Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:39Z : No. of bitstreams: 1 Publico-056a.pdf: 696691 bytes, checksum: 64c4289072c6f1c83f49be3d7e27f3ae (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:39Z : No. of bitstreams: 2 Publico-056a.pdf: 696691 bytes, checksum: 64c4289072c6f1c83f49be3d7e27f3ae (MD5) Publico-056b.pdf: 486744 bytes, checksum: 8df649e134c8e80fb3b1eb63056a2d16 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:39Z : No. of bitstreams: 3 Publico-056a.pdf: 696691 bytes, checksum: 64c4289072c6f1c83f49be3d7e27f3ae (MD5) Publico-056b.pdf: 486744 bytes, checksum: 8df649e134c8e80fb3b1eb63056a2d16 (MD5) Publico-056c.pdf: 204395 bytes, checksum: 0a9399461d184b10dd67c8512f955943 (MD5). 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Em nosso meio, a resistência às cefalosporinas de amplo espectro em enterobactérias tem sido associada à produção de β-lactamases de espectro ampliado (ESβL). Porém, nos últimos anos, a produção de cefalosporinases do tipo AmpC mediadas por genes plasmídiais (pAmpC) também tem sido responsabilizada pela resistência a essas drogas. O objetivo deste estudo foi avaliar a presença de pAmpCs entre amostras de enterobactérias isoladas de pacientes internados no Hospital São Paulo que apresentaram infecção de corrente sangüínea, entre janeiro e julho de 2006. Foram estudadas 133 amostras de enterobactérias identificadas como K. pneumoniae (65 amostras), K. oxytoca (5 amostras), E. coli (41 amostras), P. mirabilis (18 amostras) e Salmonella spp. (4 amostras). O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos selecionados foi avaliado pela técnica de diluição em ágar, segundo as recomendações do CLSI. A detecção fenotípica da produção de pAmpC foi realizada pelos testes tri-dimensional e de Hodge modificado. Adicionalmente, foi realizada a detecção fenotípica da produção de ESβL. A pesquisa e identificação dos genes que codificam pAmpC foram realizados pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) e seqüenciamento. Entre os antimicrobianos testados, imipenem (99,2%) apresentou a maior taxa de sensibilidade, seguido pela cefoxitina (80,5%). De forma geral, os isolados de K. pneumoniae apresentaram alto grau de resistência aos β- lactâmicos e os isolados de P. mirabilis apresentaram a menor taxa de sensibilidade para ciprofloxacino (27,8%). Entre as 133 amostras estudadas, 59 (44,4%) foram classificadas fenotipicamente como produtoras de ESβL pela metodologia de disco aproximação. Foi observada discordância entre os resultados dos testes fenotípicos para detecção de pAmpC. A produção de pAmpC foi observada em seis isolados de acordo com o teste tri-dimensional, enquanto, o método de Hodge modificado classificou 19 isolados como possíveis produtores de pAmpC. Além disso, resultados duvidosos foram observados em ambas as técnicas. Um único isolado de K. pneumoniae foi identificado como produtor de CMY-2. Este isolado foi corretamente identificado como produtor de pAmpC por ambos métodos fenotípicos empregados. / The broad-spectrum cephalosporins are the main therapeutic options to Enterobacteriaceae infections and the resistance to these agents has been associated to ESβL production. However, plasmid-mediated AmpC β-lactamases (pAmpC) have been associated with this resistance phenotype. The aim of this study was to determine the occurrence of pAmpC among clinical isolates recovered from bloodstream from patients hospitalized at a Brazilian teaching hospital, collected between January and July 2006. A total of 133 non-repetitive Enterobacteriaceae per patients (65 K. pneumoniae, 41 E. coli, 18 P. mirabilis, 05 K. oxytoca and 04 Salmonella spp.) were studied. The antimicrobial susceptibility profile was determined by CLSI agar dilution method. ESβL phenotype was detected by doubledisk diffusion method while pAmpC production was evaluated by two phenotypic methods: modified three-dimensional and modified Hodge tests and the presence of pAmpC genes was confirmed by PCR and sequencing. Among tested antimicrobial, imipenem showed the highest susceptibility rate (99.2%), followed by cefoxitin (80.5%). K. pneumoniae presented high resistance to β-lactams. P. mirabilis isolates showed the lower susceptibility rate to ciprofloxacin (27.8%). Fifty-nine (44.4%) of studied isolates were phenotypically classified as ESβL producers. Modified threedimensional and Hodge methods classified 06 and 19 Enterobacteriaceae strains as pAmpC producers, respectively. Discordant results were observed between phenotypic pAmpC detection methods. Of those, a single K. pneumoniae isolate was confirmed as CMY-2 producer. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.

Uma abordagem promissora para a obtenção de coquetéis enzimáticos eficientes para a etapa de hidrólise na produção de etanol de 2ª geração é o enriquecimento em termos de atividades que lhes faltam, mas podem ser obtidas através de sistemas heterólogos. O trabalho teve como objetivo avaliar o sistema toxina -antitoxina (TA) para estabilização plasmidial em E. coli na produção de expansina e endoglucanase recombinantes. Os resultados indicaram que o sistema de expressão com estabilização TA é tão eficaz quanto o dependente de antibiótico para estabilização plasmidial. Além disso, mostrou-se mais eficiente pelo fato de não permitir a sobrevivência de células sem o plasmídeo. Estudos indicaram a quantidade mínima de 0,05mM de IPTG para expressão das proteínas nesta linhagem, cerca de 20 vezes menos que a concentração usualmente aplicada no momento da indução. Sendo assim, o sistema de estabilização plasmidial TA mostrou-se uma ótima ferramenta para o desenvolvimento de uma plataforma alternativa para a produção de proteínas recombinantes. / A promising approach to obtain efficient enzyme cocktails for the hydrolysis step in the production of 2nd generation ethanol is the enrichment in terms of activities that are lacking, but can be obtained by heterologous systems. The study aimed to evaluate the toxina-antitoxin (TA) system for plasmid stabilization in E. coli in the production of recombinant expansin and endoglucanase. The results indicated that the expression system with TA stabilization is as effective as the antibiotic dependent for plasmid stabilization. Moreover, it proved to be more efficient by not allo wing the survival of cells without the plasmid. Studies have indicated the minimum amount of 0.05 mM IPTG for expression of proteins in this strain, about 20 times less than the concentration usually applied for induction. Thus, the plasmid stabilization TA system proved to be a great tool for the development of an alternative platform for producing recombinant proteins.

Neste estudo 60 cepas de Aeromonas, 15 A. hydrophila, 15 A. caviae, 15 A. sobria e 15 A. jandaei, isoladas de 5 diferentes pontos do reservatório de Guarapiranga, São Paulo, e previamente testada quanto à produção de fatores de virulência, acúmulo de fluído em alça ligada e hemólise em ágar sangue, foram submetidas a ribotipagem e a análise do perfil plasmidial. Cada cepa apresentou um perfil de ribotipagem diferente tendo-se observado para as espécies A. hydrophila e A. caviae a diferenciação em 3 agrupamentos, e A. sobria e A. jandaei dois agrupamentos cada. A análise do perfil plasmidial demonstrou que 13,4 por cento das A. hydrophila apresentaram um ou no máximo 2 plasmídios, enquanto 33,3 por cento das A. sobria e 53,3 por cento das A. jandaei apresentaram de 1 a 6 plasmídios para cada espécie; A. caviae não apresentou cepas contendo plasmídios. Não foi observada correlação entre a presença de plasmídios e a produção de fatores de virulência pelas cepas estudadas. A ribotipagem demonstrou haver um polimorfismo genômico dentro de uma mesma espécie de Aeromollas e, ainda, diferenciou cepas isoladas de um mesmo ponto de amostragem. Estas metodologias, ribotipagem e análise do perfil plasmidial, apresentam em geral características que são complementares, demonstrando ser ferramentas importantes a serem empregadas, tanto em estudos epidemiológicos como ecológicos. / In this work 60 Aeromonas strains, 15 A. hydrophila, 15 A. caviae, 15 A. sobria and 15 A. jandaei isolated from 5 different points of Guarapiranga Dam, São Paulo, and previously tested for virulence factors production (ileal loop assay and hemolysis on blood agar) were submitted to ribotyping and plasmidial profiles analysis. Each strain showed a different ribopattern and there were observed that for A. hydrophila and A. caviae each specie were grouped in 3 ribotypes, A. sobria and A. jandaei in 2 ribotype each. Plasmidial profiles analysis demonstrated that 13,4 per cent af A. hydrophila had at least one but no more than 2 plasmids, 33,3 per cent of A. sobria and 53,3 per cent af A. jandaei had from one to 6 plasmids each, and A. caviae didn\'t show to have any plasmids. There were not observed correlation between presence of plasmids and virulence factor production. Ribotyping showed that there are genomic polymorphism within the same Aeromonas specie and differentiate strains that were isolated from the same sample point, indicating that those methodologies have in general characteristics that are complementary and are important tools to be used either in epidemiological or ecological studies.

Nosso grupo tem estudado uma estratégia alternativa de tratamento para a deficiência de hormônio de crescimento (DGH), utilizando a administração in vivo do plasmídeo pUC-UBI-hGH, seguida de eletroporação, no músculo quadríceps de camundongos anões e imunodeficientes (lit/scid), que proporcionou níveis sustentáveis de hGH na circulação durante 60 dias e um aumento significativo de peso dos animais tratados. Visando investigar os efeitos autócrinos/parácrinos e endócrinos derivados deste tipo de tratamento, e compará-los aos da administração diária por via parenteral do hormônio de crescimento humano recombinante (r-hGH) neste modelo animal, os seguintes parâmetros de crescimento foram avaliados no presente trabalho: peso corpóreo, comprimento total do corpo e da cauda, pesos de órgãos (fígado, rins, coração, baço, músculos quadríceps e gastrocnêmio) e os níveis plasmáticos de mIGF-I (fator de crescimento semelhante à insulina I de camundongo) e de glicose. Em um primeiro experimento, foram observados aumentos altamente significativos (P<0,001) do peso corpóreo e do comprimento total do corpo e da cauda, após 50 dias de tratamento. Todos os órgãos analisados para o grupo tratado, exceto os músculos gastrocnêmios apresentaram aumentos de peso altamente significativos. O quadríceps direito, o que recebeu a injeção do DNA plasmidial, apresentou um aumento de peso de 48,1% em comparação com o controle injetado com salina (P<0,001), enquanto o aumento de peso dos quadríceps esquerdo, não injetados, dos animais tratados foi de 31% (P<0,005). Estes dados sugerem efeitos locais (autócrino e / ou parácrinos) e sistêmicos (endócrinos) resultantes da injeção do plasmídeo contendo o gene do hGH e da consequente expressão e secreção do hGH. Em outro experimento, a comparação da administração única de DNA plasmidial com injeções diárias de r-hGH proporcionou aumentos significativos dos pesos corpóreos, em relação ao grupo controle, de 23,1% (P<0,01) e de 35,5% (P<0,001) para os grupos tratados com DNA e proteína, respectivamente, enquanto as inclinações das curvas de crescimento foram praticamente idênticas: 0,094 g / animal / dia para a injeção de DNA e 0,095 g / animal / dia para a proteína. Entre os dois grupos tratados, não houve diferenças significativas entre o peso dos seguintes órgãos: rins direito e esquerdo, baço e músculo quadríceps direito. Os níveis de glicose no plasma dos grupos tratados e controle não apresentaram diferenças significativas ao final dos tratamentos de 28 e 50 dias. As diferenças das concentrações de mIGF-I entre os grupos tratados foram significativas apenas após 7 dias de tratamento. Os valores foram sempre maiores para o grupo tratado com DNA plasmidial em relação ao grupo do r-hGH, e os níveis de ambos os grupos tratados foram significativamente superiores ao do grupo controle. Apesar da necessidade de outros estudos para confirmar a segurança e a viabilidade deste tratamento, este tipo de terapia gênica para a DGH pode vir a ser uma alternativa viável ao tratamento padrão desta doença, baseado em repetidas injeções de r-hGH altamente purificado. / Our group has studied an alternative strategy for the treatment of growth hormone deficiency (GHD), using the in vivo administration of the plasmid pUC-UBI-hGH, followed by electroporation, into the quadriceps muscle of immunodeficient dwarf mice (lit/scid), that provided sustainable levels of hGH in the circulation during 60 days and a significant increase of body weight in the treated animals. In order to investigate the autocrine / paracrine and endocrine effects derived from this type of treatment, and compare them to the parentheral daily administration of the recombinant human growth hormone (r-hGH) in this animal model, the following growth parameters were evaluated in this study: body weight, total body length, tail length, organ weights (liver, kidneys, heart, spleen, quadriceps and gastrocnemius muscles) and the plasmatic levels of mIGF-I (mouse insulin-like growth factor I) and glucose. In a first experiment, higly significant increases of body weight, total body length and tail length were observed, after 50 days of treatment. All the analised organs of the treated group, except the two gastrocnemius muscles, presented a highly significant weight increase. The right quadriceps, that received the DNA injection, presented a 48.1% weight increase versus saline injected control (P<0.001), whereas the weight increase of left quadriceps, non injected, of treated animals was 31.0% (P<0.005). These data suggest local (autocrine and / or paracrine) and systemic (endocrine effects as a result of hGH DNA injection and the consequent hGH expression and secretion. In a second experiment, the comparison between single plasmid DNA administration with daily r-hGH injections provided significant body weight increases (P<0.001) of both treated groups, compared to control group, of 23.1% (P<0.01) and 35.5% for DNA and protein treated groups respectively, while the slopes of the growth curves were practically identical: 0.094 g / mouse / day for DNA and 0.095 g / mouse / day for protein injection. In both treated groups, the weights of the following organs did not present significant differences: right and left kidneys, spleen and right quadriceps muscle. The levels of glucose in the plasma of treated and control groups showed no significant differences after 28 and 50 days. The differences in mIGF-I concentration, among the treated groups, were significant only 7 days after treatment. The values were always higher in the group treated with plasmid DNA in relation to the r-hGH group, and the levels of both treated groups were significantly higher than the control group. Despite the need for further studies to confirm the safety and feasibility of this treatment, this type of gene therapy for DGH can be a viable alternative to the standard treatment for this disease, based on repetitive injections of highly purified r-hGH.

Neste estudo 60 cepas de Aeromonas, 15 A. hydrophila, 15 A. caviae, 15 A. sobria e 15 A. jandaei, isoladas de 5 diferentes pontos do reservatório de Guarapiranga, São Paulo, e previamente testada quanto à produção de fatores de virulência, acúmulo de fluído em alça ligada e hemólise em ágar sangue, foram submetidas a ribotipagem e a análise do perfil plasmidial. Cada cepa apresentou um perfil de ribotipagem diferente tendo-se observado para as espécies A. hydrophila e A. caviae a diferenciação em 3 agrupamentos, e A. sobria e A. jandaei dois agrupamentos cada. A análise do perfil plasmidial demonstrou que 13,4 por cento das A. hydrophila apresentaram um ou no máximo 2 plasmídios, enquanto 33,3 por cento das A. sobria e 53,3 por cento das A. jandaei apresentaram de 1 a 6 plasmídios para cada espécie; A. caviae não apresentou cepas contendo plasmídios. Não foi observada correlação entre a presença de plasmídios e a produção de fatores de virulência pelas cepas estudadas. A ribotipagem demonstrou haver um polimorfismo genômico dentro de uma mesma espécie de Aeromollas e, ainda, diferenciou cepas isoladas de um mesmo ponto de amostragem. Estas metodologias, ribotipagem e análise do perfil plasmidial, apresentam em geral características que são complementares, demonstrando ser ferramentas importantes a serem empregadas, tanto em estudos epidemiológicos como ecológicos. / In this work 60 Aeromonas strains, 15 A. hydrophila, 15 A. caviae, 15 A. sobria and 15 A. jandaei isolated from 5 different points of Guarapiranga Dam, São Paulo, and previously tested for virulence factors production (ileal loop assay and hemolysis on blood agar) were submitted to ribotyping and plasmidial profiles analysis. Each strain showed a different ribopattern and there were observed that for A. hydrophila and A. caviae each specie were grouped in 3 ribotypes, A. sobria and A. jandaei in 2 ribotype each. Plasmidial profiles analysis demonstrated that 13,4 per cent af A. hydrophila had at least one but no more than 2 plasmids, 33,3 per cent of A. sobria and 53,3 per cent af A. jandaei had from one to 6 plasmids each, and A. caviae didn\'t show to have any plasmids. There were not observed correlation between presence of plasmids and virulence factor production. Ribotyping showed that there are genomic polymorphism within the same Aeromonas specie and differentiate strains that were isolated from the same sample point, indicating that those methodologies have in general characteristics that are complementary and are important tools to be used either in epidemiological or ecological studies.

Nosso grupo tem estudado uma estratégia alternativa de tratamento para a deficiência de hormônio de crescimento (DGH), utilizando a administração in vivo do plasmídeo pUC-UBI-hGH, seguida de eletroporação, no músculo quadríceps de camundongos anões e imunodeficientes (lit/scid), que proporcionou níveis sustentáveis de hGH na circulação durante 60 dias e um aumento significativo de peso dos animais tratados. Visando investigar os efeitos autócrinos/parácrinos e endócrinos derivados deste tipo de tratamento, e compará-los aos da administração diária por via parenteral do hormônio de crescimento humano recombinante (r-hGH) neste modelo animal, os seguintes parâmetros de crescimento foram avaliados no presente trabalho: peso corpóreo, comprimento total do corpo e da cauda, pesos de órgãos (fígado, rins, coração, baço, músculos quadríceps e gastrocnêmio) e os níveis plasmáticos de mIGF-I (fator de crescimento semelhante à insulina I de camundongo) e de glicose. Em um primeiro experimento, foram observados aumentos altamente significativos (P<0,001) do peso corpóreo e do comprimento total do corpo e da cauda, após 50 dias de tratamento. Todos os órgãos analisados para o grupo tratado, exceto os músculos gastrocnêmios apresentaram aumentos de peso altamente significativos. O quadríceps direito, o que recebeu a injeção do DNA plasmidial, apresentou um aumento de peso de 48,1% em comparação com o controle injetado com salina (P<0,001), enquanto o aumento de peso dos quadríceps esquerdo, não injetados, dos animais tratados foi de 31% (P<0,005). Estes dados sugerem efeitos locais (autócrino e / ou parácrinos) e sistêmicos (endócrinos) resultantes da injeção do plasmídeo contendo o gene do hGH e da consequente expressão e secreção do hGH. Em outro experimento, a comparação da administração única de DNA plasmidial com injeções diárias de r-hGH proporcionou aumentos significativos dos pesos corpóreos, em relação ao grupo controle, de 23,1% (P<0,01) e de 35,5% (P<0,001) para os grupos tratados com DNA e proteína, respectivamente, enquanto as inclinações das curvas de crescimento foram praticamente idênticas: 0,094 g / animal / dia para a injeção de DNA e 0,095 g / animal / dia para a proteína. Entre os dois grupos tratados, não houve diferenças significativas entre o peso dos seguintes órgãos: rins direito e esquerdo, baço e músculo quadríceps direito. Os níveis de glicose no plasma dos grupos tratados e controle não apresentaram diferenças significativas ao final dos tratamentos de 28 e 50 dias. As diferenças das concentrações de mIGF-I entre os grupos tratados foram significativas apenas após 7 dias de tratamento. Os valores foram sempre maiores para o grupo tratado com DNA plasmidial em relação ao grupo do r-hGH, e os níveis de ambos os grupos tratados foram significativamente superiores ao do grupo controle. Apesar da necessidade de outros estudos para confirmar a segurança e a viabilidade deste tratamento, este tipo de terapia gênica para a DGH pode vir a ser uma alternativa viável ao tratamento padrão desta doença, baseado em repetidas injeções de r-hGH altamente purificado. / Our group has studied an alternative strategy for the treatment of growth hormone deficiency (GHD), using the in vivo administration of the plasmid pUC-UBI-hGH, followed by electroporation, into the quadriceps muscle of immunodeficient dwarf mice (lit/scid), that provided sustainable levels of hGH in the circulation during 60 days and a significant increase of body weight in the treated animals. In order to investigate the autocrine / paracrine and endocrine effects derived from this type of treatment, and compare them to the parentheral daily administration of the recombinant human growth hormone (r-hGH) in this animal model, the following growth parameters were evaluated in this study: body weight, total body length, tail length, organ weights (liver, kidneys, heart, spleen, quadriceps and gastrocnemius muscles) and the plasmatic levels of mIGF-I (mouse insulin-like growth factor I) and glucose. In a first experiment, higly significant increases of body weight, total body length and tail length were observed, after 50 days of treatment. All the analised organs of the treated group, except the two gastrocnemius muscles, presented a highly significant weight increase. The right quadriceps, that received the DNA injection, presented a 48.1% weight increase versus saline injected control (P<0.001), whereas the weight increase of left quadriceps, non injected, of treated animals was 31.0% (P<0.005). These data suggest local (autocrine and / or paracrine) and systemic (endocrine effects as a result of hGH DNA injection and the consequent hGH expression and secretion. In a second experiment, the comparison between single plasmid DNA administration with daily r-hGH injections provided significant body weight increases (P<0.001) of both treated groups, compared to control group, of 23.1% (P<0.01) and 35.5% for DNA and protein treated groups respectively, while the slopes of the growth curves were practically identical: 0.094 g / mouse / day for DNA and 0.095 g / mouse / day for protein injection. In both treated groups, the weights of the following organs did not present significant differences: right and left kidneys, spleen and right quadriceps muscle. The levels of glucose in the plasma of treated and control groups showed no significant differences after 28 and 50 days. The differences in mIGF-I concentration, among the treated groups, were significant only 7 days after treatment. The values were always higher in the group treated with plasmid DNA in relation to the r-hGH group, and the levels of both treated groups were significantly higher than the control group. Despite the need for further studies to confirm the safety and feasibility of this treatment, this type of gene therapy for DGH can be a viable alternative to the standard treatment for this disease, based on repetitive injections of highly purified r-hGH.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-28Bitstream added on 2014-06-13T18:47:23Z : No. of bitstreams: 1 tremiliosi_lmm_me_jabo.pdf: 861044 bytes, checksum: c306ab67ac384aa19a76905d2b359990 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Bacillus thuringiensis durante sua fase de esporulação produz proteínas cristal, codificadas pelos genes cry, podendo atingir pragas de diversas ordens. Esta bactéria é utilizada no controle de pragas como a Spodoptera frugiperda, causadora de sérios prejuízos na agricultura. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar os isolados MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 e as linhagens H D73 e CRY-B de B. thuringiensis visando o controle de S. frugiperda. Foi utilizada a técnica de PCR que permitiu a identificação das subclasses do gene cry1 A (Aa, Ab, Ac e Ae). O RAPD determinou similaridade entre todos os isolados e linhagens e somente a subsp. CRY(-)B apresentou 50 % de similaridade em relação às demais. Evidenciaram-se dois perfis diferentes entre todos e a B ausência plasmidial na subsp. CRY(-). A resistência e susceptibilidade aos antibióticos estreptomicina, canamicina, rifampicina e eritromicina, nas concentrações de 40, 60, 80, 100 e 120 uglml, permitiu constatar que somente a linhagem CRY(-)B apresentou resistência para rifampicina. Todos os isolados e linhagens foram resistentes a canamicina e susceptíveis a eritromicina e para estreptomicina todos foram resistentes em concentração variadas. Nos bioensaios os isolados MT6, MT7, PR2, SP6, SP8 e a linhagem HD73, demonstraram potencial no controle de lagartas de primeiro instar de S. frugiperda. / Bacillus thuringiensis is an entomopathogenic bacteria that during sporulation produces crystal proteins, coded by cry genes, able to act on a great number of organisms. Such bacteria is used to control agronomic pests such as Spodoptera frugiperda, the causal agent of serious problems on the agroindustry. The aim of the present work was to characterize the isolates MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 and the strains of the bacterium B. thuringiensis subsp. kurstaki HO-73 e CRY(-)B aiming the control of S. frugiperda. The RAPO have determined 90% of similarity among the isolates and the strain CRY (-)B presented 50% similarity with the other ones. The plasmid profiles analyses has revealed similarities among the isolates SP6, SP8, MT6 and MT8 and differences between this strain HO-73 and isolate PR2. The MICs were conducted with the antibiotics streptomycin, kanamycin, rifampicin and erythromycin on the following concentrations 40, 60, 80, 100 and 120 ug/ml. Only the strain CRY(-)B has presented resistance to rifampicin. The bioassays results have shown that the MT6, MT7, SP8, SP6, PR2 isolates and the HO-73 exhibited 100 % efficiency for the biological control of S. frugiperda larvae.

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-05-02T23:09:42Z No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-05-07T23:08:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-07T23:08:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VitorTroccoliRibeiro_DISSERT.pdf: 3222596 bytes, checksum: 3c00f5a502043e131a9b815409cc4fc9 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / A leishmaniose visceral é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania, podendo ser letal quando não há tratamento adequado. Estima-se que existem 12 milhões de pessoas infectadas pela doença, mas infelizmente não há nenhuma vacina capaz de prevenir a doença. Ademais, o tratamento da doença apresenta alto custo e elevada toxicidade. Diante disso, deve-se destacar a pesquisa de componentes antigênicos purificados que possam ser utilizados como ferramenta para obtenção de vacinas ou testes para diagnóstico específico. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo avaliar a influência da concentração de IPTG durante a indução e a influência da temperatura de cultivo na expressão do antígeno 503 e na estabilidade do plasmídeo pQE-30 em Escherichia coli. Todos os ensaios foram realizados em incubador rotativo e feitos em duplicata. Primeiramente foram realizados cultivos induzidos com IPTG nas concentrações de: 0,01 mM; 0,1 mM; 0,5 mM; 1,0 mM e 1,5 mM na temperatura de 37 °C. A concentração de indutor não afetou a estabilidade do plasmídeo e quando induzido com 1,0 mM, a expressão de antígeno 503 máxima foi de 0,101 ± 0,004 g/L. Foi possível verificar que a menor concentração de IPTG utilizada foi o suficiente para conseguir a expressão da proteína recombinante. Em seguida, a concentração de IPTG foi fixada em 1,0 mM e avaliadas as temperaturas de cultivo de 27, 32 e 42 °C. Estes ensaios foram comparados com o ensaio realizado anterior a 37 °C. A temperatura influenciou a estabilidade do plasmídeo, sendo que quanto menor a temperatura de cultivo, maior estabilidade. De acordo com os resultados, foi possível verificar que a temperatura de 37 °C obteve maior expressão do antígeno 503, sendo considerada portanto, as condições ótimas para produção de antígeno 503 em incubador rotativo. / Visceral leishmaniasis is an infectious-parasitic disease caused by protozoa of the genus Leishmania, which can be lethal when there is no adequate treatment. It is estimated that there are 12 million people infected by the disease, but unfortunately there is no vaccine capable of preventing the disease. In addition, the treatment of the disease presents high cost and high toxicity. Therefore, we must highlight the research of purified antigenic components that can be used as a tool to obtain vaccines or tests for specific diagnosis. In this context, the present work aims to evaluate the influence of the concentration of IPTG during the induction and the influence of culture temperature on 503 antigen expression and on the stability of plasmid pQE-30 in Escherichia coli. All assays were performed in a rotary incubator and made in duplicate. First, IPTG induced cultures were carried out at concentrations of: 0.01 mM; 0.1 mM; 0.5 mM; 1.0 mM and 1.5 mM at 37 °C. The concentration of the inducer did not affect the stability of the plasmid and when induced with 1.0 mM, the 503 antigen expression was maximal 0.101 ± 0.004 g / L. It was possible to verify that the lowest concentration of IPTG used was enough to achieve expression of the recombinant protein. Thereafter, the concentration of IPTG was fixed at 1.0 mM and the cultivation temperatures of 27, 32 and 42 °C were evaluated. These assays were compared with the previous assay performed at 37 °C. Temperature influenced the stability of the plasmid, and the lower the culture temperature, the greater the stability. According to the results, the temperature of 37 °C obtained the highest expression of 503 antigen, being considered therefore, the optimal conditions for 503 antigen production in a rotary incubator.

Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Keratinocytes are very attractive cells for ex vivo gene transfer and systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation via a mechanism which mimics the natural process. In this study, retrovirally transduced keratinocytes with the mouse growth hormone (mGH) gene underwent a treatment for adhesion to collagen and clonal analysis, in order to enrich in stem cells the keratinocyte population. The main result was an in vitro increase of cell viability for treated keratinocytes, which should result in an increase of the in vivo sustainability of hormone secretion, when implanting organotypic cultures onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice. A model for in vivo gene therapy based on the electrotransfer of human growth hormone (hGH)-coding naked DNA in the exposed quadriceps muscle of dwarf (lit/lit) and immunodeficient dwarf (lit/scid) mice was also utilized. Electroporation conditions were optimized, setting up eight 50-V pulses of 20 ms at a 0.5 s interval, using a plasmid containing the ubiquitin C promoter and the genomic hGH sequence. Administration of a single dose of 50 g of this plasmid led, for the first time in the literature, to sustained levels of circulating hGH of the order of 1.5-3 ng/ml, up to 60 days. The DNA-treated animals presented a highly significant weight gain (P<0.001) of 33.1%, compared to a non-significant weight loss of 4.2% for the control group (saline injected mice + electroporation). The injected quadriceps muscles of the DNA-treated mice showed a 48% weight increase, when compared to the control group (P<0.001). Another electrotransfer study was carried out comparing the use of the genomic hGH sequence (gDNA) with the complementary sequence (cDNA), cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. It was observed that hGH was more efficiently expressed in the circulation of lit/scid mice, for 21 days, when injecting cDNA. Lentiviral vectors containing the hGH (cDNA and gDNA) and the mGH (cDNA) genes were also constructed and will be used in a next study, both for the transduction of keratinocytes or for in vivo electrotransfer. Lentiviral vectors will in fact be necessary for future studies, considering their reduced toxicity when compared to retroviral vectors. The results of this work, as well as opening perspectives of new studies, will establish in the near future conditions for gene therapy as a feasible and safe option for the treatment of GH deficiency and other systemic diseases.