as well as mice and observed limited integration capacity of grafted cells. Only few transplanted rat photoreceptors were localized in the rat retina, lacking proper photoreceptor morphology. Especially regarding a perspective clinical application in humans, these data are remarkable. They imply the question, whether low integration in rat represents a general problem and might thus also be relevant for treatment in humans, or whether the rat retina forms just an exception. Thus, further detailed analysis of the cellular and molecular mechanisms underlying the integration process of transplanted photoreceptors represent an essential prerequisite for the development of a safe and efficient therapy, aiming to treat retinal degenerative diseases characterized by photoreceptor loss. / Degenerationserkrankungen der Netzhaut (Retina) sind in Industrieländern die Hauptursache für verminderte Sehfähigkeit und Blindheit. Sowohl Umweltfaktoren als auch vererbte Mutationen können Defekte wie altersbedingte Makuladegeneration (AMD) oder Retinitis pigmentosa (RP) auslösen und führen zu einem sehr variablen Krankheitsbild. Eine Gemeinsamkeit aller Formen ist das Absterben der lichtdetektierenden Fotorezeptoren (Stäbchen und/oder Zapfen). Dieses kann entweder durch direkte Schädigung, oder als Sekundäreffekt nach Degeneration der unterstützenden Zellen erfolgen. Obwohl im Moment vielversprechende Behandlungsansätze untersucht werden, ist es zurzeit nicht möglich, retinale Degenerationserkrankungen dieser Art zu heilen. Ein erfolgversprechender Ansatz könnte jedoch der Ersatz der degenerierten Zellen durch transplantierte Fotorezeptoren sein. Erste Studien demonstrierten die spezifische Anreicherung von primären Fotorezeptoren aus der Netzhaut neugeborener Mäuse und deren subretinale Transplantation in Wildtyp-Mäuse und Mausmodelle mit retinaler Degeneration. Die transplantierten Zellen integrierten in die Empfängernetzhaut und entwickelten sich in ausgereifte Fotorezeptoren und konnten unter anderem bei nachtblinden Mäusen die Sehfähigkeit bei Dunkelheit verbessern. Die Differenzierung von humanen oder murinen ES- und iPS-Zellen in vitro in vollständige Retinae und die Transplantation daraus gewonnener Fotorezeptoren in Mäuse, bilden vorläufig den Höhepunkt dieser Entwicklung. Obwohl die Fortschritte der jüngsten Vergangenheit beeindruckend sind, sollten vor der sicheren und effektiven Anwendung einer retinalen Zellersatztherapie als therapeutische Maßnahme beim Menschen noch einige wissenschaftliche Fragestellungen beantwortet werden. Studien zeigen, dass Zellpopulationen, die direkt aus der Spendernetzhaut entnommen und transplantiert wurden, auf Grund ihrer Heterogenität in geringeren Zahlen in die Empfängerretina einwandern als angereicherte Fotorezeptoren. Zusätzlich besteht bei unsortierten Zellen, die aus Stammzellpopulationen gewonnen wurden, das Risiko einer Tumorbildung. Daher haben wir die magnetisch-aktivierte Zellsortierung (MACS) zur Anreicherung junger Fotorezeptoren etabliert. Die dabei benötigten, für Fotorezeptoren spezifischen, Oberflächenproteine wurden mit Hilfe von Microarray-Analysen des Transkriptoms junger Stäbchen von Mäusen identifiziert. Dabei wurde unter anderem die 5\'-Nukleotidase (Nt5e, CD73) entdeckt, die uns die erfolgreiche Anreicherung junger Mausfotorezeptoren mit Hilfe von CD73-vermitteltem MACS erlaubte. Die Transplantation dieser angereicherten Zellpopulation in die Netzhaut von Empfängertieren resultierte in einer signifikant erhöhten Integrationsrate im Vergleich zu nicht-angereicherten retinalen Zellen. Die Überprüfung der Nutzbarkeit weiterer identifizierter Oberflächenproteine zur Zellanreicherung bzw. die Übertragung der etablierten Protokolle zur Zellsortierung und Transplantation auf Fotorezeptoren aus ES- und iPS-Zellkulturen, sollten im Fokus nachfolgender Experimente stehen. Die Integration transplantierter Zellen in die Empfängernetzhaut ist ein komplexer Prozess und von unterschiedlichen Einflussfaktoren abhängig. Durch Transplantationsexperimente in alternden Wildtyp-Mäusen und einem Mausmodell, dessen Fotorezeptorschicht keine Stäbchen und stattdessen nur Zapfen und zapfenähnlichen Fotorezeptoren aufweist, konnte gezeigt werden, dass vor allem die Aktivierung von Müllerzellen die Integrationsrate der Fotorezeptoren erhöht. Neben dieser sogenannten Gliose werden weitere Faktoren, wie die reduzierte Stabilität der äußeren Grenzmembran, die flächenmäßig größere Verteilung der transplantierten Zellen im subretinalen Raum oder die reduzierte Dichte der Zellen in der äußeren Körnerschicht, als potentielle integrationsfördernde Komponenten in Betracht gezogen. Diese bilden interessante Schwerpunkte für weitere Forschungen, um eine ausreichende Zellintegration durch Manipulation der Empfängernetzhaut, auch in der klinischen Anwendung, zu erreichen. Obwohl Transplantationsexperimente zusätzlich zur Maus auch in anderen Empfängerspezies, wie Ratten und Schweinen, durchgeführt wurden, liegen bis jetzt keine Studien vor, die die in der Maus erfolgreich etablierten Protokolle der Zellanreicherung und Transplantation von Fotorezeptor-Suspensionen in diesen Spezies reproduzierte. Der Transfer dieser Technik und eine Generalisierung der Anwendbarkeit eines Fotorezeptorersatzes durch Transplantation in verschiedenen Säugetierarten geben jedoch wichtige Hinweise für eine mögliche Translation dieser Technologie für klinische Anwendungen. Deshalb haben wir unser bereits an der Maus getestetes Protokoll auf die Ratte übertragen und erfolgreich Fotorezeptoren der Ratte mit Hilfe von CD73-vermitteltem MACS angereichert. Nach deren Transplantation in die Netzhaut von Ratten und Mäusen zeigten die Rattenfotorezeptoren aber eine stark verminderte Integrationsfähigkeit und das Fehlen einer reifen Fotorezeptormorphologie. Speziell in Hinsicht auf eine zukünftige klinische Anwendung sind diese Ergebnisse relevant, da sie die Frage aufwerfen, ob die mangelnde Integration in der Ratte ein generelles Problem darstellt und daher auch beim Menschen zu erwarten ist, oder ob sie nur eine Ausnahme im Rattenmodell bildet. Aus diesem Grund bildet die weitere Erforschung der zellulären und molekularen Mechanismen der Integration transplantierter Fotorezeptoren eine wichtige Grundlage für die Entwicklung einer sicheren und effizienten Therapie mit dem Ziel, degenerative Netzhauterkrankungen zu heilen.

Histidinkinase-Rhodopsine (HKRs) können als besondere Gruppe der Hybrid-Histidinkinasen beschrieben werden, deren N-terminale sensorische Domäne ein mikrobielles Rhodopsin ist. HKR-codierende Sequenzen konnten in den Genomen verschiedener Algen, Pilze und Amoeben gefunden werden doch ihre Aufgaben und Wirkungsweisen sind bisher ungeklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die rekombinanten Rhodopsin-Domänen von zwei HKRs mit verschiedenen spektroskopischen Techniken charakterisiert. Sie zeigten mehrere Besonderheiten. Das Rhodopsin-Fragment von Cr-HKR1 aus Chlamydomonas reinhardtii kann durch alternierende kurzwellige und langwellige Belichtung zwischen zwei stabilen Absorptionsformen konvertiert werden: einer Blaulicht-absorbierenden (Rh-Bl) und einer UVA-Licht-absorbierenden Form (Rh-UV). Dies resultiert aus der ungewöhnlichen thermischen Stabilität des Zustandes mit deprotonierter Schiff’scher Base. Das zweite charakterisierte HKR, die Os-HKR-Rhodopsin-Domäne aus der marinen Picoalge Ostreococcus tauri, zeigt eine Dunkelabsorption von 505 nm. Auch Os-HKR ist photochrom und die deprotonierte Spezies kann effizient akkumuliert werden. Diese P400-Absorptionsform ist jedoch nicht völlig stabil sondern es kommt nach Belichtungsende zur langsamen Dunkelzustands-Regeneration. Überraschenderweise konnte die Bindung sowie die transiente Abgabe eines Anions während des Os-HKR-Photozyklus festgestellt werden. Somit beeinflusst nicht nur das Licht, sondern auch das Salz in der Umgebung die Os-HKR-Reaktionen. Aufgrund ihrer photochromen Eigenschaften werden die HKRs als wirksame lichtinduzierte Schalter für die C-terminalen Signaltransduktionsdomänen postuliert. Schwingungsspektroskopische Analysen deckten eine Heterogenität hinsichtlich der im Protein gebundenen Retinal‐Konfiguration sowie die Existenz von zwei parallelen Photozyklen auf. Jeder dieser Photozyklen geht aus einer der beiden Retinal-Isomere hervor. / Histidine kinase rhodopsins (HKRs) can be described as hybrid histidine kinases with a microbial rhodopsin as N-terminal sensory domain. HKR-encoding sequences were found in the genomes of various unicellular organisms such as algae, fungi and amoeba but their mechanistic and physiologic function is unknown. During this work the absorptive properties of the recombinant rhodopsin domains of two HKRs were studied by the usage of different spectroscopic techniques. Both HKRs showed unusual characteristics. The rhodopsin fragment of Cr‐HKR1 from Chlamydomonas reinhardtii can be interconverted between two stable absorbance forms by the alternate application of short‐ and long‐wavelength light: a blue light-absorbing dark form (Rh-Bl) and a UVA light-absorbing form (Rh-UV). This unusual photocycle results from the uncommon thermal stability of the absorbance state with a deprotonated retinal Schiff base. The second studied HKR, the Os‐HKR rhodopsin domain from the marine picoalga Ostreococcus tauri, shows an absorbance maximum at 505 nm in darkness. Likewise Cr‐HKR1 the Os‐HKR is photochromic and the deprotonated form P400 can be efficiently accumulated. But the Os-HKR P400-form is not completely stable. A slow dark state recovery occurs. Surprisingly the dark state absorbance of Os‐HKR was found to be dependent on anion binding in the protein. Furthermore during the photocycle the transient anion release occurs and therefore not only light but also salt impacts the Os-HKR-reactions. Due to their pronounced photochromic properties, the HKRs are postulated to act as effective molecular switches for the C-terminal signal transduction domains in response to the light conditions. Vibrational spectroscopy revealed the heterogeneity with regard to the retinal configuration bound in the HKRs suggesting the existence of two parallel photocycles. Either of these photocycles originates from one of the two retinal isoforms.

Die Modifikation von Genen ist in den molekularen Biowissenschaften ein fundamentales Werkzeug, um die Funktion von Genen zu studieren (Reverse Genetik). Diese Arbeit hat erfolgreich Zinkfinger- und CRISPR/Cas9-Nukleasen für die Verwendung in C. reinhardtii etabliert, um Gene im Kerngenom gezielt auszuschalten und präzise zu verändern. Basierend auf vorausgegangener Arbeit mit Zinkfingernukleasen (ZFN) konnte die Transformationseffizienz um das 300-fache verbessert werden, was die Inaktivierung von Genen auch in motilen Wildtyp-Zellen ermöglichte. Damit war es möglich, die Gene für das Kanalrhodopsin-1 (ChR1), Kanalrhodopsin-2 (ChR2) und das Chlamyopsin-1/2-Gen (COP1/2) einzeln und gemeinsam auszuschalten. Eine Analyse der Phototaxis in diesen Stämmen ergab, dass die Phototaxis durch Inaktivierung von ChR1 stärker beeinträchtigt ist als durch Inaktivierung von ChR2. Um das CRISPR/Cas9-System zu verwenden, wurden die Transformationsbedingungen so angepasst und optimiert, dass der Cas9-gRNA-Komplex als in vitro hergestelltes Ribonukleoprotein in die Zellen transformiert wurde. Um die Bedingungen für präzise Genmodifikationen zu messen und zu verbessern, wurde das SNRK2.2-Gen als Reportergen für eine „Blau-Grün Test“ etabliert. Kleine Insertionen von bis zu 30 bp konnten mit kurzen Oligonukleotiden eingefügt werden, während größere Reportergene (mVenus, SNAP-Tag) mithilfe eines Donor-Plasmids generiert wurden. In dieser Arbeit konnten mehr als 20 nicht-selektierbare Gene – darunter 10 der 15 potenziellen Photorezeptorgene – mit einer durchschnittlichen Mutationsrate von 12,1 % inaktiviert werden. Insgesamt zeigt diese Arbeit in umfassender Weise, wie Gen-Inaktivierungen und Modifikationen mithilfe von ZFNs und des CRISPR/Cas9-Systems in der Grünalge C. reinhardtii durchgeführt werden können. Außerdem bietet die Sammlung der zehn Photorezeptor-Knockouts eine aussichtsreiche Grundlage, um die Vielfalt der Photorezeptoren in C. reinhardtii zu erforschen. / Gene editing is a fundamental tool in molecular biosciences in order to study the function of genes (reverse genetics). This study established zinc-finger and CRISPR/Cas9 nucleases for gene editing to target and inactivate the photoreceptor genes in C. reinhardtii. In continuation of previous work with designer zinc-finger nucleases (ZFN), the transformation efficiency could be improved 300-fold, which enabled the inactivation of genes in motile wild type cells. This made it possible to disrupt the Channelrhodopsin-1 (ChR1), Channelrhodopsin-2 (ChR2) and Chlamyopsin-1/2 (COP1/2) genes individually and in parallel. Phototaxis experiments in these strains revealed that the inactivation of ChR1 had a greater effect on phototaxis than the inactivation of ChR2. To apply the CRISPR/Cas9 system, the transformation conditions were adapted and optimized so that the Cas9-gRNA complex was successfully electroporated into the cells as an in vitro synthesized ribonucleoprotein. This approach enabled gene inactivations with CRISPR/Cas9 in C. reinhardtii. In order to measure and improve the conditions for precise gene modifications, the SNRK2.2 gene was established as a reporter gene for a ‘Blue-Green test’. Small insertions of up to 30 bp were inserted using short oligonucleotides, while larger reporter genes (mVenus, SNAP-tag) were integrated using donor plasmids. Throughout this study, more than 20 non-selectable genes were disrupted, including 10 of the photoreceptor genes, with an average mutation rate of 12,1 %. Overall, this work shows in a comprehensive way how gene inactivations and modifications can be performed in green alga C. reinhardtii using ZFNs or CRISPR/Cas9. In addition, the collection of the ten photoreceptor knockouts provides a promising source to investigate the diversity of photoreceptor genes in C. reinhardtii.