This thesis attempts to broaden what is known about bacterial symbionts within amoebae by the use of a number of different molecular methods. Initially a number of different amoeba strains were screened for bacterial symbionts by 16S rRNA gene PCR, then the symbionts were identified by comparative sequence analysis and phylogenetic analysis. The amoeba strains containing bacterial symbionts were characterised by cell morphology, 18S rRNA gene sequencing, internal transcribed spacer sequencing and allozyme electrophoresis. Amoebae belonging to the genera Acanthamoeba, Naegleria, Ripidomyxa and Saccamoeba were identified as containing symbionts that belonged to a wide range of different bacterial genera. Relationships between bacterial symbionts and their host amoebae were analysed by the use of transmission electron microscopy and fluorescent in situ hybridisation using symbiont specific probes. Also described are attempts that were made to isolate and grow the bacterial symbionts outside of their host amoebae as well as experiments to try to transfer bacterial symbionts from one amoeba strain to another. Lastly the results from this study are discussed as a whole to put into perspective how they contribute to the body of knowledge of symbionts within protozoa.

O mamastrovirus 5 (MAstV5) é classificado no gênero Mamastrovirus da família Astroviridae, sendo associado com surtos agudos de gastroenterite transitória em filhotes de cães ao redor do mundo. O objetivo desta dissertação foi detectar e analisar a variabilidade genética dos MAstV5 circulantes em cães no Brasil. Para isto, amostras de suabe retal foram coletadas de 269 cães de diferentes regiões do Brasil no período de 2008-2014, dos quais 26,39% foram positivos para MAstV5 através de RT-PCR convencional e de RT-Hemi-nested PCR, amplificando porção conservada do gene do capsídeo e do gene da polimerase, respectivamente. Quatro destas cepas tiveram seu genoma parcialmente sequenciado, caracterizado e analisado filogeneticamente. A caracterização dessas amostras revelou uma notável heterogeneidade genética entre as cepas de MAstV5. A baixa identidade entre as sequências do gene do capsídeo (<85%) indicaria uma possível nova classificação entre a espécie MAstV5 em dois genótipos. Conclue-se que o MAstV5 ocorre em cães no Brasil e as cepas circulantes possuem uma grande diversidade genética. / The Mamastrovirus 5 (MAstV5) is classified in the genus Mamastrovirus of the Astroviridae family, being associated with acute episodes of transient gastroenteritis in puppies around the world. The aim of this work was to detect and analyze the genetic variability of circulating MAstV5 in dogs in Brazil. For this, rectal swab samples were collected from 269 dogs from different regions of Brazil in the 2008-2014 period, of which 26.39% were positive for MAstV5 by conventional RT-PCR and RT-Hemi-nested PCR, amplifying conserved portion of the capsid gene and polymerase gene, respectively. Four of these strains had its genome sequenced partially characterized and analyzed phylogenetically. The characterization of these samples revealed a remarkable genetic heterogeneity among strains of MAstV5. The low identity between the sequences of capsid gene (<85%) indicate a possible new classification between the two genotypes MAstV5 species. We conclude that the MAstV5 occurs in dogs in Brazil and circulating strains have a high genetic diversity.

Vertebrates show dramatic interspecific variation in the size of their brains. The complexity of brains is considered to be the key factor of evolutionary success in Vertebrates, and therefore an evolutionary trend towards increasing brain size and coplexity is assumed. Large and complex brains evolved independently in birds and mammals. Birds have brains that are comparable in their relative size to the brains of mammals. However, in stark contrast to mammals, there is no general trend towards increase of brain size in birds. Relatively large brains have evolved independently in many avian lineages. Highly encephalised orders are parrots (Psittaciformes), woodpeckers and relatives (Piciformes), hornbills, hoopoe and wood hoopoes (Bucerotiformes), owls (Strigiformes), storks (Ciconiiformes) and several families of songbirds (Passeriformes), mainly bowerbirds (Ptilorhynchidae) and corvids (Corvidae). Otherhighlyencephalizedgroupsarenon-parasiticcuckoos(genusCentropus,Phaenicophaeus and Coua) and family Diomeidea and genus Pelecanus belonging to the clade water birds. Less encephalized groups include the basal lineages such as paleognaths and fowl (Galloanserae), and also pigeons (Columbiformes) and swifts, treeswifts and hummingbirds (Apodiformes). We suggest that this mosaic evolution is result of...

The complete sequence of mitochondrial DNA from Diuraphis noxia was obtained and characterized. The mitogenome contains a standard set of 13 protein-coding genes, 19 tRNA genes, 2 ribosomal RNA genes. A+T-rich and ?repets? regions in the same order as those of the other analyzed aphids. Comparison to mtDNAs from other Sternorrhyncha species obtained from GenBank revealed possible markers for studies on population differentiation. Phylogenetic analysis using parsimony and maximum likelihood confirmed the classification of Diuraphis noxia into the Aphididae.

Rabies is an infectious disease of the central nervous system caused by the rabies virus (RABV), which affects all mammals. In Brazil the rabies has caused considerable losses to cattle herds in various regions. The official diagnosis is made by the fluorescent antibody technique (FAT) concomitantly with biological assay, usually the mouse inoculation tests (MIT). The MIT is considered a sensitive, specific and effective technique for rabies diagnosis, but has disadvantages such as long time to obtain the results and the need to use animals. The first paper of this dissertation describes a molecular and epidemiological investigation of outbreaks of bovine rabies occurring in the central region of Rio Grande do Sul state, Brazil, between May and August 2012. In this period, 45 cases suspected of rabies were reported in 22 small herds, located within a 4.7km range, in the county of Pinhal Grande. From these, 32 samples were submitted to rabies diagnosis and RabV and/or viral antigens were identified in 27 samples. Subsequently, 11 brain samples were submitted to reverse transcription/polymerase chain reaction (RT-PCR) for the nucleoprotein gene (N) followed by nucleotide sequencing and phylogenetic analysis. Seven out of 11 samples yielded identical sequences; one presented a synonymous, non-coding mutation, indicating a likely common origin of the virus. However, three other samples presented nucleotide mutations which resulted in amino acid changes, suggesting a different origin of the virus. In summary, these results suggest that RabV strains of different origin/lineages co-circulate in the region and were involved in the outbreaks. The second paper describes an evaluation of sensitivity for VI of Rabv in neuroblastoma cells (N2A) and baby hamster kidney cells (BHK-21). For this, thirty-six samples derived bovine brains of suspected rabies cases were initially submitted to the FAT and MIT test and subsequently to three protocols VI in each cell line: a single pass 24h and 72h, and three passes 48h. The average time to obtain final results at MIT was 12.3 days (8-21). The average time required for final MIT results was 12.3 days (8 21). The FAT and MIT combined detected 32/36 positive samples, these MIT detected 32 (100%) and the FAT detected 31 (96.8%). The isolation in BHK-21 cells resulted in 100% (32/32) positivity in the protocol of 72h and 96.9% (31/32) after three passages of 48h. The isolation in N2A cells resulted in 100% (32/32) positive for 72h and 30/32 (93.7%) samples 48h after three passages. A single 24h passage protocol (T1) in both cell lines performed poorly, detecting less than 40% of the positive samples. These results indicate that VI in either cell line, especially in BHK-21 cells that grow faster and are much easier to maintain than N2A cells, does represent an adequate alternative for MIT as a confirmatory test for rabies diagnostic in bovine specimens, yielding reliable results in reduced time. / A raiva é uma doença infecciosa do sistema nervoso central causada pelo vírus da raiva (RabV), que afeta todos os mamíferos. No Brasil a raiva tem causado consideráveis perdas a rebanhos bovinos em diversas regiões. O diagnóstico oficial é realizado pela técnica de imunofluorescência direta (FAT) de forma concomitante com a prova biológica, geralmente a inoculação intracerebral em camundongos (MIT). A MIT é considerada uma técnica sensível, específica e eficaz para o diagnóstico da raiva, porém apresenta desvantagens como o longo tempo para obtenção dos resultados e a necessidade de uso de animais. O primeiro artigo da presente dissertação descreve uma investigação epidemiológica e molecular de surtos de raiva ocorridos na região central do Rio Grande do Sul, entre maio e agosto de 2012. Nesse período, 45 casos suspeitos de raiva foram relatados em 22 rebanhos, localizados dentro de um raio de 4,7km, no município de Pinhal Grande. Desses, 32 amostras foram submetidas para diagnóstico da raiva, sendo que o RabV e/ou antígenos virais foram identificados em 27 amostras. Em um segundo momento, 11 amostras foram submetidas à transcrição reversa - - reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para o gene da nucleoproteína (N) do RabV, seguido de sequenciamento nucleotídico e análise filogenética. Sete das 11 amostras apresentaram sequências nucleotídicas idênticas e uma apresentou mutação sinônima, não-codificante, indicando uma provável origem comum dos vírus. Por outro lado, três amostras apresentaram mutações que resultaram em alterações de aminoácidos, sugerindo uma origem diferente do vírus. Esses resultados sugerem que RabV de diferentes origens/linhagens co-circulam na região e foram envolvidos nos surtos descritos. O segundo artigo descreve a avaliação da sensibilidade ao isolamento do RabV em linhagens de células de neuroblastoma murino (N2A) e rim de hamster neonato (BHK-21). Para isso, trinta e seis amostras de cérebros bovinos oriundos de casos suspeitos de raiva foram inicialmente submetidas ao teste de FAT e MIT e, subsequentemente, a três protocolos de VI em cada linhagem celular: uma única passagem de 24h e 72h, e três passagens de 48h. O tempo médio necessário para obtenção de resultados finais na MIT foi de 12,3 dias (8-21). A FAT e MIT combinadas detectaram 32/36 amostras positivas. Dessas, a MIT detectou 32 (100%) e a FAT detectou 31 (96,8%). O tempo médio necessário para obter os resultados conclusivos na MIT foi de 12,3 dias (8-21). O isolamento em células BHK-21 resultou em 100% (32/32) de positividade no protocolo de 72h e em 96,9% (31/32) após três passagens de 48h. Em células N2A o isolamento resultou em 100% (32/32) das amostras positivas em 72h e em 30/32 (93,7%) após três passagens de 48h. Uma única passagem de 24h em ambas as linhagens mostrou um baixo desempenho, detectando menos de 40% das amostras positivas. Estes resultados indicam que o isolamento viral em qualquer uma das linhagens representa uma boa alternativa para a MIT como um teste confirmatório para o diagnóstico da raiva em amostras de bovinos, produzindo resultados confiáveis em tempo reduzido.

O mamastrovirus 5 (MAstV5) é classificado no gênero Mamastrovirus da família Astroviridae, sendo associado com surtos agudos de gastroenterite transitória em filhotes de cães ao redor do mundo. O objetivo desta dissertação foi detectar e analisar a variabilidade genética dos MAstV5 circulantes em cães no Brasil. Para isto, amostras de suabe retal foram coletadas de 269 cães de diferentes regiões do Brasil no período de 2008-2014, dos quais 26,39% foram positivos para MAstV5 através de RT-PCR convencional e de RT-Hemi-nested PCR, amplificando porção conservada do gene do capsídeo e do gene da polimerase, respectivamente. Quatro destas cepas tiveram seu genoma parcialmente sequenciado, caracterizado e analisado filogeneticamente. A caracterização dessas amostras revelou uma notável heterogeneidade genética entre as cepas de MAstV5. A baixa identidade entre as sequências do gene do capsídeo (<85%) indicaria uma possível nova classificação entre a espécie MAstV5 em dois genótipos. Conclue-se que o MAstV5 ocorre em cães no Brasil e as cepas circulantes possuem uma grande diversidade genética. / The Mamastrovirus 5 (MAstV5) is classified in the genus Mamastrovirus of the Astroviridae family, being associated with acute episodes of transient gastroenteritis in puppies around the world. The aim of this work was to detect and analyze the genetic variability of circulating MAstV5 in dogs in Brazil. For this, rectal swab samples were collected from 269 dogs from different regions of Brazil in the 2008-2014 period, of which 26.39% were positive for MAstV5 by conventional RT-PCR and RT-Hemi-nested PCR, amplifying conserved portion of the capsid gene and polymerase gene, respectively. Four of these strains had its genome sequenced partially characterized and analyzed phylogenetically. The characterization of these samples revealed a remarkable genetic heterogeneity among strains of MAstV5. The low identity between the sequences of capsid gene (<85%) indicate a possible new classification between the two genotypes MAstV5 species. We conclude that the MAstV5 occurs in dogs in Brazil and circulating strains have a high genetic diversity.

Este trabalho faz uma descrição detalhada da morfologia de Ceraeochrysa, mapas de distribuição, listas de ocorrência de espécies em cultivos agrícolas para o Brasil e um estudo das relações filogenéticas entre as espécies do gênero. A análise filogenética incluiu 62 espécies de Ceraeochrysa, quatro espécies de grupos externos ao gênero em vários níveis e 50 caracteres morfológicos. Um total de 11 espécies para as quais havia pouca informação sobre machos foram inseridas na matriz uma a uma em análises separadas, de modo a diminuir o efeito de informação ausente. Foi obtida uma única árvore mais parcimoniosa, que corrobora a hipótese de monofilia do gênero. Das características consideradas sinapomórficas para Ceraeochrysapresença de espermateca alongada e de gonapse, a primeira é plesiomórfica para C. placita e C. intacta (que têm a espermateca no formato pill-box), recuperadas como irmãs do restante de Ceraeochrysa, já a segunda característica está presente também nas espécies de Cryptochrysa. O estudo da morfologia gerou uma quantidade importante de caracteres que poderão ser utilizados em novas análises filogenéticas de Chrysopidae. A maioria das espécies brasileiras de Ceraeochrysa é de distribuição conhecida da Amazônia, da Mata Atlântica e do Cerrado, mas não há informação suficiente para um estudo biogeográfico do gênero. Entre as espécies brasileiras, C. cincta, C. cubana e C. claveri são as que têm maior distribuição geográfica e ocorrem em grande diversidade de plantações agrícolas. / This work has a detailed study of the morphology of Ceraeochrysa, distribution maps for the species of the genus, lists of occurrences in crops of the Brazilian species and a phylogenetic analysis of the relationships between the species of the genus. The phylogenetic study included 62 species of Ceraeochrysa, with four outgroup species and 50 morphological characters. A total of 11 species for which there is missing data for males were included in the matrix one by one and analysed independently, so negative effect of missing data in the analysis could be reduced. The monophyly of the genus was recovered, but no uniquely derived characters were found. Of the features often considered synapomorphies of Ceraeochrysathe presence of an elongated spermatheca and the presence of a gonapsisthe former of spermatheca is plesiomorphic for C. placita and C. intacta (which have pill-box format), recovered as sister species for the remaining of the genus, while a gonapsis was seen to also occur in Criptochrysa. The detailed morphological study resulted in a lot of information that can be used in robust phylogenetic studies of the Chrysopidae. Most of the Brazilian species of Ceraeochrysa are known from the Amazon, the Atlantic Forest and the Cerrado, but there is not information enough for a biogeographic study of the genus. Among the Brazilian species, C. cincta, C. cubana, and C. claveri are those that have most widely distributed and occur in great variety of agricultural crops.

Orientador: Clarice Weis Arns / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T10:06:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Spilki_FernandoRosado_D.pdf: 6085947 bytes, checksum: 7f34cc6e57c39e7467bfe62caa231676 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O Vírus Respiratório Sincicial Bovino (BRSV) é uma causa importante de doença respiratória em bovinos. O BRSV é um membro da família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae, pertencendo ao gênero Pneumovirus. Nos últimos quinze anos, evidências sorológicas e de isolamento do vírus revelaram que o BRSV está circulando no Brasil, causando doença clinicamente evidente ou formas subclínicas da infecção. Na primeira parte do presente trabalho, seis diferentes linhagens celulares foram examinadas quanto a sua susceptibilidade à infecção pelo BRSV, levando em conta a variabilidade entre diferentes isolados e características de crescimento do vírus. Chicken embryo related cells (CER), e células CRIB (MDBK-resistentes à infecção pelo Vírus da Diarréia Viral Bovina, BVDV) foram as mais apropriadas à multiplicação do vírus. Ambas as linhagens permitiram o cultivo do vírus em títulos de até 105,5 DICC50 (Doses Infectantes para 50% dos Cultivos Celulares por 100 IlL)...Observação: O resumo, na íntegra poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) is a major cause of respiratory disease in young cattle. The virus is a member of the Paramyxoviridae family, Pneumovirinae subfamily, belonging to the Pneumovirus genus. During the last fifteen years, serological evidence and isolation of the virus revealed that BRSV is circulating in Brazil, causing clinically evident respiratory disease or subclinical fonns of the infection. In the first part of the present work, susceptibility of six different cell lines to BRSV'"li infection in regard to viral isolate variability and growth characteristics of the virus were examined. Chicken embryo related cells (CER), and bovine CRIB cells (a bovine viral diarrhea virus-resistant clone ofMDBK cells) showed to be the most appropriate for virus multiplication. Both cells provided infectious virus titres ofup to 105,5 TCID50 (50% tissue culture infective doses per 100 flL)...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

O mamastrovirus 5 (MAstV5) é classificado no gênero Mamastrovirus da família Astroviridae, sendo associado com surtos agudos de gastroenterite transitória em filhotes de cães ao redor do mundo. O objetivo desta dissertação foi detectar e analisar a variabilidade genética dos MAstV5 circulantes em cães no Brasil. Para isto, amostras de suabe retal foram coletadas de 269 cães de diferentes regiões do Brasil no período de 2008-2014, dos quais 26,39% foram positivos para MAstV5 através de RT-PCR convencional e de RT-Hemi-nested PCR, amplificando porção conservada do gene do capsídeo e do gene da polimerase, respectivamente. Quatro destas cepas tiveram seu genoma parcialmente sequenciado, caracterizado e analisado filogeneticamente. A caracterização dessas amostras revelou uma notável heterogeneidade genética entre as cepas de MAstV5. A baixa identidade entre as sequências do gene do capsídeo (<85%) indicaria uma possível nova classificação entre a espécie MAstV5 em dois genótipos. Conclue-se que o MAstV5 ocorre em cães no Brasil e as cepas circulantes possuem uma grande diversidade genética. / The Mamastrovirus 5 (MAstV5) is classified in the genus Mamastrovirus of the Astroviridae family, being associated with acute episodes of transient gastroenteritis in puppies around the world. The aim of this work was to detect and analyze the genetic variability of circulating MAstV5 in dogs in Brazil. For this, rectal swab samples were collected from 269 dogs from different regions of Brazil in the 2008-2014 period, of which 26.39% were positive for MAstV5 by conventional RT-PCR and RT-Hemi-nested PCR, amplifying conserved portion of the capsid gene and polymerase gene, respectively. Four of these strains had its genome sequenced partially characterized and analyzed phylogenetically. The characterization of these samples revealed a remarkable genetic heterogeneity among strains of MAstV5. The low identity between the sequences of capsid gene (<85%) indicate a possible new classification between the two genotypes MAstV5 species. We conclude that the MAstV5 occurs in dogs in Brazil and circulating strains have a high genetic diversity.

O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um lentivirus que infecta gatos domésticos (Felis catus), causando uma imunodeficiência progressiva análoga a AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Humana). A ampla heterogeneidade molecular do FIV e a alta capacidade de promover mutações sob pressões imunológicas, farmacológicas ou ambientais são características inerentes aos lentivirus. A identificação do subtipo de vírus e o conhecimento da diversidade genética das cepas circulantes são fundamentais para o desenvolvimento estratégico de vacinas capazes de resultar na imunização do hospedeiro e no estabelecimento de testes diagnósticos. Objetivando isolar o material genético e realizar a caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina foram coletadas e analisadas amostras de sangue periférico de felinos portadores do FIV, co-habitantes de um abrigo aberto de felinos, em São Paulo, SP, em quatro momentos distintos, T0 (zero), no momento inicial da avaliação e seis, dez e quinze meses após a coleta inicial, correspondendo aos momentos T1, T2 e T3, respectivamente. Foram realizados testes hematológicos e bioquímicos nas quatro coletas com a finalidade de avaliar a evolução clínica da infecção. Adicionalmente foi realizado um estudo de variabilidade genética do FIV, com base no sequenciamento dos produtos amplificados dos gene env obtidos no estudo. Os envelopes clonados foram utilizados para transfectar células resultando na expressão das proteínas do envelope que possibilitaram estudos com os receptores celulares utilizados pelos isolados brasileiros. As análises das seqüências virais mostraram que todas as amostras, do abrigo, pertencem ao subtipo B. Foi observado um baixo percentual de mudança, da região estudada do vírus entre as quatro coletas. O fenômeno de &quot;quasispecies&quot; virais, bastante estudado no HIV, pode ser documentado em nossas amostras. Nos exames hematológicos e bioquímicos; hematócrito, hemoglobina, contagem total de leucócitos, proteína total e gamaglobulinas; dos animais infectados pelo FIV observou-se mudanças entre a primeira e quarta coleta demonstrando assim a importância dos testes utilizados no acompanhamento da infecção pelo FIV. Com relação aos dados com os receptores do FIV, os resultados apontam uma menor complexidade na interação entre os envelopes dos isolados do estudo com o receptor CD134 para proceder a infecção quando comparados com cepas virulentas do FIV. / FIV is an important viral pathogen that infects the domestic cat and causes a slow progressive degeneration of the immune system which eventually leads to a disease comparable to acquired immune deficiency syndrome (AIDS) in humans. Similar to all retroviruses, FIV has a relatively high evolutionary rate and genomic heterogeneity. The determination of subtype and the knowledge of genetic diversity of the current strains are very important to developing a protective vaccine and for the routine diagnosis of infection. The aim of this study was to isolate and characterize samples of feline immunodeficiency virus from cats from an open shelter in Sao Paulo, Brazil. All cats infected with FIV from this shelter were sampled on August 26th, 2007 (T0) and also six (T1), ten (T2) and fifteen (T3) months after the basal sampling (T0). In each sample, blood was analyzed for the following: complete hematology, clinical chemistry and serum protein electrophoresis. Hematological and clinical chemistry parameters were analyzed to determine laboratory parameters characteristic of disease progression which allow a better description of the chronic phase of the infection. Furthermore, analyses of the variants from each sample were performed in order to estimate the degree of divergence following infection with Brazilian strains. The FIV envelope glycoprotein gene from Brazilian FIV isolates cloned were transfected to investigate the receptor usage. The sequences of all virus of the study belong to subtype B. Little sequence variation was observed in circulating viruses between the samples from each infected cat. Quasispecies of FIV have been detected in this study. The following hematological and clinical chemistry parameters were changed in the FIV-infected cats between the first blood sampling and last blood sampling: packed cell volume (PCV), hemoglobin, total white blood cells (WBC), total protein and gamma globulin fractions. Monitoring of hematological and clinical chemistry parameters may prove useful for the evaluation of disease progress. Regarding receptors, our data are consistent with isolates of the study requiring a less complex interaction with CD134 for infection to proceed compared to the virulent FIV isolates.