CRIPTO 1 (CR1) é membro da família de fatores de crescimento epidermal-CRIPTO-1/FRL-1/Cryptic com funções específicas na embriogênese e tumores. Este estudo verificou a presença de CR1 em placentas saudáveis e com distúrbios de invasividade. Nossos resultados mostraram a expressão de CR3 e CR1 em placentas de primeiro e terceiro trimestre de gestação, respectivamente. Placentas acretas e coriocarcinomas também foram imunorreativos para CR1, principalmente em células citotrofoblásticas invasivas e malignas, respectivamente. A expressão de CR1 em células citotrofoblásticas extravilosas de primeiro trimestre prevaleceu em células em diferenciação e em células invasivas, sugerindo sua participação nesses processos. CR1 recombinante aumentou significativamente a invasão e migração em células HTR8/SV-neo, o que foi abolido na presença de RNA de interferência. Esses achados corroboram a ação dessa proteína sobre as células trofoblásticas. / CRYPTO 1 (CR1) is member of the family of epidermal growth factor-CRYPTO-1 / FRL-1 / Cryptic with specific roles in embryogenesis and tumors. This study investigated the presence of CR1 in healthy placentas and in placentas with invasive disorders. Our results showed the expression of CR3 and CR1 in the first and third trimester placentas, respectively. Placental choriocarcinoma and accreta placentas were also immunoreactive for CR1, especially in malignant and invasive cytotrophoblast cells, respectively. CR1 expression in first trimester extravillous cytotrophoblast cells prevailed in differentiating and invasive cells, suggesting a role in these processes. Recombinant CR1 significantly increased invasion and migration HTR8 / SV-Neo cells, which was abolished in the presence of interference RNA. These findings corroborate the action of this protein on the trophoblast cells.

O estresse por calor influencia a fisiologia da fêmea causando modificações placentárias que interferem no desenvolvimento fetal e desempenho dos cabritos. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do estresse térmico durante o terço final da gestação sobre a placenta de cabras Saanen, o comportamento materno-filial, as respostas termorregulatórias e peso dos cabritos do nascimento até os 60 dias de vida. Neste projeto de pesquisa foram utilizadas 47 cabras no terço final da gestação, 24 animais foram submetidos ao estresse por calor na câmara climática (tratamento estresse térmico - ET) e 23 cabras permaneceram em ambiente de termoneutralidade (tratamento controle - CT). O experimento foi organizado em 3 fases distintas: gestação, parto e desenvolvimento dos cabritos. Em cada fase os animais foram acompanhados diariamente e quinzenalmente, foi obtido plasma para dosagem de cortisol. Todos partos foram acompanhados, sendo colhidas amostras do líquido amniótico e placenta, da qual foi realizado análise histológica e expressão gênica das HSPs 27, 70 e 90, enzima 11β-HSD tipo 1 e tipo 2, CRH e ACTH-R. No nascimento, foi realizado o escore APGAR dos cabritos e avaliações do comportamento materno-filial. Os cabritos foram pesados semanalmente e acompanhados do nascimento até o desmame. As concentrações de cortisol no líquido amniótico das cabras do tratamento ET (39,42 ± 1,3 ng/mL) foram significativamente maiores que o tratamento CT (31,87 ± 2,04 ng/mL) e o inverso ocorreu para a concentração plasmática dos cabritos no nascimento que foram significativamente maiores para o tratamento CT (94,83 ± 5,49 ng/mL) que para o ET (70,20 ± 5,41 ng/mL). O estresse térmico causou redução significativa na eficiência placentária das cabras ET (9,98 ± 0,41) quando comparada as cabras CT (13,06 ± 2,16), assim como na expressão gênica da enzima 11β-HSD tipo 2 no tecido placentário das cabras ET (4,16 ± 1,79) e aumento na expressão gênica do ACTH-R (9,4 ± 1,00) quando comparadas ao tecido placentário das cabras CT (25,06 ± 3,85 e 3,44 ± 1,00, respectivamente). Como forma de proteção celular, houve maior expressão gênica da HSP 70 no tecido placentário das cabras ET (5,44 ± 0,46) que das cabras CT (3,05 ± 0,64). Os cabritos ET apresentaram maior mobilização dos mecanismos termorregulatórios que os cabritos CT. As cabras ET apresentaram maior frequência na atividade de estimulo a cria a levantar. Os cabritos ET também tiveram maior frequência na tentativa de levantar que os cabritos CT. Houve diferença no peso dos cabritos CT (3,97±0,07 Kg) e ET (3,71±0,07 Kg) aos 8 dias de vida, e tendência no nascimento e 15 dias de vida. No entanto, o tratamento térmico não influenciou o peso ao desmame. Em conclusão, o estresse térmico por calor no terço final de gestação de cabras, estimulou maior atividade de cuidados das cabras com os cabritos, assim como teve impacto negativo na eficiência placentária, tendo como reflexo maior mobilização dos mecanismos termorregulatórios, e menor ganho de peso dos cabritos nos primeiros 15 dias de vida, mas sem interferir no desempenho ao desmame. / Heat stress influences the physiology of female causing placental changes that interfere in the fetal development and performance of goatlings. Thus, the aim of the present study was to evaluate the effect of thermal stress during the final third of gestation on the placental of Saanen goats, thermoregulatory responses and goatlings\' performance. In this research, 47 goats at final third of gestation were used, 24 animals were submitted to heat stress in climatic chamber (heat stress treatment - HS) and 23 goats remained in thermoneutral environment (control treatment - CT). The experiment was organized in three distinct phases: gestation, kidding and development of kids. At each stage the animals were monitored daily and biweekly, it was obtained the plasma for cortisol analysis. The kidding of all goats was assisted and samples of amniotic fluid and placenta were collected, it was performed histological analysis and gene expression of HSPs 27, 70 and 90, 11β-HSD enzyme type 1 and type 2, CRH and ACTH-R. At birth, was evaluated the APGAR score of the goatlings and was observed the maternal-filial behaviors. The kids were weighed weekly and were accompanied from birth to weaning at 60 days years old. The concentrations of cortisol in the amniotic fluid for the HS goats (39.42 ± 1.3 ng/mL) were significantly higher than the CT goats (31.87 ± 2.04 ng/mL) and the opposite occurred for the goatlings cortisol plasma concentration at birth that was significantly higher for the CT treatment (94.83 ± 5.49 ng/mL) than for HS (70.20 ± 5.41 ng/mL). The heat treatment promoted a significant reduction in the placental efficiency for HS goats (9.98 ± 0.41) when compared to CT goats (13.06 ± 2.16), there was also a significant reduction in 11β-HSD type 2 enzyme gene expression in placental tissue of HS goats (4.16 ± 1.79) and an increase in the gene expression of ACTH-R (9.4 ± 1,00) when compared to the placental tissue of CT goats (25.06 ± 3.85 and 3.44 ± 1,00, respectively). In order to protect cells, there was more gene expression in the HSP 70 in placental tissue of HS goats (5.44 ± 0.46) than the CT goats (3,05 ± 0,64). The HS kids showed greater mobilization of the thermoregulatory mechanisms than the goatlings of the CT treatment. The HS goats showed higher frequency in the stimulation activity of offspring to raise. HS kids had higher frequency in the attempt to raise than those in CT. At 8 days of life, was observed a difference in the goatling\'s weight, CT (3.97 ± 0.07 kg) and HS (3.71 ± 0.07 kg). However, the heat treatment did not influence the weight at weaning. In conclusion, heat stress in the final third of gestation of goats stimulated greater goat care with goats, as well as having a negative impact on the placental efficiency, with a greater mobilization of thermoregulatory mechanisms, and the lowest weight gain of kids goats in the first 15 days of life, but without interfering in the performance of animals at weaning.

Introdução: Acretismo placentário é condição pouco frequente na qual há aderência anormal do tecido trofoblástico à parede uterina. É uma causa importante de hemorragia puerperal, associada a altas taxas de morbimortalidade maternofetal, grande necessidade de transfusão de hemoconcentrados. Os tratamentos propostos variam desde conduta conservadora até a histerectomia pós-parto, associada ou não a procedimentos endovasculares. Objetivo: O presente estudo visa descrever a técnica endovascular de balonamento temporário e embolização das artérias ilíacas internas durante o parto cesáreo, avaliar sua eficácia em reduzir o sangramento materno relacionado ao acretismo placentário, bem como relatar a segurança e o índice de complicações relacionadas ao tratamento endovascular. Materiais e métodos: Coorte retrospectiva de pacientes com diagnóstico pré-natal de acretismo placentário submetidas a tratamento endovascular de balonamento temporário e embolização das artérias ilíacas internas, seguido de histerectomia puerperal no nosso serviço, no período de janeiro de 2012 até novembro de 2016. Foram analisados dados relativos aos antecedentes gestacionais e cirúrgicos, achados de exames de imagem, achados histológicos, níveis de hemoglobina prévios, durante e após o parto, bem como volumes de hemoconcentrados administrados e taxa de complicações relacionadas ao procedimento endovascular. Resultados: Trinta e Siqueira FM 7 cinco pacientes foram submetidas ao manejo proposto durante o período estudado. Foi observado um volume médio de transfusão relacionado ao procedimento e perda sanguínea estimada de 540 ml e 1229 ml, respectivamente. Ocorreram complicações relacionadas ao procedimento endovascular em quatro pacientes, sendo um caso de necrose muscular glútea, um de lesão isquêmica cutânea superficial e dois casos de trombose arterial aguda de membros inferiores. Conclusão: O presente estudo demonstrou que o balonamento temporário e embolização das artérias ilíacas internas reduziu significativamente as necessidades transfusionais relacionadas ao parto nas pacientes com acretismo placentário, quando comparado com casos da literatura nos quais não foram realizadas intervenções endovasculares, com baixo índice de complicações relacionadas ao procedimento. / Introduction: Placenta accreta (PA) is the infrequent condition in which there is abnormal adherence of the trophoblastic tissue to the uterine wall. It\'s considered a major cause of puerperal bleeding, associated with high maternal morbimortality and need for blood products transfusion. Proposed treatments range from conservative to postpartum hysterectomy, combined or not to endovascular techniques. Objectives: to describe the detailed endovascular technique of temporary balloon occlusion followed by embolization of the internal iliac arteries (IIA) during cesarean section, evaluate the ability in reducing birth-related blood loss in patients with diagnosed PA and to assess safety and complications related to the endovascular procedure. Materials and methods: retrospective cohort of patients diagnosed with PA submitted to temporary balloting and embolization of the IAA followed by puerperal hysterectomy in our institution from January 2012 to November 2016. We recorded patient data such as gestational and surgical history, pre-natal radiological image findings, histopathological description, pre e postoperative hemoglobin levels and volume of blood products transfused in all patients. Follow up accounted for possible complications related to the procedure. Results: thirty-five patients were submitted to the approach during the study period. The median volume of packed red blood cells (RBC) and estimated blood loss were 540 ml and 1229 ml respectively. A total of 4 patients had complications attributed to the endovascular procedure - one case of Siqueira FM 9 deep glute tissue necrosis, one of superficial tissue necrosis and two cases of acute arterial thrombosis of the inferior limbs. Conclusion: the present study demonstrated that temporary ballooning and embolization of the IAA was able to significantly reduce birth-related blood loss and transfusion needs in patients with PA when compared to other literature series where no endovascular procedures were performed, with a low rate of procedure-related complications.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-10T13:14:18Z No. of bitstreams: 1 Welma Emidio da Silva.pdf: 1500896 bytes, checksum: 7ff17715c3c5e19b309e27006eee6e14 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T13:14:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Welma Emidio da Silva.pdf: 1500896 bytes, checksum: 7ff17715c3c5e19b309e27006eee6e14 (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Several authors have reported that metronidazole crosses the placental barrier and enters the fetal circulation and is still excreted in breast milk. Thus, not recommend the use of this drug in pregnant women and also the breastfeeding suspension for 12-24 hours after administration. However, some investigators report lack of evidence that the use of metronidazole is associated with increased risk teratogenic when administered during pregnancy is therefore unnecessary waiting for the termination of pregnancy for treatment with this drug. Thus, this study aimed to analyze the effect of administration of metronidazole during pregnancy on placental and fetal development of albino rats. 30 albino rats were used, which were divided into two groups. GROUP I - pregnant rats treated with placebo and GRUPOII - pregnant rats treated with metronidazole. The metronidazole was administered daily by gavage at a dose of 130 mg / kg for 7, 14 and 21 days of gestation. The results showed that the treated group a significant reduction in the number of deployment sites, the total area of the placental disc and the constituents of the layers of the labyrinth and trofospôngio. The histochemical analysis revealed no significant changes in the content of collagen and elastic fibers and reticular. The test showed TUNEL apoptotic activity at the site of implantation and placental development 14 days regardless of treatment. We did not observe any evidence of malformation in the head, trunk and limbs of neonates. However, a significant reduction in weight and number of neonates in the group treated with metronidazole compared to control. Thus, we conclude that metronidazole in pregnant rats administered orally at a dosage of 130 mg / kg, in two thirds of early pregnancy interferes with the interaction blastocyst endometrium, in placental and fetal development, suggesting that this drug should be avoided in the early stages of pregnancy. / Vários autores relatam que o metronidazol atravessa a barreira placentária e penetra na circulação fetal, sendo ainda excretado no leite materno. Desta forma, não recomendam o uso dessa droga em mulheres gestantes e também a suspensão do aleitamento materno por 12 a 24 horas após a administração do mesmo. Entretanto alguns pesquisadores relatam faltar evidências de que o uso do metronidazol está associado com o aumento de riscos teratogênicos quando administrado durante a gestação sendo, portanto, desnecessário a espera do termino da gestação para o tratamento com essa droga. Assim, a presente pesquisa teve como objetivos analisar o efeito da administração do metronidazol durante a prenhez, sobre o desenvolvimento placentário e fetal de ratas albinas. Foram utilizadas 30 ratas albinas, que foram divididas em dois grupos. GRUPO I – ratas prenhas tratadas com placebo e GRUPOII – ratas prenhas tratadas com metronidazol. O metronidazol foi administrado por gavagem na dosagem diária de 130 mg/kg durante 7, 14 e 21 dias de gestação. Os resultados mostraram que no grupo tratado houve redução significativa do número de sítios de implantação, da área total do disco placentário e nos elementos constituintes das camadas do labirinto e trofospôngio. A análise histoquímica não revelou alterações significativas no teor de fibras colágenas, elásticas e reticulares. O teste de TUNEL mostrou atividade apoptótica nos sítios de implantação e placentas com 14 dias de desenvolvimento independente do tratamento. Não foram observados nenhum indício de malformação na cabeça, tronco e membros dos neonatos. No entanto, houve uma redução significativa no número e peso dos neonatos no grupo tratado com o metronidazol em relação ao controle. Assim, concluímos que o metronidazol administrado em ratas prenhes, por via oral, na dosagem de 130 mg/Kg, nos dois terços iniciais da gestação interfere na interação blastocisto endométrio, no desenvolvimento placentário e fetal, sugerindo que o uso desse medicamento deve ser evitado nas fases iniciais da gestação.

Introdução: Acretismo placentário é condição pouco frequente na qual há aderência anormal do tecido trofoblástico à parede uterina. É uma causa importante de hemorragia puerperal, associada a altas taxas de morbimortalidade maternofetal, grande necessidade de transfusão de hemoconcentrados. Os tratamentos propostos variam desde conduta conservadora até a histerectomia pós-parto, associada ou não a procedimentos endovasculares. Objetivo: O presente estudo visa descrever a técnica endovascular de balonamento temporário e embolização das artérias ilíacas internas durante o parto cesáreo, avaliar sua eficácia em reduzir o sangramento materno relacionado ao acretismo placentário, bem como relatar a segurança e o índice de complicações relacionadas ao tratamento endovascular. Materiais e métodos: Coorte retrospectiva de pacientes com diagnóstico pré-natal de acretismo placentário submetidas a tratamento endovascular de balonamento temporário e embolização das artérias ilíacas internas, seguido de histerectomia puerperal no nosso serviço, no período de janeiro de 2012 até novembro de 2016. Foram analisados dados relativos aos antecedentes gestacionais e cirúrgicos, achados de exames de imagem, achados histológicos, níveis de hemoglobina prévios, durante e após o parto, bem como volumes de hemoconcentrados administrados e taxa de complicações relacionadas ao procedimento endovascular. Resultados: Trinta e Siqueira FM 7 cinco pacientes foram submetidas ao manejo proposto durante o período estudado. Foi observado um volume médio de transfusão relacionado ao procedimento e perda sanguínea estimada de 540 ml e 1229 ml, respectivamente. Ocorreram complicações relacionadas ao procedimento endovascular em quatro pacientes, sendo um caso de necrose muscular glútea, um de lesão isquêmica cutânea superficial e dois casos de trombose arterial aguda de membros inferiores. Conclusão: O presente estudo demonstrou que o balonamento temporário e embolização das artérias ilíacas internas reduziu significativamente as necessidades transfusionais relacionadas ao parto nas pacientes com acretismo placentário, quando comparado com casos da literatura nos quais não foram realizadas intervenções endovasculares, com baixo índice de complicações relacionadas ao procedimento. / Introduction: Placenta accreta (PA) is the infrequent condition in which there is abnormal adherence of the trophoblastic tissue to the uterine wall. It\'s considered a major cause of puerperal bleeding, associated with high maternal morbimortality and need for blood products transfusion. Proposed treatments range from conservative to postpartum hysterectomy, combined or not to endovascular techniques. Objectives: to describe the detailed endovascular technique of temporary balloon occlusion followed by embolization of the internal iliac arteries (IIA) during cesarean section, evaluate the ability in reducing birth-related blood loss in patients with diagnosed PA and to assess safety and complications related to the endovascular procedure. Materials and methods: retrospective cohort of patients diagnosed with PA submitted to temporary balloting and embolization of the IAA followed by puerperal hysterectomy in our institution from January 2012 to November 2016. We recorded patient data such as gestational and surgical history, pre-natal radiological image findings, histopathological description, pre e postoperative hemoglobin levels and volume of blood products transfused in all patients. Follow up accounted for possible complications related to the procedure. Results: thirty-five patients were submitted to the approach during the study period. The median volume of packed red blood cells (RBC) and estimated blood loss were 540 ml and 1229 ml respectively. A total of 4 patients had complications attributed to the endovascular procedure - one case of Siqueira FM 9 deep glute tissue necrosis, one of superficial tissue necrosis and two cases of acute arterial thrombosis of the inferior limbs. Conclusion: the present study demonstrated that temporary ballooning and embolization of the IAA was able to significantly reduce birth-related blood loss and transfusion needs in patients with PA when compared to other literature series where no endovascular procedures were performed, with a low rate of procedure-related complications.

O estresse por calor influencia a fisiologia da fêmea causando modificações placentárias que interferem no desenvolvimento fetal e desempenho dos cabritos. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do estresse térmico durante o terço final da gestação sobre a placenta de cabras Saanen, o comportamento materno-filial, as respostas termorregulatórias e peso dos cabritos do nascimento até os 60 dias de vida. Neste projeto de pesquisa foram utilizadas 47 cabras no terço final da gestação, 24 animais foram submetidos ao estresse por calor na câmara climática (tratamento estresse térmico - ET) e 23 cabras permaneceram em ambiente de termoneutralidade (tratamento controle - CT). O experimento foi organizado em 3 fases distintas: gestação, parto e desenvolvimento dos cabritos. Em cada fase os animais foram acompanhados diariamente e quinzenalmente, foi obtido plasma para dosagem de cortisol. Todos partos foram acompanhados, sendo colhidas amostras do líquido amniótico e placenta, da qual foi realizado análise histológica e expressão gênica das HSPs 27, 70 e 90, enzima 11β-HSD tipo 1 e tipo 2, CRH e ACTH-R. No nascimento, foi realizado o escore APGAR dos cabritos e avaliações do comportamento materno-filial. Os cabritos foram pesados semanalmente e acompanhados do nascimento até o desmame. As concentrações de cortisol no líquido amniótico das cabras do tratamento ET (39,42 ± 1,3 ng/mL) foram significativamente maiores que o tratamento CT (31,87 ± 2,04 ng/mL) e o inverso ocorreu para a concentração plasmática dos cabritos no nascimento que foram significativamente maiores para o tratamento CT (94,83 ± 5,49 ng/mL) que para o ET (70,20 ± 5,41 ng/mL). O estresse térmico causou redução significativa na eficiência placentária das cabras ET (9,98 ± 0,41) quando comparada as cabras CT (13,06 ± 2,16), assim como na expressão gênica da enzima 11β-HSD tipo 2 no tecido placentário das cabras ET (4,16 ± 1,79) e aumento na expressão gênica do ACTH-R (9,4 ± 1,00) quando comparadas ao tecido placentário das cabras CT (25,06 ± 3,85 e 3,44 ± 1,00, respectivamente). Como forma de proteção celular, houve maior expressão gênica da HSP 70 no tecido placentário das cabras ET (5,44 ± 0,46) que das cabras CT (3,05 ± 0,64). Os cabritos ET apresentaram maior mobilização dos mecanismos termorregulatórios que os cabritos CT. As cabras ET apresentaram maior frequência na atividade de estimulo a cria a levantar. Os cabritos ET também tiveram maior frequência na tentativa de levantar que os cabritos CT. Houve diferença no peso dos cabritos CT (3,97±0,07 Kg) e ET (3,71±0,07 Kg) aos 8 dias de vida, e tendência no nascimento e 15 dias de vida. No entanto, o tratamento térmico não influenciou o peso ao desmame. Em conclusão, o estresse térmico por calor no terço final de gestação de cabras, estimulou maior atividade de cuidados das cabras com os cabritos, assim como teve impacto negativo na eficiência placentária, tendo como reflexo maior mobilização dos mecanismos termorregulatórios, e menor ganho de peso dos cabritos nos primeiros 15 dias de vida, mas sem interferir no desempenho ao desmame. / Heat stress influences the physiology of female causing placental changes that interfere in the fetal development and performance of goatlings. Thus, the aim of the present study was to evaluate the effect of thermal stress during the final third of gestation on the placental of Saanen goats, thermoregulatory responses and goatlings\' performance. In this research, 47 goats at final third of gestation were used, 24 animals were submitted to heat stress in climatic chamber (heat stress treatment - HS) and 23 goats remained in thermoneutral environment (control treatment - CT). The experiment was organized in three distinct phases: gestation, kidding and development of kids. At each stage the animals were monitored daily and biweekly, it was obtained the plasma for cortisol analysis. The kidding of all goats was assisted and samples of amniotic fluid and placenta were collected, it was performed histological analysis and gene expression of HSPs 27, 70 and 90, 11β-HSD enzyme type 1 and type 2, CRH and ACTH-R. At birth, was evaluated the APGAR score of the goatlings and was observed the maternal-filial behaviors. The kids were weighed weekly and were accompanied from birth to weaning at 60 days years old. The concentrations of cortisol in the amniotic fluid for the HS goats (39.42 ± 1.3 ng/mL) were significantly higher than the CT goats (31.87 ± 2.04 ng/mL) and the opposite occurred for the goatlings cortisol plasma concentration at birth that was significantly higher for the CT treatment (94.83 ± 5.49 ng/mL) than for HS (70.20 ± 5.41 ng/mL). The heat treatment promoted a significant reduction in the placental efficiency for HS goats (9.98 ± 0.41) when compared to CT goats (13.06 ± 2.16), there was also a significant reduction in 11β-HSD type 2 enzyme gene expression in placental tissue of HS goats (4.16 ± 1.79) and an increase in the gene expression of ACTH-R (9.4 ± 1,00) when compared to the placental tissue of CT goats (25.06 ± 3.85 and 3.44 ± 1,00, respectively). In order to protect cells, there was more gene expression in the HSP 70 in placental tissue of HS goats (5.44 ± 0.46) than the CT goats (3,05 ± 0,64). The HS kids showed greater mobilization of the thermoregulatory mechanisms than the goatlings of the CT treatment. The HS goats showed higher frequency in the stimulation activity of offspring to raise. HS kids had higher frequency in the attempt to raise than those in CT. At 8 days of life, was observed a difference in the goatling\'s weight, CT (3.97 ± 0.07 kg) and HS (3.71 ± 0.07 kg). However, the heat treatment did not influence the weight at weaning. In conclusion, heat stress in the final third of gestation of goats stimulated greater goat care with goats, as well as having a negative impact on the placental efficiency, with a greater mobilization of thermoregulatory mechanisms, and the lowest weight gain of kids goats in the first 15 days of life, but without interfering in the performance of animals at weaning.

RESUMO BALDISSERA, J.L.C. Avaliação das diferentes metodologias de realização do ensaio clonogênico e validação do método de criopreservação e ressuspensão do sangue de cordão umbilical e placentário criopreservado. 2015, 78 f. Dissertação. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. O sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido utilizado como fonte de célulastronco hematopoéticas (CTHs) para transplante. A qualidade desse produto pode ser afetada durante as várias etapas do seu processamento. Neste estudo, foi avaliada a melhor metodologia de preparo da amostra para a realização do ensaio clonogênico (pura, diluída ou lavada) e validado o método de criopreservação e de ressuspensão das bolsas de SCUP. Foi avaliada também a funcionalidade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) como método para determinar a função das CTHs do SCUP, em 15 unidades criopreservadas pelo Laboratório de Criobiologia e Terapia Celular do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina (HEMOSC). As unidades foram descongeladas em quatro etapas. O conteúdo dos segmentos e da bolsa foi coletado e ressuspenso com solução de albumina 5%, ACD 5% e solução fisiológica. A suspensão celular obtida foi utilizada para realização do ensaio clonogênico, avaliação da viabilidade celular, quantificação das células nucleadas (CN), CD34+ e das ALDH br . Os parâmetros tempo, custo e o resultado do ensaio clonogênico, utilizados para avaliar a metodologia, indicaram que a suspensão celular diluída é o melhor método a ser utilizado para a realização do ensaio clonogênico. A quantificação das CN e das células CD34+ totais pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,3 (±1,9) x 10 8 e 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) e 3,3 (±2,7) x 10 6 e 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectivamente. A quantificação das CN e das células CD34+ viáveis pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,1 (±1,9) e 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) e 3,27 (±2,0) x 10 6 e 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectivamente. A porcentagem de células nucleadas e CD34+ viáveis no segmento proximal e na bolsa de 20 mL foi, respectivamente, 66,3 (±11,8) e 75 (35-93); 76,5 (±11,6) e 89 (75-100). No ensaio clonogênico foi observado crescimento médio de 31,8 (±7,6) unidades formadoras de colônias granulócito-macrófago (CFU-GM) x 10 5 CN plaqueadas obtidas da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. Não foi encontrada correlação entre as células ALDH br /CD45 + viáveis e a quantificação das CFUGM ou das células CD34+ viáveis da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. O coeficiente de correlação entre as células nucleadas e as células ALDEFLUOR bright da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento foi (r) = 0,9399 com p < 0,0001 e (r) = 0,5478 com p = 0,0426, respectivamente. Foi encontrada correlação entre quantificação das células CD34+ e das CFU-GM da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento. Esses dados indicam que o método utilizado para a realização da criopreservação e o descongelamento das unidades de SCUP encontra-se validado, e que o segmento pode ser utilizado como uma ferramenta de controle de qualidade para a seleção da unidade de SCUP para transplante. Palavras-chave: Validação. Sangue de cordão umbilical e placentário. Aldefluor. Célulastronco hematopoéticas. / ABSTRACT BALDISSERA, J.L.C. Evaluation of different methods of performing clonogenic assay and validation of the method of cryopreservation and resuspension of cryopreserved umbilical cord and placental blood. 2015. 78 f. Master Dissertation. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. Umbilical cord and placental blood (UCPB) has been used as a source of hematopoietic stem cells (HSCs) for transplant. The quality of this product may be affected during the various stages of processing it. In this study, the author reviewed the best preparation methodology for performing the clonogenic assay (pure, diluted or washed) and validated the method of cryopreservation and resuspension of UCPB bags. The author also evaluated the functionality of the aldehyde dehydrogenase enzyme (ALDH) as a method to determine the function of umbilical cord and placental blood HSCs, in 15 cryopreserved units by the Laboratory of Cryobiology and Cell Therapy of the Center for Hematology and Hemotherapy of Santa Catarina (HEMOSC). The units were thawed in four steps. The content of the segments and the bag was collected and resuspended in a 5% albumin solution, 5% acid ci trate dextrose and saline solution. The cell suspension obtained was used to conduct the clonogenic assay, the assessment of cell viability, the quantification of nucleated cells (NC), CD34 + and ALDH br . The parameters of time, cost and the result of the clonogenic assay, used to evaluate the methodology, indicated that the diluted cell suspension is the best method to be used when performing a clonogenic assay. The quantification of the nucleated cells (NC) and the total CD34+ cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,3 (±1,9) x 10 8 and 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) and 3,3 (±2,7) x 10 6 and 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectively. The quantification of the NC and CD34+ viable cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,1 (±1,9) and 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) and 3,27 (±2,0) x 10 6 and 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectively. The percentage of viable nucleated cells and CD34+ viable cells in the proximal segment and in the 20mL bag was 66,3 (±11,8) and 75 (35-93); 76,5 (±11,6) and 89 (75-100), respectively. In the clonogenic assay an average growth of 31,8 (± 7,6) colony-forming granulocyte-macrophage units (CFUGM) x 10 5 NC plated, obtained from the post-cryopreservation/thawing bag was observed. No correlation between the ALDH br /CD45 + viable cells and the quantification of CFU-GM or CD34+ viable cells obtained from the bag post cryopreservation was found. The coefficient of correlation between nucleated cells and ALDEFLUOR bright cells from the bag and segment after cryopreservation were (r) = 0, 9399 with p < 0, 0001 and (r) = 0, 5478 with p = 0,0426, respectively. A correlation between quantification of CD34+ cells and CFU-GM bag and segment cells after cryopreservation/thawing was found. This data indicates that the method used to perform the cryopreservation and thawing of the UCPB unit has been validated, and that the segment can be used as a tool for quality control when making the selection of UCPB for transplant. Keywords: Validation. Umbilical cord and placental blood. Aldefluor. Hematopoietic stem cells.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-07T12:41:36Z No. of bitstreams: 1 Ismaela Maria Ferreira de Melo.pdf: 1484897 bytes, checksum: 412f7fc7d3537d1d040e74378ac1ef3c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T12:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ismaela Maria Ferreira de Melo.pdf: 1484897 bytes, checksum: 412f7fc7d3537d1d040e74378ac1ef3c (MD5) Previous issue date: 2012-02-07 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Fluoroquinolones are frequently used in human and veterinary medicine for treatment and prevention of disease respiratory tract, digestive and urinary. Within this group we can highlight the enrofloxacin, a drug that presents a wide spectrum of activity against Gram positive and Gram negative. It is known that fluoroquinolones are the property of crossing the placenta and may have adverse effects on the developing fetus, especially when you consider that more than half of pregnancies are unplanned, and thus a large number of women may be exposed to potentially these drugs during the first trimester of pregnancy. However, the mechanisms of these adverse effects are still unknown. Thus, the present study was to evaluate the effect of enrofloxacin in pregnant rats on placental development and offspring. Enrofloxacin (Baytril ®) was administered at a dose of 5 mg / kg daily intramuscular throughout pregnancy. The placentas were analyzed morphologically, morphometrically and immunohistochemical tests for seven, fourteen and twenty days of pregnancy. The results showed that the treated group there was significant reduction in the number of implantation sites, weight and placental total area of the disk at fourteen and twenty days of development, and quantitative changes in the constituents of the layers of the labyrinth, trophoblastic giant cells and trofospongio of the placenta. There were observed no evidence of malformation in the head, trunk and limbs of neonates. However, there was a significant reduction in the number and weight of neonates in enrofloxacin-treated group compared to control, but without affecting its length. There was no change in the histochemical analysis, however, the TUNEL test showed stronger apoptotic activity in the placentas with only 14 days of development in the treated group compared to control. With this we conclude that enrofloxacin when administered at a dose of 5 mg/kg in rats during pregnancy interferes with placental development by altering the constituents of the placenta and increase apoptosis in the middle third of pregnancy, and reflecting the reduction in the number and weight of neonates. / As fluoroquinolonas são freqüentemente usadas na medicina humana e veterinária para tratamento e prevenção de doenças do trato respiratório, digestivo e urinário. Dentro deste grupo podemos destacar a enrofloxacina, um fármaco que apresenta um elevado espectro de atividade frente bactérias Gram positivo e Gram negativo. Sabe-se que as fluoroquinolonas têm a propriedade de atravessar a placenta podendo ter efeitos adversos no feto em desenvolvimento, principalmente se levarmos em consideração que mais da metade das gestações não são planejadas, e assim, um grande número de mulheres pode ser potencialmente expostas a estes fármacos durante o primeiro trimestre de gravidez. No entanto, os mecanismos desses efeitos adversos ainda são desconhecidos. Assim, a presente pesquisa teve como objetivo avaliar o efeito da enrofloxacina em ratas prenhas no desenvolvimento da placenta e da prole. A enrofloxacina (Baytril®) foi administrada na dose de 5 mg/kg, diariamente, via intramuscular, durante toda a gestação. As placentas foram analisadas morfologicamente, morfometricamente e imunohistoquimicamente aos sete, quatorze e vinte dias de prenhez. Os resultados mostraram que no grupo tratado houve redução significativa do número de sítios de implantação, do peso e área total do disco placentário aos quatorze e vinte dias de desenvolvimento, e alterações quantitativas nos elementos constituintes das camadas do labirinto, trofospongio e células trofoblasticas gigantes da placenta. Não foram observados nenhum indício de malformação na cabeça, tronco e membros dos neonatos. No entanto, houve uma redução significativa no número e peso dos neonatos no grupo tratado com a enrofloxacina em relação ao controle, porém sem afetar o seu comprimento. Não houve alteração na análise histoquímica, porém, o teste de TUNEL mostrou atividade apoptótica mais intensa apenas nas placentas com 14 dias de desenvolvimento do grupo tratado em relação ao controle. Com isso concluímos que a enrofloxacina quando administrada na dosagem de 5 mg/kg durante prenhez em ratas interfere no desenvolvimento placentário, por alterar os elementos constituintes da placenta e aumentar a apoptose no terço médio da gestação, tendo como reflexo a redução no número e peso dos neonatos.

RESUMO BALDISSERA, J.L.C. Avaliação das diferentes metodologias de realização do ensaio clonogênico e validação do método de criopreservação e ressuspensão do sangue de cordão umbilical e placentário criopreservado. 2015, 78 f. Dissertação. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. O sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) tem sido utilizado como fonte de célulastronco hematopoéticas (CTHs) para transplante. A qualidade desse produto pode ser afetada durante as várias etapas do seu processamento. Neste estudo, foi avaliada a melhor metodologia de preparo da amostra para a realização do ensaio clonogênico (pura, diluída ou lavada) e validado o método de criopreservação e de ressuspensão das bolsas de SCUP. Foi avaliada também a funcionalidade da enzima aldeído desidrogenase (ALDH) como método para determinar a função das CTHs do SCUP, em 15 unidades criopreservadas pelo Laboratório de Criobiologia e Terapia Celular do Centro de Hematologia e Hemoterapia de Santa Catarina (HEMOSC). As unidades foram descongeladas em quatro etapas. O conteúdo dos segmentos e da bolsa foi coletado e ressuspenso com solução de albumina 5%, ACD 5% e solução fisiológica. A suspensão celular obtida foi utilizada para realização do ensaio clonogênico, avaliação da viabilidade celular, quantificação das células nucleadas (CN), CD34+ e das ALDH br . Os parâmetros tempo, custo e o resultado do ensaio clonogênico, utilizados para avaliar a metodologia, indicaram que a suspensão celular diluída é o melhor método a ser utilizado para a realização do ensaio clonogênico. A quantificação das CN e das células CD34+ totais pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,3 (±1,9) x 10 8 e 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) e 3,3 (±2,7) x 10 6 e 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectivamente. A quantificação das CN e das células CD34+ viáveis pré-criopreservação e pós-criopreservação/descongelamento foi 8,1 (±1,9) e 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) e 3,27 (±2,0) x 10 6 e 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectivamente. A porcentagem de células nucleadas e CD34+ viáveis no segmento proximal e na bolsa de 20 mL foi, respectivamente, 66,3 (±11,8) e 75 (35-93); 76,5 (±11,6) e 89 (75-100). No ensaio clonogênico foi observado crescimento médio de 31,8 (±7,6) unidades formadoras de colônias granulócito-macrófago (CFU-GM) x 10 5 CN plaqueadas obtidas da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. Não foi encontrada correlação entre as células ALDH br /CD45 + viáveis e a quantificação das CFUGM ou das células CD34+ viáveis da bolsa pós-criopreservação/descongelamento. O coeficiente de correlação entre as células nucleadas e as células ALDEFLUOR bright da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento foi (r) = 0,9399 com p < 0,0001 e (r) = 0,5478 com p = 0,0426, respectivamente. Foi encontrada correlação entre quantificação das células CD34+ e das CFU-GM da bolsa e do segmento pós-criopreservação/descongelamento. Esses dados indicam que o método utilizado para a realização da criopreservação e o descongelamento das unidades de SCUP encontra-se validado, e que o segmento pode ser utilizado como uma ferramenta de controle de qualidade para a seleção da unidade de SCUP para transplante. Palavras-chave: Validação. Sangue de cordão umbilical e placentário. Aldefluor. Célulastronco hematopoéticas. / ABSTRACT BALDISSERA, J.L.C. Evaluation of different methods of performing clonogenic assay and validation of the method of cryopreservation and resuspension of cryopreserved umbilical cord and placental blood. 2015. 78 f. Master Dissertation. Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2015. Umbilical cord and placental blood (UCPB) has been used as a source of hematopoietic stem cells (HSCs) for transplant. The quality of this product may be affected during the various stages of processing it. In this study, the author reviewed the best preparation methodology for performing the clonogenic assay (pure, diluted or washed) and validated the method of cryopreservation and resuspension of UCPB bags. The author also evaluated the functionality of the aldehyde dehydrogenase enzyme (ALDH) as a method to determine the function of umbilical cord and placental blood HSCs, in 15 cryopreserved units by the Laboratory of Cryobiology and Cell Therapy of the Center for Hematology and Hemotherapy of Santa Catarina (HEMOSC). The units were thawed in four steps. The content of the segments and the bag was collected and resuspended in a 5% albumin solution, 5% acid ci trate dextrose and saline solution. The cell suspension obtained was used to conduct the clonogenic assay, the assessment of cell viability, the quantification of nucleated cells (NC), CD34 + and ALDH br . The parameters of time, cost and the result of the clonogenic assay, used to evaluate the methodology, indicated that the diluted cell suspension is the best method to be used when performing a clonogenic assay. The quantification of the nucleated cells (NC) and the total CD34+ cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,3 (±1,9) x 10 8 and 8,2 (±2,0) x 10 8 (p = 0,3388) and 3,3 (±2,7) x 10 6 and 3,2 (±2,1) x10 6 (p = 0,4455), respectively. The quantification of the NC and CD34+ viable cells pre-cryopreservation and post-cryopreservation/thawing was 8,1 (±1,9) and 6,3 (±1,7) x 10 8 (p < 0,0001) and 3,27 (±2,0) x 10 6 and 2,8 (±1,8) x 10 6 (p = 0,0063), respectively. The percentage of viable nucleated cells and CD34+ viable cells in the proximal segment and in the 20mL bag was 66,3 (±11,8) and 75 (35-93); 76,5 (±11,6) and 89 (75-100), respectively. In the clonogenic assay an average growth of 31,8 (± 7,6) colony-forming granulocyte-macrophage units (CFUGM) x 10 5 NC plated, obtained from the post-cryopreservation/thawing bag was observed. No correlation between the ALDH br /CD45 + viable cells and the quantification of CFU-GM or CD34+ viable cells obtained from the bag post cryopreservation was found. The coefficient of correlation between nucleated cells and ALDEFLUOR bright cells from the bag and segment after cryopreservation were (r) = 0, 9399 with p < 0, 0001 and (r) = 0, 5478 with p = 0,0426, respectively. A correlation between quantification of CD34+ cells and CFU-GM bag and segment cells after cryopreservation/thawing was found. This data indicates that the method used to perform the cryopreservation and thawing of the UCPB unit has been validated, and that the segment can be used as a tool for quality control when making the selection of UCPB for transplant. Keywords: Validation. Umbilical cord and placental blood. Aldefluor. Hematopoietic stem cells.

A utilização das células progenitoras hematopoéticas (CPH) obtidas do sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) apresenta vários benefícios para o transplante de CPH em comparação às células provenientes de outras fontes. Dentre eles, a maior disponibilidade e a maior imaturidade imunológica das CPH, o que permite certa flexibilidade nos critérios de compatibilidade entre doador e receptor e uma menor taxa de reação do enxerto-versus-hospedeiro. A legislação brasileira e órgãos internacionais exigem a realização de vários testes para garantir a qualidade do produto hemoterápico contendo CPH a ser transplantado. O objetivo deste estudo foi confirmar que o teste para quantificação de CPH com elevada atividade da enzima ALDH1(ALDHbr) pode ser considerado um teste de adequado ou seja, é capaz de predizer quais produtos tem melhor capacidade de repopular a medula óssea do recipiente após o transplante. Para isso, foram utilizadas 40 unidades de SCUP coletadas e processadas pelo Banco de Sangue de Cordão Umbilical e Placentário do Cetebio / Fundação Hemominas. As unidades foram processadas por método automatizado e amostras do creme leucocitário (buffy coat) foram coletadas para a realização da quantificação de células ALDHbr, quantificação de células CD34+, ensaio clonogênico (CFU), hemograma e cálculo do total de células nucleadas (TCN). A citometria de fluxo foi utilizada para a quantificação das CPH ALDHbr e CD34+ e das subpopulações CD45dim e CD38+. Outras informações como idade materna, idade gestacional e sexo do recém-nascido também foram coletadas para descrição das unidades. Para verificar a viabilidade da utilização do teste de ALDH pelos BSCUP foi realizado o levantamento do seu custo. A capacidade funcional das CPH em proliferar e se diferenciar em tecido hematopoético foi avaliada por meio do ensaio clonogênico. Detectou-se correlação entre a quantidade de células ALDHbr e o número de colônias no ensaio clonogênico (p<0,001), entre o número de células ALDHbr e de células CD34+ (p=0,001) e entre o número de colônias no ensaio clonogênico e o número de células CD34+ (p<0,001). A imunofenotipagem mostrou que 46,25% das células ALDHbr eram CD45dimCD38+CD34+. Os dados sugerem que a quantificação de células ALDHbr em unidades de SCUP pode ser considerada teste adequado, de baixo custo, de execução simples, rápida e menos dependente do operador em relação ao ensaio clonogênico. / The use of the umbilical cord blood cells presents numberless benefits when compared to the cells from different sources. Among them, the ease of availability, the bigger immunological immaturity, which allows some flexibility in the compatibility between donor and receptor and less induction of reaction of graft-versus-host. The Brazilian legislation and international organizations demand the practice of various tests to guarantee the quality of the product to be transplanted. The aim of this research was to confirm that the test used to quantify ALDHbr cells can be considered a power test, meaning that it tests the ability to repopulate the bone marrow after transplant. For this study, it has been used 40 units of SCUP collected and processed by the Cetebio Umbilical Cord Blood Bank - Fundação Hemominas. The units were processed by the automatized method and the samples of the final product (buffy coat) were collected for the quantification of ALDHbr cells, quantification of CD34+ cells, clonogenic essay (CFU), hemogram and the total number of nucleated cells (TNC). It was used the flow cytometry to perform ALDH and CD34+ tests. Besides that, it was also performed the association of antibodies anti-CD34, anti-CD45 and anti-CD38 for the immunophenotyping of the units. Other information such as maternal age, fertilization age and the newborn gender were also collected for description of the units. In order to verify the viability of the use of the ALDH test by BSCUP its costs were calculated, as well as of the clonogenic essay. The results showed a significant correlation between ALDHbr cells and the clonogenic essay (p<0.001), between ALDHbr and CD34+ cells (p=0,001) and between the clonogenic essay and the quantification of CD34+ cells (p<0,001). The immunophenotyping revealed that 46,25% of ALDHbr cells were CD45dimCD38+CD34+. The data indicated that the quantification of ALDHbr cells in the SCUP units can be considered a powerful and low cost procedure, of easier and quicker execution and less operator dependent.