Plasmodium spp. and Trypanosoma brucei spp. are protozoan parasites with complex lifecycles, each having to adapt to the diverse environments of their insect vector and mammalian host. Each has multiple developmental forms that differ in their morphology and metabolism. Differentiation between these forms is a tightly regulated and often synchronised process in response to changes in the parasite's environment. The molecular mechanisms by which they perceive and respond to such environmental changes are largely unknown. The Plasmodium and T. brucei genomes encode a homologue of the phylogenetically widespread GPR89 family of putative receptors or channels. The mammalian GPR89 homologue has been implicated in the regulation of Golgo acidification, whilst in plants it has been shown to be involved in G protein signally pathways. This study set out to characterise the Plasmodium and T. brucei GPR89 proteins in order to assess their potential role as environmental sensors. Bioinformatic analyses demonstrated that the GPR89 proteins are a highly divergent family of multi-transmembrane domain proteins that may perform a channel or transporter function. Several expression strategies were employed to evaluate the role of the GPR89 proteins. Functional insight was gained from the ectopic expression of both the T. brucei and Arabidopsis thaliana GPR89 proteins in T. Brucei cells. Over-expression of TbGPR98 causes premature stumpy formation in pleomorphic T. brucei cells. This phenotype was replicated by over-expression of a A. thaliana homologue in T. brucei despite signigicatnt sequence divergence. Furthermore, both were demonstrated to act on the same pathway as the putatuve RNA binding protein, RBP7 that was receontly identified in a genome-wide screen for components of the stumpy differentiation pathway. Hence, TbGPR89 is likely a compnent of the slender to stumpy differentiation pathway in bloodstream form trypanosomes and there appears to be functional complementarity between T. brucei and A. thaliana GPR89 proteins.

Orientador: Marina Politi Okoshi / Coorientador: Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda / Coorientador: Katashi Okoshi / Banca: Roberto Jorge da Silva Franco / Banca: José Francisco Kerr Saraiva / Banca: Eros Antonio de Almeida / Banca: Alexandre Rodrigues / Resumo: Introdução: O envolvimento do sistema cardiovascular em pacientes com malária por Plasmodium vivax tem sido pouco estudado. Neste trabalho, avaliamos as estruturas cardíacas, a função ventricular e marcadores sistêmicos de lesão cardiovascular em pacientes com a forma não-grave da malária por P. vivax, em Manaus, estado do Amazonas, Brasil. Métodos: Foram avaliados, prospectivamente, 26 pacientes adultos com malária por P. vivax em tratamento ambulatorial, no período de janeiro de 2012 a março de 2013. Os resultados foram comparados com grupo controle de 25 indivíduos saudáveis, pareados por gênero e idade. Avaliação clínica, exames laboratoriais e ecocardiografia transtorácica foram realizados na primeira avaliação após o diagnóstico de malária (dia zero, D0) e sete dias após (D7) início do tratamento. Resultados: Os Casos apresentaram maiores valores do diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo (VE; 28,8±2,82 vs 30,9±4,03 mm; p=0,037) e do volume diastólico do VE (82,4±12,3 vs 93,8±25,9 ml; p=0,05) e menor fração de ejeção do VE (método de Teicholz: 73,2±6,59 vs 68,4±4,87; p=0,004) que os Controles. A fração de variação da área do ventrículo direito (VD) foi menor (54,7±5,11 vs 50,5±6,71 %; p=0,014) e o índice de performance miocárdica do VD (0,21±0,71 vs 0,33±0,19; p=0,007), a área diastólica do VD (13,0±3,19 vs 15,3±2,96 cm2; p=0,009 ), a área de sistólica do VD (6,41±1,27 vs 7,45±1,46 cm2; p=0,009) e a resistência vascular pulmonar (1,13±0,25 vs 1,32±0,26 unidades Woods; p=0,012) foram maiores nos Casos que nos Controles. A fração de variação da área do VD foi também menor e a resistência vascular pulmonar maior nos Casos no D0 que no D7. No D0, os Casos apresentaram maior concentração sérica de bilirrubina indireta, da molécula de adesão celular vascular solúvel tipo 1, do fragmento N-terminal do pró-peptídeo natriurético cerebral e da troponina T, e menor ... / Abstract: Purpose: Malaria is an endemic disease in the Amazon Region. In Brazil it has been largely attributed to Plasmodium vivax infection since the 1990's. Cardiovascular system involvement in patients with P. vivax malaria has been poorly addressed. The aim of this study was to evaluate cardiac structures and function and serum markers of cardiovascular injury in patients with the nonsevere form of P. vivax malaria in Manaus, Amazonas state, Brazil. Methods: In an observational study, we prospectively evaluated 26 patients with P. vivax malaria in an outpatient referral hospital from January 2012 to March 2013 and compared results with a control group of 25 gender- and age-matched healthy individuals. Patients underwent clinical evaluation, laboratory tests, and transthoracic echocardiography at first evaluation after malaria diagnosis (day zero, D0) and seven days after starting malaria treatment (day seven, D7). Results: Echocardiography showed higher left ventricular (LV) systolic diameter (28.8±2.82 vs 30.9±4.03 mm; p=0.037) and LV diastolic volume (82.4±12.3 vs 93.8±25.9 ml; p=0.05), and lower LV ejection fraction (Teicholz method: 73.2±6.59 vs 68.4±4.87; p=0.004) values in patients than controls. Right ventricle (RV) fractional area change (54.7±5.11 vs 50.5±6.71%; p=0.014) was lower, and RV myocardial performance index (0.21±0.71 vs 0.33±0.19; p=0.007), RV diastolic area (13.0±3.19 vs 15.3±2.96 cm2; p=0.009) and systolic area (6.41±1.27 vs 7.45±1.46 cm2; p=0.009), and pulmonary vascular resistance (1.13±0.25 vs 1.32±0.26 Woods unit; p=0.012) were higher in patients than controls. RV fractional area change was lower and pulmonary vascular resistance higher in patients in D0 than D7. In D0, patients presented higher serum levels of indirect bilirubin, soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1), Nterminal prohormone brain natriuretic peptide, and troponin T, and lower levels of nitric oxide than D7 and controls / Doutor

Glutamate dehydrogenase a (GDHa) has been suggested as a potential drug target against the malaria parasite Plasmodium falciparum. GDHa knockout cell line was generated and needed a phenotypic description by means of molecular biology and biochemistry. The knockout cell line was tested for higher oxidative stress sensitivity, levels of relevant proteins and gene transcripts were quantified. Furthermore, concentrations of two key molecules enabling redox homeostasis, glutathione and NADPH, were attempted to quantify. Finally, we attempted to disrupt a gene of another glutamate dehydrogenase, gdhb, which did not result in formation of viable parasites. In conclusion, GDHa is not a suitable drug target and GDHb needs to be further elucidated.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2009-10-24T13:16:24Z No. of bitstreams: 1 2006_Paulo Cesar Rodrigues Tabanez.pdf: 2997772 bytes, checksum: c45f51b562196594cb16abea9281c014 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-27T13:18:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Paulo Cesar Rodrigues Tabanez.pdf: 2997772 bytes, checksum: c45f51b562196594cb16abea9281c014 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-27T13:18:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Paulo Cesar Rodrigues Tabanez.pdf: 2997772 bytes, checksum: c45f51b562196594cb16abea9281c014 (MD5) Previous issue date: 2006-07-31 / A talidomida é uma droga imunomoduladora que tem sido utilizada experimentalmente em muitas condições clínicas, porém seu uso na malária ainda é insipiente. A malária é uma doença com alta morbi-mortalidade presente em todas as regiões tropicais do mundo. As manifestações severas da doença, possivelmente, estão ligadas à excessiva resposta imunitária, principalmente à produção de fator de necrose tumoral e radicais de oxigênio e nitrogênio. A talidomida diminui a produção de FNT por aumentar a degradação do seu ARNm e diminuir a ativação do NFκB. O presente trabalho avaliou a influência da talidomida sobre a evolução da malária e sobre as funções dos macrófagos em camundongos susceptíveis ou não à malária cerebral. Camundongos Balb/C e CBA foram infectados com 106 eritrócitos parasitados por Plasmodium berghei ANKA, tratados a partir do terceiro dia de infecção com 150 mg/Kg de talidomida diluída em solução a 0,8M de sacarose, por via oral, uma vez ao dia, em um volume de 100 μL. Outros dois grupos não foram infectados, mas foram tratados da mesma forma. No oitavo dia de infecção, o sangue foi obtido para a determinação do FNT e os macrófagos foram recuperados da cavidade abdominal para avaliação, in vitro, da capacidade fagocitária, produção de peróxido de hidrogênio, óxido nítrico e FNT. A capacidade fagocitária foi avaliada pelo teste de fagocitose, com ou sem opsoninas, em placa sendo determinado o índice fagocitário. A produção de peróxido de hidrogênio foi determinada pelo teste de oxidação do vermelho de fenol na presença de peroxidase. O óxido nítrico foi determinado pela reação de Griess. O FNT foi quantificado no soro e no sobrenadante das culturas dos macrófagos pelo teste imunoenzimático. A influência da talidomida, mas também da sacarose e da associação da talidomida com sacarose foi avaliada na evolução da malária por meio da curva de sobrevida, da parasitemia, anemia e peso dos camundongos Balb/C. Nos camundongos Balb/C, o tratamento com talidomida não modificou a sobrevida, diminuiu a perda de peso, retardou a elevação da parasitemia em nove dias, porém agravou a anemia a partir do vigésimo primeiro dia de infecção. O tratamento com solução a 0,8M de sacarose antecipou em um dia o início da morte e diminuiu em nove dias o tempo de vida, aumentou a perda de peso no início da infecção e posteriormente, a partir do décimo quarto dia, reduziu a perda de peso, agravou a parasitemia e a anemia. Porém, a associação da talidomida com a sacarose não modificou a curva de sobrevida e retardou a evolução da parasitemia a partir do vigésimo primeiro dia de infecção, por outro lado, agravou a evolução da anemia e aumentou a perda de peso a partir do vigésimo primeiro dia de infecção. Nos camundongos CBA, a associação da talidomida com sacarose não modificou a curva de sobrevida dos animais, a perda de peso, a parasitemia e a anemia. Em relação à função dos macrófagos, o tratamento dos camundongos Balb/C e CBA com talidomida diluída em solução 0,8M de sacarose não alterou a capacidade fagocitária e a produção de peróxido de hidrogênio, modulou negativamente a produção de óxido nítrico e diminuiu a produção de FNT tanto na cultura de macrófagos quanto no soro. Nossos dados sugerem que a talidomida, nos camundongos Balb/C, modulou a hiperativação do sistema imunitário de forma benéfica, uma vez que os aspectos gerais da evolução da malária não foram alterados, ao contrário, houve diminuição da perda de peso e retardo na evolução da parasitemia, porém, a administração isolada de sacarose deve ser avaliada pelos seus possíveis efeitos deletérios durante a infecção. Os dois modelos estudados não respondem da mesma forma à infecção provavelmente determinados por fatores genéticos. Sugerem, portanto, que a utilização da talidomida como terapia adjuvante aos anti-plasmodiais, antes das manifestações clínicas de gravidade, deve ser avaliada em seres humanos, exceto mulheres, com o objetivo de diminuir a grande morbidade e mortalidade da malária. ______________________________________________________________________ ABSTRACT / Thalidomide is an immunomodulatory drug that has been successfully evaluated in several clinical conditions, however it needs better evaluation in severe malaria. Malaria has high morbimortality in vast areas of the world. The excessive activation of the immune system, with increased production of tumor necrosis factor, oxygen and nitrogen reactive species, plays an important role in the pathogenesis of the disease. Thalidomide inhibits the production of TNF increasing the rate of mRNA degradation and depressing NFκB pathway. This work aimed to evaluate the influence of thalidomide on malaria outcome and on macrophage functions of susceptible (CBA) and not susceptible (Balb/C) mice to cerebral malaria. Balb/C and CBA mice were injected with 106 Plasmodium berghei ANKA infected-erythrocytes, and after three days mice were treated per os with 150 mg/Kg/day of thalidomide in 100 μL of 0,8M sucrose solution. The same treatment was administered to two other not infected groups. Another group was treated with only 0,8M sucrose solution. On the eightieth day after infection, blood was collected and macrophages were obtained from peritoneal cavity to assess, in vitro, immunological functions. Phagocytosis was evaluated by phagocytic index. Hydrogen peroxide was assessed by phenol red oxidation and nitric oxide production was assessed by Griess reaction. TNF production was evaluated in serum and supernatant of peritoneal macrophage cultures by immunoassay test. The influence of thalidomide on mortality, parasitemia, hematocrit and body weight was assessed in Balb/C and CBA-infected mice. Another Balb/c group treated with sucrose was added. Thalidomide did not influence the survival time, diminished body weight loss, delayed parasitemia in fortieth day, but worsened anemia twenty one days onward of infection in Balb/C mice compared to non-treated animals. The treatment with sucrose prompts one day the beginning of death and nine days the survival time. Firstly sucrose increased and after fortieth day of infection decreased body weight loss. It worsened parasitemia and anemia compared to that non-treated animals. However, association of thalidomide and sucrose did not alter survival time and body weight loss but increased parasitemia on fourth day onward of infection and worsened anemia after twenty one days of infection compared to that non-treated animals. The association of thalidomide and sucrose to treat CBA infected mice did not alter the survival time, body weight loss, parasitemia or anemia. The treatment with thalidomide of Balb/C and CBA infected mice did not influence the phagocytosis and hydrogen peroxide production, but it downregulated nitric oxide production, and decreased TNF production in serum (Balb/C) and supernatant of peritoneal macrophage cultures (Balb/C and CBA). Our findings suggest that thalidomide improved the outcome of disease, by decreasing body weight loss and delaying the parasitemia. Treatment with sucrose should be better evaluated because its possible deleterious effects. Our findings suggest that both experimental models show different immunopathological mechanisms, probably due to genetic factors. Moreover, thalidomide as adjuvant therapy in human malaria should be evaluated, except in women, to reduce morbidity and mortality of severe malaria.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2011. / Submitted by Gabriela Ribeiro (gaby_ribeiro87@hotmail.com) on 2011-06-28T18:32:02Z No. of bitstreams: 1 2011_AlanFecchio.PDF: 1068161 bytes, checksum: 361c20f6d6683f24f194fadeb71ba488 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-30T13:06:24Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_AlanFecchio.PDF: 1068161 bytes, checksum: 361c20f6d6683f24f194fadeb71ba488 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-30T13:06:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_AlanFecchio.PDF: 1068161 bytes, checksum: 361c20f6d6683f24f194fadeb71ba488 (MD5) / Hemoparasitos têm fundamental importância na ecologia e evolução de aves, uma vez que são capazes de afetar a sobrevivência e reprodução de seus hospedeiros. A prevalência (porcentagem de indivíduos infectados na população de hospedeiros) dos parasitos da malária aviária (Plasmodium e Haemoproteus) varia de zero a 100% entre diferentes espécies na comunidade de aves, embora as causas ecológicas e evolutivas dessa variação não sejam bem entendidas. Diante desse contexto, a proposta da presente tese foi determinar quais características reprodutivas (tipo de construção do ninho e altura do ninho) e da história de vida (peso, sistema social, tempo de incubação e status migratório) em aves poderiam explicar as taxas de parasitismo entre as diferentes espécies de hospedeiros em uma comunidade estudada durante cinco anos no Cerrado do Brasil Central. Adicionalmente, foi estudada a estrutura e organização da taxocenose dos parasitos da malária aviária através do sequenciamento de parte do gene mitocondrial (citocromo b) do parasito. Usando Modelo Linear Misto Generalizado (GLMM) e método tradicional para detecção dos hemoparasitos (microscopia), mostramos uma significante correlação positiva entre altura do ninho e prevalência de Haemoproteus, o que corrobora a hipótese que associa prevalência de hemoparasitos e estrato de nidificação em aves da América do Norte. Foram apresentadas novas evidências de que espécies sociais de aves neotropicais e com reprodução cooperativa são mais parasitadas por Haemoproteus. Ainda, espécies que nidificam em cavidades são mais parasitadas por Plasmodium. Através de métodos moleculares para diagnóstico (amplificação e sequenciamento do gene mitocondrial do parasito) e GLMM, a socialidade das espécies de aves estudadas foi a melhor variável para explicar os valores de prevalência de Haemoproteus (Parahaemoproteus) entre as espécies de hospedeiros da comunidade de aves, onde espécies 2 sociais foram significativamente mais parasitadas. Espécies migratórias foram mais parasitadas por Haemoproteus (Parahaemoproteus), embora a relação tenha sido margialmente significante. A prevalência geral (Plasmodium + Haemoproteus) não variou entre os cinco anos de estudo ou entre as estações seca e chuvosa. Entre os indivíduos nos quais foi possível determinar a idade, não houve diferença significativa na prevalência (Plasmodium + Haemoproteus) em aves com menos de um ano de idade e aves com mais de um ano de idade. Baseado na divergência de três ou mais substituições nucleotídicas em fragmentos de aproximadamente 600 pares de base do citocromo b dos parasitos, a taxocenose dos parasitos da malária aviária foi composta por 17 linhagens sendo oito pertencentes ao gênero Plasmodium, oito pertencentes a Haemoproteus (Parahaemoproteus) e apenas uma linhagem pertencente a Haemoproteus (Haemoproteus). O número de espécies de hospedeiros que uma linhagem infectou variou de um a sete, e como esperado, o número de linhagens se aproximou do número de espécies de hospedeiros, confirmando a elevada diversidade desses hemoparasitos. Os dados sugerem que a maioria das espécies de hospedeiros pode ser infectada por uma grande variedade de hemoparasitos, uma vez que, o número de linhagens que uma espécie de hospedeiro abriga variou de uma a sete e o número de linhagens de hemoparasitos aumentou com o número de indivíduos infectados em cada espécie de hospedeiro. Sugerimos que parâmetros comportamentais e reprodutivos das espécies de aves podem ser responsáveis por sua exposição diferencial aos vetores, explicando dessa forma, a variação na prevalência de hemoparasitos entre as espécies de hospedeiros dentro da comunidade de aves. A taxocenose de hemoparasitos estudada na comunidade de aves no Cerrado do Brasil Central confirma os padrões que estão surgindo em estudos envolvendo os parasitos da malária aviária utilizando marcadores moleculares: 1) elevada diversidade de 3 linhagens; 2) número de linhagens de hemoparasitos se aproximando do número local de espécies de hospedeiros e; 3) duas estratégias quanto ao uso das espécies de hospedeiros, desde extrema especialização à grande amplitude das espécies de hospedeiros utilizados. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Blood parasites play a fundamental role in the ecology and evolution of birds, because they are able to affect host fitness and survival. The prevalence of avian malaria parasites among different host species can vary from zero to 100%, nonetheless, the ecological and evolutionary reasons for this variation are still unclear. The goal of this thesis was to analyze if aspects of the host’s natural history (nest height, nest type, body mass, migratory status, incubation time and social system), which we believe are variables associated with hosts´ exposure to vectors, could explain the variation in blood parasite prevalence of a bird community from the Cerrado biome of central Brazil. Additionally, we studied the structure and organization of an assemblage of malaria parasites by sequencing part of the mitochondrial cytochrome b gene. By using Generalized Linear Mixed Models (GLMM) and traditional methods to detect blood parasite infections (microscopy) we found a significant positive correlation between nest height and Haemoproteus prevalence, which is in accordance with the hypothesis that associates blood parasite prevalence in North American birds with nesting stratum. Additionally, new evidence is presented that Neotropical bird species that live in groups and are cooperative breeders are more parasitized by Haemoproteus and that cavity/closed cup nesters are more parasitized by Plasmodium. Through molecular methods for diagnosis (by sequencing a part of the mitochondrial cytochrome b gene of parasite) and GLMM, the sociality of the bird species studied was the best variable to explain the high prevalence of Haemoproteus (Parahaemoproteus) between host species in this bird community. Migratory species were also more parasitized by Haemoproteus (Parahaemoproteus), although the relationship was only weakly significant. Malaria prevalence determined by PCR screening (pooled Plasmodium and Haemoproteus) 5 did not vary among the five years or between dry and rainy seasons. Among all individuals that could be aged, parasite prevalence did not differ between juveniles and adults. Based on divergence in 600 sequenced nucleotides of the parasite’s cytochrome b gene we differentiated 17 parasite lineages. The number of host species that a single lineage infected varied from one to seven, and as one would expect, the number of parasite lineages approached the number of host species, confirming the high diversity of these parasites. The data suggest that most host species can be infected by a wide variety of parasite lineages, since the number of lineages that infected single host species ranged from one to seven and this number increased with the number of individuals infected. We concluded that behavioural parameters of hosts may be responsible for their differential exposure to vectors. Therefore, these parameters may be able to describe interspecific variation of blood parasite prevalence in other bird communities. The assemblage of blood parasites studied in bird communities in the Cerrado of central Brazil confirms the patterns that are emerging in studies of avian malaria parasites using molecular markers: 1) high species diversity; 2) number of parasite lineages approaching the number of host species within a local area; and 3) two strategies regarding use of host species by parasites, extreme specialization and broad range of host species used.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_11995_Tese_28_mar_2018.pdf: 1434096 bytes, checksum: 78535cc2fc29ae622c421c0a525003aa (MD5) Previous issue date: 2018-03-22 / Nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, casos de malária autóctone podem ser encontrados próximos a fragmentos de Mata Atlântica. No estado do Espírito Santo, tal doença é particularmente frequente, sendo Plasmodium vivax o parasito comumente reconhecido como o agente etiológico das infecções humanas. Porém, observadas as distâncias espaciais e temporais entre os casos relatados e o comportamento dos insetos vetores locais, especialmente Anopheles (Kerteszia) cruzii, o ciclo de transmissão parece não corresponder ao ciclo tradicional da malária. Sendo assim, a hipótese da existência de uma zoonose, com símios infectados mantendo a transmissão, é estabelecida. Considerando que há pontos obscuros em relação à malária-bromélia, como é chamada, a avaliação do comportamento dos componentes dessa cadeia de transmissão se faz necessária. No presente estudo, a transmissão da malária-bromélia na região rural endêmica do Espírito Santo é investigada com base em dois pilares principais: análise comportamental dos vetores do gênero Anopheles, principalmente os do subgênero Kerteszia, e a comparação do genoma mitocondrial completo do DNA extraído de diversos isolados de Plasmodium spp. que infectaram humanos, um símio do gênero Allouata e mosquitos Anopheles spp. da mesma região. Armadilhas luminosas com CO2 (CDC-CO2) foram instaladas nas áreas abertas, na margem e no interior da floresta, e armadilhas Shannon foram instaladas na margem da floresta para a captura dos mosquitos. O genoma mitocondrial dos Plasmodium spp. enontrados nos diferentes hospedeiros foi completamente sequenciado e comparado em uma rede de haplótipos que incluiu todas as sequências de genomas mitocondriais de P. vivax/simium de amostras de seres humanos e símios de outras regiões do Brasil. Foram capturados 1.414 anofelinos distribuídos em 13 espécies. Anopheles (Kerteszia) cruzii Dyar&Knab foi a espécie mais capturada na copa das árvores e foi também o vetor com maior prevalência de infecção por Plasmodium vivax, de acordo com técnicas moleculares de PCR. A rede de haplótipos nostrou que humanos e símios da Mata Atlântica estavam infectados pelo mesmo haplótipo, mas alguns isolados de seres humanos não eram idênticos ao isolado de símio. Além disso, o DNA de plasmódios extraído de mosquitos revelou sequências diferentes das obtidas de simios, mas semelhantes a de dois isolados de seres humanos. O estudo revelou, portanto, a maior prevalência de infecção em A. (K.) cruzii entre os anofelinos e o comportamento acrodendrofílico desses vetores, principalmente dos infectados, reforçando a hipótese de que a presença de P. vivax nesses espécimes surja pelos repastos sanguíneos em animais que vivem na copa das árvores, como os símios. A comparação dos genomas mitocondriais dos parasitos mostra que, na Mata Atlântica e especialmente no Espírito Santo, parasitos com estruturas moleculares semelhantes são compartilhados por seres humanos e símios. A reconhecida identidade entre P. vivax e P. simium ao nível de espécie, o compartilhamento de haplótipos, e a participação do mesmo vetor na transmissão da infecção para ambas as espécies hospedeiras indica transferência interespécies dos parasitos.

Submitted by Allison Andrade (allisonandrade.13@hotmail.com) on 2016-03-21T14:49:59Z No. of bitstreams: 1 NÃO AUTORIZADO (Dissertação - Yury Oliveira Chaves).pdf: 2946397 bytes, checksum: 617c45e456c2a50064426a77318221ef (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-03-21T15:47:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 NÃO AUTORIZADO (Dissertação - Yury Oliveira Chaves).pdf: 2946397 bytes, checksum: 617c45e456c2a50064426a77318221ef (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-03-21T15:49:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 NÃO AUTORIZADO (Dissertação - Yury Oliveira Chaves).pdf: 2946397 bytes, checksum: 617c45e456c2a50064426a77318221ef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T15:49:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NÃO AUTORIZADO (Dissertação - Yury Oliveira Chaves).pdf: 2946397 bytes, checksum: 617c45e456c2a50064426a77318221ef (MD5) Previous issue date: 2013-08-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The innate immune response in the acute phase of malaria results in an immune state that is profoundly altered can protect the host against a grave form of disease. The aim of this study was to evaluate the dynamics of cellular subpopulations of T lymphocytes (CD3+CD4+ e CD3+CD8+), B lymphocytes (CD5+CD19+ e CD5-CD19+) , NK (CD3+CD16+CD56+ e CD16+CD56+) and regulatory T cells ((CD4+CD25+FoxP3+) in patients infected with Plasmodium vivax according to exposure criteria provided malaria and hemoglobin and platelets. During May and November (2012) Peripheral blood samples from patients infected exclusively by P. vivax with uncomplicated malaria were separated into: Group 1 (Primo-infected), Group 2 (Last infection <7 months) and Group 3 (Last infection over 1 year). Mixed infections and co-infections with dengue were excluded by PCR. The expression of adhesion molecules (CD31 and CD54) molecule and memory (CD45RO) and cytokines IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α and IFN-Ɣ, were analyzed by Flow Cytometry. Hematological data showed that patients with vivax malaria had decreased percentages of lymphocytes (p <0.0001) compared to controls. Of the seventy-one patients, 36 were Primo infected; 16 had malaria <7 months and 19 for 1 more year. We observed significant differences in immunophenotyping in relation to the malaria patients recent (<7 months) relative to other features. These patients showed decreased amount of B1 lymphocytes (p=0.042) and T-CD8-CD69 (p=0.027). Was also noted Thrombocytopenia in patients infected with cousin directly proportional correlation with the subpopulations of activated CD4 and CD8 expression and PECAM-1 in CD8 T-lymphocytes. Marked differences in cytokine profile could be observed with cytokines TNF-α compared with IL-10 and IL-6 and the reduction in the number of some lymphocyte subpopulations in patients whose last malaria occurred <7 months. These results would indicate immunocompensation of the immune response against severe disease in these individuals with recent history malaria, and the state is not immune from the Primo-infected patients could contribute to the change in platelet count behaving as a risk factor for the development of thrombocytopenia in malaria. / A resposta imune inata na fase aguda da malária resulta em um estado imunológico que é profundamente alterado podendo proteger o hospedeiro contra uma forma grave da doença. O objetivo deste estudo foi avaliar a dinâmica celular das subpopulações de Linfócitos T (CD3+CD4+ e CD3+CD8+), Linfócitos B (CD5+CD19+ e CD5-CD19+) , NK (CD3+CD16+CD56+ e CD16+CD56+) e células T reguladoras (CD4+CD25+FoxP3+) em pacientes infectados pelo Plasmodium vivax segundo critérios de exposição previa de malária e níveis de hemoglobina e plaqueta. Durante maio e novembro (2012), amostras de sangue periférico de pacientes infectados exclusivamente pelo P. vivax com malária não complicada foram separadas em: Grupo 1 (Primo-infectado); Grupo 2 (Última infecção < 7 meses) e Grupo 3 (Última infecção mais de 7 meses). Infecções mistas e co-infecções com dengue foram excluídas por PCR. A expressão moléculas de Adesão (CD31 e CD54) e molécula de memória (CD45RO e as citocinas IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17, TNF-α e IFN-Ɣ, foram analisadas por Citometria de Fluxo. Os dados hematológicos mostraram que os pacientes com malária vivax apresentaram diminuídas as porcentagens de linfócitos (p <0.0001) em relação aos controles. Dos setenta e um pacientes, 36 foram Primo infectado; 16 tiveram malária < 7 meses e 19 há mais 1 ano. Foi observado diferenças significativas nas imunofenotipagens em relação ao aos pacientes com malária Recente (< 7 meses) em relação aos outros históricos. Esses pacientes apresentaram diminuídas quantidade de Linfócitos B1 (p=0.042) e T-CD8-CD69 (p=0.027).Foi também observada a Plaquetopenia acentuada nos pacientes primo infectados com correlação diretamente proporcional com as subpopulações de CD4 e CD8 ativados e expressão PECAM-1 em linfócitos T-CD8. Diferenças acentuadas no perfil de citocinas puderam de ser observadas com as citocinas TNF-α em relação com IL-10 e IL-6 e a redução no numero de algumas subpopulações linfocitárias nos pacientes cuja ultima malária ocorreu < 7 meses Estes resultados seriam indicativos de imunocompensação da resposta imune contra formas graves da doença nestes indivíduos com historia recente de malária, e o estado não imune de pacientes do Primo infectadopoderia contribuir para a alteração da contagem de plaquetas comportando-se como um fator de risco para o desenvolvimento de Plaquetopenia na malária.

Neste trabalho, usamos um modelo murino de recrudescência da malária associada à gravidez, com camundongos BALB/c infectados por Plasmodium berghei ANKAGFP com o objetivo de avaliar a resposta imune associada ao recrudescimento da infecção. Observando as populações de células do baço por citometria de fluxo notou-se um aumento no percentual de células CD4+, CD19+, TCR <font face=\"Symbol\">g<font face=\"Symbol\">d+, GR1+ nos animais infectados, em relação aos controles não infectados. Não foram observadas diferenças no percentual de leucócitos placentários. Além disso, nossos resultados mostraram que no baço, linfócitos TCD4+ e TCD8+ estão mais ativados em fêmeas recrudescentes, enquanto que na placenta, estes animais apresentaram um aumento na ativação de células TCD4+. A relação IgG2a/IgG1 em animais ecrudescentes e não recrudescentes indicou um aumento de 3 vezes na produção de IgG2a que indica um padrão Th1 de resposta imune. A análise de qRT-PCR concomitantemente à citometria de fluxo evidenciou que células dendríticas são os reservatórios do parasita durante o estágio crônico da doença, que antecede o recrudescimento. Juntos, esses dados sugerem que a recrudescência durante a gestação está diretamente ligada ao dano tecidual, provavelmente relacionado a uma exacerbada resposta Th1 na placenta. / In this work, we used a murine model of recrudescence of malaria associated with pregnancy, consisting of BALB / c mice infected with Plasmodium berghei ANKAGFP to evaluate the immune response associated with the recrudescence of the disease. Observing the spleen cell populations by flow cytometry, an increase in the percentage of CD4+, CD19+, TCR <font face=\"Symbol\">g<font face=\"Symbol\">d+, GR1+ cells was observed in the infected animals, compared to the uninfected controls. No differences were observed in the percentage of placental leukocytes. Furthermore, our results showed that in the spleen, CD4+ and CD8+ cells were in a more active state in recrudescent females, while in the placenta, these animals exhibited an increase in CD4+ T cell activation. The ratio IgG2a/IgG1 in recrudescent vs non-recrudescent animals showed a 3-fold increase in the production of IgG2a indicating a Th1 immune response. qRT-PCR analysis, together with flow cytometry, showed that dendritic cells were the reservoirs of the parasite during the chronic stage of the disease, preceding the recrudescence. Together, these data suggest that recrudescence during pregnancy is directly linked to tissue damage, probably related to an exacerbated Th1 response in the placenta.

The asexual life cycle of Plasmodium falciparum parasites takes only 48 hours, allowing for rapid replication. The continuous infection, rupturing and re-infection of erythrocytes results in the pathogenicity of this disease. Schizogony (nuclear division) in P. falciparum parasites occurs via alternation between the S and M phases of the cell cycle where DNA synthesis occurs in the mature trophozoite and schizont stages, followed by mitosis to form daughter merozoites. Merozoites then give rise to ring stages after they have infected erythrocytes and the ring stages continue their development to trophozoites. This cyclic development, known as the intraerythrocytic developmental cycle, has a unique transcriptional regulation, which is closely linked to cell cycle regulation. However, the intricacies that these mechanisms are controlled by are still unidentified. One of the means in which the P. falciparum parasite’s complex life cycle is controlled is by means of epigenetics. Epigenetics refers to the heritable changes on a phenotypic level, which are independent of changes on a genetic level. One group of enzymes that participates in the parasite’s epigenetic control is the Plasmodium histone deacetylases. Inhibition of histone deacetylases (HDACs) results in hyperacetylation, which causes aberrant gene transcription and eventually results in parasite death. Comparative analyses of three histone isolation methods and analysis of P. falciparum parasite histones and their post-translational modifications (PTMs) by mass spectrometry techniques identified both epigenetically relevant and novel PTMs in P. falciparum parasite histones and led to the discovery of an adapted histone isolation method for investigation of histone PTM landscapes. When this modified method was used for the investigation of histones that were isolated from P. falciparum parasites treated with HDAC inhibitors compared to untreated parasites, differences were seen in the PTM landscape. Subsequent in silico screening strategies were used to identify ten compounds from the Medicines for Malaria Venture (MMV) Malaria Box, which target the active site of the zinc-requiring PfHDAC1. From these, eight compounds showed inhibition of proliferation of cultured P. falciparum parasites. Ensuing, the adaptation of an HDAC assay to investigate histone deacetylase inhibition was used to validate these compounds as possible PfHDAC1 inhibitors, with at least two of the compounds showing significant inhibition of PfHDAC1 activity, comparable to that of the known HDAC inhibitor, suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA. The use of in silico screening of a large library of compounds, such as the MMV Malaria Box, successfully narrows down candidates for possible anti-malarials with drug-like properties by identification of their cellular targets. This work is method-based and facilitates the investigation of the epigenetic landscape of histones, and the identification of novel HDAC inhibitors. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2014. / gm2014 / Biochemistry / unrestricted

Magister Pharmaceuticae - MPharm / Plasmodium falciparum malaria continues to be a worldwide health problem, especially in developing countries in Africa and is responsible for over a million fatalities per annum. Chloroquine (CQ) is low-cost, safe and was the mainstay aminoquinoline derived chemotherapeutic agent that has been used for many years against blood-stage malaria. However, today the control of malaria has been complicated by increased resistance of the malaria parasite to existing antimalarial agents such as CQ. The primary cause of resistance is mutation in a putative ATP-powered multidrug efflux pump known as the p-glycoprotein (pGP) pump, and point mutation in P. falciparum CQ resistance transporter (PfCRT) protein. These mutations are responsible for the reduced accumulation of CQ at its primary site of action, the acidic digestive food vacuole of the parasite.To overcome the challenges of CQ resistance in P. falciparum, chemosensitiser offer an attractive approach. Chemosensitisers or reversal agents are structurally diverse molecules that are known to reverse CQ resistance by inhibiting the pGP efflux pump and/or the PfCRT protein associated with CQ export from the digestive vacuole in CQ resistant parasites. Chemosensitisers include the well-studied calcium channel blocker verapamil and antihistaminic agent chlorpheniramine. These drugs have little or no inherent antimalarial activity but have shown to reverse CQ resistance in P. falciparum when co-administered with CQ. Because of the channel blocking abilities of pentacycloundecylamines (PCUs) such as NGP1-01, it is postulated that these agents may act as chemosensitisers and circumvent the resistance of the Plasmodium parasite against CQ. Therefore as a proof of concept we conducted an experiment using CQ co- administered with different concentrations of NGP1-01 to evaluate the ability of NGP1-01 to act as a chemosensitiser.Herein, we report the ability of NGP1-01, the prototype pentacycloundecylamine (PCU), to reverse CQ resistance (> 50 %) and act as a chemosensitiser. NGP1-01 alone exhibited very low intrinsic antimalarial activity against both the resistant and sensitive strain (> 2000 nM), with no toxicity to the parasite detected at 10 µM. A statistically significant (p < 0.05) dose dependent shift was seen in the CQ IC50 values at both 1 µM and 10 µM concentration of co-administeredNGP1-01 against the resistant strain. Based on this finding we set out to synthesise a series of novel agents comprising of a PCU moiety as the reversal agent (RA) conjugated to a CQ-like aminoquinoline (AM) molecule and evaluate the potential of these PCU-AM derivatives as antimalarial- and/or reversed CQ agents. As recently shown by Peyton et al., (2012), the conjugation of a CQ-like molecule with a RA such as the chemosensitiser imipramine and derivatives thereof is a viable strategy to reverse CQ resistance in multidrug-resistant P. falciparum. The novel compounds were obtained by amination and reductive amination reactions. The synthetic procedures involved the conjugation of the Cookson’s diketone with different tethered 4-aminoquinoline moieties to yield the respective carbinolamines and the subsequent imines. This was followed by a transannular cyclisation using sodium cyanoborohydride as reducing agent to yield the desired PCU-AM derivatives. The CQ-like AMderivatives were obtained using a novel microwave (MW) irradiation method. Structure elucidation was done by utilising 1H- and 13C NMR spectroscopy as well as IR absorption spectrophotometry and mass spectrometry. Five PCU-AM reversed CQ derivatives were successfully synthesised and showed significant in vitro antimalarial activity against the CQ sensitive strain (NF54). PCU-AM derivatives 1.1 – 1.4 showed antimalarial IC50 values in the ranges of 3.74 – 17.6 ng/mL and 27.6 – 253.5 ng/mL against the CQ-sensitive (NF54) and CQ-resistant strains (Dd2) of Plasmodium falciparum, respectively. Compound 1.1 presented with the highest antimalarial activity against both strains and was found to be 5 fold more active against the resistant strain than CQ. The reversed CQ approach resulted in improved resistance reversal and a significantly lower concentration PCU was required compared to NGP1-01 and CQ in combination. This may be attributed to the improved ability of compound 1.1 to actively block the pGP pump and/or the increased permeability thereof because of the lipophilic aza-PCU moiety. Compound 1.1 also showed the lowest RMI value confirming that this compound has the best potential to act as a reversed CQ agent in the series. Cytotoxicity IC50 values observed for compounds 1.1 – 1.4 were in the low micromolar concentrations (2.39 – 9.54 µM) indicating selectivity towards P. falciparum (SI = 149 – 2549) and low toxicity compared to the cytotoxic agent emetine (IC50 = 0.061 µM).These results indicate that PCU channel blockers and PCU-AM derived conjugates can be utilised as lead molecules for further optimisation and development to enhance their therapeuticpotential as reversal agents and reversed CQ compounds.