Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T00:45:49Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Daiana Perce.pdf: 3555490 bytes, checksum: 2638dddd9374d377120b0e33dfb8169b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T00:45:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Daiana Perce.pdf: 3555490 bytes, checksum: 2638dddd9374d377120b0e33dfb8169b (MD5) Previous issue date: 2011-04-19 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / O Antígeno de Ligação ao Eritrócito de 175kDa (EBA-175) é o ligante preferencial do P. falciparum no processo de penetração em eritrócitos sendo considerado, portanto, um importante antígeno candidato à vacina, O EBA-175 apresenta duas regiões bem caracterizadas: a região II - conservada, imunogênica e com 2 segmentos ricos em cisteína (F1 e F2) que estão envolvidos na ligação do parasito à glicoforina-A da superfície dos eritrócitos e, a região III – apresentando fragmentos C (cepa CAMP) e F (cepa FCR3), que são mutuamente exclusivos, que definem as famílias alélicas do EBA-175. Estudos realizados em áreas hiperendêmicas de malária na África mostraram uma forte associação entre a forma clínica da doença e o dimorfismo da região III do EBA-175. As diferenças observadas entre áreas endêmicas em relação aos parasitos circulantes são fatores importantes em termos de estratégias de desenvolvimento de uma vacina visto que sua eficácia pode variar em diferentes cenários epidemiológicos. Neste estudo avaliou-se a diversidade genética das regiões II e III do EBA-175 apresentada pelos isolados naturais de P. falciparum provenientes de Porto Velho (RO), área de transmissão instável como são as áreas brasileiras, associando-a as variáveis de morbidade e exposição à malaria. Os isolados, obtidos ao longo de 13 anos, foram divididos em grupos de acordo com o ano da coleta: PV94/1994 (n= 101), PV02/2002 (n= 57) e PV07/2007 (n=30). Após a extração do DNA o polimorfismo genético foi analisado por PCR e seqüenciamento. Observamos na região II apenas um tipo de fragmento, com 926 pb. Na região III, observamos o clássico dimorfismo com uma freqüência maior do fragmento-C (84.3%). A infecção mista foi observada em 1,6% dos isolados. O fragmento-C foi amplificado em maior freqüência nos isolados das três coletas realizadas. Não observamos diferenças nas frequências dos fragmentos C e F entre os 3 grupos estudados. A análise do seqüenciamento da região II revelou 5 alterações nucleotídicas em 3 dos 15 isolados. Essas alterações levaram a 2 trocas de aminoácidos. A análise do seqüenciamento da região III evidenciou: no fragmento-C, 8 trocas de nucleotídeos em 3 das 45 amostras. Essas alterações levaram a 7 mudanças de aminoácidos; no fragmento-F, 2 alterações nucleotídicas foram reveladas em 2 das 11 amostras. Estas alterações levaram a 4 trocas de aminoácidos. Esses dados sugerem que não há diferenças significantes nas porções gênicas que codificam as regiões II e III do EBA-175 entre os isolados de P. falciparum circulantes em Porto Velho. Além disso, observamos que a frequência do dimorfismo alélico do EBA-175 é temporalmente estável e ausência de associação entre o polimorfismo encontrado e as variáveis de morbidade e exposição à malária. / P. falciparum Erythrocyte Binding Antigen 175 (EBA-175) plays a central role in erythrocytes invasion being considered, therefore, a target for malaria vaccine development.This antigen present to well characterized regions: the region II - conserved and immunogenic, that contains two cysteine-rich segments (F1 and F2), which are involved in binding to glycophorin-A on the surface of erythrocytes and, the region III – that contains mutually exclusive C (strain CAMP) and F (strain FCR3) fragments, which defines the two allelic families of EBA-175. Several studies performed in high endemicity malaria area in Africa have shown the influence of this dimorphism on clinical disease and outcome. The differences observed between different endemic areas in relation to exposed individuals and the circulating parasites are important factors in terms of vaccine strategies since the efficacy of a potential vaccine may vary in different epidemiological scenarios. The goal of this study was to evaluate the genetic diversity of regions II and III of EBA-175 in P. falciparum isolates from Porto Velho (RO), a region of malaria unstable transmission, and the influence of this diversity on malaria morbidity and exposure variables. The blood samples were collected in three time points between 1994, 2002 and 2007 (PV94 group, n=101; PV02 group, n=57; PV07 group, n=30, respectively). The genetic polymorphism was analyzed by PCR and sequencing. We observed in the region II only one type of fragment with 926 bp. In the region III we observed the classic dimorphism with a higher frequency of the C-fragment (84.3%). The mixed infection was observed in 1.6% of isolates. There were no differences in the frequency of fragments C and F among the 3 groups. Sequencing of region II revealed 5 nucleotide changes in 3 of 15 isolates, leading to 2 amino acids replacements. Sequencing of region III revealed that: in the C-fragment there were 8 nucleotide changes in 3 of 45 samples, leading to 7 amino acids replacements; in the fragment-F there were 2 nucleotide changes , in 2 of 11 samples, leading to 2 amino acids replacements. Our results showed: reduced genetic diversity in P. falciparum EBA-175 isolates circulating in Porto Velho; predominance of C-fragment and temporal stability of allelic dimorphism of the EBA-175. Moreover, no association was observed between the EBA-175 dimorphism and malaria morbidity and exposure variables.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-20T15:55:54Z No. of bitstreams: 1 Isaclaudia Gomes de Azevedo.pdf: 1665691 bytes, checksum: ee1af0ea03f6788f85de4a97da24c983 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-20T15:55:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Isaclaudia Gomes de Azevedo.pdf: 1665691 bytes, checksum: ee1af0ea03f6788f85de4a97da24c983 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A malária é uma doença parasitária causada pelo protozoário do gênero Plasmodium e é um grande problema de saúde pública. Por volta de 40% da população mundial está em área de risco de malária. A malária cerebral é a principal complicação, mas o edema pulmonar e a injúria pulmonar (ARDS) podem ser desencadeadas pela infecção com P. falciparum, P. vivax e P. knowlesi, e ocorrem frequentemente durante ou após o início do tratamento antimalárico. Os mecanismos moleculares e celulares de indução de injúria pulmonar, como da malária cerebral permanecem indefinidos. Previamente, nós encontramos que a deleção genética da integrina CD11d/CD18, que é expressa em leucócitos mieloides, desencadeia uma maior sobrevida no animais infectados com Plasmodium berghei Anka (PbA), que é uma modelo de malária grave. Tal resultado sugere que a molécula CD11d/CD18 tenha um papel determinante na imunopatogênese da malária. Perguntamos se CD11d/CD18 determina eventos fisiopatológicos na ARDS desencadeadas por infecção PbA. Realizamos análises da expressão da subunidade CD11d e de parâmetros inflamatórios, como da permeabilidade da barreira vascular por exclusão do corante azul de Evans, e citocinas por ELISA. Proteínas e leucócitos foram mensurados no lavado broncoalveolar (LAB). A migração celular foi medida pela contagem de células ao microscópio e por citometria de fluxo. Também foi avaliada a expressão do ligante de CD11d, VCAM-1 e a função respiratória dos animais. A Análise da expressão do mRNA da subunidade CD11d sugere um acúmulo de leucócitos e/ou que a expressão da subunidade CD11d é aumentada em macrófagos pulmonares e/ou em outras células mieloides pulmonares após a infecção. Nós também observamos um acumulo de leucócitos, hemácias e fluido nos pulmões de CD11d+/+ mice. A inflamação e a hemorragia foram menos intensas nos pulmões dos animais CD11d-/-. Em paralelo, a integridade da barreira vascular foi prejudicada nos animais CD11d+/+, enquanto os animais CD11d-/- tinham menor extravazamento de azul de Evans no tecido pulmonar e níveis mais baixos de proteína no LAB em comparação com CD11d+/+, apesar de o número total de leucócitos no LBA ter sido semelhante. Observamos níveis mais baixos de citocinas inflamatórias que estavam associadas com a malária experimental e clínica, em amostras de animais CD11d-/- quando comparados com os animais CD11d+/+. A maior parte dos leucócitos dos camundongos CD11d-/- ficavam retidos na medula óssea e também havia menos células CD14+ no sangue periférico, quando comparado com os camundongos CD11d+/+. Os nossos resultados demonstram que a ausência da subunidade CD11d não interfere na expressão de VCAM-I e acarreta uma melhor função respiratória após a infecção. Podemos observar que a integrina CD11d/CD18 influência nos principais eventos fisiopatológicos na ARDS desencadeada pela malária experimental, incluindo ruptura da barreira vascular pulmonar, inflamação e hemorragia. / Malaria is a parasitic disease caused by protozoa of the genus Plasmodium and is a major public health problem. 40% or more of the global population is at risk for malaria. Cerebral malaria is the most feared complication, but pulmonary edema and lung injury (ARDS) are also triggered by the infection with Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, and Plasmodium knowlesi, and often occur during or after the begin of anti-malarial therapy. The molecular and cellular mechanisms of pulmonary injury, like those of CM, remain incompletely defined. Previously, we found that genetic deletion of integrin CD11d/CD18, which is expressed on myeloid leukocytes, improves survival in mice infected with P. berghei Anka (PbA), a model of severe malarial infection. Thus, CD11d/CD18 may be a critical determinant in injurious innate immune responses to malarial parasites. We asked if CD11d/CD18 is involved in pathophysiologic events in ARDS triggered by PbA infection. We measured CD11d subunit expression, vascular barrier function by Evans blue dye (EBD) exclusion, and cytokines by ELISA. Protein and leukocytes were measured in bronchoalveolar lavage (BAL) samples. Cell migration was measured by microscope counting and flow cytometry. We also analyzed the expression of the ligand to CD11d, VCAM-1, and respiratory function of animals. Analysis of CD11d mRNA suggested that CD11d subunit expressing leukocytes accumulate and/or that CD11d subunit expression is increased in lung macrophages or other pulmonary myeloid cells early after infection. We showed a dramatic accumulation of leukocytes, red blood cells, and fluid in the lungs of CD11d+/+ mice. Inflammation and hemorrhage were reduced in the lungs of CD11d-/- animals. In parallel, vascular barrier integrity was impaired in CD11d+/+ animals; once CD11d-/- animals had less accumulation of EBD in extravascular lung tissue and lower levels of BAL protein compared to CD11d+/+, although the total number of BAL leukocytes was similar. Compared to CD11d+/+, there were lower levels of inflammatory cytokines that are associated with experimental and clinical malaria in samples from CD11d-/- mice. Most of the leukocytes in CD11d-/- mice are retained in the bone marrow and also there is less CD14+ in the peripheral blood when compared to CD11d+/+ mice. Our findings demonstrate that the absence of CD11d integrin does not interfere in VCAM-I expression and correlates with a better respiratory function in infected CD11d-/- when compared to CD11d+/+ mice. We observed that CD11d/CD18 influences key pathophysiologic events in ARDS in experimental malaria, including pulmonary vascular barrier disruption, inflammation, and hemorrhage.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2013-05-23T18:32:40Z No. of bitstreams: 1 TESE_Armando_de_Menezes_Neto_2012.pdf: 13065237 bytes, checksum: bdac30d844b06bec6a790e23fa724740 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-05-23T18:32:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_Armando_de_Menezes_Neto_2012.pdf: 13065237 bytes, checksum: bdac30d844b06bec6a790e23fa724740 (MD5) Previous issue date: 2012 / O peptídeo sinal é um motivo encontrado, geralmente, na extremidade N-terminal de proteínas e a sua presença determina a entrada na via clássica de transporte intracelular, após a translocação da proteína para o lúmen do retículo endoplasmático. Portanto, a presença ou ausência do peptídeo sinal influencia a função biológica de uma proteína ao ser um fator determinante da sua localização subcelular. Como a conservação de função entre proteínas ortólogas é esperada, foi hipotetizado que a localização subcelular e, consequentemente, a presença do peptídeo sinal deveriam, também, se apresentar conservadas. Partindo desta premissa, as predições de peptídeo sinal em proteínas ortólogas de cinco espécies de Plasmodiumforam analisadas. Predições de peptídeo sinal (SignalP) e informações de ortologia (OrthoMCL-DB) para proteínas de cinco espécies do gênero Plasmodium(Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, Plasmodium bergueie Plasmodium yoelii) foram combinadas em uma estratégia inovadora, visando a identificação de grupos de proteínas ortólogas que apresentam predições de peptídeo sinal divergentes (grupos Mistos). As proteínas pertencentes a estes grupos foram submetidas a uma análise comparativa baseada na inspeção visual de alinhamentos múltiplos e de modelos gênicos e regiões genômicas flanqueadoras da extremidade N-terminal. Novos modelos gênicos foram sugeridos para aquelas proteínas que apresentavam prováveis erros de anotação de sequência, especialmente na região N-terminal. Alguns dos novos modelos gênicos foram validados por RT-PCR. Os resultados da inspeção visual foram usados para treinar uma Máquina de Suporte de Vetores (Support Vector Machine) com o objetivo de classificar grupos Mistos em: (1)Com erros de anotação ou (2)Sem erros de anotação. O SVM foi aplicado para classificar os grupos Mistos de cinco bancos de dados, montados a partir de vinte e duas espécies. Os grupos contendo proteínas com predições de peptídeo sinal divergentes apresentaram uma alta taxa de erros de anotação. Um total de 478 proteínas de Plasmodiumforam reanotadas sendo que a maioria apresentou inversões das suas predições de peptídeo sinal originais, representando um impacto significativo no conjunto final de proteínas destinadas à via clássica de transporte intracelular, principalmente para Plasmodium vivaxe Plasmodium yoelii. O classificador baseado nos dados da inspeção visual se mostrou bastante flexível e robusto, apresentando uma performance boa e consistente mesmo frente a cenários variados de agrupamento de espécies. A metodologia proposta introduz uma abordagem simples, porém promissora, para a realização de tarefas de curadoria e controle de qualidade dos dados de anotação de sequências proteicas em uma escala genômica. Os resultados do classificador definem a base para seu desenvolvimento em uma ferramenta computacional e os resultados das reanotações em Plasmodiumimpactarão a busca por novos alvos vacinais e quimioterápicos. / Signal peptide is a motif usually found in the N-terminal end of proteins and its presence directs proteins to enter the classical intracellular transport pathway, after their co-translational translocation to the endoplasmic reticulum lumen. Therefore, the presence or absence of a signal peptide plays an indirect role in defining the biological function of a protein, as it is a determinant of subcellular localization. Since function is usually conserved among orthologous proteins, it has been hypothesized that subcellular localization and, consequently, signal peptide status are expected to behave accordingly. Based on this premise, signal peptide predictions among orthologous proteins from five Plasmodium species were analyzed. Signal peptide predictions (SignalP) and orthology information (OrthoMCL-DB) for proteins from five Plasmodiumspecies (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium knowlesi, Plasmodium bergueiand Plasmodium yoelii) were combined into an innovative strategy, intending the identification of groups of orthologous proteins showing diverging signal peptide predictions (Mixed groups). The proteins belonging to these groups were submitted to a comparative analysis based on visual inspection of multiple alignments and of gene models and their upstream flanking regions. New gene models were proposed for those proteins presenting putative sequence misannotations, especially in their N-terminal region. Some of the new gene models were validated through RT-PCR. Results from the visual inspection were used to train a Support Vector Machine to be able to classify Mixed groups into: (1)With misannotations and (2)Without misannotations. The SVM was applied in the classification of Mixed groups from five datasets, built from twenty-two species. Groups featruing proteins with diverging signal peptide predictions showed an elevated rate of misannotations. A total of 478 Plasmodiumproteins were reannotated, and most had their original signal peptide predictions inverted, representing a significant impact in the final set of proteins destined to the classical intracellular transport pathway, especially for Plasmodium vivaxand Plasmodium yoelii. The classifier based on the visual inspection data was shown to be flexible and robust, performing well and consistently even when dealing with highly ecletic species clusterings. The proposed methodology introduces a simple yet promising approach to the tasks of curation and quality control of annotation data from proteins sequences in genomic scale. The classifier's results define the groundwork for its development into a computational tool and the reannotations results for Plasmodiumproteins shall impact the search for new vaccine and drug targes.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T13:49:32Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_MarinaLimaSilvaSantos (2).pdf: 2635807 bytes, checksum: c598c1386e331ed15526c363ab1c2321 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T13:49:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_MarinaLimaSilvaSantos (2).pdf: 2635807 bytes, checksum: c598c1386e331ed15526c363ab1c2321 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-07-03T13:54:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_MarinaLimaSilvaSantos (2).pdf: 2635807 bytes, checksum: c598c1386e331ed15526c363ab1c2321 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-03T13:54:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_DIP_MarinaLimaSilvaSantos (2).pdf: 2635807 bytes, checksum: c598c1386e331ed15526c363ab1c2321 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou / Plasmodium vivax tem sido reconhecido por sua capacidade de causar malária grave, o que torna prioritário os estudos acerca dos mecanismos patogênicos associados a essa espécie. Dado o caráter inflamatório exibido pela malária vivax, faz-se relevante estudar os fatores genéticos do hospedeiro vertebrado que podem influenciar o curso da doença. Nesse sentido, o presente trabalho investigou a influência da variabilidade genética de componentes plaquetários e do inflamossoma sobre a morbidade na infecção por P. vivax. Mais especificamente, a primeira hipótese avaliada foi a de que alterações clínicas e hematológicas na malária vivax estão envolvidas com polimorfismos em genes de receptores plaquetários, relacionados ao aumento da adesão e/ou agregação das plaquetas: integrina α2 (C807T), integrina β3 (T1565C) e glicoproteína GPIbα (T-5C). A partir do estudo de aproximadamente 200 indivíduos sintomáticos infectados por P. vivax, foi possível confirmar que os polimorfismos do receptor para colágeno (α2) e do receptor para fator de von Willebrand (GPIbα) estão associados a duas das complicações mais frequentes na malária: trombocitopenia grave e anemia. A segunda hipótese investigada foi a de que polimorfismos em genes de componentes do inflamossoma – plataforma molecular capaz de desencadear a produção de citocinas inflamatórias – estão associados à morbidade em pacientes infectados por P. vivax. Nossos achados confirmaram essa hipótese e sugeriram que polimorfismos nos genes de NLRP1, NLRP3 e CARD8 podem contribuir para as alterações clínicas e hematológicas observadas nos indivíduos estudados. Em conjunto, os dados aqui apresentados constituem a primeira demonstração de que a variabilidade genética de receptores plaquetários e componentes do inflamossoma pode influenciar na patogenia da malária causada por P. vivax. Estudos futuros visando esclarecer o papel da cascata de coagulação inflamação na morbidade dessa doença fazem-se necessários. / Plasmodium vivax is increasingly recognized as an important cause of severe malaria, making studies on the mechanisms involved on its pathogenesis of high priority. Given the marked inflammatory status of P. vivax infection, it seems to be relevant to investigate host genetic polymorphisms that might influence the course of disease. In this context, the present study investigated whether genetic variability in platelets and inflammasome components would contribute to vivax malaria morbidity. More specifically, the first hypothesis investigated was that susceptibility to P. vivax disease could be associated with polymorphisms in relevant platelet membrane glycoproteins that result in gain of function: integrin α2 (C807T), integrin β3 (T1565C) and GPIbα (T-5C). By studying about 200 symptomatic patients, we confirmed that polymorphisms associated with collagen (α2), and von Willebrand factor (GPIbα) receptors were associated with two of the most common P. vivax complications: severe thrombocytopenia and anemia. The second hypothesis investigated was that polymorphisms in inflammasome genes – molecular platforms capable of promoting pro-inflammatory cytokines production – could be associated with P. vivax disease. Our findings confirmed this hypothesis and suggested that genetic variability in NLRP1, NLRP3 and CARD8 would partially explain the differences in hematological and clinical profiles of P. vivax patients. All together, this study represents the first demonstration that genetic variability in platelet receptors and inflammasome components might contribute to P. vivax pathogenesis, and it opens new possibilities to investigate the crosstalk between coagulation and inflammation on malaria morbidity.

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:45:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ana_silva_ioc_mest_2012.pdf: 1481530 bytes, checksum: 26cfc4a55477788165190207123da53d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A malária é uma doença que acomete milhões de pessoas todos os anos no planeta. No Brasil, essa doença atingiu cerca de 267 mil pessoas somente em 2011, sendo que a maior parte dos casos ocorreu na região Amazônica. Causada por protozoários do gênero Plasmodium, possui um amplo espectro clínico que vai desdeinfecções assintomáticas, malária não complicada, a malária grave ou complicada, podendo evoluir até o óbito. Estudos realizados em áreas holo e hiperendêmicas de malária, fundamentalmente no continente Africano e em Papua Nova Guiné, permitiram estabelecer que o conhecimento da população de parasitos que circulam em uma área.Este estudo se propôs a avaliar o perfil genético da infecção por P. falciparumem uma área de alto risco epidemiológico para malária e com presença de infecção assintomática no município de Barcelos, médio rio Negro, estado do Amazonas Para isso, foi estudado o gene MSP1 que codifica a Proteína de Superfície de Merozoíto 1, com o intuito de verificar a diversidade genética dos parasitos da região de Barcelos, a multiplicidade da infecção e as relações dos diferentes genótipos com o status clínico em área endêmica para malária. Foi realizada reação de polimerase em cadeia (PCR) a partir de DNA extraído de 79 amostras de sangue coletadas em indivíduos desta região. No total, foram encontrados 10 diferentes genótipos do parasito sendo que a maior parte dos indivíduos (45 pessoas, 56,96%) portava apenas um genótipo do parasito. Entre os indivíduos assintomáticos, 70,37% apresentavam um genótipo e os demais (29,63%) apresentaram dois genótipos Entre os pacientes com malária, 50% tinham apenas um genótipo, 25% tinham dois genótiposs, 19,23% apresentaram três genótipos e 5,77% portavam quatro genótipos. Em média, portadores assintomáticos possuíam 1,3 genótipos diferentes enquanto pacientes com malária tiveram em média 1,8 genótipos. Concluiu-se que na região de Barcelos circulam populações de P. falciparumconsideravelmente diversas e que as infecções múltiplas estão mais presentes em portadores de malária que em indivíduos assintomáticos / Malaria is a disease that attacks millions of people all of the years in the world . In Brazi l, it reached about 267 thousand people only in 2011 , and most of the cases was registered in the Amazonian area. Caused by protozoa of the gender Plasmodium , it possesses a wide clinical spectrum ranging from asymptomatic infections , no complicatedma laria, serious or complicatedmalaria that could develop until death. Studies accomplished in holo - and hyperendemic areas, fundamentally in t he African continent and in Papua New Guinea, allowed to establish that the knowledge of the population of parasite s that circulate in a certain area . This study intended to evaluate the genetic profile of the infection for P. falciparum in an area of high epidemic risk for malaria and with the pre sence of asymptomatic infection in the city of Barcelos, medium Rio Negro , state of Amazon as . For that, the gene MSP - 1 , that codifies the Merozoite Surface Protein 1, was studied to verify the genetic diversity of the parasites of the ar ea of Barcelos, the multiplicity of the infection and the relationships of the differen t genotypes with the clinical status in an endemic area for malaria. Polymerase Chain R ea ction (PCR) was accomplished starting from extracted DNA from blood samples collected in individuals from this area. In total, 10 different genotypes of the parasite we re found and most of the individuals (45 people, 56,96%) carried just a genotype of the parasite . Amon g the asymptomatical individuals , 70,37% introduced a genotype and the othe rs (29,63%) presented two . Among the patients with malaria, 50% had only one ge notype, 25% had two genotypes , 19,23% presented three genotypes and 5,77% carried four genotypes. On average, asymptomaticbearers possessed 1,3 genotypes while patient s with malaria had 1,8 genotypes on average. It was concluded that in the area of Barcel os diverse populations of P. falciparum circulate and that multiple infections are more present in malaria bearers tha n in asymptomatic individuals

Made available in DSpace on 2016-07-01T12:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 monica_cuero_ioc_mest_2016.pdf: 2091495 bytes, checksum: 520eacc5a4964c1f22509ada51d4d97a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-05T23:52:44Z (GMT). No. of bitstreams: 3 monica_cuero_ioc_mest_2016.pdf.txt: 128716 bytes, checksum: 4fd30b67febb8c98bc54a69c0cccdcfd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) monica_cuero_ioc_mest_2016.pdf: 2091495 bytes, checksum: 520eacc5a4964c1f22509ada51d4d97a (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A complexa diversidade genética do Plasmodium falciparum é em parte responsável pela evasão da resposta imune do hospedeiro, pelo surgimento da resistência aos fármacos e pela dificuldade no desenvolvimento de uma vacina anti-malárica eficaz. Estudos sobre a biologia deste parasito se concentram fundamentalmente em áreas holo e hiperendêmicas de malária na África subsaariana. Trabalhos realizados na região Amazônica, ainda são escassos no que se refere à diversidade genética de populações naturais de P. falciparum. Este estudo analisou a diversidade genética de P. falciparum isolados de indivíduos provenientes da região do médio rio Negro, Amazonas utilizando como alvo o gene que codifica para a proteína de superfície do merozoíta 2. METODOLOGIA: O estudo foi realizado em Barcelos, um município de alto risco epidemiológico para malária com uma média anual de 5.000 casos nos últimos cinco anos (IPA médio=156,4/1000). Foram avaliadas 79 amostras isoladas de indivíduos que apresentaram malária clínica ou infecção assintomática. Os DNAs genômicos extraídos foram submetidos à reação em cadeia da polimerase (PCR) para a confirmação do diagnóstico de infecção pelo P. falciparume em seguida foi feita uma PCR-nested, para amplificação da região do bloco 3 do gene msp2 para diferenciação das famílias alélicas (3D7 e FC27) e a diversidade intra-família foi observada após digestão com a enzima HinfI RESULTADOS: Só foi encontrada a familia 3D7 nas amostras estudadas. Dois diferentes genótipos foram encontrados circulando na área, caracterizados pela combinação dos fragmentos 16 pb, 108 pb, 349 (genotipo 1) e 16 pb, 108 pb, 400pb (genotipo 2). Foi observado que só dois indivíduos com malária clinica portavam os dois genótipos simultaneamente. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas ao comparar a presença de genótipos com sexo, grupos de idade, área rural ou urbana, antecedentes de malária previa e o desfecho clinico dos indivíduos (p>0,05). CONCLUSÕES: O estudo do polimorfismo do gene msp2 tem se mostrado como uma ferramenta útil para o estudo da diversidade genética do P. falciparum. No município de Barcelos a diversidade genética desde parasito foi limitada mostrando só a presença de dois genótipos circulantes e em poucos casos uma multiplicidade da Infecção de dois parasitas simultáneamente / The complex genetic diversity of Plasmodium falciparum is partly responsible for the evasion of the host immune response, the emergence of drug resistance and the difficulty in developing an effective anti-malarial vaccine. Studies on the biology of this parasite are mainly concentrated in holo and hyperendemic malaria areas in sub-Saharan Africa. Research in the Amazon region, is scarce in relation to the genetic diversity of natural populations of P. falciparum. This study analyzed the genetic diversity of P. falciparum isolates from individuals of the Middle Rio Negro, Amazon in Brazil, using the gene coding for the merozoite surface protein 2 (MSP2). METHODOLOGY: The study was conducted in Barcelos, a malaria high epidemiological risk municipality, with an annual average of 5,000 cases in the last five years (mean IPA = 156.4 / 1000). We evaluated 79 samples isolated from subjects presenting clinical malaria or asymptomatic infection. The extracted genomic DNA was subjected to polymerase chain reaction (PCR) to confirm the diagnosis of infection with P. falciparum. A PCR-nested was made for amplification of the gene msp2 block 3 region for differentiation of allelic families (3D7 and FC27); intrafamily diversity was observed after digestion with the enzyme HinfI RESULTS: Only family 3D7 was observed in the samples. Two different genotypes were found circulating in the area, characterized by the combination of fragments 16 bp, 108 bp, 349 (genotype 1) and 16 bp, 108 bp, 400bp (genotype 2). It was observed that only two individuals with clinical malaria carried two genotypes simultaneously. No statistically significant differences were found when comparing the presence of genotypes with sex, age groups (p>0,05). Only two individuals carried out two different genotypes simultaneously (MOI). CONCLUSIONS: The study of polymorphism of the msp2 gene has been shown to be a useful tool for the study of genetic diversity of P. falciparum. The genetic diversity and MOI is very limited in this area with the presence of only two circulating genotypes

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-15Bitstream added on 2015-05-14T16:59:11Z : No. of bitstreams: 1 000828911.pdf: 473053 bytes, checksum: 63407242b7f0b46a1ef661b3ea907e82 (MD5) / Introdução: O envolvimento do sistema cardiovascular em pacientes com malária por Plasmodium vivax tem sido pouco estudado. Neste trabalho, avaliamos as estruturas cardíacas, a função ventricular e marcadores sistêmicos de lesão cardiovascular em pacientes com a forma não-grave da malária por P. vivax, em Manaus, estado do Amazonas, Brasil. Métodos: Foram avaliados, prospectivamente, 26 pacientes adultos com malária por P. vivax em tratamento ambulatorial, no período de janeiro de 2012 a março de 2013. Os resultados foram comparados com grupo controle de 25 indivíduos saudáveis, pareados por gênero e idade. Avaliação clínica, exames laboratoriais e ecocardiografia transtorácica foram realizados na primeira avaliação após o diagnóstico de malária (dia zero, D0) e sete dias após (D7) início do tratamento. Resultados: Os Casos apresentaram maiores valores do diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo (VE; 28,8±2,82 vs 30,9±4,03 mm; p=0,037) e do volume diastólico do VE (82,4±12,3 vs 93,8±25,9 ml; p=0,05) e menor fração de ejeção do VE (método de Teicholz: 73,2±6,59 vs 68,4±4,87; p=0,004) que os Controles. A fração de variação da área do ventrículo direito (VD) foi menor (54,7±5,11 vs 50,5±6,71 %; p=0,014) e o índice de performance miocárdica do VD (0,21±0,71 vs 0,33±0,19; p=0,007), a área diastólica do VD (13,0±3,19 vs 15,3±2,96 cm2; p=0,009 ), a área de sistólica do VD (6,41±1,27 vs 7,45±1,46 cm2; p=0,009) e a resistência vascular pulmonar (1,13±0,25 vs 1,32±0,26 unidades Woods; p=0,012) foram maiores nos Casos que nos Controles. A fração de variação da área do VD foi também menor e a resistência vascular pulmonar maior nos Casos no D0 que no D7. No D0, os Casos apresentaram maior concentração sérica de bilirrubina indireta, da molécula de adesão celular vascular solúvel tipo 1, do fragmento N-terminal do pró-peptídeo natriurético cerebral e da troponina T, e menor ... / Purpose: Malaria is an endemic disease in the Amazon Region. In Brazil it has been largely attributed to Plasmodium vivax infection since the 1990’s. Cardiovascular system involvement in patients with P. vivax malaria has been poorly addressed. The aim of this study was to evaluate cardiac structures and function and serum markers of cardiovascular injury in patients with the nonsevere form of P. vivax malaria in Manaus, Amazonas state, Brazil. Methods: In an observational study, we prospectively evaluated 26 patients with P. vivax malaria in an outpatient referral hospital from January 2012 to March 2013 and compared results with a control group of 25 gender- and age-matched healthy individuals. Patients underwent clinical evaluation, laboratory tests, and transthoracic echocardiography at first evaluation after malaria diagnosis (day zero, D0) and seven days after starting malaria treatment (day seven, D7). Results: Echocardiography showed higher left ventricular (LV) systolic diameter (28.8±2.82 vs 30.9±4.03 mm; p=0.037) and LV diastolic volume (82.4±12.3 vs 93.8±25.9 ml; p=0.05), and lower LV ejection fraction (Teicholz method: 73.2±6.59 vs 68.4±4.87; p=0.004) values in patients than controls. Right ventricle (RV) fractional area change (54.7±5.11 vs 50.5±6.71%; p=0.014) was lower, and RV myocardial performance index (0.21±0.71 vs 0.33±0.19; p=0.007), RV diastolic area (13.0±3.19 vs 15.3±2.96 cm2; p=0.009) and systolic area (6.41±1.27 vs 7.45±1.46 cm2; p=0.009), and pulmonary vascular resistance (1.13±0.25 vs 1.32±0.26 Woods unit; p=0.012) were higher in patients than controls. RV fractional area change was lower and pulmonary vascular resistance higher in patients in D0 than D7. In D0, patients presented higher serum levels of indirect bilirubin, soluble vascular cell adhesion molecule–1 (sVCAM-1), Nterminal prohormone brain natriuretic peptide, and troponin T, and lower levels of nitric oxide than D7 and controls

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Este trabalho foi elaborado em conjunto com a Université Pierre et Marie Curie. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-02-07T16:06:48Z No. of bitstreams: 1 2016_CarlosHenriqueSaraivaGarcia_Parcial.pdf: 4658600 bytes, checksum: a608388f9b6fa01da088371cfde06c09 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-27T20:54:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CarlosHenriqueSaraivaGarcia_Parcial.pdf: 4658600 bytes, checksum: a608388f9b6fa01da088371cfde06c09 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-27T20:54:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CarlosHenriqueSaraivaGarcia_Parcial.pdf: 4658600 bytes, checksum: a608388f9b6fa01da088371cfde06c09 (MD5) / Na história da medicina, a malária é uma das doenças parasitárias mais graves e distribuídas que afetam seres humanos. A doença é causada por parasitas do gênero Plasmodium. A malária de roedores é utilizada comumente como modelo por permitir a combinação de experimentos in vivo e in vitro, além de estudos por genética reversa. Embora a gametogênese dos estágios sexuais de Plasmodium seja um passo essencial da transmissão da malária, dados moleculares sobre a reorganização nuclear, montagem do flagelo e sua regulação na gametogênese estão incompletas. A ATPase cinesina-8 de P. berghei é uma proteína motora sugerida como um importante componente para a gametogênese macho. Os gametócitos com o gene kin8 interrompido (Δkin8) são semelhantes morfologicamente aos tipos selvagens (WT), enquanto que na gametogênese existe disfunção que tornam as células Δkin8 incompetentes para gametogênese completa e incapazes de exflagelar. Nos esforços para melhorar o conhecimento sobre a exflagelação de gametas, fizemos experimentos quantitativos de proteômica e fosfoproteômica com gametócitos WT e Δkin8. A amostra enriquecida de gametócitos do sangue murinho no tempo T0 foi induzida a exflagelação por ácido xanturênico e colhida no tempo T7 e T15 min. A quantificação relativa entre amostras foi realizada com uso de peptídeos marcados por iTRAQ na triplicata biológica independente e analisados por nanoLC/MS-MS Orbitrap Elite Mass Spectrometer após enriquecimento TiO2. Os dados foram processados através do softwares Patternlab for Proteomics e Blast2GO. Em parasitas WT, 443 proteínas e 206 fosfoproteínas foram identificados a partir de 2.617 peptídeos. Em parasitas Δkin8, 530 proteínas e 218 fosfoproteínas proteínas foram identificadas a partir de 3.198 peptídeos. A produção de gametas é regulada por fosforilações nas duas condições celulares. Entre os processos biológicos da Ontologia de Genes, aqueles relacionados a tradução de RNA, e biossíntese de DNA e proteínas foram as que mais se destacaram e mais regulados na gametogênese. Foi observado também que a glicólise e a resposta ao estresse ambiental foram mais notável principalmente no início da diferenciação celular. Para Δkin8, a desorganização de microtúbulos dos axonemas e fusos mitóticos é causa provável da supressão de proteínas motoras (cinesina -8, -13 e dineína) como também pela superexpressão de proteínas de organização do braço interno e braço radial. Observamos importante diminuição de unidades de nucleossomos e aumento de proteínas envolvidas com a desorganização da divisão nuclear. Quando comparado com o WT, no mutante houve maior expressão de proteínas envolvidas no complexo proteassoma dependente de ubiquitina e menor quantidade de algumas proteínas interferentes no metabolismo energético e egresso. A análise do Δkin8 traz novas informações sobre a exflagelação e mal funcionamento do microgameta mutante. Em conclusão, a gametogênese exige manifestamente a expressão de proteínas e sua regulação por fosforilações para a produção de energia na diferenciação dos gametas. A Cinesina 8 é essencial para a gametogênese masculina normal como também para a montagem de axonemas em P. berghei, e seu estudo fornece informações quanto a organização celular e biologia de Plasmodium. / Malaria is one of the most serious and widespread parasitic diseases that affected humans in medicine history. The disease is caused by parasites from Plasmodium genus. Rodent malaria parasites are commonly used as model since it permits the combination of in vivo and in vitro experiments and reverse genetic studies. Although Plasmodium sexual stages gametogenesis is an essential step to ensure the malaria transmission, molecular data on nuclear reorganization and intracytoplasmic flagellum assembly proteins and their regulating in gametogenesis is still missing. The P. berghei motor ATPase kinesin 8 is proposed as important component for male gametogenesis. Kin8-disrupted gametocytes (Δkin8) were morphologically similar to wild-type (WT) parasites, while male gametogenesis is not functional and able to exflagellate. In efforts to improve the knowledge on gamete exflagellation, we did quantitative proteomic and phosphoproteomic experiments with WT and Δkin8 gametocytes. Gametocytes-enriched sample from mice blood at time T0 were xanthurenic acid-induced to exflagellate and harvested at time T7 and T15 min. The relative quantitative comparisons overtime were performed through iTRAQ labelled peptides from independent biological triplicate sample analysed by nanoLC/MS-MS Orbitrap Elite Mass Spectrometer after TiO2 enrichment. Data was processed through Patternlab for Proteomics software and Blast2GO. In the WT parasites, 443 proteins and 206 phosphoproteins were identified from 2,617 peptides. In Δkin8 parasites, 530 proteins and 218 phosphoproteins were identified from 3,198 peptides. Gamete formation is highly regulated by phosphorylation in both cell conditions. Among GO biological processes, those related to RNA translation, DNA and protein biosynthesis were most prominent and strongly regulated throughout the gametogenesis, and phosphorylated proteins are mainly RNA, ATP or protein binding proteins. We observed that glycolysis and environmental stress response are predominant, mainly at the beginning of the differentiation. For Δkin8 parasites, axoneme and mitotic spindle microtubules disorganization is likely to be caused by motor proteins down-regulation (kinesin-8, -13, and dynein) as well as by up-regulated proteins from inner arm and radial spoke organization. We noticed important down-expression of nucleosome units, up-expression of proteins involved in the replication that could be related to the nuclear division disorganisation. A higher expression of proteins involved in the ubiquitin-dependant proteasome complex and stress response and folding, and lower expression of some proteins that interferes in energy metabolism and egress in the mutant compared to the WT. The Δkin8 proteomic approach brings new clues on the exflagellation and the mutant microgamete impairment observed. In conclusion, gametogenesis clearly requires a high protein expression and phosphorylation modulation to produce energy for gamete differentiation. Kinesin 8 is essential for male gametogenesis and normal axoneme assembly in P. berghei, providing new insights into Plasmodium flagellar organization and biology. / Dans l'histoire de la médecine, le paludisme est l'une des maladies parasitaires les plus graves et répandues. Elle est causée par des parasites du genre Plasmodium. Les parasites du paludisme de rongeurs sont couramment utilisés comme modèles pour étudier le paludisme humain permettant des études de génétique inverse in vivo. Bien que la gamétogenèse des stades sexués de Plasmodium soit une étape essentielle pour la transmission du paludisme, les données moléculaires sur la réorganisation nucléaire, l'assemblage du flagelle et de leurs régulations pendant la gamétogenèse, sont toujours incomplètes. La kinésine-8 de P. berghei est une protéine motrice qui jouerait un rôle important lors de la formation des gamètes mâles. Les gamétocytes avec le gène kin8 interrompu (Δkin8) sont morphologiquement semblables au type sauvage (WT) mais la gametogenèse mâle n’est pas fonctionnelle et les cellules mutantes sont incapables de produire des gamètes mâles. Afin d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires mis en oeuvre au cours de la gamétogenese, nous avons entrepris des études protéomiques et phosphoprotéomiques comparatives et quantitatives chez le parasite de type sauvage et chez le mutant Δkin8. Les gamétocytes enrichis à partir du sang de souris infectées ont été récoltés au temps 0, 7 et 15 min après induction de la gamétogenese par l'acide xanthurénique. Des comparaisons quantitatives relatives ont été effectuées par nanoLC/MS-MS du type Orbitrap Elite à partir des peptides et phosphopeptides préalablement enrichis par TiO2, marqués par iTRAQ, et de triplicats biologiques. Les données ont été traitées par les logiciels Patternlab for Proteomics et Blast2GO. Chez WT, 443 protéines et 206 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 2.617 peptides. Chez Δkin8, 530 protéines et 218 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 3.198 peptides. La formation de gamètes est fortement régulée par phosphorylation dans les deux conditions cellulaires. Parmi les processus biologiques (GO term), ceux liés à la traduction de l’ARN, la biosynthèse de l’ADN et de protéines sont les plus marquants et les plus régulés. La glycolyse et la réponse aux stress environnementaux sont également prédominantes, surtout au début de la différenciation des gamètes. Chez Δkin8, une forte sous-expression des protéines motrices kinésine-13 et dynéine, et une surexpression de protéines de l'organisation des bras intérieur et radiaire des axonèmes sont observées. La modulation de l’expression de ces protéines participe certainement, en plus de l’absence de la kinésine-8, au phénotype observé chez Δkin8: l’absence d’assemblage des axonèmes des gamètes mâles. Nous avons constaté également une sous-expression significative d’unités des nucléosomes et la surexpression de protéines impliquées dans la réplication. Ceci pourrait être relié à la perturbation de la division nucléaire observée chez Δkin8. Par rapport au WT, Δkin8 montre une expression élevée de protéines du complexe de protéasome dépendant de l’ubiquitine et de protéines impliquées dans la réponse au stress et le repliement des protéines, ainsi qu’une faible expression de certaines protéines qui interviennent dans le métabolisme énergétique et la sortie de l’hématie. Ces approches de protéomique et phosphoprotéomique comparatives permettent pour la première fois d’identifier les évènements moléculaires, leur dynamique et leur modulation, mis en jeux lors de la gamétogenèse de P. berghei.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-graduação em Medicina Tropical, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-03-03T17:43:05Z No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / Approved for entry into archive by Ruthléa Nascimento(ruthleanascimento@bce.unb.br) on 2017-03-31T16:30:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-31T16:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ShirleyClaudinoPereiraCouto.pdf: 2005336 bytes, checksum: 109e6489df275decec29166652ec4123 (MD5) / A malária continua sendo um importante problema de saúde pública mundial acometendo milhões de pessoas principalmente nas regiões tropicais, e resulta em aproximadamente em 600 mil mortes por ano. As drogas antimaláricas influenciam indiretamente as respostas do sistema imunitário pela capacidade de diminuir a carga parasitária, diminuindo a quantidade de antígenos capazes de ativar o sistema imunitário. Entretanto, ainda está pouco esclarecida a ação das drogas antiplasmodiais sobre os mecanismos de defesa contra o plasmódio. A fagocitose encontra-se entre os principais mecanismos de eliminação do parasito, principalmente pela produção de radicais de oxigênio e nitrogênio pelos monócitos. A biogênese dos corpos lipídicos encontra-se aumentada na malária e pode estar envolvida na defesa e na fisiopatogenia da malária grave. O objetivo desse trabalho foi avaliar a influência do efeito imunomodulador do artemeter, lumefantrina e mefloquina na malária, pela avaliação da influência dessas drogas na fagocitose das formas eritrocitárias do plasmódio, na produção de óxido nítrico e peróxido de hidrogênio e na biogênese de corpos lipídicos. A influência do artemeter, da lumefantrina ou da mefloquina sobre a fagocitose por monócitos de indivíduos normais foia valiada in vitro utilizando 106 eritrócitos parasitados pelo Plasmodium falciparum, pelos receptores para padrões moleculares de patógenos (rPMP) e pelos receptores para opsoninas (rOps). Os monócitos e/ou os eritrócitos foram tratados previamente com as drogas por 60 min. O índice fagocitário foi determinado pela média de eritrócitos parasitados ingeridos por monócito multiplicado pela proporção de monócitos envolvidos na fagocitose. A produção de óxido nítrico foi avaliada pela reação de Griess e a produção de peróxido de hidrogênio foi avaliada pela oxidação do vermelho fenol na presença de peroxidase, sendo os monócitos estimulados pelos eritrócitos parasitados. Os corpúsculos lipídicos foram avaliados pela coloração com Oil Red O. As drogas foram utilizadas in vitro considerando os picos séricos observados quando do tratamento in vivo, sendo 360 ng/mL para o artemeter, 4,9g/mL para a lumefantrina e 687ng/mL para a mefloquina. Quando foi feito o tratamento dos monócitos e dos eritrócitos com o artemeter, observamos diminuição no IF quando avaliado pelos rOps (7,6x 5,2) (p= 0,02). A diminuição da fagocitose foi semelhante quando quantificada para hemozoína (p=0,036). Para a lumefantrina, houve diminuição do IF de 8,4 para 4,6 (p=0,02), quando apenas os monócitos foram tratados e a fagocitose avaliada pelos rPMP. Também houve diminuição do IF para esquizontes pelos rPMP, quando apenas os monócitos foram tratados (p=0,006). Quando os monócitos foram estimulados com os eritrócitos parasitados pelos rPMP, as três drogas diminuíram a expressão de corpúsculos lipídicos (p<0,05). Entretanto, quando os monócitos foram estimulados com os eritrócitos infectados sensibilizados, pelos receptores para opsoninas, houve aumento da expressão dos corpúsculos lipídicos pelo tratamento com a lumefantrina e a mefloquina (p<0,05). O estímulo dos monócitos com os eritrócitos parasitados aumentou a produção de peróxido de hidrogênio (p=0,009). E a mefloquina diminuiu a produção basal de H2O2 pelos monócitos (p<0,05). A diminuição da expressão de corpúsculos lipídicos nos monócitos estimulados com eritrócitos parasitados pelo P. falciparum pelos rPMP e seu aumento pelos rOps indica que a expressão dos corpúsculos lipídicos foi dependente da via pelo qual o monócito foi estimulado pelo eritrócito parasitado. A lumefantrina deprimiu a fagocitose dos eritrócitos parasitados pelos rPMP, enquanto a depressão da fagocitose ocasionada pelo artemeter foi dependente da ingestão do parasito pelos receptores para complemento. Nossos dados mostraram que o artemeter, a lumefantrina e a mefloquina modulam as respostas dos monócitos aos eritrócitos parasitados pelo P. falciparum em aspectos fundamentais relacionados com a defesa inata, nas interações iniciais do parasito com as células de defesa do hospedeiro. Mostrando, portanto, que a ação desses fármacos não depende exclusivamente de sua atividade antiparasitária, mas que o resultado final da ação desses medicamentos depende também da modulação de diversos mecanismos de defesa inato contra o parasito. / Malaria remains a worldwide public health issue, affecting millions of people, especially those living in tropical regions. Statistics confirm the magnitude of this disease, with, approximately, 600 thousand deaths each year. Antimalarial drugs indirectly influence immune response through its capacity to reduce parasite load, reducing the quantity of antigens that are capable of activating immune system. However, the role played by antiplasmodial drugs on defense against Plasmodium is still not well established. Phagocytosis remains one of the main mechanisms of eliminating parasites, especially through production of radical oxygen and nitrogen molecules by monocytes. The lipid body biogenesis is also enhanced in malaria e may be involved in defense and pathophysiology of severe disease. Therefore, the objective of the current study was to evaluate the immunomodulatory effect of arthemeter, lumefantrine and mefloquine drugs in malaria, based on the role of these drugs on phagocytosis of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes, on the production of nitric oxide and hydrogen peroxide and on the biogenesis of lipid bodies. The influence of arthemeter, lumefantrine and mefloquine on phagocytosis by monocytes in healthy individuals was evaluated in vitro using 106 Plasmodium falciparum-infected erythrocytes, through pathogen-associated molecular pattern receptors (PAMPr) or opsonin receptors. Monocytes and/or erythrocytes were previously treated with the drugs for 60 minutes. The phagocitic index was determined by the product of the mean number of parasitized erythrocytes ingested by monocyte and the proportion of monocytes involved in phagocytosis. The production of nitric oxide was evaluated through the Griess reaction, while de hydrogen peroxide production through the red phenol oxidation in presence of peroxidase. Lipid body formation was evaluated by oil red O staining. The drug concentrations used in vitro were obtained by the higher serum levels observed in vivo after ingestion of the drugs, which was 360 ng/mL for arthemeter 4,9 μg/mL for lumefantrine and 687ng/mL for mefloquine. When monocytes and erythrocytes were treated with arthemeter, it was observed a decrease in the phagocitic index when analyzed through opsonin receptors (7,5x5,2) (p=0,02). The reduction in phagocytosis was similar when quantified by hemozoine ingestion (p=0,02). Regarding the lumefantrine treatment, a reduction from 8,4 to 4,6 was observed in the phagocytic index when only monocytes were treated and phagocytosis was assessed through pathogen-associated molecular pattern receptors. An additional reduction was also observed in phagocytic index for esquizonts, through PAMPr when only monocytes were treated (p=0,006). When monocytes were stimulated with parasitized erythrocytes by PAMPr, all three drugs diminished the lipid body formation. However, when monocytes were stimulated with sensitized infected erythrocytes by the opsonin receptors, an increase in lipid body formation was observed when lumefantrine or mefloquine treatment were done (p>0,05). When monocytes were stimulated with Plasmodium falciparum-infected erythrocytes there was an increase in hydrogen peroxide production (p=0,009), whereas mefloquine treatment reduced the basal production of H2O2 by monocytes (p<0,05). Reduction observed in lipid body production after monocyte stimulation with Plasmodium falciparum-infected erythrocytes by PAMPr and its increase when monocyte stimulation occurred by opsonin receptors show that lipid body formation depended on the intracellular pathway by which monocytes were stimulated. Lumefantrine reduced phagocytosis of infected erithrocytes through PAMPr, while reduction caused by arthemeter was observed when phagocytosis occurred by complement receptors. Our dada show that arthemeter, lumefantrine and mefloquine modulate monocyte functions in defense against P. falciparum. Therefore, we conclude that beside the antiparasitic action of these drugs they also modulate the innate defense against parasite.

abstract: The complex life cycle and widespread range of infection of Plasmodium parasites, the causal agent of malaria in humans, makes them the perfect organism for the study of various evolutionary mechanisms. In particular, multigene families are considered one of the main sources for genome adaptability and innovation. Within Plasmodium, numerous species- and clade-specific multigene families have major functions in the development and maintenance of infection. Nonetheless, while the evolutionary mechanisms predominant on many species- and clade-specific multigene families have been previously studied, there are far less studies dedicated to analyzing genus common multigene families (GCMFs). I studied the patterns of natural selection and recombination in 90 GCMFs with diverse numbers of gene gain/loss events. I found that the majority of GCMFs are formed by duplications events that predate speciation of mammal Plasmodium species, with many paralogs being neutrally maintained thereafter. In general, multigene families involved in immune evasion and host cell invasion commonly showed signs of positive selection and species-specific gain/loss events; particularly, on Plasmodium species is the simian and rodent clades. A particular multigene family: the merozoite surface protein-7 (msp7) family, is found in all Plasmodium species and has functions related to the erythrocyte invasion. Within Plasmodium vivax, differences in the number of paralogs in this multigene family has been previously explained, at least in part, as potential adaptations to the human host. To investigate this I studied msp7 orthologs in closely related non-human primate parasites where homology was evident. I also estimated paralogs’ evolutionary history and genetic polymorphism. The emerging patterns where compared with those of Plasmodium falciparum. I found that the evolution of the msp7 multigene family is consistent with a Birth-and-Death model where duplications, pseudogenization and gene lost events are common. In order to study additional aspects in the evolution of Plasmodium, I evaluated the trends of long term and short term evolution and the putative effects of vertebrate- host’s immune pressure of gametocytes across various Plasmodium species. Gametocytes, represent the only sexual stage within the Plasmodium life cycle, and are also the transition stages from the vertebrate to the mosquito vector. I found that, while male and female gametocytes showed different levels of immunogenicity, signs of positive selection were not entirely related to the location and presence of immune epitope regions. Overall, these studies further highlight the complex evolutionary patterns observed in Plasmodium. / Dissertation/Thesis / Doctoral Dissertation Biology 2016