O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (TFDa) sobre o Enterococcus faecalis (E. faecalis), in vitro, utilizando a clorofila (CL) como agente fotossensibilizador (FS) e o diodo emissor de luz (LED) como fonte de luz. A cultura pura de E. faecalis foi ativada em caldo de BHI a 37oC por 24h. O cultivo do microrganismo foi centrifugado a 3000rpm por 15min, e o pellet re-suspenso em 0,85% de solução salina. As concentrações da bactéria foram ajustadas para 107UFC mL-1 (unidades formadoras de colônias por mililitro). Diferentes tipos de solventes para a CL foram testados: éter, álcool de cereais, Tween 80 e P-123. 100l do inóculo e o mesmo volume da solução teste foram inseridos em cada poço da placa de microtitulação. A mistura foi agitada e aguardou-se 1min. 25l da suspensão foi removida e diluições seriadas foram realizadas. Alíquotas de cada diluição foram espalhadas na superfície da placa, armazenadas em microaerofilia e incubadas na estufa por 24h a 37oC. O número de UFC foi contado em cada placa. Para o experimento da TFDa, os grupos foram divididos em: controle (G1); TBO 1min (G2); CL+Tween 1min (G3); CL+Tween 5min (G4); CL+P-123 1min (G5); CL+P-123 5min (G6); CL+Tween 1min + LED 1min (G7); CL+Tween 1min + LED 5min (G8); CL+Tween 5min + LED 1min (G9); CL+Tween 5min + LED 5min (G10); CL+P-123 1min + LED 1min (G11); CL+P-123 1min + LED 5min (G12); CL+P-123 5min + LED 1min (G13); CL+P-123 5min + LED 5min (G14); TBO 1min + LED 1min (G15); TBO 1min + LED 5min (G16); LED 1min (G17); LED 5min (G18).Um volume de 100l da suspensão bacteriana foi inserido em poços da placa e o mesmo volume da solução do FS foi adicionado. A CL foi solubilizada em soluções aquosas de Tween ou P-123. Cada poço foi agitado e o tempo de préirradiação foi de 1 ou 5min. O LED foi acionado durante 1 ou 5min. 25l da suspensão foi submetida a diluições seriadas e as alíquotas de cada diluição foram espalhadas na superfície da placa em Ágar BHI. As placas foram armazenadas e colocadas na estufa a 37oC por 24h. Os experimentos foram realizados em triplicata e as UFC em cada placa foram contadas. As UFC foram transformadas em valores de Log10 UFC para normalizar os dados para análise estatística. A média e o desvio padrão (DP) de cada experimento foram calculados. Os resultados mostraram que o Tween e o P-123 foram os solventes mais eficazes para diluição da CL. A TFDa com utilização da CL diluída em Tween ou P-123 com tempo de pré-irradiação de 5min e com a ação do LED por 5min causou uma pequena diminuição na contagem bacteriana. A CL diluída em Tween com tempo de 1min teve uma redução significante da contagem bacteriana. O TBO quando associado ao LED durante 1min provocou uma leve redução no número de UFC. A irradiação pelo LED durante 5min foi capaz de causar uma diminuição significativa da quantidade de UFC. / The aim of this study was to investigate the effect of Antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) against Enterococcus faecalis (E. faecalis), in vitro, using chlorophyll (CL) as photosensitizer (FS) agent and light-emitting diode (LED) as light source. Pure culture of E. faecalis was cultivated in BHI broth at 37oC for 24h. The culture was centrifuged at 3000rpm for 15min, and the pellets were resuspended in 0.85% saline solution. The bacterial concentrations were adjusted to 107CFU mL-1 (colony forming units per milliliter). Different types of solvents for CL were tested: ether, grain alcohol, Tween 80 and P-123. 100l of inoculum and the same volume of the test solution were inserted into each well of the microtitre plate. The mixture was mixed and 1 min was awaited. 25l of the suspension was removed and serial dilutions were performed. Aliquots of each dilution were spread on the surface of the plates, stored in microaerophilic conditions and incubated for 24h at 37oC. The number CFU was counted in each plate. For aPDT experiment, the groups were divided into: control (G1); TBO 1min (G2); CL+Tween 1min (G3); CL+Tween 5min (G4); CL+P-123 1min (G5); CL+P-123 5min (G6); CL+Tween 1min + LED 1min (G7); CL+Tween 1min + LED 5min (G8); CL+Tween 5min + LED 1min (G9); CL+Tween 5min + LED 5min (G10); CL+P-123 1min + LED 1min (G11); CL+P-123 1min + LED 5min (G12); CL+P-123 5min + LED 1min (G13); CL+P-123 5min + LED 5min (G14); TBO 1min + LED 1min (G15); TBO 1min + LED 5min (G16); LED 1min (G17); LED 5min (G18). A volume of 100l of bacterial suspension was inserted into the well of microtitre plate and the same volume of FS was added. CL was solubilized in aqueous solution of Tween and P-123. Each well was mixed and preirradiation time was 1 or 5min. LED was irradiated during 1 or 5 min. 25l of suspension was subjected to serial dilutions and aliquots of each dilution were spread on the surface of agar BHI plates. The plates were stored and incubated at 37oC for 24h. Experiments were performed in triplicate and CFU in each plate were counted. The results showed that Tween and P-123 were the most effective solvents for CL dilution. aPDT with diluted CL in Tween or P-123 with pre-irradiation time of 5min and with LED irradiation for 5min caused a small decrease in bacterial count. CL diluted in Tween with 1min time showed a significant reduction in bacterial count. TBO when associated with LED irradiation of 1min caused a slight reduction on CFU number. LED irradiation during 5min caused a significant reduction in CFU count.

Objetivo: Alternativas para o tratamento da doença periodontal necessitam ser testadas e uma opção viável parece ser o uso da terapia antimicrobiana fotodinâmica. O objetivo deste estudo foi investigar o efeito da terapia antimicrobiana fotodinâmica através das alterações no perfil microbiológico e no padrão de citocinas após o tratamento da doença periodontal induzida por ligaduras em cães. Métodos: Para tanto, foi induzida doença periodontal através da colocação de ligaduras em torno dos pré-molares mandibulares bilaterais em oito cães. Após a indução da doença os sítios foram aleatoriamente tratados através de raspagem e alisamento radicular (RAR) com instrumentos manuais, terapia antimicrobiana fotodinâmica (TAF) com a utilização de uma fonte de luz laser associada a um fotosensitizador, ou através da combinação das terapias. Para a análise da resposta dos sítios frente aos tratamentos, diferentes tempos experimentais foram utilizados (baseline, uma, três e quatro semanas) onde foram coletadas amostras de placa dentobacteriana subgengival e a contagem de 40 espécies microbianas foi determinada através da técnica de hibridização DNA-DNA. Além disso, amostras de tecidos periodontais foram removidas e a expressão gênica de diferentes citocinas (TNF-&alpha;, RANKL, OPG, MMP-1, IL-6 e IL-10) foi determinada pela técnica de reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real. Os dados foram analisados através dos testes de equações de estimação generalizadas (EEG) e análise da variância (ANOVA) com um nível de significância de 0,05. Resultados: Os dados demonstraram uma redução dos níveis da maioria das espécies bacterianas monitoradas após uma semana para todos os tratamentos realizados (P < 0,001), no entanto, um aumento na contagem média de P. intermedia (P <0,01), P. nigrescens (P < 0,001) e T. forsythia (P < 0,05) foi observado para os sítios tratados por TAF e por RAR + TAF. Após quatro semanas foi observada uma possível recolonização de P. gingivalis e T. denticola, para todos os tratamentos testados (P < 0,001). A contagem média de T. forsythia manteve-se elevada durante o curso do estudo, especialmente para TAF e RAR + TAF. Adicionalmente foi observada uma notável redução da contagem média de A. actinomycetemcomitans para o grupo TAF (P < 0,001). Em relação ao perfil das citocinas avaliadas, os resultados foram similares para todos os tratamentos testados. O fator tempo foi considerado estatisticamente significante independente do tratamento realizado (P < 0,001) e não foi observada influência dos tratamentos sobre os resultados (P > 0,05). Foi observada uma redução progressiva na expressão das citocinas durante os períodos de observação, entretanto entre os períodos de três e quatro semanas não houve diferença estatisticamente significante (P > 0,05). Conclusões: De acordo com o modelo experimental utilizado neste estudo os dados sugerem que os tratamentos testados afetaram diferentemente as espécies bacterianas monitoradas e apresentaram um efeito similar na expressão das citocinas avaliadas. / The purpose of this study was to evaluate the effect of a single application of antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) on microbiological profile and cytokine pattern in dogs. Periodontal disease was induced by placing 3.0 silk ligatures around the mandibular pre-molars bilaterally during 8 weeks. The dogs were randomly treated with aPDT using a dye/laser system, scaling and root planning (SRP) or with the association of treatments (SRP+aPDT). Plaque samples were collected at baseline, 1, 3 and 4 weeks and the mean counts of 40 species were determined using DNA-DNA hybridization. Gingival biopsies were removed and the expression of tumor necrosis factor alpha (TNF-&alpha;), receptor activator of NF-kB ligand (RANKL), osteoprotegerin (OPG), matrix metalloproteinase (MMP-1), interleukin (IL) 6, IL-10 and total bacterial load by analysis of 16S rRNA gene were evaluated through RealTime PCR. The results shows that the levels of the majority of the species were reduced one week post therapy for all treatments, however, an increase in counts of Prevotella intermedia (P =0.00), Prevotella nigrescens (P =0.00) and Tannerella forsythia (P =0.00) was observed for aPDT and SRP+aPDT. After 4 weeks a regrowth of Porphyromonas gingivalis (P =0.00) and Treponema denticola (P =0.00), was observed for all treatments, also a strikingly reduction of counts on counts of Aggregatibacter actinomycetemcomitans was observed for the aPDT (P =0.00). For the cytokine pattern the results were similar for all treatments and it was observed a reduction in the expression of cytokines and bacterial load throughout the study. Our results suggest that SRP, aPDT in a single application and SRP+aPDT affects different bacterial species and have similar effects on the expression of cytokines evaluated during the treatment of ligature-induced periodontitis.

Orientador: Marcos José Salvador / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T10:46:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lourenco_CarolineCaramanode_M.pdf: 7003473 bytes, checksum: 01a19e43e829c4233180019cb1a470d8 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Este estudo teve por objetivo a prospecção químico-farmacológica de fotossensibilizadores naturais para aplicação em terapia fotodinâmica (PDT) antimicrobiana e de substâncias bioativas acumuladas no extrato etanólico das folhas de Eugenia chlorophylla (Myrtaceae), bem como a caracterização química e da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais das folhas, caule e flores desta espécie vegetal. Para tanto, procedeu-se o preparo do extrato vegetal bruto (hexânico e etanólico) a partir das folhas de E. chlorophylla e a avaliação da absorção de luz na região espectral do visível de interesse e útil para aplicação em PDT. O extrato bruto etanólico foi submetido a uma extração líquido-líquido com hexano, diclorometano e butanol. Os melhores resultados na avaliação da absorção de luz na região espectral do visível de interesse e útil para aplicação em PDT foram obtidos com o extrato bruto e com a fração diclorometânica da partição, para os quais foram avaliadas suas características fluorescentes em estado estacionário no modo de emissão e excitação (caracterização preliminar de suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas). Desenvolveuse a adequação de metodologia para uma avaliação inicial da eficiência fotoquímica dos extratos e frações obtidos (produção de oxigênio singlete, ensaio, 1,3 - diphenylisobenzofuran (DPBF), bem como adequou-se os procedimentos para a realização dos bioensaios na presença e ausência de luz. Procedeu-se a avaliação da atividade antimicrobiana in vitro com o extrato bruto etanólico e suas frações da partição líquidolíquido, na ausência de irradiação laser, determinando-se os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) para as amostras bioativas e estimando-se os valores de concentração subinibitória que seriam usados na PDT atimicrobiana. Ainda, foram estabelecidos os procedimentos para a padronização do protocolo experimental de PDT antimicrobiana frente a bactérias (Gram positivas e Gram negativas) e leveduras in vitro e avaliou-se o efeito do extrato bruto etanólico e da fração diclorometânica como fotossensibilizadores naturais em PDT antimicrobiana, utilizando-se 11 cepas indicadoras. De acordo com os resultados obtidos o extrato bruto etanólico (ECB) e sua fração diclorometânica (ECD) apresentaram absorção de luz na região de 600 a 800 nm, demonstrou a capacidade de formar oxigênio singlete no ensaio com DPBF quando irradiados pelo laser e apresentou resultado efetivo na inativação de algumas das cepas indicadoras (bactérias e leveduras) em PDT antimicrobiana quando irradiados em sessão única por 5 min com laser diodo InGaAlP, ?=660nm. A partir dos resultados dos ensaios com DPBF e com a utilização de inibidores específicos do mecanismo fotoquímico em modelo biológico sugeriu-se que o mecanismo fotoquímico predominante para ECD é o do tipo II (mediado pela formação de oxigênio singlete). Deu-se inicio ao estudo fitoquímico monitorado pela absorção de luz na região do visível (400 a 830 nm), pela avaliação da eficiência fotoquímica e pelas atividades biológicas. Pelo resultado do estudo de desreplicação por ESI-MS/MS do extrato etanólico bruto e da fração ECD sugeriu-se a presença do ácido quínico nestas amostras. Como as folhas frescas de E. chlorophylla apresentavam odor intenso e neste projeto foi proposto também estudo para a prospecção de substâncias bioativas, realizou-se um estudo para a caracterização química e avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais das folhas, caule e flores desta espécie vegetal. A caracterização química dos constituintes majoritários do óleo essencial foi realizada por cromatografia gasosa (CG-EM). Os óleos essenciais das folhas, caule e flores de E. chlorophylla foram obtidos por hidrodestilação e apresentaram rendimento de 0,01 a 0,1%. Setenta e cinco componentes foram identificados, representando mais de 85% do total do óleo. Os principais componentes detectados nos óleos essenciais foram Ecariofileno (flores), óxido de cariofileno (caule, flores e folhas), globulol (caules e folhas) e T-muurolol, 1-epi-cubenol e ?-cadinol (caule, flores e folhas). Todos os óleos mostraram leve a moderada atividade antimicrobiana (na ausência de radiação laser), sobre principalmente as bactérias Gram positivas e Candida albicans, sendo estes resultados similares ao observado na literatura para esta espécie vegetal, com exceção do óleo do caule, coletado em 2011, que não se mostrou ativo nas condições experimentais utilizadas e é composto, predominantemente (85,4%) por um constituinte alifático para o qual não foi possível identificar a estrutura química por CG-EM. Ainda, observou-se variação nos valores de concentração inibitória mínima frente às cepas bioativas dependendo do ano de coleta e armazenagem dos óleos essenciais obtidos / Abstract: This study aimed at making a chemical-pharmacological search for prospection of natural photosensitizers in photodynamic therapy (PDT) and of bioactive compounds accumulated in the ethanolic extract of leaves from Eugenia chlorophylla (Myrtaceae) and to study the chemical characterization and antimicrobial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of this plant species. For this purpose, we carried out the preparation of the crude plant extract (hexane and ethanol) from the leaves of E.chlorophylla followed by the assessment of light absorption in the visible spectral region of interest could be useful for application in PDT. The crude ethanol extract was subjected to a liquid-liquid extraction with hexane, dichloromethane and butanol. The best results for the absorption of light in the visible spectral region of interest to gets with usefulness for application in PDT were obtained for the crude extract and dichloromethane fraction, which were evaluated for their characteristics in steady-state fluorescent emission mode and excitement (preliminary characterization of photochemical properties). Still, it has adequate methodology was developed for an initial assessment of the photochemical efficiency of extracts (production of singlet oxygen, DPBF test 1.3-diphenylisobenzofuran) as well as the adequate conformed for the achievement of bioassays in the presence and absence of light. Evaluation of antimicrobial activity was carried out in vitro with a crude ethanol extract and their fractions from liquid-liquid partition, in the absence of laser irradiation, determining the values of minimum inhibitory concentration (MIC) in antimicrobial testes for bioactive samples and estimating the sub-inhibitory concentration values which would be used in antimicrobial PDT. Standardization of the experimental protocol of in vitro antimicrobial PDT was carried out against Gram positive and Gram-negative bacteria and yeast the effect of the crude ethanol extract and the dichloromethane fraction evaluated as natural photosensitizes in antimicrobial PDT using 11indicator strains. According to results obtained from the crude ethanol extract (ECB) and its dichloromethane fraction (ECD) showed light absorption in the region from 600 to 800 nm, it was demonstrated that singlet oxygen was formed in the assay with DPBF when irradiated by laser ( ?=660nm) showed effective results in the inactivation of antimicrobial PDT in some of the indicator strains (bacteria and yeasts) when irradiated in a single session for 5 min with InGaA1P laser diode. Along with the test result with DPBF, research using specific inhibitors of the photochemical mechanism in a biological model suggests that the dominant photochemical mechanism for ECD is the type II (mediated by the formation of singlet oxygen). We carried out the phytochemical study monitored by light absorption in the visible region (400 to 830nm), in which the evaluation of photochemical efficiency and biological activities and the results of the study of dereplication of the crude ethanolic extract and the ECD fraction by ESI-MS/MS suggest the presence of quinic acid in these samples. Since the fresh leaves of E. chlorophylla have an intense smell and this project also contemplated a search for bioactive substances a study was carried out for the chemical characterization and antimicrobial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of the plant species. The chemical characterization of the major constituents of the essential oil was performed by gas chromatography (GC-MS). Essential oils from leaves, stems and flowers of E. chlorophylla were obtained by hydrodistillation and presented a yield of 0.01 to 0.1%. Seventy-five compounds were identified, representing over 85% of the total oil. The main components were E-caryophyllene (flowers), caryophyllene oxide (stem, leaves and flowers), globulol (stems and laves) and T-muurolol, 1-epi-? cubenol, and ?-cadinol (stem, leaves and flowers). All essential oils studied showed mild to moderate antimicrobial activity mainly associated with Gram positive bacteria and Candida albicans with results similar to those observed in the literature for this plant species. An exception was the stem oil collected in 2011 that was not active in the experimental conditions used and is constituted predominantly (85.4%) for an aliphatic constituent not identified by GC-MS. Was verified variation in the minimum inhibitory concentration values of essential oils of E. chlorophylla with the year of collect and with storage time / Mestrado / Biologia Vegetal / Mestre em Biologia Vegetal

Orientador: Prof. Dr. Anderson Orzari Ribeiro / Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia/Química, Santo André, 2017. / Neste trabalho apresentamos a sintese e caracterizacao de derivados de xantenos para emprego como fotossensibilizadores em Terapia Fotodinamica. A sintese de 08 diferentes compostos foi realizada utilizando-se o alcool resorcinol e derivados do anidrido ftalico, na presenca de ZnCl2. Foram utilizadas tecnicas como RMN de 1H, FTIR, espectrometria de massas para comprovar as estruturas e a pureza dos compostos sintetizados. Em solucao aquosa, empregando tecnicas para obter os espectros de absorcao, excitacao e emissao na regiao do UV-vis, foi possivel observar que os compostos apresentam altos valores de coeficiente de absortividade molar, baixos valores de rendimento quantico de fluorescencia (¿¶F) e alto valores de oxigenio singlete (¿¶¿'), conjunto de propriedades estas que os tornam interessantes compostos para serem estudados como fotossensibilizadores em TFD. No processo de Inativacao Fotodinamica os compostos apresentaram bons resultados para microorganismos Gram-positivos, apresentando alta taxa de inibicao no crescimento de suas colonias e ate mesmo a morte destes no caso dos derivados halogenados. / In this work we present the synthesis and characterization of xanthenes for application as photosensitizers in Photodynamic Therapy. The 08 compounds studied were synthesized by reaction of phthalic anhydride derivatives with resorcinol and ZnCl2 and were characterized by spectroscopic and spectrometric techniques such as FTIR, 1H NMR and UV-vis. The fluorescence quantum yield (....), and singlet oxygen quantum yield (....) in biological media indicate that these compounds are good candidates for photosensitizers. In the Photodynamic Inactivation, the compounds presented good results for Gram-positive microorganisms, with high inhibition rate in the growth and death, in the case of halogenated derivatives.

The persistence of microorganisms in the root canal system after chemical-mechanical preparation plays an important role in the success rate of endodontic treatment. Photodynamic Therapy in endodontics appeared to be a supplement to the disinfection of root canals aiming resolve this persistence. When questioning what the actual antibacterial effect of this treatment in clinical endodontics, we face numerous formulations and concentrations of the photosensitizer used, as well as numerous methodologies to test its antimicrobial activity, offering confusing and inconclusive results. The aim of this study was to evaluate the in vitro antibacterial activity against two strains of Enterococcus faecalis ATCCs 29212 and 51299, of the methylene blue photosensitizer (PS) in different formulations and concentrations cited in the literature. The method used to evaluate the antibacterial activity of the photosensitizer was the microdilution to determine the minimum inhibitory concentration. The 18 test substances, in the literature, were left in contact for five minutes in each well and then followed by the application of the laser (660 nm, Kondortech®, São Carlos, SP, Brazil) for three minutes. The tests were performed according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2013). After the incubation period at 35 ± 2 ° C 18-24hs, read visually observing the bacterial growth and is considered where the inhibitory substances were wells without turbidity and / or deposition of sediments at the bottom was carried out. Dissolved in a mixture of 2% chlorhexidine and H₂O₂ (substance 15), and a mixture of glycerol, ethanol, water, hydrogen peroxide and Triton X100 detergent (substance 10) PS inhibited the growth of Enterococcus faecalis resistant microorganism 29212. For the addition of these the mixture PS glycerol, ethanol, and water (substance 13) also showed an inhibitory power. No concentration of methylene blue dissolved in water (300 to 7.5 μmol / L) had able to inhibit the growth of the strains analyzed. Given the literature reviewed and the results of the study to predict the efficacy of PDT against microorganism problem in endodontics, a standardization of the optimal formulation of PS, its contact time and also of important laser parameters is still necessary, as full power , creep and irradiation time. / A permanência dos microrganismos no sistema de canais radiculares após o preparo químico-mecânico desempenha um importante papel na taxa de sucesso do tratamento endodôntico. A Terapia Fotodinâmica surgiu na endodontia para ser um suplemento à desinfecção dos canais radiculares visando dirimir essa persistência. Ao questionarmos qual o real efeito antibacteriano desse tratamento na clínica de endodontia, nos deparamos com inúmeras formulações e concentrações usadas do fotossensibilizador, bem como inúmeras metodologias para testar sua atividade antimicrobiana, oferecendo resultados confusos e não conclusivos. O objetivo deste estudo foi avaliar in vitro a atividade antibacteriana, frente a duas cepas de Enterococcus faecalis ATCCs 29212 e 51299, do agente fotossensibilizador (FS) azul de metileno em diferentes concentrações e formulações citadas na literatura. O método empregado para avaliar a atividade antibacteriana do fotossensibilizador foi a microdiluição em caldo com a determinação da concentração inibitória mínima. As 18 substâncias-teste, citadas na literatura, foram deixadas em contato por cinco minutos em cada poço e então, seguiu-se a aplicação do laser (660nm, Kondortech®, São Carlos, SP, Brazil) por três minutos. Os testes foram realizados de acordo com o Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2013). Após o período de incubação de 18-24hs a 35±2ºC, foi realizada a leitura visual observando o crescimento bacteriano, sendo consideradas inibitórias as substâncias onde os poços estavam sem turbidez e/ou depósito de sedimentos no fundo. O FS dissolvido numa mistura de H₂O₂ e clorexidina 2% (substância 15) e numa mistura de glicerol, etanol, água, peróxido de hidrogênio e detergente Triton X100 (substância 10) inibiram o crescimento do Enterococcus faecalis 29212. Para o microrganismo resistente além destas, a mistura do FS em glicerol, etanol e água (substância 13) também apresentou poder inibitório. Nenhuma concentração de azul de metileno dissolvido em água (300 a 7,5 μmol/L) apresentou poder de inibir o crescimento das cepas estudadas. Diante da literatura pesquisada e dos resultados do estudo, para predizer a eficácia da TFD frente ao microrganismo problema na endodontia, ainda é necessário uma padronização da formulação ideal do FS, seu tempo de contato e ainda, de parâmetros importantes do laser, como potência total, fluência e tempo de irradiação.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed to evaluate the histological effect of different formulations of Methylene Blue (MB) used in antimicrobial Photodynamic Therapy (aPDT) as adjuvant to conventional treatment, on gingival collagen fibers in the treatment of periodontal disease induced in rats. In this study were used 120 male rats (Rattus Novergicus, Wistar lineage). The periodontitis was induced by placing a ligature on right mandibular first molar in 105 rats. After 7 days, they were removed and the animals were randomized in 5 groups: NC negative control; PC positive control (no treatment); SRP - scaling and root planning (SRP) and periodontal pocket irrigation with saline solution; aPDT SRP + aPDT (with MB 0,01% dissolved in water + laser); aPDT/ethanol SRP + aPDT (with MB 0,01% dissolved in solvents containing ethanol 20% + laser). The NC animals received neither periodontitis induction nor treatment. Five animals of NC and PC and ten animals of SRP, aPDT and aPDT/ethanol are euthanized 7, 15 and 30 days after treatment. Gingival samples were collected to the quantification of collagen fibers and descriptive analysis of collagen type I and III proportion and organization. Data were analyzed with ANOVA and multilevel Poisson regression analysis. The animals of NC, PC, SRP, aPDT and aPDT/ethanol showed percentage of collagen fibers area of 67,99%, 45,71%, 58,39%, 71,70% and 72,37%, respectively, but no statistical difference was seen in aPDT and aPDT/ethanol; the collagen fibers area was higher at 30 days (71,37%) than at 7 days (60,25%) and at 15 days (63,12%) after treatment, showing statistical difference only at 30 days (ANOVA). Considering multivariate Poisson regression analysis, aPDT and aPDT/ethanol showed 6% higher rate of collagen fibers organization when compared to NC (p<0,05); this organization increased 5% at 15 days after treatment and 19% at 30 days when compared to 7 days (p<0,05). The action of different formulations of MB was similar concerning the quantity and organization of gingival collagen fibers, presenting higher collagen type I quantity, parallel and dense alignment at 30 days after treatment. According to the experimental model used in this study, the ethanol presence in MB formulation doesn t interfere on collagen fibers quantity and quality of collagen fibers in periodontal wound healing. This study suggests the aPDT could be a promising alternative to periodontal disease treatment as adjuvant to conventional treatment. / Este estudo objetivou avaliar histologicamente o efeito de diferentes formulações de Azul de Metileno (AM), na Terapia Fotodinâmica antimicrobiana (TFDa), como adjuvante ao tratamento periodontal convencional, sobre as fibras colágenas do tecido gengival no tratamento da doença periodontal induzida em ratos. Neste estudo, foram utilizados 120 ratos machos (Rattus Novergicus, linhagem Wistar). A periodontite foi induzida pela colocação de ligaduras no molar inferior direito em 105 ratos. Decorridos 7 dias, as ligaduras foram removidas e os animais foram randomizados em 5 grupos: CN - controle negativo; CP - controle positivo (sem tratamento); RAR - raspagem e alisamento radicular (RAR) e irrigação da bolsa periodontal com solução salina; TFDa - RAR + TFDa (com AM a 0,01% dissolvido em água + laser); e TFDa/etanol - RAR + TFDa (com AM a 0,01% dissolvido em solventes contendo etanol a 20% + laser). Os animais do CN não foram submetidos à indução de doença ou tratamento. Cinco animais de CN e CP e dez animais de RAR, TFDa e TFDa/etanol foram eutanasiados em 7, 15 e 30 dias após os tratamentos. Amostras de tecido gengival foram coletadas para quantificação das fibras colágenas e análise descritiva da proporção e organização dos tipos I e III de colágeno. Dados foram analisados com ANOVA e análise multinível de Regressão de Poisson. Os animais de CN, CP, RAR, TFDa e TFDa/etanol mostraram percentual de área das fibras colágenas de 67,99%, 45,71%, 58,39%, 71,70% e 72,37%, respectivamente, porém nenhuma diferença estatística foi observada entre TFDa e TFDa/etanol; a área das fibras colágenas foi maior aos 30 dias (71,37%) do que aos 7 dias (60,25%) e aos 15 dias (63,12%) após o tratamento, apresentando diferença estatística somente aos 30 dias (ANOVA). Considerando a análise multivariada da Regressão de Poisson, TFDa e TFDa/etanol apresentaram uma taxa 6% maior de organização das fibras colágenas quando comparados ao CN (p<0,05); tal organização aumentou 5% aos 15 dias após o tratamento e 19% aos 30 dias, quando comparados aos 7 dias (p<0,05). A ação das diferentes formulações do AM foi semelhante no que diz respeito à quantidade e organização das fibras colágenas do tecido gengival, apresentando maior quantidade de colágeno tipo I, com alinhamento paralelo e denso aos 30 dias após o tratamento. De acordo com o modelo experimental utilizado neste estudo, a presença do etanol na formulação do AM não interfere na quantidade e na qualidade das fibras colágenas frente ao processo de cicatrização periodontal. Este estudo sugere que a TFDa pode ser uma alternativa promissora para o tratamento da doença periodontal como adjuvante ao tratamento convencional.

Resumo: A utilização da PDT para tratamento de diferentes tipos de infecções, tal como a candidose bucal, tem sido estudada. Entretanto, poucos são os dados científicos que relatam os possíveis efeitos tóxicos dessa terapia. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da irradiação na mucosa bucal de ratos com LED azul (de 460 nm e potência de 200 mW/cm2) em presença do fotossensibilizador (FS) Photogem®, em duas diferentes concentrações (500 mg/L e 1000 mg/L). Para isso, foram utilizados 101 ratos (Rattus Norvegicus Albinus Holtzman) distribuídos em 6 grupos, de acordo com os seguintes tratamentos: Grupo 1 - controle; Grupo 2 - aplicação do FS (500 mg/L); Grupo 3 - aplicação do FS (500 mg/L) e irradiação com LED; Grupo 4 - aplicação do FS (1000 mg/L); Grupo 5 - aplicação do FS (1000 mg/L) e irradiação com LED; e Grupo 6 - irradiação com LED. O FS foi aplicado por 30 minutos (tempo de pré-incubação) e o tempo de irradiação da mucosa foi de 20 minutos (dose de 144 J/cm2). Decorridos os 4 períodos de avaliação propostos (0 dia, 1dia, 3 dias e 7 dias), os animais tiveram a mucosa palatina fotografada para análise macroscópica, sendo então imediatamente sacrificados para remoção cirúrgica do palato e posterior análise em microscopia de luz e de fluorescência. Um mapeamento térmico foi realizado a fim de avaliar a variação de temperatura ocorrida no tecido durante a irradiação com LED. Macroscopicamente, em todos os grupos experimentais e para todos os períodos de avaliação propostos na presente pesquisa, observou-se que a mucosa apresentava-se intacta, com aspecto de normalidade semelhante ao do Grupo 1 (controle). Microscopicamente, alterações teciduais, caracterizadas especialmente por discreta inflamação, puderam ser observadas na mucosa palatina de apenas 4 de um total de 80 animais submetidos a PDT... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The use of PDT has been investigated for the treatment of different types of infection, like oral candidosis. There are, however, few research-based data that report the possible toxic effects of this therapy. Therefore, this study evaluated the effects of irradiating the palatal mucosa of rats with blue LED (460 nm; 200 mW/cm²) in the presence of the photosensitizer Photogem® at two concentrations (500 and 1000 mg/L). Then, 101 rats (Rattus norvegicus albinus Holtzman) were randomly distributed in six groups, according to the treatment performed on the palatal mucosa: Group 1: control; Group 2: Photogem® (500 mg/L); Group 3: Photogem® (500 mg/L) + blue LED; Group 4 - Photogem® (1000 mg/L); Group 5: (1000 mg/L) + blue LED; and Group 6: blue LED. The exposure times to the photosensitizing agent and to the light source were 30 min (pre-incubation time) and 20 min (144 J/cm2 energy density), respectively. At 0, 1, 3 and 7 days posttreatment, the animals had their palatal mucosa photographed for macroscopic analysis and were immediately sacrificed. The palate was removed for further analysis by light and fluorescence microscopy. Thermal mapping was made to evaluate the temperature change occurred in the tissue during LED irradiation. In all experimental groups and periods, the macroscopic analysis revealed intact mucosa with normal aspect similar to that of Group 1 (control). Tissue alterations, characterized primarily by a mild inflammation, were observed microscopically on the mucosa of only 4 out of 80 animals subjected to PDT. Photosensitizer penetration into the treated mucosa was identified by the fluorescence emitted by Photogem® and was limited to the epithelial layer. The thermal mapping revealed a temperature increase from 35 to 41ºC during the 20-min irradiation. In conclusion, under the tested conditions, PDT using Photogem® at 500 and 1000 mg/L concentrations... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Coorientador: Carlos Alberto de Souza / Banca: Eunice Teresinha Giampaolo / Banca: Cristina Kuraschi / Mestre

AIMS: The rapidly growing industrial and medical use of nanomaterials, especially zinc oxide and titanium dioxide, has led to growing concerns about their toxicity. Accordingly, the intrinsic genotoxic and cytotoxic potential of these nanoparticles have been evaluated. MATERIALS & METHODS: Using a HEp-2 cell line, cytotoxicity was tested along with mitochondrial activity and neutral red uptake assays. The genotoxic potential was determined using the Comet and the cytokinesis-blocked micronucleus assays. In addition, tyrosine phosphorylation events were investigated. RESULTS & CONCLUSION: We found concentration- and time-dependent cytotoxicity and an increase in DNA and cytogenetic damage with increasing nanoparticle concentrations. Mainly for zinc oxide, genotoxicity was clearly associated with an increase in tyrosine phosphorylation. Our results suggest that both types of nanoparticles can be genotoxic over a range of concentrations without being cytotoxic.

Photosensitizing effects of xenobiotics are of increasing concern in public health since modern lifestyle often associates sunlight exposure with the presence of chemical substances in the skin. An important number of chemicals like perfumes, sunscreen components, or therapeutic agents have been reported as photosensitizers. In this context, a considerable effort has been made to design a model system for photosafety assessment. Indeed, screening for phototoxicity is necessary at the early phase of drug discovery process, even before introducing drugs and chemicals into clinical therapy, to prevent undesired photoreactions in humans. In the case of new pharmaceuticals, their phototoxic potential has to be tested when they absorb in the regions corresponding to the solar spectrum, that is, for wavelengths >290 nm. So, there is an obvious need for a screening strategy based on in vitro experiments. The goal of the present thesis was the photochemical study of different photoactive drugs to investigate the key molecular aspects responsible for their photosensitivity side effects. In a first stage, rosuvastatin was considered in chapter 3 as representative compound of the statin family. This lipid-lowering drug, also known as “superstatin”, contains a 2-vinylbiphenyl-like moiety and has been previously described to decompose under solar irradiation, yielding stable dihydrophenanthrene analogues. During photophysical characterization of rosuvastatin, only a long-lived transient at ca. 550 nm was observed and assigned to the primary photocyclization intermediate. Thus, the absence of detectable triplet-triplet absorption and the low yield of fluorescence ruled out the role of the parent drug as an efficient sensitizer. In this context, the attention was placed on the rosuvastatin main photoproduct (ppRSV). Indeed, the photobehavior of this dihydrophenanthrene-like compound presented the essential components needed for an efficient biomolecule photosensitizer i.e. (i) a high intersystem crossing quantum yield (ΦISC =0.8), (ii) a triplet excited state energy of ca. 67 kcal mol−1 , and (iii) a quantum yield of singlet oxygen formation (Φ∆) of 0.3. Furthermore, laser flash photolysis studies revealed a triplet-triplet energy transfer from the triplet excited state of ppRSV to thymidine, leading to the formation of cyclobutane thymidine dimers, an important type of DNA lesion. Finally, tryptophan was used as a probe to investigate the Type I and/or Type II character of ppRSV-mediated oxidation. In this way, both an electron transfer process giving rise to the tryptophanyl radical and a singlet oxygen mediated oxidation were observed. On the basis of the obtained results, rosuvastatin, through its major photoproduct ppRSV, should be considered as a potential sensitizer. Then, itraconazole (ITZ), a broad-spectrum antifungal agent, was chosen as main character of chapter 4. Its photochemical properties were investigated in connection with its reported skin photosensitivity disorders. Steady state photolysis, fluorescence and phosphorescence experiments were performed to understand ITZ photoreactivity in biological media. The drug is unstable under UVB irradiation, suffering a primary dehalogenation of the 2,4-dichlorophenyl moiety that occurs mainly at the ortho-position. In poorly H-donating solvents, as acetonitrile, the major photoproduct arises from intramolecular attack of the initially generated aryl radical to the triazole ring. In addition, reduced compounds resulting from homolytic cleavage of the C-Cl bond in ortho or para positions and subsequent Habstraction from the medium are obtained to a lesser extent. In good H-donating solvents, such as ethanol, the main photoproducts are formed by reductive dehalogenation. Furthermore, irradiation of a model dyad containing a tryptophan unit and the reactive 2,4-dichlorophenyl moiety of itraconazole leads to formation of a new covalent link between these two substructures revealing that homolysis of the C-Cl bond of ITZ can result in alkylation of reactive amino acid residues of proteins, leading to formation of covalent photoadducts. Therefore, it has been established that the key process in the photosensitization by itraconazole is cleavage of the carbon-halogen bond, which leads to aryl radicals and chlorine atoms. These highly reactive species might be responsible for extensive free radical-mediated biological damage, including lipid peroxidation or photobinding to proteins. In chapter 5, photobehavior of imatinib (IMT) was addressed. This is a promising tyrosine kinase inhibitor used in the treatment of some types of human cancer, which constitutes a successful example of rational drug design based on the optimization of the chemical structure to reach an improved pharmacological activity. Cutaneous reactions, such as increased photosensitivity or pseudoporphyria, are among the most common nonhematological IMT side effects; however, the molecular bases of these clinical observations have not been unveiled yet. Thus, to gain insight into the IMT photosensitizing properties, its photobehavior was studied together with that of its potentially photoactive anilino-pyrimidine and pyridyl-pyrimidine fragments. In this context, steady-state and time resolved fluorescence, as well as laser flash photolysis experiments were run, and the DNA photosensitization potential was investigated by means of single strand breaks detection using agarose gel electrophoresis. The obtained results revealed that the drug itself and its anilino-pyrimidine fragment are not DNA-photosensitizers. By contrast, the pyridyl-pyrimidine substructure displayed a marked photogenotoxic potential, which was associated with the generation of a long-lived triplet excited state. Interestingly, this reactive species was efficiently quenched by benzanilide, another molecular fragment of IMT. Clearly, integration of the photoactive pyridyl-pyrimidine moiety in a more complex structure strongly modifies its photobehavior, which in this case is fortunate as it leads to an improved toxicological profile. Thus, on the bases of the experimental results, direct in vivo photosensitization by IMT seems unlikely. Instead, the reported photosensitivity disorders could be related to indirect processes, such as the previously suggested impairment of melanogenesis or the accumulation of endogenous porphyrins. Finally, a possible source of errors in the TEMPO/EPR method for singlet oxygen detection was analyzed. For many biological and biomedical studies, it is essential to detect the production of 1O2 and to quantify its production yield. Among the available methods, detection of the characteristic 1270 nm phosphorescence of singlet oxygen by time-resolved near infrared (TRNIR) emission constitutes the most direct and unambiguous approach. An alternative indirect method is electron paramagnetic resonance (EPR) in combination with trapping. This is based on the detection of the TEMPO free radical formed after oxidation of TEMP (2,2,6,6- tetramethylpiperidine) by singlet oxygen. Although the TEMPO/EPR method has been largely employed, it can produce misleading data. This was demonstrated by the present study, where the quantum yields of singlet oxygen formation obtained by TRNIR emission and by the TEMPO/EPR method were compared for a set of well-known photosensitizers. The results revealed that the TEMPO/EPR method leads to significant overestimation of singlet oxygen yield when the singlet or triplet excited state of the photosensitizers were efficiently quenched by TEMP, acting as electron donor. In such case, generation of the TEMP+• radical cation, followed by deprotonation and reaction with molecular oxygen gives rise to a EPR detectable TEMPO signal that is not associated with singlet oxygen production. This knowledge is essential for an appropriate and error-free application of the TEMPO/EPR method in chemical, biological and medical studies. / Nardi, G. (2014). MECHANISTIC STUDIES ON THE PHOTOTOXICITY OF ROSUVASTATIN, ITRACONAZOLE AND IMATINIB [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48535