Τα τελευταία χρόνια μια πληθώρα ερευνητικών εργασιών συσχετίζει την παραγωγή των δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS) με ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες. Στο επίπεδο του κυττάρου, η παραγωγή ROS δύναται να προκληθεί τόσο υπό την επίδραση φυσιολογικών ερεθισμάτων (όπως ορμόνες και κυτταροκίνες) όσο και από εξωγενείς παράγοντες (όπως μικροοργανισμοί και ακτινοβολία). Η αυξημένη παραγωγή ROS ενέχεται στην παθογένεση διαφόρων ασθενειών, όπως του καρκίνου, της αθηροσκλήρωσης και της ρευματοειδούς αρθρίτιδας. Αν και σε υψηλές συγκεντρώσεις οι ROS καθίστανται κυτταροτοξικές, σε χαμηλά επίπεδα φαίνεται να δρουν ως ειδικά μόρια που συμμετέχουν στη μεταγωγή σήματος. Ανάμεσα στις ROS, ιδιαίτερο ενδιαφέρον προσελκύει το Η2Ο2, το οποίο λόγω της σχετικής σταθερότητας, της έλλειψης πολικότητας και του μικρού μοριακού μεγέθους, είναι ιδανικός υποψήφιος μεσολαβητής στη μεταγωγή σήματος στο εσωτερικό των κυττάρων. Η heparin affin regulatory peptide (HARP) είναι αυξητικός παράγοντας με σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου και στην αγγειογένεση. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση του Η2Ο2 στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων προστάτη LNCaP και των ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβα ομφάλιου λώρου (HUVEC), καθώς και στην αγγειογένεση in vivo στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης (CAM) εμβρύου όρνιθας. Μελετήθηκε επίσης η πιθανή εμπλοκή της HARP στη δράση του Η2Ο2. Βρέθηκε ότι εξωγενώς χορηγούμενο Η2Ο2 επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC και την αγγειογένεση in vivo στην CAM εμβρύου όρνιθας. Επιπρόσθετα, το Η2Ο2 αύξησε τα επίπεδα της πρωτεΐνης HARP in vitro και in vivo. Το U0126 και η κουρκουμίνη ανέστειλαν τόσο την αύξηση των επιπέδων της πρωτεΐνης HARP, όσο και τον πολλαπλασιασμό των HUVEC που επάγονται από το Η2Ο2. Σε συμφωνία με τα παραπάνω, βρέθηκε ότι το Η2Ο2 επάγει τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων LNCaP. Επιπλέον, προκάλεσε αύξηση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης HARP, με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση και το χρόνο. Η HARP φαίνεται να μεσολαβεί στις δράσεις του Η2Ο2, καθώς σε κύτταρα LNCaP στα οποία έχει κατασταλεί η έκφρασή της δεν εκδηλώθηκαν οι διεγερτικές δράσεις του Η2Ο2. Η κουρκουμίνη και ολιγονουκλεοτίδια-δολώματα έναντι του AP-1 ανέστειλαν τόσο την έκφραση της HARP, όσο και τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων LNCaP που επάγονται από το Η2Ο2. Μετά από εισαγωγή της ρυθμιστικής περιοχής του γονιδίου της HARP σε πλασμιδιακό φορέα ανοδικά γονιδίου αναφοράς, το Η2Ο2 αύξησε με χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο τη δραστηριότητα του υποκινητή του συγκεκριμένου γονιδίου. Η επαγωγική αυτή δράση ανεστάλη όταν εισήχθησαν σημειακές μεταλλαγές σε τουλάχιστον μία από τις δύο πιθανές αλληλουχίες δέσμευσης του AP-1. Η επίδραση του Η2Ο2 φαίνεται να οφείλεται στη δέσμευση των Fra-1, JunD και της ενεργού μορφής της c-Jun στη ρυθμιστική περιοχή του γονιδίου της HARP. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία ενισχύεται η άποψη ότι η HARP διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων. Επίσης, προτείνεται ότι το γονίδιο της HARP παρουσιάζει ευαισθησία σε μεταβολές της οξειδωτικής κατάστασης του κυττάρου, καθώς η έκφρασή της επάγεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις Η2Ο2. Τέλος, αναδεικνύεται η εμπλοκή συγκεκριμένων συμπλόκων του AP-1 στη ρύθμιση της μεταγραφικής δραστηριότητας του γονιδίου της HARP και των επακόλουθων βιολογικών δράσεων σε απόκριση στο Η2Ο2. / A growing body of evidence correlates the production of Reactive Oxygen Species (ROS) with many aspects of cell functions. Cellular ROS production can be augmented by the action of hormones, cytokines, and other physiological stimuli and also by external factors, such as xenobiotics or irradiation. Increased ROS production has been implicated in the pathogenesis of several diseases, such as cancer, atherosclerosis, rheumatoid arthritis and ischemia/reperfusion injury. Although ROS may be cytotoxic when produced in excess, at moderate levels they may act as specific signalling molecules. Among different ROS, H2O2 possesses the properties of relative stability, neutrality and small size, which make it an ideal candidate for a signalling molecule. Heparin affin regulatory peptide (HARP) is a mitogenic and angiogenic growth factor and plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. In the present study we found that exogenous H2O2 significantly induced human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) proliferation and migration, and angiogenesis in the in vivo chorioallantoic membrane assay. In addition, it increased HARP protein amounts in vitro and in vivo. U0126 and curcumin abrogated both H2O2-induced HARP protein amounts increment and HUVEC proliferation. In the same line, exogenous H2O2 significantly induced human prostate cancer LNCaP cell proliferation and migration. Moreover, H2O2 significantly increased HARP mRNA and protein amounts in a concentration- and time-dependent manner. HARP seems to be involved in the stimulatory effect of H2O2, since the latter had no effect on stably transfected LNCaP cells that did not express HARP. Curcumin and AP-1 decoy oligonucleotides abrogated both H2O2-induced HARP expression and LNCaP cell proliferation and migration. H2O2 increased luciferase activity of the 5’-flanking region of the HARP gene introduced in a reporter gene vector, an effect that was abolished when even one of the two putative AP-1 binding sites of the HARP promoter was mutated. The effect of H2O2 seems to be due to binding of Fra-1, JunD and phospho-c-Jun to the HARP promoter. In conclusion, H2O2 up-regulates HARP expression through the induction of specific AP-1 dimers, leading to increased cell proliferation and migration.

Η ΒΥΠ διαθέτει αντίτυπο της διατριβής σε έντυπη μορφή στο βιβλιοστάσιο διδακτορικών διατριβών που βρίσκεται στο ισόγειο του κτιρίου της. / Τα κακοήθη γλοιώματα συνιστούν τον πιο κοινό τύπο καρκίνου του κεντρικού νευρικού συστήματος στους ενήλικες και χαρακτηρίζονται από υψηλό βαθμό αγγειογένεσης και διήθησης στον παρακείμενο φυσιολογικό ιστό. Αν και οι θεραπευτικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία, ποσοστό μεγαλύτερο του 90% των ασθενών εμφανίζουν υποτροπή της νόσου και η συνολική επιβίωση είναι εξαιρετικά χαμηλή. Τα παραπάνω γεγονότα εντείνουν την ανάγκη για την εφαρμογή πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών σχημάτων, καθώς και την ανακάλυψη νέων μορίων-στόχων για τη θεραπεία του συγκεκριμένου τύπου καρκίνου. Η HARP είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας με μοριακό βάρος 18 kDa που έχει ισχυρή συγγένεια με την ηπαρίνη. Η HARP εκφράζεται κυρίως κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη και απομονώθηκε για πρώτη φορά ως πρωτεΐνη που προάγει την επέκταση των νευριτών στον αναπτυσσόμενο εγκέφαλο. Στην HARP έχει αποδοθεί ένας σημαντικός αριθμός βιολογικών δράσεων, όπως η συμμετοχή της στον πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στη διαφοροποίηση των κυττάρων, στο σχηματισμό οστών, στη χονδρογένεση, στη σπερματογένεση, στην ογκογένεση και στην αγγειογένεση. Η HARP εκφράζεται σε διάφορες καρκινικές σειρές από μηνιγγίωμα, νευροβλάστωμα, αστροκυττάρωμα, μελάνωμα, μικροκυτταρικό τύπο καρκίνου του πνεύμονα και γλοιοβλάστωμα. Κλινικές μελέτες έχουν αναφέρει αυξημένα επίπεδα της HARP στον ορό αίματος ασθενών με καρκίνο του κόλον του εντέρου, με καρκίνο του παγκρέατος και με καρκίνο του μαστού. Στην παρούσα μελέτη, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε το ρόλο της HARP στην ανάπτυξη όγκου και στην αγγειογένεση που προκαλούν τα κύτταρα C6, μετασχηματίζοντας τα κύτταρα αυτά με την αντινοηματική αλληλουχία για το cDNA της HARP και καταστέλλοντας την έκφρασή της στα κύτταρα C6. Μείωση της ενδογενούς έκφρασης της πρωτεΐνης της HARP στα κύτταρα C6 (κύτταρα AS-C6) προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό, στην ανάπτυξη των κυττάρων σε τρισδιάστατο περιβάλλον και στη μετανάστευση. Όταν κύτταρα AS-C6 εμβολιάστηκαν σε χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη εμβρύου όρνιθας, οδήγησαν σε σημαντική αύξηση της καρκινικής αγγειογένεσης, σε σύγκριση με τις μεμβράνες που είχαν εμβολιαστεί με μη μετασχηματισμένα κύτταρα C6 ή με κύτταρα C6 που είχαν μετασχηματιστεί μόνο με το πλασμίδιο-φορέα (κύτταρα ΡC-C6). Με παρόμοιο τρόπο, θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων AS-C6 προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση στον πολλαπλασιασμό, στη μετανάστευση και στο σχηματισμό ψευδαγγείων των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro σε σύγκριση με την επίδραση του θρεπτικού μέσου καλλιέργειας των κυττάρων C6 και ΡC-C6. Η έκφραση της HARP φαίνεται να είναι απαραίτητη για την ανασταλτική δράση αυξημένων ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων C6 και αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων cAMP οδήγησε σε αύξηση της έκφρασης και έκκρισης HARP, πιθανά μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1. Τέλος, παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση των επιπέδων του mRNA και της πρωτεΐνης του αυξητικού παράγοντα των ενδοθηλιακών κυττάρων (vascular endothelial growth factor, VEGF) σε καλλιέργειες των κυττάρων AS-C6 σε σχέση με τα κύτταρα C6 και PC-C6. H HARP βρέθηκε να συν-ανοσοκατακρημνίζεται με τον VEGF σε θρεπτικό μέσο καλλιέργειας των κυττάρων C6 και pC-C6, το οποίο υποδηλώνει μια άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ των δύο αυτών αυξητικών παραγόντων. Συνοψίζοντας, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας προτείνουν ότι ο αυξητικός παράγοντας HARP έχει αρνητικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξη όγκου και της αγγειογένεση που επάγουν τα κύτταρα C6, πιθανά ρυθμίζοντας την έκφραση ή/και τη διαθεσιμότητα άλλων αυξητικών παραγόντων. / Malignant gliomas, the most common type of brain tumors in adults, present a remarkable degree of neovascularisation and invasiveness into surrounding tissues. Although combinations of surgery, radiotherapy and chemotherapy are used, more than 90% of the patients experience local recurrence and their survival is extremely low. These facts stress the need for more effective therapeutic strategies and new targets for tumour therapy. Heparin affin regulatory peptide (HARP), also known as pleiotrophin or heparin-binding growth-associated molecule, is an 18-kDa secreted growth factor that has high affinity for heparin. HARP is mainly expressed during embryonic development, in early postnatal rat and bovine brain and was first isolated as a major neurite outgrowth-promoting protein of developing brain. Since then, a number of biological activities have been well established for HARP, such as its role in cellular proliferation, migration and differentiation and its involvement in bone formation, chondrogenesis, spermatogenesis, tumor growth and angiogenesis. HARP is expressed in various cancer cell lines, derived from meningiomas, neuroblastomas, astrocytomas, melanomas, small cell lung cancer (SCLC) cell lines and glioblastomas. Clinical studies have shown elevated serum levels and tumor expression of HARP in patients with colon, stomach, pancreatic and breast cancer. Ιn the present study, we tried to elucidate the role of HARP in the growth and angiogenicity of C6 glioma cells by using an antisense strategy for inhibition of HARP expression in rat C6 glioma cells. Decrease of the expression of endogenous HARP protein in C6 cells (AS-C6 cells) significantly increased proliferation rate and anchorage-independent growth of cells. Implantation of AS-C6 cells onto chicken embryo chorioallantoic membranes resulted in a significant increase of tumor-induced angiogenesis, compared with those induced by non transfected or C6 cells transfected with the plasmid alone (PC-C6 cells). In the same line, conditioned medium from AS-C6 cells significantly increased endothelial cell proliferation, migration and tube formation in vitro compared with the effect of C6 or PC-C6 cells. HARP expression is required for cAMP-induced inhibition of C6 cell proliferation and migration and cAMP increased the expression and secretion of HARP by C6 cells, possibly through activation of Activator Protein 1. Finally, a significant increase in vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA and protein levels were observed in cultures of AS-C6 cells compared with C6 or PC-C6 cells. HARP was co-immunoprecipitated with VEGF from the conditioned medium of C6 and PC-C6 cells, which indicates a direct interaction between the two factors. Collectively, these data suggest that HARP negatively regulates tumor growth and angiogenesis induced by C6, possibly through regulation of the expression or/and activation of other growth factors.

Η παρούσα εργασία αφορά στην ρύθμιση της έφρασης και έκκρισης της πλειοτροπίνης απο ανθρώπινα ενδοθηλιακά και κύτταρα γλοιοβλαστώματος. Γενικά, οι βιβλιογραφικές αναφορές σχετικά με τη ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου της πλειοτροπίνης είναι πολύ λίγες, παρόλο που είναι ένα μόριο το οποίο φαίνεται να συμμετέχει στην αγγειογένεση και την ανάπτυξη πολλών τύπων όγκων. Μελετήθηκε η επίδραση παραγόντων που προάγουν της αγγειογένεση όπως, το μονοξείδιο του αζώτου, ο ορός και υποξία με σκοπό την διαλεύκανση του μονοπατιού ρύθμισης της ανάπτυξης των γλοιοβλαστωμάτων, το οποίο αν αξιοποιηθεί θεραπευτικά, ίσως να οδηγήσει σε καλύτερα θεραπευτικά αποτελέσματα. / In this study we examined the regulation of the expression and secretion of pleiotrophin from human endothelial and glioblastoma cells. Although pleiotrophin is a growth factor proved to promote angiogenesis and tumor growth, yet few things are known about its transcriptional regulation. In this work we studied the effect of factors that promote angiogenesis like nitric oxide, serum and hypoxia in order to elucidate the involved pathway.

Ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN), γνωστός και ως HARP (Heparin-Affin Regulatory Peptide), έχει μοριακή μάζα 18 kDa και ανήκει σε μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη και σχετίζονται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε την επίδραση εξωγενώς χορηγούμενης PTN στην παραγωγή Η2Ο2 ενδοκυτταρικά, σε δύο τύπους ανθρώπινων κυττάρων, ενδοθηλιακά από φλέβα ομφάλιου λώρου (HUVEC) και καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP. Η ΡΤΝ επάγει με δοσο-εξαρτώμενο και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο την παραγωγή του Η2Ο2 και στους δύο τύπους κυττάρων. Προεπώαση των κυττάρων με apocynin, που θεωρείται εκλεκτικός αναστολέας του ενζυμικού συστήματος της NADPH οξειδάσης, οδήγησε σε πλήρη αναστολή της επαγόμενης από ΡΤΝ αύξησης του ενδοκυτταρικού Η2Ο2 και κυτταρικής μετανάστευσης. Ο υποδοχέας RPTPβ/ζ, ο οποίος εμπλέκεται στην επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση των HUVEC, φαίνεται να εμπλέκεται και στην επαγόμενη από ΡΤΝ αύξηση των ενδοκυτταρικών επιπέδων Η2Ο2, αφού μείωση της έκφρασης ή της ενεργότητας του RPTPβ/ζ στα κύτταρα HUVEC και LNCaP είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από την PTN ενδοκυτταρικής παραγωγής Η2Ο2. Η κινάση Src, η οποία αλληλεπιδρά και ενεργοποιείται από δέσμευση της ΡΤΝ στον RPTPβ/ζ, εμπλέκεται στην παραγωγή Η2Ο2 που επάγεται από την PΤΝ και στους δύο υπό μελέτη τύπους κυττάρων, αφού αναστολή της από τον εκλεκτικό αναστολέα ΡΡ1 είχε ως αποτέλεσμα την αναστολή της επαγόμενης από την PTN ενδοκυτταρικής παραγωγής Η2Ο2. Με σκοπό να αξιολογηθεί ο ρόλος της ενδογενούς ΡΤΝ στα ενδοκυτταρικά επίπεδα Η2Ο2 χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα LNCaP που είχαν μετασχηματιστεί σταθερά με την αντινοηματική αλληλουχία του γονιδίου της ΡΤΝ και εκφράζουν μειωμένα επίπεδα ΡΤΝ (AS-LNCaP) ή κύτταρα που είχαν μετασχηματιστεί σταθερά μόνο με το πλασμίδιο φορέα (PC-LNCaP). Επιπλέον, δημιουργήθηκαν και χαρακτηρίστηκαν σταθερά μετασχηματισμένα ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα PC3, τα οποία εκφράζουν την αντινοηματική αλληλουχία του γονιδίου της ΡΤΝ και εκφράζουν μειωμένα επίπεδα ΡΤΝ (AS-PC3),τροποποιημένη μορφή της ΡΤΝ από την οποία λείπουν 26 αμινοξέα από το καρβοξυτελικό της άκρο (ΗΔ-PC3), ή μόνο το πλασμίδιο φορέα (PC-PC3). Παρατηρήθηκε ότι μειωμένα επίπεδα έκφρασης PTN ή υπερέκφραση της τροποποιημένης μορφής της χωρίς το καρβοξυτελικό άκρο σχετίζεται με μειωμένη μεταναστευτική ικανότητα και στους δύο τύπους κυττάρων. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ότι η πλειοτροπίνη μέσω του υποδοχέα της RPTPβ/ζ και της κινάσης src επάγει την παραγωγή Η2Ο2 σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά και καρκινικά κύτταρα προστάτη, γεγονός που φαίνεται να εμπλέκεται με επαγωγή της μετανάστευσης των κυττάρων. / Pleiotrophin (PTN), also called heparin affin regulatory peptide or heparin-binding growth associated molecule, is an 18 kDa secreted growth factor that displays high affinity for heparin. A growing body of evidence indicates that PTN is involved in cell proliferation, migration and differentiation. In the present work, we studied the effect of exogenous administration of PTN on the generation of hydrogen peroxide (HP) by two types of human cells, umbilical vein endothelial (HUVEC) and prostate cancer LNCaP cells. Human recombinant PTN significantly increased the production of HP in a concentration and time dependent manner. The PTN induced production of HP was blocked by the NADP(H) oxidase inhibitor apocynin, suggesting that superoxide is probably the initial ROS produced by PTN, rapidly dismutating to HP. In addition, apocynin completely abolished the stimulatory effect of PTN in migration of both HUVEC and LNCaP cells. Receptor protein-tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ), which has been implicated in PTN-induced migration, seems to be also involved in PTN-induced HP generation, since suppression of the receptor using genetic and pharmacological inhibitors or inhibition of src kinase activity abolished PTN induced HP levels. Finally, stably transfected human prostate cancer LNCaP and PC3 cells that express reduced amounts of PTN or over-express a truncated form of PTN missing 25 aminoacids from its carboxyl terminus, considered as dominant negative for tumor growth, have reduced amounts of intracellular HP and decreased migration capability, compared with the corresponding cells that are non transfected or are transfected only with the carrier plasmid. Collectively, these results suggest a role of HP in the PTN/RPTPβ/ζ signaling pathway that leads to cell migration in both human endothelial and prostate cancer cell lines.

Τα ρετινοειδή αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια οργανικών μορίων που μοιάζουν δομικά με τη βιταμίνη Α. Το all-trans ρετινοϊκό οξύ (atRA) συμμετέχει σε μεγάλο εύρος βιολογικών διεργασιών μέσω της πρόσδεσής του και της ενεργοποίησης των υποδοχέων του, τους υποδοχείς ρετινοϊκού οξέος (RAR) και τους υποδοχείς ρειτινοειδών Χ (RXR). Κάθε κατηγορία υποδοχέων περιλαμβάνει τρία μέλη, α, β και γ. Τα ρετινοειδή χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία πολλών ασθενειών, από την κοινή ακμή ως την οξεία προμυελωτική λευχαιμία. Λόγω των σοβαρών ανεπιθύμητων ενεργειών τους, γίνεται προσπάθεια να συντεθούν ανάλογα με λιγότερες ανεπιθύμητες δράσεις ή/και καλύτερη αποτελεσματικότητα. Προς αυτήν την κατεύθυνση έχουν συντεθεί πολλά ανάλογα, ανάμεσα τους και αυτά που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία: RA2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων atRA με σπερμίνη), ACI2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων ασιτρετίνης με σπερμίνη), TRX2SPM (ένα σύζευγμα δύο μορίων τριοξαλενίου με σπερμίνη), ACI-SPM-TRX (σύζευγμα ασιτρετίνης και τριοξαλενίου με σπερμίνη), RA-SPM-ACI (σύζευγμα atRA και τριοξαλενίου με σπερμίνη). Τα ανάλογα αυτά συντέθηκαν από την ερευνητική ομάδα του καθηγητή Δ. Παπαϊωάννου, στο Τμήμα Χημείας του Πανεπιστημίου Πατρών. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση των αναλόγων αυτών στην ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3 in vitro και έγινε μια αρχική διερεύνηση του μηχανισμού δράσης και της πιθανής εμπλοκής των υποδοχέων ρετινοειδών. Ως πρότυπη ένωση με την οποία συγκρίθηκαν όλες οι άλλες ενώσεις χρησιμοποιήθηκε το ανάλογο RA2SPM, Το ανάλογο ACI2SPM έχει την καλύτερη δράση σε σύγκριση με τα άλλα ανάλογα, αφού προκάλεσε δοσο-εξαρτώμενη μείωση του αριθμού των κυττάρων PC3 σε ποσοστό παρόμοιο με τη δράση του RA2SPM και είναι πιο δραστικό στη συγκέντρωση 10-6Μ σε σχέση με τα άλλα ανάλογα. Αυτή η δράση φαίνεται να σχετίζεται με αύξηση των επιπέδων του mRNA του ογκοκατασταλτικού γονιδίου RARβ, που όμως είναι μικρότερη από αυτήν που προκαλεί το ανάλογο RA2SPM. Ο εκλεκτικός ανταγωνιστής του RARα, Ro-41-5253, βρέθηκε ότι επίσης προκαλεί αύξηση των επιπέδων του mRNA του RARβ, ενώ δεν επηρεάζει τη δράση του ACI2SPM. Επιπλέον, το ανάλογο ACI2SPM μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης πλειοτροπίνης (PTN), η οποία είναι γνωστό πως παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3. Η μείωση είναι μικρότερη από αυτήν που προκαλεί το ανάλογο RA2SPM και δεν επηρεάζεται από τον ανταγωνιστή Ro 41-5253, ο οποίος έχει από μόνος του ανασταλτική δράση. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδεικνύουν ότι το ανάλογο ACI2SPM είναι αποτελεσματικό στη μείωση του αριθμού των καρκινικών κυττάρων προστάτη PC3 και στη μείωση των επιπέδων της (PTN), αλλά η δράση του είναι μικρότερη από αυτήν του RA2SPM. Επίσης, καταδεικνύουν ότι ο εκλεκτικός αναστολέας του RARα Ro-41-5253, όπως έχει αναφερθεί ξανά στη διεθνή βιβλιογραφία, παρουσιάζει προβλήματα εκλεκτικότητας και πρέπει να χρησιμοποιείται με προσοχή. / Retinoids constitute a large family of organic compounds structurally related to the naturally occurring vitamin A. All-trans-retinoic acid (atRA) is known to modulate a wide range of cellular biological processes through binding to and activation of its specific receptors, retinoic acid receptors (RAR) and retinoid X receptors α, β and γ. Retinoids are being used for the treatment of various diseases, ranging from acne vulgaris to acute promyelocytic leukemia. However, due to serious adverse effects, there has been a great effort to synthesize analogues with better efficacy or/and minimized adverse effects. Towards this direction, many analogues have been synthesized, among which those that have been used in the present work: RA2SPM (a conjugate of all-trans retinoic acid with spermine), ACI2SPM (a conjugate of 2 molecules of acitretin with spermine), TRX2SPM (a conjugate of 2 molecules of trioxalen with spermine), ACI-SPM-TRX (a conjugate of trioxalen and acitretin with spermine), RA-SPM-ACI (a conjugate of all-trans retinoic acid and acitretin with spermine). These analogues have been synthesized by the research group of Prof. D. Papaioannou at the Department of Chemistry of the University of Patras. The present work represents an initial investigation of the in vitro effects of these analogues on prostate cancer cell growth (PC3), as well as of their mechanism of action and the possible involvement of retinoid receptors. The analogue RA2SPM was used as a reference control. The analogue ACI2SPM decreased the number of prostate cancer PC3 cells in a concentration-dependent manner, being as effective as RA2SPM and more effective compared with the rest of the tested analogues. This effect seems to correlate with an increase of the mRNA levels of the RARβ tumour repressor gene; however, the RARβ tumour repressor mRNA levels decrease is smaller than that observed with RA2SPM. The RARa selective antagonist Ro 41-5253 also increases the RARβ mRNA levels, while it does not affect the ACI2SP-induced increase. Furthermore, the ACI2SPM analogue was found to decrease the protein levels of the growth factor pleiotrophin (PTN), which is known to play an important role in the growth of the prostate cancer cell line PC3. Similarly to the effect on RARβ, the decrease of the PTN levels achieved by ACI2SPM is smaller than the one achieved by RA2SPM and is unaffected by the antagonist Ro 41-5253. Ro 41-5253 decreased PTN levels by itself, supporting the increasing notion that it should be used with caution as a RARα antagonist. In conclusion, the results of this work suggest that the ACI2SPM analogue is efficient in decreasing the prostate cancer PC3 cell numbers and PTN protein levels but seems to be less effective than RA2SPM action. More work is required in order to define the mechanism(s) of action of the tested analogues, as well as to better specify their effectiveness and toxicity.

No description available.

Η πλειοτροπίνη (PTN) αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη όγκων και την αγγειογένεση. Διάφοροι υποδοχείς αλληλεπιδρούν με την ΡΤΝ και διαμεσολαβούν τις βιολογικές της δράσεις, όπως η Ν-συνδεκάνη, ο ALK (κινάση αναπλαστικού λεμφώματος) και ο RPTPβ/ζ (υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ). Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η ικανότητα της PTN να επάγει κυτταρική μετανάστευση εξαρτάται από το σχηματισμό ενός λειτουργικού συμπλόκου που αποτελείται από τον RPTPβ/ζ και την ιντεγκρίνη ανβ3. Η πολυ-λειτουργική πρωτεΐνη νουκλεολίνη (NCL), η οποία υπερεκφράζεται στην επιφάνεια ενεργοποιημένων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων και διαμεσολαβεί τις διεγερτικές δράσεις διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων, έχει επίσης προταθεί ως υποδοχέας χαμηλής συγγένειας για την ΡΤΝ, με άγνωστες όμως λειτουργίες. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε, με τη χρήση μεθόδων ανοσοκατακρήμνισης-ανοσοαποτυπώματος, διπλού ανοσοφθορισμού και προσδιορισμού αλληλεπίδρασης λόγω εγγύτητας, ότι η PTN αλληλεπιδρά άμεσα με τη NCL. Η αλληλεπίδραση αυτή περιλαμβάνει πρόσδεση της αμινοτελικής περιοχής της ΡΤΝ (αμινοξέα: 16-24) στην κεντρική περιοχή της NCL (αμινοξέα: 308-645). Μείωση της έκφρασης της NCL με siRNA ή λειτουργική αναστολή της μεμβρανικής NCL από το πεπτίδιο 5(KPR)TASP ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων. Με αφετηρία την παρατήρηση ότι ο εντοπισμός της NCL στην κυτταρική επιφάνεια ανιχνεύθηκε μόνο σε κύτταρα που εκφράζουν την ανβ3, και πραγματοποιώντας πειράματα ανοσοφθορισμού και βιοχημικές μελέτες σε κύτταρα με γενετικά τροποποιημένη έκφραση των υπό μελέτη μορίων, δείξαμε ότι ο εντοπισμός της NCL στην πλασματική μεμβράνη εξαρτάται από τη φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της c-src. Καθοδικά της ανβ3, η PI3K συμμετέχει σε αυτή τη δράση. Ο VEGF165 που επίσης επάγει το μεμβρανικό εντοπισμό της NCL, δρα μέσω δέσμευσης στον RPTPβ/ζ και ενεργοποίησης του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3. Η περιοχή δέσμευσης στους υποδοχείς VEGFR-1 και VEGFR-2 ή η περιοχή δέσμευσης στην ηπαρίνη στο μόριο του VEGF165 δεν εμπλέκονται στον επαγόμενο από VEGF165 εντοπισμό της NCL στην κυτταρική μεμβράνη. Εκτός από την PI3K, στη δράση του VEGF165 καθοδικά της ανβ3 εμπλέκεται και η κινάση p38, η ενεργοποίηση της οποίας είναι ανεξάρτητη από τον RPTPβ/ζ και τη φωσφορυλίωση της β3 στις τυροσίνες 773 ή 785, και φαίνεται να ανήκει σε μονοπάτι που ενεργοποιείται παράλληλα και που παραμένει αδιευκρίνιστο. Μηχανιστικά, η NCL βρέθηκε να αλληλεπιδρά άμεσα με την ανβ3, τον RPTPβ/ζ, τον VEGF165 και τον VEGFR-2, αλλά επηρεάζει τον ενδοκυτταρικό εντοπισμό μόνο του RPTPβ/ζ και της PTN. Θετική συσχέτιση παρατηρήθηκε ως προς την έκφραση της μεμβρανικής NCL και της ανβ3 σε μικροσυστοιχίες ιστών προερχόμενων από ανθρώπινα γλοιοβλαστώματα. Τέλος, βρέθηκε ότι το μονοκλωνικό αντίσωμα anti-C23 και τα πεπτίδια που στοχεύουν τη μεμβρανική NCL, 5(KPR)TASP, ΗΒ-19 και Nucant 6L, ανέστειλλαν σημαντικά τη μετανάστευση κυττάρων που εκφράζουν ανβ3, ενώ είχαν μικρή ή καθόλου δράση στη μετανάστευση κυττάρων που δεν εκφράζουν ανβ3 ή υπερεκφράζουν μετάλλαγμα της β3 με αντικατάσταση της κυτταροπλασματικής τυροσίνης 773 σε φαινυλαλανίνη. Συνολικά, από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής προκύπτει ότι η έκφραση της ανβ3 και η φωσφορυλίωση της β3 στην τυροσίνη 773 καθορίζουν τον εντοπισμό της NCL στην κυτταρική επιφάνεια, καθοδικά του σηματοδοτικού μονοπατιού RPTPβ/ζ/c-src που συμμετέχει στην κυτταρική μετανάστευση που επάγεται τόσο από την ΡΤΝ, όσο και από τον VEGF165. Επίσης, φαίνεται ότι η έκφραση της ανβ3 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιοδείκτης για τη χρήση ανταγωνιστών της μεμβρανικής NCL ως αντικαρκινικών παραγόντων. / Pleiotrophin (PTN) is a growth factor that plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Several receptors interact with PTN and mediate its biological actions, such as N-syndecan, anaplastic lymphoma kinase (ALK) and receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ). Our group has previously shown that the ability of PTN to stimulate migratory responses depends on the formation of a functional complex consisting of RPTPβ/ζ and integrin ανβ3. The multifunctional protein nucleolin (NCL), which is over-expressed on the surface of activated endothelial and tumor cells and mediates the stimulatory actions of several angiogenic factors, has been also suggested as a low affinity receptor for PTN, however with unknown functions. In the present study, by using immunoprecipitation/Western blot analyses, double immunofluorescence and proximity ligation assays, we showed that PTN directly interacts with NCL. This interaction involves binding of the amino-terminal domain of PTN (amino acids: 16-24) to the central domain of NCL (amino acids: 308-645). Down-regulation of NCL by siRNA or blockage of cell surface NCL by its ligand 5(KPR)TASP completely abolished PTN-induced endothelial cell migration. Based on the observation that cell surface NCL localization was detected only in cells expressing ανβ3 and by performing immunofluorescence and biochemical studies in cells with genetically altered expression of the studied molecules, we demonstrated that cell surface NCL localization depends on the phosphorylation of β3 at Tyr773 through RPTPβ/ζ and c-src activation. Down-stream of ανβ3, PI3K activity is required for cell surface NCL localization. VEGF165 that also induces cell surface NCL localization acts through binding to RPTPβ/ζ and activation of the RPTPβ/ζ/c-src/ανβ3 signaling pathway. The receptor or the heparin binding sites on the VEGF165 molecule do not seem to be involved in this VEGF165 action. Apart from PI3K, in VEGF165-induced cell surface NCL localization, p38 that lays down-stream of ανβ3, is also involved. Activation of p38 is independent of RPTPβ/ζ and β3 Tyr773 or Tyr785 phosphorylation, and seems to belong to a parallel signaling pathway that remains unclear. Mechanistically, NCL was found to directly interact with ανβ3, RPTPβ/ζ, VEGF165 and VEGFR-2, but only affects the intracellular localization of RPTPβ/ζ and PTN. Positive correlation of cell surface NCL and ανβ3 expression was observed in human glioblastoma tissue arrays. Finally, the monoclonal antibody anti-C23 and the peptides targeting cell surface NCL, 5(KPR)TASP, HB-19 and Nucant 6L, significantly inhibited migration of cells expressing ανβ3 in the presence of serum, while they had a minor or no effect on cells lacking ανβ3 or over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosine 773 to phenylalanine. Collectively, these data suggest that ανβ3 expression and β3 phosphorylation at Tyr773 downstream of the RPTPβ/ζ/c-src signaling cascade determines the cell surface localization of NCL, which is required for cell migration induced by both PTN and VEGF165. Moreover, expression of ανβ3 could be used as a biomarker for the use of cell surface NCL antagonists as anticancer agents.

Τα πυρρολοκαρβαζολικά ανάλογα του ινδολοκαρβαζολικού αρωματικού σκελετού φυσικών προϊόντων είναι μία νέα τάξη ενώσεων που εξετάζονται ως πιθανά αντικαρκινικά φάρμακα. Διακρίνονται σε αναστολείς πρωτεϊνικών κινασών και σε παράγοντες που δρουν στη DNA τοποϊσομεράση Ι ή ΙΙ και βλάπτουν το DNA, ανάλογα με το μηχανισμό δράσης τους και τη δομή τους. Μελετώντας την επίδραση επτά πυρρολο[2,3-α]καρβαζολικών αναλόγων στην ενεργότητα της κυκλινο-εξαρτώμενης κινάσης 1 (cyclin dependent kinase 1, CDK1) βρήκαμε ότι μόνο ένα από τα ανάλογα (1e) ανέστειλε πλήρως και με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο το ένζυμο, ενώ όλα αναστέλλουν μερικώς ή πλήρως την ενεργότητα της τοποϊσομεράσης Ι in vitro. Στηn παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση των ίδιων αναλόγων στον πολλαπλασιασμό και μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και στην αγγειογένεση in vivo, στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας. Διαπιστώθηκε ότι όλα τα ανάλογα αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro, καθώς και την αγγειογένεση in vivo, αλλά διαφέρουν ως προς την αποτελεσματικότητα ή την ισχύ. Από προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας είναι γνωστό ότι ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (PTN) επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων in vitrο, δρώντας μέσω του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης RPTPβ/ζ και της ιντεγκρίνης ανβ3. Με δεδομένο ότι στη βιβλιογραφία η CDK1 έχει αναφερθεί να συμμετέχει στην επαγόμενη από ενεργοποίηση της ανβ3 μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μελετήσαμε την επίδραση των πυρρολο[2,3-α]καρβαζολικών αναλόγων στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Μόνο το ανάλογο 1e ανέστειλε τη δράση της ΡΤΝ, τόσο στα ενδοθηλιακά, όσο και στα ανθρώπινα κύτταρα γλοιοβλαστώματος U87MG, τα οποία εκφράζουν RPTPβ/ζ και ιντεγκρίνη ανβ3 και μεταναστεύουν ως ανταπόκριση στη διέγερση με ΡΤΝ. Ίδια δράση είχε και η ροσκοβιτίνη, γνωστός αναστολέας των CDK1/2 και CDK5 και στα δύο είδη κυττάρων, ενώ ο εκλεκτικός μόνο για CDK1/2 αναστολέας NU2058 δεν είχε καμία δράση στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων δεν εξαρτάται από τις κινάσες CDK1 και CDK2, αλλά από την κινάση CDK5, δεδομένο που επιβεβαιώθηκε με μείωση της έκφρασης της CDK5 με την τεχνική του siRNA. Η ΡΤΝ δρα επαγωγικά στην ενεργότητα της CDK5, με μέγιστη δράση 5 λεπτά μετά την επίδραση της ΡΤΝ. Σε αυτήν την ενεργοποίηση συμμετέχει και ο υποδοχέας της ΡΤΝ RPTPβ/ζ, αλλά όχι η ιντεγκρίνη ανβ3. Από παλιότερες μελέτες μας είναι δεδομένο πως η πρόσδεση της ΡΤΝ στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ οδηγεί σε ενεργοποίηση της κινάσης c-SRC, η οποία απαιτείται για την επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση. Για πρώτη φορά αναφέρουμε την αλληλεπίδραση της c-SRC με την CDK5 σε εκχυλίσματα ενδοθηλιακών κυττάρων, καθώς και το ότι η επαγόμενη από ΡΤΝ ενεργοποίηση της κινάσης CDK5 επιτυγχάνεται μέσω ενεργοποίησης της κινάσης c-SRC. Τέλος, η κινάση CDK5 δεν εμπλέκεται στην ενεργοποίηση της ιντεγκρίνης ανβ3 και των ERK1/2 από την ΡΤΝ. Συμπερασματικά, η κυκλινο-εξαρτώμενη κινάση 5 (CDK5) φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων που σχετίζονται με αγγειογένεση και τα αποτελέσματά μας προσφέρουν σημαντικά δεδομένα προς αυτήν την κατεύθυνση. Eίναι η πρώτη φορά που περιγράφεται η έκφραση του βασικού ρυθμιστή της CDK5 p35 σε άλλο είδος κυττάρων, εκτός των νευρικών, και ιδιαίτερα στα ενδοθηλιακά. Ο εξέχων ρόλος της κινάσης CDK5 σε διάφορες λειτουργίες και σε παθολογικές καταστάσεις, αρχικά στο νευρικό και στη συνέχεια στα περισσότερα συστήματα, καθιστά ιδιαίτερα σημαντικό το σχεδιασμό και την ανάπτυξη αναλόγων που επιδρούν στην ενεργότητά της άμεσα ή έμμεσα, με βάση τη δομή του αναλόγου 1e. / Indolocarbazole alkaloids constitute a group of natural products that have attracted great attention because of their potential therapeutic applications. Ιndolopyrrolocarbazoles are a new class of antitumor drugs, which can be divided into two major groups, depending on their mechanisms of action and structural features: protein kinase inhibitors and DNA-damaging agents. We have previously evaluated the effect of 7 pyrrolo[2,3-a]carbazole analogues on CDK1/cyclinB (Cyclin Dependent Kinase 1, CDK1) activity and found that only compound1e totally inhibited the enzyme in a dose-dependent manner, while all analogues partially or totally inhibited the activity of topoisomerase I in vitro, with compound 1e being the least effective. In this thesis, the effect of all the pyrrolo[2,3-a]carbazole analogues on angiogenesis was investigated, using the in vivo model of the chick embryo chorioallantoic membrane, as well as proliferation and migration of human endothelial cells in vitro. All the analogues had an effect on the proliferation and migration of endothelial cells in vitro and angiogenesis in vivo, but with differences in their effectiveness or potency. We have previously shown that PTN induces migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and ανβ3 integrin. The recent report that ανβ3 expression up-regulates CDK1, which then modulates cell migration, led us to test the effect of the CDK1 inhibitor compound 1e and the other pyrrolo[2,3a]carbazole analogues on the PTN induced migration of human endothelial cells. Only compound 1e inhibited PTN induced migration of human endothelial cells, a result also confirmed in human glioblastoma U87MG cells, which are known to express both RPTPβ/ζ and ανβ3 and migrate in response to PTN. Roscovitine, a synthetic inhibitor of CDKs with selectivity towards CDK1/2 and CDK5, completely attenuated PTN-induced migration of endothelial cells, while the CDK1/2 selective inhibitor NU2058 had no effect, suggesting that inhibition of CDK5 is responsible for inhibition of PTN-induced cell migration. The complete attenuation of PTN-induced migration of endothelial cells following the down-regulation of CDK5 by siRNA further confirmed that CDK5 plays an important role in PTN-induced migration of endothelial cells. PTN increased CDK5 kinase activity with the maximum increase observed within 5 min after stimulation of cells with PTN. This was confirmed by both direct kinase assays, as well as by measuring interaction of CDK5 with its activator protein p35. PTN-induced activation of CDK5 is independent of ανβ3, but depends on RPTPβ/ζ and its downstream activated c-SRC kinase. This is the first time that an interaction between CDK5 and c-SRC is reported in extracts of endothelial cells, as well as the fact that PTN induced CDK5 activation requires c-SRC activation in these cells. Finally, we report no immediate effect of kinase CDK5 on PTN induced activation of ανβ3 integrin and ERK1/2 phosphorylation. Accumulating data favour the notion that CDK5 plays an important role in angiogenesis-related functions of endothelial cells and our data reinforce this observation. The expression of p35 in endothelial cells, the prime regulator of CDK5, is reported here for the first time in other type of cells apart from neuronal. The basic role of CDK5 in several pathologies point out the importance of research and development of compounds that can be effective in inhibiting this kinase, based on the structure of analogue 1e.

Abstract Heart failure (HF) and aortic valve stenosis (AS) are complex disorders affected by functional alterations and actively regulated remodelling of the heart and the aortic valve, respectively. In addition to structural proteins, such as collagens and elastin, the extracellular matrix (ECM) in the heart and the aortic valve comprises non-collagenous factors that are not strictly involved in the architecture but may modulate cardiac and valvular remodelling. In the present study the expression of non-collagenous fibrosis- and calcification-related ECM proteins was investigated in HF-associated cardiac remodelling from different origins as well as in fibrocalcific aortic valve disease leading to AS. The experimental models of pressure overload, myocardial infarction (MI) and chronic renal failure were used to study the cardiac expression of bone morphogenetic protein (BMP)-2, BMP-4, bone sialoprotein, matrix Gla protein (MGP), osteoactivin, osteopontin, periostin and/or pleiotrophin in vivo in cardiac remodelling. Human aortic valves, obtained from patients undergoing valve replacement, were studied to characterize the valvular expression of BMP-2, BMP-4, bone sialoprotein, MGP, osteoactivin, osteopontin, osteoprotegerin, periostin, pleiotrophin, and thrombospondins (TSPs) 1-4 in the different stages of fibrocalcific aortic valve disease. Left ventricular (LV) MGP expression was upregulated in vivo in non-uremic cardiac remodelling. In vitro results indicate that angiotensin II elevates MGP expression in cardiomyocytes and fibroblasts. Periostin gene expression was induced in cardiac but not in aortic valve remodelling and the cardiac induction in chronic renal insufficiency was associated with LV hypertrophy and blood pressure as well as the cardiac gene expression of other fibrosis-related genes. Bone sialoprotein and osteopontin were expressed in the aortic valves in parallel with calcification, and also in distinct models of cardiac remodelling. Osteoprotegerin protein expression in stenotic valves was weak regardless of a simultaneous increase in gene expression. BMPs were downregulated in AS and no change in LV gene expression was detected in uremic cardiac remodelling. All the studied TSPs were expressed in human aortic valves, and especially the expression of TSP-2 was shown to increase in fibrocalcific aortic valves simultaneously with decreased activation of the Akt/nuclear factor (NF)-κB-pathway. This study delineates distinct expression patterns of non-collagenous ECM proteins in pathological tissue remodelling in the heart and in the aortic valve, and thus emphasizes the role of ECM proteins as an important modulator of cardiac and aortic valve remodelling. / Tiivistelmä Sydämen vajaatoiminnan ja aorttastenoosin taudinkuvaan kuuluvat toiminnallisten muutosten ohella aktiivisesti säädellyt soluväliaineen muutokset sydämen ja aorttaläpän rakenteessa. Soluväliaineen rakenteen muodostavien kollageenien ja elastiinin lisäksi soluväliaineessa on rakenteeseen kuulumattomia proteiineja. Tässä väitöskirjassa tutkittiin sidekudoksen kertymiseen ja kudosten kalkkiutumiseen osallistuvia soluväliaineen proteiineja sydämen vajaatoiminnassa sekä aorttastenoosiin johtavassa kalkkiuttavassa aorttaläppäviassa. Tutkimuksessa selvitettiin sydämen soluväliaineen proteiinien ilmentymistä painekuormituksen, sydäninfarktin ja pitkäaikaisen munuaisten vajaatoiminnan koemalleissa rotalla. Tutkittavia proteiineja olivat luun morfogeneettiset proteiinit 2 ja 4, luun sialoproteiini, matriksin Gla proteiini (MGP), osteoaktiviini, osteopontiini, periostiini ja pleiotropiini. Edellä mainittujen proteiinien lisäksi osteoprotegeriinin ja trombospondiinien 1-4 ilmentymistä tutkittiin kalkkiuttavan aorttaläppävian eri kehitysvaiheissa. Aorttaläpät oli kerätty tekoläppäleikkauspotilailta. Sydämessä MGP:n ilmentyminen lisääntyi kaikissa muissa paitsi munuaisten vajaatoiminnan koemallissa. Angiotensiini II nosti MGP:n ilmentymistä sydänlihassoluissa ja sidekudossoluissa. Periostiinin ilmentyminen lisääntyi sydämen uudelleenmuovautumisessa, muttei aorttaläppäviassa. Lisäksi munuaisten vajaatoiminnan aiheuttama periostiinin ilmentymisen muutos sydämessä liittyi sekä sydämen kasvuun, verenpaineen nousuun että muiden sidekudosta muokkaavien proteiinien ilmentymiseen. Luun sialoproteiinin ja osteopontiinin ilmentymiset erosivat toisistaan erilaisissa sydämen vajaatoiminnan malleissa, mutta aorttaläpissä niiden molempien ilmentyminen oli suhteessa läpän kalkkiutumiseen. Osteoprotegeriinin geenin ilmentyminen lisääntyi kalkkiutuneissa aorttaläpissä vaikkakin proteiinin määrä pysyi vähäisenä. Luun morfogeneettisten proteiinien ilmentyminen oli alentunut sairaissa läpissä, muttei sydämessä munuaisten vajaatoiminnan aikana. Aorttaläpissä ilmennettiin kaikkia trombospondiineita, joista trombospondiini-2:n ilmentyminen kasvoi sairaissa aorttaläpissä. Kalkkiutuneissa läpissä solunsisäinen Akt/NF-κB–signaalinvälitysjärjestelmä oli vaimentunut. Tutkimus osoittaa, että soluväliaineen proteiinien ilmentymistä säädellään eri tavoin sydämen vajaatoiminnassa ja aorttastenoosissa kudoksen uudelleenmuovautumisprosessin aikana.

H HARP (heparin-affin regulatory peptide), γνωστή και ως πλειοτροπίνη (PTN), είναι ένας 18 kDa αυξητικός παράγοντας, ο οποίος έχει υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Η HARP έχει πολλαπλές βιολογικές δράσεις, όπως συμμετέχει στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, στη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση. Επιπλέον η έκφραση της σχετίζεται με την φυσιολογική και καρκινική αγγειογένεση in vitro και in vivo. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η έκφραση της HARP και των υποδοχέων της, ALK και RPTPβ/ζ, στις διάφορες ημέρες ανάπτυξης της CAM εμβρύου όρνιθας. Επίσης, μελετήθηκε η μείωση της έκφρασης της ενδογενούς HARP, με πλασμίδιο που φέρει την αντινοηματική αλληλουχία (AS-HARP), στην αγγειογένεση in vivo, στη φωσφορυλίωση των Εrk1,2 και στη λεμφαγγειογένεση της CAM εμβρύου όρνιθας. Ανάλυση κατά Western και RT-PCR στις διάφορες ημέρες ανάπτυξης του εμβρύου έδειξε ότι η έκφραση της HARP συμβαδίζει με τη δημιουργία νέων αγγείων στη CAM, ενώ η έκφραση των υποδοχέων της HARP στην CAM φαίνεται να είναι αυξημένη στα πρώτα στάδια ανάπτυξης του ιστού. Επίσης, η μείωση της έκφρασης της HARP μετά τη χορήγηση του πλασμιδίου AS-HARP, μείωσε τα επίπεδα της πρωτεΐνης, το μήκος των αγγείων και τη φωσφορυλίωση των Erk1/2 στο in vivo μοντέλο της CAM εμβρύου όρνιθας. Αντίθετα, η μείωση της έκφρασης της HARP μετά τη χορήγηση του πλασμιδίου AS-HARP, δεν επηρέασε τη λεμφαγγειογένεση της CAM εμβρύου όρνιθας. Σαν τελικό συμπέρασμα προκύπτει ότι η έκφραση της ενδογενούς HARP στην CAM εμβρύου όρνιθας είναι σημαντική για τη φυσιολογική αγγειογένεση in vivo. / Heparin-affin regulatory peptide (HARP), also known as pleiotrophin or heparin-binding growth-associated molecule, is an 18 kDa growth factor that has a high affinity for heparin. HARP is involved in the control of cellular proliferation, migration and differentiation. Moreover, there is a strong correlation between HARP expression and tumor growth and angiogenesis. In the present work, we studied the expression of HARP and its receptors, ALK and RPTPβ/ζ, during development of the chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM), in relation to angiogenesis. By western blot analysis and RT-PCR, it was shown that HARP, ALK and RPTPβ/ζ expression increased at days of on-going angiogenesis and decreased at later time points. Transfection of CAMs with an anti-sense HARP gene construct led to a significant decrease in HARP amounts compared to vector control transfected CAMs, a significant decrease in the length of CAM blood vessels, and a decrease in the phosphorylation of Erk1/2. Contrary, transfection of CAMs with the anti-sense HARP gene construct had no influence in lymphangiogenesis of the chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM). These data suggest that endogenous HARP is involved in angiogenesis in vivo.