Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A piperina (PPR), uma alcamida presente em varias plantas do genero Piper, ja demonstrou possuir atividades anti-inflamatoria, anti-oxidante e anticonvulsivante. Esse trabalho teve como objetivo avaliar os mecanismos neuroprotetores da PPR, administrada via intraperitoneal (i.p) como pre-tratamento, 30 min antes, as convulsoes induzidas pela pilocarpina 350 mg/kg i.p (P350) em camundongos. Ficou demonstrado que o pretratamento com piperina nas doses de 2.5, 5, 10 e 20 mg/kg, aumentou significativamente os parametros de convulsao e mortalidade induzidos pela P350. Na investigacao dos possiveis mecanismos de acao, a associacao de diazepam (agonista GABAA, via i.p) 15 min antes de PPR 2.5 e 45 min antes da P350 potencializou o aumento da latencia de 1ª convulsao e evitou a morte de todos os animais que convulsionaram. A associacao de flumazenil (antagonista benzodiazepinico) 15 min depois do uso de PPR5, e 30 min antes da P350, reverteu os efeitos inibidores da PPR nas convulsoes e na mortalidade. Alem disso, o pre-tratamento com PPR a P350 aumentou a liberacao de GABA no estriado de camundongos. Considerados juntos, estes efeitos apontam fortemente para o envolvimento do sistema gabaergico no mecanismo de acao protetor da PPR. A associacao da PPR 2.5 com atropina (antagonista muscarinico colinergico), nimodipina (bloqueador de canais de Ca2+), memantina (antagonista dos canais NMDA) ou indometacina (anti-inflamatorio nao esteroidal), nao resultou em mudancas significativas dos parametros observados em relacao ao grupo P350. O pre-tratamento com PPR reverteu a diminuicao provocada pela P350 nos niveis estriatais de glicina e taurina e potencializou o aumento de histidina, o que pode potencializar a acao gabaergica. Deste modo, a PPR aumentou os niveis estriatais de aminoacidos inibitorios da atividade eletrica neuronal. Nao houve alteracoes significativas nos niveis estriatais de glutamato ou noradrenalina nesses grupos em relacao aos animais nao tratados. O pre-tratamento com PPR nao reverteu a reducao dos niveis de dopamina, nem o aumento dos niveis de DOPAC induzidos pela P350 no estriado, demonstrando nao possuir efeito significativo no metabolismo dopaminergico. A administracao aguda da PPR resultou em hiperglicemia e potencializou a decorrente da inducao pela P350. A PPR demonstrou atividade antioxidante ao reverter as elevacoes nos niveis cerebrais e plasmaticos de nitrito induzidas pela P350, bem como atividade citoprotetora ao reduzir a liberacao in vitro de lactato-desidrogenase, possivelmente embasando suas atividades neuroprotetoras. As acoes atividades antinociceptivas e antiinflamatorias perifericas da PPR foram ressaltadas tanto em modelos experimentais in vivo (teste da formalina e edema de pata induzido por carragenina) quanto in-vitro, uma vez que ela reduziu a liberacao induzida de mieloperoxidase. O pre-tratamento com PPR reduziu a imunomarcacao para o NFkB, COX-2 e TNFa no giro denteado do hipocampo, bem como a de TNFa nas areas hipocampais CA1 e CA3 e no cortex cerebral. Portanto, ha fortes evidencias de que o aumento da atividade dos sistemas de neurotransmissores inibitorios promovidos pela PPR, sejam potencializados pelas suas acoes anti-inflamatoria e anti-oxidante perifericas e centrais na promocao dos seus efeitos neuroprotetores. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundo de Auxílio aos docentes e Alunos (FADA) / Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Neurociência Translacional (INCT-INNT) / Cooperação Interinstitucional de Apoio a Pesquisas sobre o Cérebro (CInAPCe) / A epilepsia é um distúrbio que afeta o Sistema Nervoso Central (SNC), sendo a Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) a forma mais freqüente dentre as epilepsias focais em adultos, representando 40% de todos os casos. Sua incidência é de 1-2% da população mundial, com destaque para o sexo feminino por apresentar certas peculiaridades, como ciclo menstrual e período gestacional. Alterações nos níveis dos hormônios sexuais estrógeno e progesterona podem interferir no curso da epilepsia. A produção e liberação destes hormônios são influenciadas pela melatonina, um hormônio sincronizador do ritmo circadiano, e protetor do SNC. Desta forma, uma alteração nos níveis de melatonina poderia interferir na produção dos hormônios esteróides, e influenciar na excitabilidade do SNC. Objetivo: estudar o efeito da pinealectomia na epileptogênese em ratas Wistar adultas, com ciclo estral regular, submetidas ao modelo experimental da pilocarpina, através de análise comportamental e morfológica. Método: 4 grupos: SAL– fêmeas controle (n=5); PNTX+SAL– animais pinealectomizados e que receberam solução salina (n=5); PILO– animais que receberam pilocarpina (n=46); PNTX+PILO– animais pinealectomizados e que receberam pilocarpina (n=47). Os animais do grupo PILO e PNTX+PILO foram vídeo-monitorados por 60 dias após a primeira crise espontânea para estudo dos parâmetros comportamentais e então, perfundidos para técnica de neo-Timm. Resultados: os animais pinealectomizados apresentaram maior freqüência na fase de estro. Os animais PNTX+PILO tiveram diminuição nos períodos de latência para ocorrência da primeira crise após administração de pilocarpina, para ocorrência do SE e ocorrência da primeira crise espontânea, quando comparado com o grupo PILO. A mortalidade durante o SE foi maior no grupo PNTX+PILO, no entanto, a mortalidade por crise tônica foi maior no grupo PILO. Também foi maior no grupo PILO a porcentagem de animais que evoluíram para o SE. Quanto a freqüência de crises e ao grau de brotamento de fribras musgosas, não observamos diferença entre os grupos. Conclusão: A pinealectomia além de promover alterações no ciclo estral da rata, de maneira diferente daquela observada em ratas não pinealectomizadas e submetidas ao modelo da pilocarpina, promove uma epileptogênese menos intensa do que aquela vista em machos pinealectomizados, ou até mesmo em fêmeas intactas ou castradas. / Epilepsy is a disorder that affects Central Nervous System (CNS) and the Temporal Lobe Epilepsy is among the most frequent t ypes of epilepsy representing 40% all cases. Its incidence is 1-2% of the world-w ide population, with prominence for the female sex by presenting peculiarities such as menstrual cycle and gestational period. Alterations in the levels of sexual hormone s estrogen and progesterone can intervene with the course of the epilepsy. The prod uction and release of these hormones are influenced by melatonin a hormone that synchronize the circadian rhythms and promote the protection of the CNS. In t his context alteration in the melatonin levels could intervene with the productio n of sexual hormones and promote alterations in the excitability of the CNS. Objective: In order to study the effects of pinealectomy in the development of the p ilocarpine model of epilepsy in adult female rats, the behavioral and morphological aspects were analyzed. Method : Animals were divided in four groups: SAL - female control (n=5); PNTX+SAL - Pinealectomized animals that received saline (n=5); PILO - Animals that received pilocarpine (n=46); PNTX+PILO - Pinealectomized animals that received pilocarpine (n=47). The animals of PILO and PNTX+PILO groups we re video-monitored 24h/day during 60 days in order to observe the latency to t he first seizure and seizure frequency. After this period the animals were kille d and the brain sections were neo- Timm stained. Results: The pinealectomized animals presented a higher fre quency of the proestrus phase in the estrous cycle. The a nimals of PNTX+PILO group presented a reduced period of latency to occurrence of the first seizure after pilocarpine administration and to occurrence of status epilepticus (SE), as well as, a reduced silent phase when compared with animals of the PILO group. The mortality during SE was increased in PNTX+PILO group, however , the mortality by seizure tonic was increased in the PILO group and this grou p presented an increase rate of animals that evolved to SE. About seizure frequenc y and mossy fiber sprouting we do not observe difference between the groups. Conclusion: Our data showed that the pinealectomy promotes alterations in the estrou s cycle of the female rats in different aspects when compared with female rats no t pinealectomized submitted to the pilocarpine model of epilepsy. On the other han d a less intense epileptogenesis was observed in this rats when compared with castra ted and intact females rats or pinealectomized males rats. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013. / Made available in DSpace on 2013-12-06T00:14:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 320697.pdf: 4138053 bytes, checksum: 396dba9bf591ba65b301e00464ca9436 (MD5) Previous issue date: 2013 / Objetivos: A influência de crises epilépticas nas respostas emocionais observadas em humanos e animais tem sido extensivamente investigada, mas poucos trabalhos têm evidenciado o perfil comportamental de animais que não convulsionam apesar de terem sido tratados com agentes convulsivantes. Com intuito de melhor caracterizar os mecanismos envolvidos nos efeitos induzidos pela pilocarpina (PILO) ? um agonista não seletivo dos receptores muscarínicos -, ratos Wistar adultos machos foram tratados (20 a 350 mg/kg, i.p.) e aqueles que não desenvolveram status epilepticus ou crises recorrentes espontâneas foram avaliados 24 h ou 1 mês após o tratamento no teste do labirinto em cruz elevado (LCE). Além disso, o envolvimento dos receptores GABA-A (diazepam, DZP, i.p., 1 mg/kg; pentilenotetrazol, PTZ, i.p., 15 mg/kg) e NMDA (memantina, i.p., 4 mg/kg) foram investigados para tentar esclarecer os mecanismos neurais implicados nos efeitos da PILO. Registros de eletroencefalograma (EEG) hipocampal, dosagens bioquímicas de corticosterona plasmática (CORT), ACTH e expressão de receptores NMDA foram realizados 24 h ou 1 mês após o tratamento.Resultados: A injeção de PILO (150 ou 350 mg/kg) promoveu efeitos ansiogênicos em ratos avaliados no teste do LCE, com uma diminuição do tempo gasto e número de entradas nos braços abertos do labirinto em comparação aos ratos controle. A injeção de DZP bloqueou os efeitos ansiogênicos observados em ratos tratados com PILO e avaliados 24 h ou 1 mês após o tratamento, aumentou o tempo e número de entradas nos braços abertos do labirinto e a incidência de comportamentos relacionados à avaliação de risco. Por outro lado, a injeção de PTZ não alterou o perfil comportamental de ratos tratados com PILO e avaliados no labirinto, sugerindo a promoção de uma resposta ansiogênica máxima observada nesse grupo. O tratamento com pilocarpina (150 e 350 mg/kg) aumentou o ritmo teta hipocampal embora apenas a dose mais elevada de PILO (350 mg/kg) tenha promovido descargas do tipo ponta-onda durante registros de EEG, mostrando que os efeitos tipo-ansiogênicos observados com a dose de 150 mg/kg não são dependentes de atividade ictal. Além disso, tanto os níveis plasmáticos de CORT quanto ACTH aumentaram 24 h após a injeção de PILO embora apenas os níveis de CORT permaneceram elevados 1 mês após o tratamento, o que pode sugerir o envolvimento de fatores epigenéticos (e.g. alterações na expressão de receptores de glicocorticoides em estruturas límbicas relacionadas à função do eixo HPA). O pré-tratamento com memantina bloqueou os efeitos ansiogênicos observados em ratos tratados com PILO e avaliados 24 h ou 1 mês após o tratamento, havendo aumento do tempo e número de entradas nos braços abertos do labirinto. Os níveis de expressão dos receptores NMDAR1 e R2B no hipocampo foram diminuídos 24 h ou 1 mês (mas não a subunidade R2B) após a injeção de PILO.Conclusões: Nossos dados sugerem que a estimulação central de receptores colinérgicos muscarínicos, através de uma única injeção sistêmica de pilocarpina (em doses subconvulsivas), é capaz de induzir comportamentos defensivos relacionados à ansiedade durante um longo período em ratos, efeitos estes não dependentes de atividades epilépticas no hipocampo. Os efeitos ansiogênicos parecem estar associados a um aumento da atividade teta hipocampal, que pode desempenhar um papel codificador na regulação do sistema septo-hipocampal sobre o eixo HPA, que está ativado (conforme indicado pela maior liberação de glicocorticoides). Além disso, observamos uma diminuição da expressão de receptores do tipo NMDA no hipocampo de ratos tratados com pilocarpina, sugerindo que alterações na atividade neuronal hipocampal inibitória sobre o eixo HPA podem ser responsáveis por mediar as respostas ansiogênicas observadas após o tratamento com pilocarpina. Nossos achados são compatíveis com os preceitos da teoria de Gray e McNaughton (1983), que enfatiza o importante papel modulatório da circuitaria septo-hipocampal na regulação dos estados de medo e ansiedade através da ativação de aferências colinérgicas sobre estruturas límbicas. Levando em consideração as limitações no campo translacional de doenças psiquiátricas para modelos animais, os resultados aqui expostos podem auxiliar no refinamento de pesquisas pré-clínicas relacionadas aos transtornos de ansiedade, proporcionando um melhor entendimento dos mecanismos envolvidos nas respostas de ansiedade e estresse em roedores. <br>

A potenciação longa duração (do inglês: long-term potentiation, ou LTP) na região de CA1 do hipocampo é considerada como um dos exemplos de plasticidade cerebral mais estudados, e provável base celular do aprendizado e da memória. Mecanismos morfofisiológicos em comum, entretanto, parecem ser compartilhados pela LTP e pela epilepsia experimental. Estes referem-se, basicamente, à necessidade de uma estimulação de alta freqüência, ao envolvimento de uma transmissão sináptica glutamatérgica, ao aumento do íon Ca2+ no meio intracelular, à expressão gênica, à síntese de proteínas, e à ativação de receptores metabotrópicos glutamatérgicos. Desse modo, alguns autores sugerem que a LTP tem um importante papel no desenvolvimento das crises epilépticas, havendo uma continuidade entre os fenômenos plásticos e patologia. O presente estudo buscou investigar, num modelo experimental de Epilepsia de Lobo Temporal (ELT) induzido pela pilocarpina (um agonista colinérgico muscarínico), em ratos, a existência de plasticidade neuronal em distintos tempos de epilepsia (30 dias, 60 dias e 90 dias), utilizando como medida a potenciação de longa duração (LTP) nas sinapses entre os axônios da via colateral de Schaffer e as células piramidais de CA1, em fatias hipocampais. Além disso, verificou-se a presença de brotamento neuronal (“sprouting”), um correlato de plasticidade cerebral estrutural concomitante à cronicidade da ELT, em um campo próximo de CA1, o giro denteado hipocampal. A análise da amplitude dos potenciais pós-sinápticos excitatórios (PEPS) de campo mostrou que somente a presença de epilepsia, nesse modelo, interferiu negativamente com a indução da LTP, o que foi atribuído a efeitos de excitotoxicidade, à condição permanente de epileptogênese, à perda neuronal progressiva, a anormalidades dendríticas do corpo neuronal e de axônios decorrentes da injeção de pilocarpina. As chances de ocorrência da LTP para os animais controles foi de 4 a 10 vezes maior do que a dos animais epilépticos. A inclinação do PEPS, uma medida correspondente à eficiência sináptica, demonstrou sofrer influência do tempo de epilepsia. Um decaimento nessa medida ocorreu no grupo de animais que permaneceu durante mais tempo com o quadro de crises recorrentes, ou seja, com 90 dias de ELT. Além disso, observou-se também um comprometimento desta nos animais controle de 90 dias, após o período de 60 minutos da estimulação. Assim, animais saudáveis com mais idade também não mantiveram uma eficiência sináptica aumentada e estável por mais de 30 minutos após a estimulação. Mecanismos moleculares tais com excitabilidade neuronal e aumento na eficiência da transmissão sináptica encontram-se mais preservadas em animais saudáveis e de menos idade. A presença de brotamento neuronal, por sua vez, foi identificada em quase 100% das amostras de tecido hipocampal de animais epilépticos, não sendo observado em nenhum animal controle, o que nos serviu como um indicador do comprometimento hipocampal associado a crises epilépticas recorrentes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-07-14T12:35:49Z No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T12:43:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T12:43:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_FlaviaMariaMedeirosGomes.pdf: 5082726 bytes, checksum: b4f9330a9dd76115f33d108006b4b10e (MD5) / A Epilepsia do Lobo Temporal (ELT) é o subtipo mais prevalente de Epilepsia em adultos e sua relevância clínica deve-se à sua gravidade e alta porcentagem de pacientes resistentes aos fármacos antiepilépticos disponíveis atualmente. Há, portanto, uma necessidade pela busca de novas terapias farmacológicas capazes de controlar essa condição patológica de forma eficiente, assim como de compreender melhor as alterações causadas pelo funcionamento anormal das estruturas neuronais durante a Epilepsia. Nesse aspecto, os artrópodes peçonhentos representam uma fonte alternativa de compostos neuroativos selecionados pela evolução dessas espécies. A potencialidade farmacológica dessas moléculas reforça o interesse em compreender sua ação no sistema nervoso central, foco desse trabalho. O Laboratório de Neurofarmacologia isolou o peptídeo Neuropolybina a partir da peçonha da vespa Polybia paulista, e ele apresentou uma interessante atividade antiepiléptica em modelos agudos de crises epilépticas. Além disso, não apresentou efeitos adversos na exploração espontânea e na coordenação motora dos animais testados. Portanto, o objetivo foi avaliar a efetividade antiepiléptica da Neuropolybina em camundongos submetidos ao modelo crônico de Status Epilepticus (SE) induzido por pilocarpina. Esse modelo é amplamente utilizado na literatura e apresenta similaridades com achados histopatológicos e comportamentais observados em pacientes epilépticos em apenas algumas semanas, enquanto as mesmas alterações levam anos para se manifestar nos pacientes. A Comissão de Ética no Uso Animal (CEUA/UnB) aprovou todos os experimentos. Camundongos Swiss receberam a administração i.p. de pilocarpina e após 10 minutos, manifestaram sinais do SE, que durou três horas (período agudo do modelo). No período de 15 dias após o SE (período latente), foi realizado um procedimento estereotáxico para implantar uma cânula-guia no ventrículo lateral e oito eletrodos profundos e corticais. Após os 15 dias, durante o período das crises recorrentes e espontâneas (CRE), os camundongos foram tratados por cinco dias consecutivos com administração i.c.v. de veículo, Neuropolybina (0,5 e 2,5 nmol) e Diazepam (4 mg.kg-1). Durante esse período, o comportamento, as CRE e a atividade epileptiforme foram monitoradas por filmagem e eletroencefalografia. Após o período de tratamento, os camundongos foram eutanasiados e as alterações morfológicas foram avaliadas por técnicas histológicas (Coloração de Nissl para neurônios) e Imunohistoquímica/imunofluorescência (GFAP para astrócitos e DAPI para núcleos celulares). Foi observada uma redução da duração das CRE após o tratamento com Neuropolybina. O número de neurônios viáveis nas regiões CA1 e CA3 da formação hipocampal dos tratados foi significativamente diferente dos doentes, e a presença de astrócitos não foi diferente quando comparada aos sadios, sugerindo que o peptídeo evitou a perda neuronal induzida pelo SE. O peptídeo produziu um efeito antiepiléptico e possui um potencial terapêutico no modelo de ELT. Ademais, ele pode ser usado como uma ferramenta na pesquisa em neurociência e no desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da Epilepsia. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Temporal Lobe Epilepsy (TLE) is the most prevalent subtype of Epilepsy in adults and its clinical relevance is due to the gravity and the high percentage of patients resistant to antiepileptic drugs currently available. Thus, there is a need to seek new pharmacological therapies able to efficiently control this disease, as well as a better understanding of the changes caused by the abnormal functioning of neuronal structures during Epilepsy. In this aspect, venomous arthropods represent an alternative source of evolutionary selected neuroactive compounds. The pharmacological potentiality of these molecules reinforce the interest on its action on the central nervous system, focused by this work. The Neuropharmacology Laboratory previous isolated Neuropolybin from the Polybia paulista wasp venom and this peptide has demonstrated an interesting antiepileptic activity on acute models of seizures. Furthermore, Neuropolybin has not presented side effects on spontaneous exploration and motor coordination of the animals tested. Therefore, the aim was to evaluate the antiepileptic effectiveness of the peptide Neuropolybin in mice submitted to a chronic model of status epilepticus (SE) induced by pilocarpine. This model has been used frequently and presents similarities with histopathological and behavioral findings in epileptic patients in just a few weeks, while the same changes take years to manifest in patients. The Ethical Committee on Use of Animals (CEUA/UnB) approved all procedures. Swiss mice received an i.p. injection of pilocarpine and after 10 minutes, they manifested signs of SE for three hours (acute period of the model). Fifteen days after SE (latent period), a stereotaxic procedure was perfomed to implant a guide cannula in the lateral ventricle and eight deep and cortical electrodes. After 15 days, already during the spontaneous recurrent seizures (SRS), treatment was carried out during five consecutive days by i.c.v. injections with vehicle solution, Neuropolybin (0.5 and 2.5 nmol) or Diazepam (4 mg.kg-1). During this period, behavioral, SRS and epileptiform activity were monitored by video recording and electroencephalography. After the period of treatment, the animals were euthanized and morphological changes were evaluated by histological (Nissl stain for neurons) and immunohistochemistry and immunofluorescence (GFAP stain for astrocytes and DAPI stain for cells nuclei) techniques. There was a reduction in SRS duration with Neuropolybin treatment. The number of viable neurons in CA1 and CA3 regions of the hippocampus formation of treated mice was significantly different from that of epileptic mice after the treatment. The presence of astrocytes did not increase when compared to healthy animals, suggesting that the peptide minimized neuronal loss induced by SE. Neuropolybin thus exerts a promising antiepileptic effect and provides a therapeutic potential on this model of TLE. Nevertheless, the peptide may also be used as a tool in neuroscience research and as a framework in the design of novel drug agents for epilepsy treatment.

A potenciação longa duração (do inglês: long-term potentiation, ou LTP) na região de CA1 do hipocampo é considerada como um dos exemplos de plasticidade cerebral mais estudados, e provável base celular do aprendizado e da memória. Mecanismos morfofisiológicos em comum, entretanto, parecem ser compartilhados pela LTP e pela epilepsia experimental. Estes referem-se, basicamente, à necessidade de uma estimulação de alta freqüência, ao envolvimento de uma transmissão sináptica glutamatérgica, ao aumento do íon Ca2+ no meio intracelular, à expressão gênica, à síntese de proteínas, e à ativação de receptores metabotrópicos glutamatérgicos. Desse modo, alguns autores sugerem que a LTP tem um importante papel no desenvolvimento das crises epilépticas, havendo uma continuidade entre os fenômenos plásticos e patologia. O presente estudo buscou investigar, num modelo experimental de Epilepsia de Lobo Temporal (ELT) induzido pela pilocarpina (um agonista colinérgico muscarínico), em ratos, a existência de plasticidade neuronal em distintos tempos de epilepsia (30 dias, 60 dias e 90 dias), utilizando como medida a potenciação de longa duração (LTP) nas sinapses entre os axônios da via colateral de Schaffer e as células piramidais de CA1, em fatias hipocampais. Além disso, verificou-se a presença de brotamento neuronal (“sprouting”), um correlato de plasticidade cerebral estrutural concomitante à cronicidade da ELT, em um campo próximo de CA1, o giro denteado hipocampal. A análise da amplitude dos potenciais pós-sinápticos excitatórios (PEPS) de campo mostrou que somente a presença de epilepsia, nesse modelo, interferiu negativamente com a indução da LTP, o que foi atribuído a efeitos de excitotoxicidade, à condição permanente de epileptogênese, à perda neuronal progressiva, a anormalidades dendríticas do corpo neuronal e de axônios decorrentes da injeção de pilocarpina. As chances de ocorrência da LTP para os animais controles foi de 4 a 10 vezes maior do que a dos animais epilépticos. A inclinação do PEPS, uma medida correspondente à eficiência sináptica, demonstrou sofrer influência do tempo de epilepsia. Um decaimento nessa medida ocorreu no grupo de animais que permaneceu durante mais tempo com o quadro de crises recorrentes, ou seja, com 90 dias de ELT. Além disso, observou-se também um comprometimento desta nos animais controle de 90 dias, após o período de 60 minutos da estimulação. Assim, animais saudáveis com mais idade também não mantiveram uma eficiência sináptica aumentada e estável por mais de 30 minutos após a estimulação. Mecanismos moleculares tais com excitabilidade neuronal e aumento na eficiência da transmissão sináptica encontram-se mais preservadas em animais saudáveis e de menos idade. A presença de brotamento neuronal, por sua vez, foi identificada em quase 100% das amostras de tecido hipocampal de animais epilépticos, não sendo observado em nenhum animal controle, o que nos serviu como um indicador do comprometimento hipocampal associado a crises epilépticas recorrentes.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:05:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (Pronex) / A epilepsia do lobo temporal vem sendo amplamente investigada com diferentes técnicas tanto em pacientes como em modelos experimentais, entre os quais se destaca aquele induzido pela pilocarpina. Assim como as estruturas hipocampais têm sido apontadas como responsáveis pela gênese do foco epiléptico, o cerebelo vem sendo considerado como uma importante estrutura de caráter inibitório, desde a primeira observação feita por Russel em 1894. Este papel se deve à presença abundante de neurônios GABAérgicos no córtex e núcleos cerebelares, com função inibitória, entre os quais se destacam os neurônios de Purkinje (NP). Os estudos eletrofisiológicos in vitro demonstraram uma alteração no padrão de disparos espontâneos dos animais com epilepsia. Contrariamente aos controles, freqüentemente as células de animas com epilepsia não disparavam potencias de ação (PA) de forma espontânea. Outro fator importante foi à diferença de potenciação dos disparos espontâneos nos grupos controle e portador de epilepsia em resposta a análogo de óxido nítrico (NO). Camundongos portadores de epilepsia aumentaram a sua freqüência de disparo em relação à linha de base, porém, este aumento foi significativamente menor do que o observado no grupo controle. A concentração dos principais aminoácidos foi quantificada pela técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Os resultados revelaram diferenças significativas no cerebelo entre as fases aguda e crônica do modelo. As concentrações de aspartato (ASP), glutamato (GLU), taurina (TAU) e GABA, aumentaram na fase aguda. Durante a fase crônica do modelo, houve diminuição significativa das concentrações de todos os xiv aminoácidos testados. Também podemos observar um comportamento distinto ao compararmos as análises dos aminoácidos realizadas no cerebelo e as de estudo prévio no hipocampo. Através dos estudos anatômicos, constatamos que a fase silenciosa do modelo já induz perda dos neurônios de Purkinje, que é agravada pelo aparecimento das crises espontâneas recorrentes. Essas células também comprovaram ser bastante susceptíveis aos efeitos do envelhecimento e quando este se encontra associado à epilepsia, ocorre a morte de um número próximo a 50% do total de neurônios de Purkinje. De uma maneira geral, os resultados demonstram alterações estruturais e eletrofisiológicas no cerebelo de roedores com epilepsia. Estas lesões cerebelares são posteriormente agravadas pela ação das crises epilépticas recorrentes, o que possivelmente compromete a capacidade inibitória do cerebelo. / Due to the exuberance of its inhibitory output toward deep cerebellar nuclei and extracerebellar structures, the cerebellum has been postulated to act inhibiting epileptic activity. However, and depending on the intensity and frequency of the seizures, such inhibitory capacity may be compromised by epilepsy. Epileptic cx activity generated in limbic structures could reach the cerebellum, via anatomically distant but interconnected areas, and induce severe degrees of damage. This investigation is aimed at to study the physiological and structural properties of Purkinje neurons (PN) in the model of temporal lobe epilepsy induced by pilocarpine in rodents. In the present study, using patch clamp recordings, we show differences in the spontaneous firing rate pattern of PNs recorded in adult male mice with temporal lobe epilepsy (TLE). Most PN of this group did not fire spontaneously in the presence of 50μm picrotoxin and 5mM kynurenic acid. In addition, mice with epilepsy did not show the same potentiation in spontaneous firing rate in response to NO donor analog 8p-CPT-cGMP (50µm). In addiction, the concentrations of main aminoacids were quantified trough HPLC technique. The concentrations of all aminoacids tested decreased significantly in the chronic phase of the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. PN loss was also investigated, the cerebellum of adult male Wistar rats were cut at 8-10 μm, stained in Nissl preparation and nucleated cells were counted during the silent and chronic phase of the pilocarpine model of TLE. The status epilepticus per se was sufficient to induce neuronal loss, which was aggravated after the beginning of spontaneous recurrent seizures. In addiction, we quantified the dendrite spines in PNs during the chronic phase of the model, however no alteration in density was observed. Taken together, the results showed different levels of alterations and damage to the cerebellar circuitry. As PNs are considered the main element in cerebellar cortex this may represent a larger cascade of events in the whole cerebellum induced by temporal lobe epilepsy. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:30Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (Pronex) / A vitamina D (VD), um hormônio esteróide com diversas funções no Sistema Nervoso Central (SNC), produz inúmeros efeitos fisiológicos através de respostas genômicas mediadas pelo seu receptor (VDR). Estudos clínicos e experimentais mostram uma associação entre disfunções da VD e epilepsia. Nesse sentido, o I objetivo de nosso trabalho foi analisar a expressão relativa de RNAm do VDR na formação hipocampal de ratos nos três períodos do modelo de epilepsia do lobo temporal induzido pela pilocarpina. Ratos machos, da raça Wistar, foram divididos aleatoriamente em 5 grupos: 1- ratos controle (Grupo CTRL), 2- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados após 4 horas de status epilepticus (Grupo SE), 3¬ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 7 dias após status epilepticus (Grupo SIL 7 dias) 4- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 14 dias após status epilepticus (Grupo SIL 14 dias) 5- ratos que receberam pilocarpina e foram sacrificados 60 dias após a primeira crise espontânea (Grupo Crônico). A expressão relativa de RNAm do VDR foi determinada através da técnica do RT -PCR em tempo real. Nossos resultados demonstraram um aumento da expressão relativa de RNAm do VDR nos grupos SIL 7 dias, SIL 14 dias e Crônico, respectivamente (O,060±0,024; O,052±0,035; 0,085±0,055) quando comparado com os animais do grupo CTRL e SE, respectivamente (0,019± 0,017; 0,019±0,025). Nossos resultados sugerem que o VDR é um possível candidato a na participação do processo de epileptogênese no modelo de epilepsia induzido pela pilocarpina em ratos. / Vitamin D, is a steroid hormone with multiple functions in the central nervous system (CNS), producing numerous physiological effects mediated by its receptor (VDR). Clinical and experimental studies have shown a link between VD dysfunction and epilepsy. In these lines, the purpose of our work was to analyze the relative expression of VDR mRNA in the hippocampal formation of rats during the three periods of the pilocarpine-induced epilepsy. Wistar male rats were divided into five groups: 1- control rats (CTRL group), 2 – rats that received pilocarpine and were killed 4 hr after the status epilepticus (SE group), 3 - rats that received pilocarpine and were killed 7 days after the status epilepticus (SIL 7 days group), 4 - rats that received pilocarpine and were killed 14 days after the status epilepticus (SIL 14 days group), 5 - rats that received pilocarpine and were killed 60 days after the first spontaneous seizure, (chronic group). The relative expression of the VDR mRNA was determined through real-time PCR technique. Our results showed an increase of the relative expression of the VDR mRNA in the SIL 7 days, SIL 14 days and chronic groups respectively (0,060 ± 0,024; 0,052 ± 0,035; 0,085 ± 0,055) when compared with the CTRL and SE groups (0,019 ± 0,017; 0,019 ± 0,025). These data suggest the VDR as a possible candidate participating in the epileptogenesis process of the pilocarpine model of epilepsy. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:35Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Fundo de Auxílio aos Docentes e Alunos (FADA) / Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (Pronex) / Objetivos: A nestina, uma proteína do filamento intermediário, pode ser usada como um indicador de imaturidade celular. Nas células já diferenciadas, essa proteína é substituída por outro tipo de filamento intermediário, específico do referido tecido. Porém, sua reexpressão pode ser induzida em condições regenerativas e/ou degenerativas. Assim, na tentativa de elucidar as alterações plásticas após um dano cerebral provocado pelo status epilepticus (SE) induzido pela pilocarpina em ratos, nossos objetivos foram: Ia) Estudar a expressão fisiológica normal da nestina no hipocampo e no córtex de ratos normais desde PN9 até a fase adulta (PN90); Ib) Avaliar as alterações da expressão da nestina no hipocampo e no córtex de ratos submetidos a três episódios de SE, induzidos pela pilocarpina, em PN7 PN8 e PN9. Esses animais foram estudados desde PN9 até PN90; 11) Estudar a expressão temporal e espacial da nestina no hipocampo de ratos adultos submetidos ao modelo da pilocarpina (fases aguda, silenciosa e crônica); 111) Avaliar a expressão da nestina no hipocampo de ratos idosos normais e em ratos idosos com epilepsia. Esses animais foram submetidos ao modelo da pilocarpina na fase adulta e seus cérebros foram estudados ao completarem dois anos de idade. Métodos: Indução do SE pela injeção de pilocarpina (ip); a expressão da nestina foi estudada por imuno-histoquímica. Resultados: No período pós-natal precoce, a expressão fisiológica da nestina foi intensamente visualizada nas glias radiais corticais, nas fibras hipocampais e nos vasos sanguíneos, desaparecendo nos animais adultos. Os animais submetidos ao SE em PN7-9, apresentaram aumento na expressão e atraso no desaparecimento da nestina, tanto nas glias radiais como nos vasos sanguíneos, em relação aos seus respectivos controles. Glias radiais corticais foram ainda encontradas nos ratos experimentais em PN21, enquanto que durante o desenvolvimento fisiológico normal elas já não estão mais presentes nessa idade. Quanto à distribuição temporal e espacial da nestina nos astrócitos reativos hipocampais de ratos adultos, submetidos ao modelo da pilocarpina, não encontramos a expressão dessa proteína nos animais dos grupos controle e agudo. Em contraste, os ratos...(au). / Purpose: Nestin is an intermediate filament component protein and can be used as an indicator of cellular immaturity. In the adult differentiated cell, nestin is replaced for other intermediate filament protein specific of the referred tissue. However, nestin re-expression can be induced by regenerative and/or degenerative conditions. In this way, in order to try to elucidate the plastic alterations followed by brain damage provoked by status epilepticus (SE) induced by pilocarpine in rats, the present work has the following purposes: Ia) Evaluate the physiological hippocampal and cortical nestin expression in rats from P9 to adulthood (P90); Ib) Evaluate hippocampal and cortical alterations of nestin expression in rats submitted to three episodes of SE induced by pilocarpine (P7,P8,P9). These animals were studied from P9 to P90; II) Evaluate the hippocampal temporal and spatial nestin expression of the adult rats submitted to the pilocarpine model of epilepsy (acute, silent and chronic phases); III) Evaluate the hippocampal nestin expression in aged normal rats and in aged rats with epilepsy. The aged chronic rats were submitted to the pilocarpine SE when young adults and they were studied with two years old. Methods: The SE was induced by pilocarpine injection (ip) and nestin expression was studied by immunohistochemistry. Results: Nestin expression was found in cortical radial glia, hippocampal fibers and blood vessels during early postnatal development, disappearing in the adulthood. Rats submitted to pilocarpine SE (P7-P9) showed a delayed nestin down-regulation in the cortical radial glia as well as in the blood vessels, when compared to their controls. We still found cortical radial glia in the experimental rats of P21 group, however they are not found anymore under normal physiological conditions at this age. Referring to the hippocampal reactive astrocytes expressing nestin in the adult rats submitted to the pilocarpine model, we did not detect nestin expression in the rats of the control and acute groups. In other hand, the animals of the silent group presented intense nestin expression 3 and 7 days after SE. Interestingly, still in the silent phase, we did not find any nestin expression 14 days after SE. However, in the 65 chronic phase of the model, the reactive astrocytes expressing nestin are again observed and they were sparsely distributed for all the hippocampal formation. The aged rats of the control group did not present nestin expression. However, aged chronic rats presenting long term epilepsy showed the same pattern of nestin immunoreactivity as observed in the chronic adult rats. Conclusions: This work showed that physiological nestin expression during early postnatal development to adulthood. Nestin immunoreactivity was intense in the cortical radial glia, hippocampal fibers and blood vessels during the early postnatal development disapearing in adulthood. Our data shoed that nestin expression was delayed in the rats submitted to SE (P7-9), suggesting a normal development impairment. We still found cortical radial glia in P21 in the experimental animals, suggesting a retardation of nestin down-regulation. The adult rats of the silent phase of the pilocarpine model presented transient nestin expression in the reactive astrocytes. However, reactive astrocytes expressing nestin were still found in the chronic phase of the model. These data suggest that nestin plays a role in the plastic events in the adult tissue after brain damage. The normal aging did not induce nestin re-expression. However, aged rats have the potential to re-express a developmental protein of immature cell, since the chronic aged rats in this study presented hippocampal reactive astrocytes. In this way, the knowledge of a temporal window of proteins such as nestin, with multi-potential and regenerative potential, allows advances in neurobiology understanding and contributes to the progress of cellular therapy in neurological diseases. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A epilepsia é uma condição crônica frequentemente acompanhada de perda celular e distúrbio cognitivo. Na maioria das vezes, é difícil saber o quanto isso se deve à patologia de base que provoca as crises epiléticas, as crises epilépticas por si ou seu tratamento com fármacos antiepilépticos, bem como o contexto sócio-cultural do paciente. Para investigar o efeito das células mononucleares da medula óssea (CMO) sobre a neuroplasticidade no sistema nervoso central, induzida pelo status epilepticus, provocado por lítio e pilocarpina, foram estudados ratos epilépticos e controles que receberam o transplante de (1x107 CMO/100μl ou o mesmo volume de solução salina, na veia da cauda), 90 min após SE (grupo agudo) ou 22 dias após SE (grupo crônico). Aqui mostramos que, no grupo agudo, ao compararmos os ratos controles com os transplantados, as CMO estavam presentes em (1-3, 5, 10 e 120 dias) após o transplante no cérebro epiléptico. Em 10 dias expressavam o marcador de microglia (CD11b), em 120 dias expressaram o marcador de neurônio jovem (doublecortina). Verificamos por vídeo-monitoração, (15-21dias) após o SE, que os ratos do grupo tratado com CMO não apresentaram crises espontâneas recorrentes (CER), e que, entre (120-127 dias) após SE, 20% dos ratos transplantados apresentaram CER. Observamos perda neuronal significativa nas três regiões hipocampais analisadas (CA1, CA3 e hilo do GD) no grupo epiléptico que recebeu o transplante de solução salina, sendo extremamente significativa na região de CA1 (em 10 dias); CA1, CA3 e no hilo do GD em (120 dias) após o SE. Entretanto, no grupo tratado com CMO, a perda neuronal foi menor nas regiões analisadas em 120 dias após SE. As medidas do volume hipocampal revelaram que não foram observadas diferenças significantes entre o grupo epiléptico tratado com CMO quando comparado com o grupo controle não epiléptico, tanto em 10 quanto em 120 dias após SE. O volume hipocampal entre os ratos epilépticos (não-tratado e tratado) apresentou diferença significativa em 120 dias após SE. No estudo da atividade elétrica em fatias hipocampais, ao compararmos os dados dos ratos epilépticos encontramos uma tendência a maior facilidade de se obter LTP no grupo tratado com CMO (80% das fatias) enquanto no grupo tratado com solução salina ocorreu indução em (30% das fatias) 10 dias após SE. Esta facilidade de indução foi maior em 120 dias após SE, onde a indução da LTP ocorreu em 100% das fatias do grupo epiléptico tratado com CMO e em nenhuma do grupo epiléptico tratado com solução salina. O desempenho dos ratos epilépticos de ambos os grupos experimentais foi prejudicada no teste de aprendizagem espacial do labirinto aquático. Embora que esta função foi menos afetada nos ratos epilépticos tratados com CMO do que os ratos não tratados. No grupo crônico, avaliamos por vídeo-monitoração o comportamento dos ratos epilépticos entre os dias 15-21 após SE, no dia 22 os ratos foram transplantados com CMO de dois diferentes doadores (1) ratos Wistar e (2) camundongos EGFP C57/bl6, ou solução salina e foram observados por mais 7 dias (1) e 14 dias (2). Verificou-se que independente do doador os ratos tiveram uma diminuição na freqüência das CER de aproximadamente 50% e de 53,5% [doadores (1) e (2), respectivamente], quando comparado o período pós com o pré-tratamento. Verificamos que as células GFP-positivas foram encontradas dispersas por todo o cérebro dos ratos epilépticos 45 dias após o transplante, e estavam presentes principalmente nas áreas corticais e no giro denteado do hipocampo. Algumas destas células expressaram o marcador de neurônio adulto (NeuN) e de células da glia (GFAP). No entanto, não foram observadas nos grupos agudo e crônico, células GFPpositivas no cérebro dos ratos controle (não epilépticos). A análise quantitativa de secções do cérebro de ratos do grupo epiléptico tratado com CMO mostrou que o número de neurônios não diferiu significativamente do grupo controle (não-epiléptico) nas duas regiões avaliadas (CA1 e hilo). No estudo do brotamento neuronal o grupo de ratos tratado com CMO apresentou aproximadamente 78,6% menos brotamento das fibras musgosas que os ratos epilépticos não tratados. No estudo eletrofisiológico a LTP induzida por estimulação tetânica foi obtida em (100%) das fatias hipocampais obtidas de ratos controles não-epilépticos, em (100%) das fatias de ratos epilépticos tratados com CMO e em nenhuma das fatias dos ratos epilépticos tratados com solução salina. Nossos dados sugerem que o transplante de células mononucleares da medula óssea protege e/ou previne a progressão da epilepsia crônica. / The epilepsy is a chronic condition frequently accompanied by cellular loss and cognitive disturbance. Most of the time, it is difficult to know how much this occurs due to the base pathology that provokes epileptic crises, the epileptic crises by themselves or their treatment with anti-epilepsy medications, as well as the patient’s social-cultural context. In order to investigate the effect of bone marrow mononuclear cells (BMCs) on the neuroplasticity in the central nervous system, induced by status epilepticus, provoked by lithium and pilocarpine, epileptic and control rats were studied and received a transplant of (1x107 BMC/100μl or the same volume of saline solution, in the vein of the tail), 90 min after SE (acute group) or 22 days after SE (chronic group). Here we have demonstrated that, in the acute group, when comparing the control rats to the transplanted ones, BMCs were presented in the epileptic brain (1-3, 5, 10 and 120 days) after the transplant. In 10 days they expressed the microglial marker (CD11b), in 120 days they expressed the young neuronal marker (doublecortin). We verified by video monitoring, (15-21 days) after SE, that the rats from the treated group with BMCs did not present spontaneous recurrent seizures (SRS), and that, between 120-127 days after SE, 20% of the transplanted animals presented SRS. We observed significant neuronal loss in the three analyzed hippocampus regions (CA1, CA3 and hilo of GD) in the epileptic group that received the transplant of saline solution, being extremely significant in the region of CA1 (in 10 days); CA1, CA3 and in hilo of GD in (120 days) after the SE. However, in the group treated with BMCs, the neuronal loss was smaller in the areas analyzed in (120 days) after SE. The measures of the hippocampus volume revealed significant differences not observed between the epileptic group treated with BMCs, when compared to the non-epileptic control group, as in 10 as in 120 days after SE. Nevertheless, the hippocampus volume between the epileptic rats (non-treated and treated) presented a significant difference in 120 days. In the study of electrical activity in hippocampal slices, by comparing the epileptic rats data, we found a tendency of a greater facility in obtaining LTP in the treated group with BMCs (80% of the slices) while in the treated group with a saline solution an induction in (30% of the slices) it occurred 10 days after SE. This facility of induction was higher in 120 days after SE, where the induction of LTP occurred in 100% of the slices in the epileptic group treated with BMCs and in none of the epileptic group treated with saline solution. In the spatial reference memory version of the water Maze test, the performance of both epileptic experimental groups was impaired. Although this function was less affected in epileptic rats treated with BMCs than in saline treated rats. In the chronic group, we evaluated the epileptic rats behavior through video monitoring between the days 15-21 after SE, in the day 22 the rats were transplanted with BMCs from two different donors (1) Wistar rats and (2) EGFP C57/bl6 Mice, or saline solution, and were observed for more 7 days (1) and 14 days (2). It was verified that regardless on the donor, the rats had a decrease in the frequency of SRS of approximately 50% and of 53,5% [donors (1) and (2), respectively], when comparing the pos-period with the pre-treatment. We verified that the GFP-positive cells were found scattered through the whole epileptic rats brain 45 days after the transplant, and they were mainly present in the cortical areas and the dentate gyrus of hippocampus. Some of these cells expressed an adult neuronal marker (NeuN) and glial cells (GFAP). Nevertheless, this was not observed in acute and chronic groups, GFP-positive cells in the brain of the control rats (non-epileptic). The quantitative analysis of the sectors from the brain of the epileptic rats group treated with BMCs demonstrated that the number of neurons did not differ significantly from the control group (non-epileptic) in two evaluated regions (CA1 and hilo). In the study of neuronal sprouting, the group of rats treated with BMCs presented approximately 78,6% less sprout than the rats from the non-treated group. In the electrophysiological study LTP induced by tetanic stimulation was obtained in (100%) of the hipocampal slices of nonepileptic control rats, in (100%) of the slices of epileptic rats treated with BMCs and in none of the slices from the epileptic rats treated with saline solution. Our data suggest that the transplant of cells from the bone marrow protects and/or prevents the progression of chronic epilepsy.