No description available.

Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN), είναι ένας αυξητικός παράγοντας 18 kDa με υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Το μόριο της PTN είναι πολύ συντηρημένο μεταξύ των ειδών και έχει 50% ομολογία με τη midkine, με την οποία συγκροτεί μια νέα οικογένεια αυξητικών παραγόντων. Υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης έχουν ανιχνευθεί σε πολλούς καρκινικούς όγκους, αλλά και κυτταρικές σειρές που προέρχονται από διάφορους τύπους καρκίνου σε ανθρώπους. Αρκετές είναι οι αναφορές που υποδεικνύουν την PTN ως μόριο που ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση κυττάρων. Επίσης, έχει προταθεί θετική συσχέτιση της PTN με την αγγειογένεση in vivo, αλλά και με κυτταρικές λειτουργίες που σχετίζονται με την αγγειογένεση in vitro. Ασκεί τη βιολογική της δράση μετά από αλληλεπίδραση με πρωτεογλυκάνες της επιφάνειας του κυττάρου ή μετά από δέσμευση σε ειδικούς υποδοχείς, όπως o υποδοχέας με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) και ο υποδοχέας του αναπλαστικού λεμφώματος με δράση κινάσης τυροσίνης (ALK). Στην παρούσα εργασία διαπιστώθηκε η έκφραση του υποδοχέα RPTPβ/ζ στα κύτταρα HUVEC, T98G, MO59K, U87MG, LN18, C6 και LNCaP, ενώ ο υποδοχέας ALK ανιχνεύεται σε μικρότερα επίπεδα στα κύτταρα T98G, MO59K, LN18, C6 και LNCaP. Η PTN αλληλεπιδρά με τη διαμεμβρανική μεγάλη ισομορφή του υποδοχέα RPTPβ/ζ με υψηλό βαθμό γλυκοζυλίωσης σε όλα τα υπό μελέτη κύτταρα, ενώ φαίνεται πως η διμερισμένη μορφή της, μοριακού μεγέθους 36 kDa, είναι αυτή που δεσμεύεται στους υποδοχείς της. Καθώς η PTN έχει πρόσφατα ταυτοποιηθεί ως σημαντικός αυτοκρινής παράγοντας για την καρκινική σειρά LNCaP και με βάση αποτελέσματα που δείχνουν ότι τα δύο άκρα του μορίου ίσως να παίζουν σημαντικό ρόλο στις βιολογικές δράσεις του αυξητικού παράγοντα, δημιουργήθηκαν σταθερά διαμολυσμένα καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP που υπερεκφράζουν την αλληλουχία HΔ111-136 της PTN, από την οποία λείπουν τα 26 αμινοξέα του καρβόξυτελικού άκρου (HΔ111-136) και σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα LNCaP που υπερεκφράζουν την αλληλουχία 9-110 που κωδικοποιεί τα αμινοξέα (Η9-110). Τα κύτταρα αυτά θα χρησιμοποιηθούν προκειμένου να βρεθεί αν τα άκρα του μορίου που εκφράζεται ενδογενώς εμπλέκονται με κάποιο τρόπο στις παρατηρούμενες βιολογικές δράσεις του μορίου. Στο πλαίσιο της προσπάθειας διαλεύκανσης της σχέσης δομής-δράσης της PTN, προηγούμενα αποτελέσματα της ερευνητικής μας ομάδας έχουν δείξει ότι η πλασμίνη πρωτεολύει την ΡΤΝ, οδηγώντας στο σχηματισμό πέντε πεπτιδίων με διαφορετικές δράσεις σε αγγειογενετικές διαδικασίες in vitro και in vivo. Επιπλέον, o αναστολέας της πλασμίνης απροτινίνη αναστέλλει την πρωτεόλυση της ΡΤΝ από πλασμίνη, ενώ είναι γνωστό ότι επάγει την αγγειογένεση in vivo στο μοντέλο της χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης εμβρύου όρνιθας, τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων καθώς και τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό λείων μυϊκών κυττάρων Με βάση τα παραπάνω δεδομένα, μελετήθηκε η πιθανή εμπλοκή της ΡΤΝ στις διεγερτικές δράσεις της απροτινίνης σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά HUVEC και καρκινικά κύτταρα προστάτη LNCaP. Διαπιστώθηκε πως η απροτινίνη επάγει τη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών και καρκινικών κυττάρων προστάτη. Επίσης, εκτός από αναστολή της πρωτεόλυσης της ΡΤΝ, η απροτινίνη επάγει και την έκκριση της ΡΤΝ στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων HUVEC και LNCaP, μέσω ενεργοποίησης του μεταγραφικού παράγοντα AP-1 και μεταγραφής του γονιδίου της ΡΤΝ. Η ΡΤΝ φαίνεται να εμπλέκεται στην επαγόμενη από απροτινίνη κυτταρική μετανάστευση μέσω του υποδοχέα της RΡΤΡβ/ζ και στους δύο τύπους των υπό μελέτη κυττάρων, ενισχύοντας την υπόθεση ότι η ΡΤΝ μέσω του υποδοχέα της RΡΤΡβ/ζ παίζει σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση των κυττάρων που επάγεται από διάφορους παράγοντες. / Pleiotrophin (PTN) is an 18-kDa growth factor that has a high affinity for heparin. It is highly conserved between species and shares a 55% amino acid sequence homology with midkine. The two proteins form a new family of structurally related heparin binding growth factors. A potential role of PTN in human cancers has been suggested after the detection of PTN mRNA and/or protein in various human cancer cell lines and tumour specimens of diverse origin. Many data have shown that PTN mediates proliferation, migration and cell differentiation. Moreover, it has been suggested that PTN acts as an angiogenic molecule in vivo and in vitro. It exerts its biological activity through interaction with cell surface proteoglycans and more specific receptors like receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and anaplastic lymphoma kinase (ALK). In the present study, RPTPβ/ζ protein expression has been detected in HUVEC, T98G, MO59K, U87MG, LN18, C6 and LNCaP cells, while ALK receptor is expressed as a protein at lower levels in T98G, MO59K, LN18, C6 and LNCaP cells. Interestingly, dimmers of PTN with a molecular mass of 36 kDa seem to interact with the transmebrane long isoform of RPTPβ/ζ, in all cells under study. It was also observed that dimerized PTN, is capable of co-immunoprecipitating with ALK in LNCaP cells, although this interaction could not be verified in all assays. As PTN has been recently identified as an important autocrine growth factor for the LNCaP prostate cancer cell line and based on data showing the important role of the terminal domains of PTN on its biological activities, we have developed stably transfected LNCaP cell lines overexpressing PTN lacking 25 aminoacids from its C-terminal region or the sequence that corresponds to aminoacids 9-110 of the growth factor. These cell lines are going to be used in order to investigate the implication of the terminal domains of the endogenously expressed molecule in the observed biological activities. In the frame of structure - function analysis of PTN, previous results of our group have shown that through proteolytic activity, plasmin can generate five peptides that correspond to distinct domains of the molecule, which can either activate or inhibit angiogenesis. Aprotinin, a serine protease inhibitor, enhances angiogenesis in the in vivo model of the chick embryo chorioallantoic membrane. Furthermore, aprotinin induces HUVEC migration, smooth muscle cell migration and proliferation, as well as LNCaP cell proliferation. The goal of this study was to evaluate the possible implication of PTN in aprotinin-induced stimulatory activities in human endothelial and prostate cancer cells. Our data demonstrate that aprotinin induces LNCaP and HUVEC cell migration. In line with its inhibitory effect on plasmin, aprotinin increased the amounts of the full length PTN detected in the culture medium of LNCaP and HUVEC cells. This increase seems to be due partly to inhibition of PTN proteolysis and partly to transcriptional activation of the PTN gene, as evidenced by the increased luciferase activity of a reporter gene vector carrying the full length promoter of the ptn gene. The latter seems to be dependent on the activation of the transcription factor AP-1. Finally, PTN seems to mediate the stimulatory effects of aprotinin in cell migration through its receptor RΡΤΡβ/ζ in LNCaP and HUVEC cells, strengthening the hypothesis that PTN plays an important role in cell migration induced by many factors.

Η πλειοτροπίνη είναι αυξητικός παράγοντας 18kDa ο οποίος παρουσιάζει υψηλή συγγένεια με την ηπαρίνη και εμφανίζει μεγάλη ομολογία με τη midkine, με την οποία σχηματίζουν μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που έχουν υψηλή χημική συγγένεια με την ηπαρίνη. Η πλειοτροπίνη εκφράζεται σε διάφορες μορφές καρκίνου έχοντας είτε επαγωγικό είτε ανασταλτικό ρόλο, με τα διάφορα τμήματα της να εμφανίζουν διακριτές δράσεις σε σχέση με το μητρικό μόριο. Στην παρούσα εργασία υποκλωνοποιήθηκε η κωδική περιοχή της πλειοτροπίνης αλλά και τμημάτων της σε φορείς έκφρασης. Έγινε μετασχηματισμός βακτηρίων με τους φορείς που κατασκευάστηκαν και βρέθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες έκφρασης των πεπτιδίων. Έγινε απομόνωση των τμημάτων που αντιστοιχούν στα αμινοξέα 9-59 (ΡΤΝ9-59) και 60-110 (ΡΤΝ60-110) με δυο διαφορετικά συστήματα και έγινε αξιολόγηση αυτών των συστημάτων ως προς την απόδοση και την καθαρότητα του προϊόντος. Η καθαρότητα των προϊόντων που προέκυψαν ήταν πολύ καλή, η απόδοση όμως ήταν χαμηλή σε όλες τις περιπτώσεις μικρότερη από 1 mg/ml. Λόγω της χαμηλής απόδοσης, οι ποσότητες των προϊόντων που προέκυψαν δεν είναι δυνατό να χρησιμοποιηθούν σε μελέτες διαμόρφωσης, xρησιμοποιήθηκαν όμως σε βιολογικές μελέτες. Από τη μελέτη των τμημάτων ΡΤΝ9-59 και ΡΤΝ60-110 που απομονώθηκαν, καθώς και ενός συνθετικού πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα της πλειοτροπίνης (ΡΤΝ111-136) προέκυψαν τα εξής συμπεράσματα: 1) Για την πρόσδεση της πλειοτροπίνης στην ανβ3 αλλά και στον RPTPβ/ζ δεν ευθύνονται οι δυο κεντρικές περιοχές της πλειοτροπίνης ΡΤΝ9-59 και ΡΤΝ60-110, 2) το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 έχει την ικανότητα να επάγει τη φωσφορυλίωση της υπομονάδας β3 της ιντεγκρίνης ανβ3 στη θέση Υ773 μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της κινάσης c-Src, δράση που χάνεται παρουσία ΡΡ1 ή μετά από αποσιώπηση της έκφρασης του RPTPβ/ζ, 3) το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 έχει την ικανότητα να ενεργοποιεί τις ERΚ1/2, επίσης μέσω ενεργοποίησης του RPTPβ/ζ και της κινάσης c-Src. Το γεγονός ότι το πεπτίδιο ΡΤΝ111-136 ενεργοποιεί μόρια μεταγωγής σήματος που ενεργοποιούνται και από την πλειοτροπίνη, ενώ είναι γνωστό ότι αναστέλλει την επαγωγική της δράση στην αγγειογένεση in vivo και την κυτταρική μετανάστευση in vitro, καταδεικνύει ότι οι δράσεις της πλειοτροπίνης περιλαμβάνουν περισσότερους του ενός υποδοχείς ή/και συνυποδοχείς, η λεπτή ρύθμιση των οποίων οδηγεί στην τελική βιολογική της δράση, γεγονός που συνάδει με τις διαφορετικές δράσεις της πλειοτροπίνης που παρατηρούνται σε διαφορετικά συστήματα. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά ενισχύουν την άποψη ότι το C-τελικό άκρο της πλειοτροπίνης παίζει σημαντικό ρόλο στις βιολογικές της δράσεις που σχετίζονται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη, ενώ παραμένει άγνωστος ο ρόλος των κεντρικών της περιοχών. / Pleiotrophin is 18kDa growth factor that shows high affinity to heparin. PTN is highly homologous to midkine (MK), forming together a family of growth factors. There has been found that pleiotrophin is expressed in different types of cancer. It is considered a tumour-promoting and angiogenic growth factor, although there are reports that show a negative effect of PTN on tumour growth and angiogenesis. Several data suggest that different regions of PTN may exert distinct, or even opposite effects on tumour growth and angiogenesis. In this study the coding area of pleiotrophin and regions of it were subcloned in expression vectors. Bacteria were transformed with the vectors and the conditions, where the maximum of the expression of the proteins was observed, were established. Regions of the native protein corresponding to aminoacids 9-59 (PTN9-59) and 60-110 (PTN 60-110) were isolated with two different ways and the results were compared for the quantity and the quality of the peptides. Because of the low quantity, the peptides could not be used for structural studies but they were used for biological studies. From the study of the peptides PTN9-59, PTN 60-110, and a synthetic peptide that corresponds to the last 26 aminoacids of pleiotrophin (PTN111-136) there have been emerged the following observations: 1) the two central regions of pleiotrophin seem not to have involvement to the binding of pleiotrophin to ανβ3 and to RPTPβ/ζ, 2) PTN111-136 induces the phosphorylation of β3 subunit at Y773 of the integrin via the activation of RPTPβ/ζ and c-Src kinase, something that is not observed in the presence of PP1 and siRPTPβ/ζ, 3) the peptide activates ERK1/2 via RPTPβ/ζ and c-Src kinase. The fact that the peptide PTN111-136 activates molecules of the signaling pathway of pleiotrophin and at the same time it is known that pauses the positive effect of the native protein to angiogenesis in vivo and the migration in vitro shows that reactions of pleiotrophin involve more than one of receptors or co-receptors and that the different regulation of which results in the different actions. Also the results strengthen the option that the C-terminal region of pleiotrophin has an important role in the biological activity which correlates with angiogenesis in cancer and the development of cancer although the role of the central regions of PTN is not known.

Η πλειοτροπίνη (ΡΤΝ) είναι ένας αυξητικός παράγοντας με υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Παρόλο που εκφράζεται στο χόνδρο κατά την εμβρυική και νεανική ηλικία, ο ρόλος της παραμένει ακόμα ασαφής. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης της ΡΤΝ και του υποδοχέα της Receptor Protein Tyrosine Phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) στο χόνδρο και στο υποχόνδριο οστό ασθενών με οστεοαρθρίτιδα (ΟΑ). Υλικό και Μέθοδοι: Μελετήθηκαν o χόνδρος και το υποχόνδριο οστό από 29 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ολική αρθροπλαστική γόνατος και ισχίου, λόγω πρωτοπαθούς ΟΑ. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 8 ασθενείς που χειρουργήθηκαν για υποκεφαλικό κάταγμα μηριαίου που δεν εμφάνιζαν ακτινολογικές ή μακροσκοπικές οστεοαρθριτικές αλλοιώσεις. Η μελέτη έγινε με τη χρήση ανάλυσης κατά Western και ανοσοϊστοχημείας. Αποτελέσματα: Η ΡΤΝ και ο RPTPβ/ζ δεν ανιχνεύτηκαν στο χόνδρο φυσιολογικών ενήλικων ατόμων. Η έκφραση τους και η αλληλεπίδρασή τους ήταν αυξημένη σε ασθενείς με ΟΑ μέσης ακτινολογικής και ιστολογικής βαρύτητας. Η ΡΤΝ ανιχνεύτηκε κυτταροπλασματικά κυρίως σε συστάδες επιφανειακών χονδροκυττάρων, σε χονδροκύτταρα της νεκρωτικής περιοχής και της ασβεστοποιημένης ζώνης. Επιπλέον, βρέθηκε να εκφράζεται και στα οστεοκύτταρα του υποχόνδριου οστού, με μέγιστη έκφραση σε μέσης βαρύτητας ΟΑ. Ο υποδοχέας RΡΤΡβ/ζ βρέθηκε να εκφράζεται και αυτός στο υποχόνδριο οστό σε μέσης βαρύτητας ΟΑ, ενώ με την αύξηση της βαρύτητας της νόσου, βρέθηκε να εκφράζεται στα οστεοκύτταρα βαθύτερων οστικών δοκίδων. Συμπεράσματα: Η αυξημένη έκφραση της ΡΤΝ και του υποδοχέα της RPTPβ/ζ στο χόνδρο και στο υποχόνδριο οστό ασθενών με ΟΑ καθιστά τα μόρια αυτά δυνητικά ενδιαφέροντες υποψήφιους στόχους για την ανάπτυξη θεραπευτικής προσέγγισης της νόσου. / Pleiotrophin (PTN) is a heparin-binding growth factor expressed in the cartilage in foetal and young age, but its exact role remains unclear as yet. The purpose of this paper is to study the expression of PTN and the receptor protein tyrosine phosphatase beta/zeta (RPTPβ/ζ) in the cartilage and the subchondral bone of patients with osteoarthritis. Material and Methods: We studied the cartilage and the subchondral bone from 29 patients who had undergone total knee and hip replacement for Primary Osteoarthritis, by using Western blot and immunohistochemistry analyses. As controls, we used eight patients operated for fractures of femoral head, who did not present radiological or macroscopical osteoarthritic changes. Results: PTN and RPTPβ/ζ were not detected in the cartilage of normal adults. Their expression and interaction were increased in patients with osteoarthritis (OA) of moderate radiological and histological severity. PTN was detected mainly in the cytoplasm, in clusters of superficial chondrocytes, in necrotic area chondrocytes and in chondrocytes in the tidemark zone. Moreover, it was also expressed in subchondral bone osteocytes, with maximum expression in moderate OA. RPTP β/ζ was also found to be expressed in the subchondral bone in moderate OA, while, as the severity of the disease increased, it was found to be expressed in the osteocytes of the trabecular bone. Conclusions: The increased expression of PTN and RPTPβ/ζ in the cartilage and subchondral bone of patients with OA renders these molecules potentially interesting candidate targets for developing a therapeutic approach to the disease.

Glioblastoma, grade IV glioma, is the one of the deadliest cancers, with a median survival of only 12-15 months despite aggressive treatment including surgery, chemotherapy and radiation. One hallmark of glioblastoma is the morphological and functional abnormalization of tumor blood vessels. The molecular mechanisms involved in this process and their functional and pathological implications are not yet fully understood. Indentification of molecular mechanisms that underlie vascular abnormalization in GBM is necessary to develop efficient treatment regimens for normalizing vascular function. By analyzing the RNA-content of laser microdissected vessels from human biobank specimens using affymetrix microarray analysis, we found that the abnormal glioblastoma vessels have a distinct gene expression signature. We found 95 genes which were differentially expressed in grade IV glioma vessels as compared to vessels in low grade tumors and control brain. 78 of which were up-regulated while 17 were down-regulated. Many of these genes are regulated by VEGFA or TGFβ signaling. In addition, we show a significant increase in Smad signaling complexes in the vasculature of human glioblastoma in situ, suggesting that TGFβ signaling may play important role in vessel abnormalization. CD93 is a single-pass transmembrane glycoprotein, which we found to be up-regulated in high grade glioma. Vascular expression of CD93 correlates to tumor grade in human glioma. Moreover, high grade glioma patients with high CD93 expression in the vasculature are associate with poor prognosis. We found that knocking down CD93 in endothelial cells with siRNA clearly impaired endothelial cell adhesion, migration and tube formation due to defects in cytoskeletal rearrangement. In addition, tumor growth was severely delayed in the CD93-/- mice. Pleiotrophin, a multi-functional heparin-binding growth factor, promotes glioma growth in several ways. Here, we identify pleiotrophin as a driver of vascular abnormalization in glioma. We found that high pleiotrophin expression correlates with poor survival of patients with astrocytomas. Pleiotrophin overexpression in orthotopic GL261 gliomas increases microvessel density, enhances tumour growth and decreases survival. Vessels in pleiotrophin-expressing gliomas are poorly perfused and display a high degree of abnormality, coinciding with elevated levels of vascular endothelial growth factor (VEGF) deposited in direct proximity to the vasculature. In addition to its role in vessel abnormalization, pleiotrophin enhanced PDGF-B-induced gliomagenesis. Taken together, our results indicate that PTN has an important role in glioma initiation and establishment of the characteristic abnormal tumor vasculature in glioblastoma, identifying PTN as a potential target for therapy.

Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) είναι ένας αυξητικός παράγοντας 18 kDa με υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη και σημαντικό ρόλο στην αγγειογένεση και την καρκινική ανάπτυξη, μέσω του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ, RPTPβ/ζ) και της ιντεγκρίνης ανβ3. Με βάση κάποιες προηγούμενες ενδείξεις ότι διαφορετικές περιοχές της ΡΤΝ ασκούν διαφορετικές δράσεις, στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η δράση συνθετικών πεπτιδίων που αντιστοιχούν σε διαφορετικές περιοχές του μορίου της ΡΤΝ στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση ενδοθηλιακών και κυττάρων γλοιοβλαστώματος. Πεπτίδια που αντιστοιχούν στις περιοχές 1-5 (ΡΤΝ1-5), 71-77 (ΡΤΝ71-77) και 112-136 (ΡΤΝ112-136) της ΡΤΝ προκάλεσαν στατιστικά σημαντική μείωση του αριθμού των κυττάρων γλοιοβλαστώματος Μ059Κ και C6, ενώ πεπτίδιο που αντιστοιχεί στα αμινοξέα 16-24 (ΡΤΝ16-24) δεν είχε καμία επίδραση. Όσον αφορά στη μετανάστευση, τα πεπτίδια PTN16-24 και PTN71-77 προκάλεσαν στατιστικά σημαντική επαγωγή του χημειοτακτισμού των κυττάρων Μ059Κ. Σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα, το πεπτίδιο ΡΤΝ71-77 προκάλεσε επίσης επαγωγή, σε αντίθεση με το πεπτίδιο ΡΤΝ71-77 που προκάλεσε στατιστικά σημαντική μείωση της μετανάστευσης. Το πεπτίδιο ΡΤΝ112-136 που είναι γνωστό ότι αναστέλλει την επαγόμενη από ΡΤΝ μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων, προκάλεσε μη στατιστικά σημαντική επαγωγή της μετανάστευσης κυττάρων ΜΟ59Κ, χωρίς να επηρεάζει τη μείωση της μετανάστευσης που προκαλεί η ΡΤΝ στα κύτταρα αυτά. Επιπλέον, ανέστειλε την αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με τον RPTPβ/ζ στα ίδια κύτταρα. Μια σημαντική παρατήρηση της παρούσας εργασίας είναι ότι η ΡΤΝ (αλλά όχι η ομόλογη midkine ή ο υποδοχέας της RPTPβ/ζ) αλληλεπιδρά άμεσα με τις ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 σε ενδοθηλιακά και σε κύτταρα γλοιοβλαστώματος. Το πεπτίδιο ΡΤΝ16-24 προκάλεσε σημαντική μείωση της αλληλεπίδρασης της ΡΤΝ με την ΜΜΡ-2 και αύξηση της αλληλεπίδρασης της ΡΤΝ με την ΜΜΡ-9, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση της ΡΤΝ με την ΜΜΡ-2 ίσως διαμεσολαβείται από τα αμινοξέα 16-24 του μορίου της ΡΤΝ. Φαίνεται λοιπόν, ότι κάθε περιοχή της PTN είναι υπεύθυνη για αλληλεπιδράσεις της ΡΤΝ με διαφορετικά μόρια και τελικά, για τις διαφορετικές δράσεις του μορίου. / Pleiotrophin (PTN) is an 18 kDa growth factor that has high affinity for heparin and plays an important role in angiogenesis and carcinogenesis, through its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and integrin ανβ3. Several data suggest that different regions of PTN exert distinct, or even opposite effects than the whole molecule, although conclusive data do not yet exist. In the present work we tested the effect of different synthetic peptides that correspond to distinct regions of PTN in the proliferation and migration of endothelial and glioma cells. The peptides that correspond to regions 1-5 (ΡΤΝ1-5), 71-77 (ΡΤΝ71-77) and 112-136 (ΡΤΝ112-136) of ΡΤΝ reduced in a statistically significant manner the number of M059K and C6 glioblastoma cells, whereas the peptide that corresponds to aminoacids 16-24 (ΡΤΝ16-24) did not have an effect. The peptides PTN16-24 and PTN71-77 induced the migration of glioma M059K cells in a statistically significant manner. In contrary to glioma cells, PTN16-24 also induced migration of human endothelial cells, whereas ΡΤΝ71-77 caused a statistically significant decrease of cell migration. ΡΤΝ112-136, which is known to inhibit the PTN-induced migration of human endothelial cells, induced M059K cell migration, without affecting PTN-induced decreased migration of the same cells. Moreover, ΡΤΝ112-136 inhibited the interaction of PTN with its receptor RPTPβ/ζ in M059K cells, although it is not clear if this is related to its effect on M059K cell migration. An important finding of the present study is that PTN (but not its homologue protein midkine or its receptor RPTPβ/ζ) directly interacts with MMPs 2 and 9 in both endothelial and glioma cells. ΡΤΝ16-24 reduced the interaction between PTN and MMP-2, while it enhanced the interaction between PTN and MMP-9, suggesting that the interaction of PTN with MMP-2 may be mediated by aminoacids 16-24. Conclusively, it seems that each region of PTN is responsible for the interaction of PTN with different molecules and finally, for the different actions of PTN.

Αξιοσημείωτη πρόοδος έχει σημειωθεί τα τελευταία χρόνια στην αποσαφήνιση των μορίων που πρωταγωνιστούν στην αγγειογένεση, με τον αγγειακό ενδοθηλιακό αυξητικό παράγοντα (VEGF) να παίζει πρωταγωνιστικό ρόλο. Ο VEGF προκαλεί αρκετές αγγειογενετικές λειτουργίες στα ενδοθηλιακά κύτταρα διαμέσου των υποδοχέων του VEGFR-1 και VEGFR-2 ή KDR. Η προκαλούμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων φαίνεται ότι μεσολαβείται από τον KDR, πιθανά μέσω δέσμευσης του με την ιντεγκρίνη αvβ3. Η πλειοτροπίνη (PTN) είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας με συγγένεια δέσμευσης ηπαρίνης και διαμέσου του υποδοχέα της με δράση φωσφατάσης τυροσίνης β/ζ (RPTPβ/ζ) και την ανβ3 ιντεγκρίνη προάγει τη μετανάστευση στα ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα. Πρόσφατα δείξαμε ότι εξωγενώς χορηγούμενη PTN αναστέλλει την προκαλούμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στην παρούσα εργασία μελετήσαμε την επίδραση της ενδογενούς PTN και του υποδοχέα της RPTPβ/ζ στη προκαλούμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Βρήκαμε ότι η ενδογενής PTN δε συμμετέχει στη μετανάστευση που προκαλεί ο VEGF. Αντίθετα, μείωση της έκφρασης του ενδογενούς RPTPβ/ζ με siRNA είχε ως αποτέλεσμα πλήρη αναστολή της επαγόμενης από VEGF κυτταρικής μετανάστευσης. Η αποσιώπηση του γονιδίου του RPTPβ/ζ δεν επηρέασε την προκαλούμενη από τον VEGF ενεργοποίηση των ERK1/2, αλλά μείωσε την επαγόμενη από VEGF αλληλεπίδραση ανάμεσα στον VEGFR-2 και την ιντεγκρίνη ανβ3, αλληλεπίδραση σημαντική για την προκαλούμενη από τον VEGF κυτταρική μετανάστευση. Τέλος, βρέθηκε ότι ο VEGF αλληλεπιδρά άμεσα με τον RPTPβ/ζ, αφού τα δύο μόρια συγκατακρημνίζονται σε εκχυλίσματα κυττάρων που εκφράζουν τόσο VEGF όσο και RPTPβ/ζ. Συμπερασματικά, ο RPTPβ/ζ φαίνεται να δρα ως υποδοχέας του VEGF και να είναι απαραίτητος για την προκαλούμενη από τον VEGF μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων διαμέσου του VEGFR-2. / A considerable progress has been made during the past years in elucidating the molecular actors of angiogenesis, with vascular endothelial growth factor (VEGF) representing the major inducer of angiogenesis up to date. VEGF induces several angiogenic functions of endothelial cells through its receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 or KDR. VEGF-induced endothelial cell migration seems to be mediated by KDR, possibly via engagement of integrin αvβ3. Pleiotrophin (PTN) is a secreted heparin-binding growth factor that through its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and ανβ3 integrin induces human endothelial cell migration. We have previously shown that exogenous PTN inhibits VEGF-induced endothelial cell migration. In the present work we studied the effect of endogenous PTN and its receptor RPTPβ/ζ in VEGF-induced endothelial cell migration. We found that endogenous PTN is not involved, while RPTPβ/ζ is required for VEGF-induced endothelial cell migration. Although VEGF may directly interact with RPTPβ/ζ, down-regulation of the latter by siRNA does not affect VEGF-induced ERK1/2 activation but seems to affect the interaction of KDR with ανβ3, which is important for VEGF-induced cell migration. Collectively, RPTPβ/ζ seems to be required for VEGF-induced endothelial cell migration through its receptor KDR.

Ο σακχαρώδης διαβήτης (ΣΔ) είναι ομάδα μεταβολικών διαταραχών που χαρακτηρίζονται από υψηλά επίπεδα γλυκόζης στο αίμα, είτε λόγω ανεπάρκειας παραγωγής ινσουλίνης είτε εξαιτίας της αντίστασης στην ινσουλίνη. Η επίπτωση του ΣΔ αυξάνει παγκοσμίως, αυξάνοντας και την ανησυχία για τις επιπλοκές της ασθένειας, όπως η νεφρική ανεπάρκεια, η τύφλωση και η αργή επούλωση τραυμάτων. Κοινός παρονομαστής σε αυτές τις επιπλοκές είναι η αυξημένη ή η ανεπαρκής αγγειογένεση. Οι αυξητικοί παράγοντες είναι μόρια‐κλειδιά και εμπλέκονται στις αγγειακές επιπτώσεις του ΣΔ. Η πλειοτροπίνη (pleiotrophin, PTN) είναι ένας εκκρινόμενος αυξητικός παράγοντας 18 kDa με υψηλή συγγένεια για την ηπαρίνη. Η PTN εκφράζεται σε πολλές καρκινικές σειρές και επηρεάζει πολλές διαδικασίες, όπως την επιβίωση και τη μετανάστευση κυττάρων, και την αγγειογένεση. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε η επίδραση υψηλών επιπέδων D‐ και L‐γλυκόζης στην έκκριση και στη δράση της PTN στη μετανάστευση των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων ομφάλιου λώρου (HUVEC). Τόσο η D‐ όσο και η L‐γλυκόζη μειώνουν την έκκριση της PTN in vitro, προτείνοντας ότι το φαινόμενο οφείλεται στην αυξημένη ωσμωτική πίεση. Αντίθετα, HUVEC που απομονώθηκαν από διαβητικό ασθενή εκκρίνουν μεγαλύτερα ποσά PTN συγκριτικά με κύτταρα από μη διαβητικό ασθενή. Παρόλο που το αποτέλεσμα αυτό πρέπει να επιβεβαιωθεί, εγείρει το ερώτημα της εγκυρότητας των αποτελεσμάτων από απλοποιημένα in vitro μοντέλα σε σχέση με το τι συμβαίνει σε διαβητικούς ασθενείς. Με μεθόδους όπως η δοκιμασία επούλωσης πληγών και το πείραμα χημειοτακτισμού Βoyden, διαπιστώθηκε ότι τα διαβητικά κύτταρα που εκτέθηκαν σε D‐γλυκόζη μεταναστεύουν γρηγορότερα σε σχέση με τα εκτεθειμένα σε L‐γλυκόζη κύτταρα, παρόλο που και στις δυο περιπτώσεις η μετανάστευση ήταν μειωμένη σε σχέση με αυτήν κυττάρων εκτεθειμένων σε φυσιολογικά επίπεδα γλυκόζης. Επιπλέον, τόσο η D‐ όσο και η L‐γλυκόζη αναστέλλουν πλήρως την επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση, υποδηλώνοντας ότι η ώσμωση ίσως να παίζει κάποιο ρόλο. Οι θειαζολιδινεδιόνες είναι μια κατηγορία αγωνιστών του υποδοχέα PPARγ που μειώνουν την ινσουλινοαντίσταση σε διαβητικούς ασθενείς τύπου 2. Πρόσφατα έχει αναγνωριστεί ότι οι αγωνιστές του υποδοχέα PPARγ πιθανά εμπλέκονται σε μοριακούς μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αγγειογένεση, είτε επηρεάζοντας την έκφραση αυξητικών παραγόντων, όπως ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF), είτε αναστέλλοντας τις επαγωγικές δράσεις αυτών σε αγγειογενετικές λειτουργίες των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη, εξετάστηκε η επίδραση του αγωνιστή του υποδοχέα PPARγ ροζιγλιταζόνη (RSG), στην έκφραση και την έκκριση της PTN, καθώς και στην επαγωγική δράση της PTN στη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC και στην παραγωγή δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS). Η RSG ανέστειλλε την έκκριση της PTN στο υπερκείμενο κυττάρων HUVEC αλλά είχε ένα διφασικό αποτέλεσμα στα ενδοκυττάρια επίπεδά της, όπως και στη μεταγραφή του γονιδίου ptn, με τις μικρότερες συγκεντρώσεις να προκαλούν αύξηση και τις μεγαλύτερες μείωση στα επίπεδα της PTN. Η RSG μείωσε σημαντικά τα επίπεδα των ROS και τη μη διεγερμένη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Την ίδια ακριβώς δράση είχε και ο εκλεκτικός ανταγωνιστής του υποδοχέα PPARγ, GW9662, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι δράσεις της RSG είναι ανεξάρτητες από τον PPARγ. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι ο GW9662 πρέπει να χρησιμοποιείται με προσοχή ως ανταγωνιστής του υποδοχέα PPARγ σε φαρμακολογικά πειράματα. Η RSG ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από ΡΤΝ παραγωγή ROS αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση, σε αντίθεση με την πλήρη αναστολή που προκάλεσε στην επαγόμενη από VEGF κυτταρική μετανάστευση. Συνολικά, τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας υποδηλώνουν ότι τα υψηλά επίπεδα γλυκόζης επηρεάζουν την έκφραση της PTN και την επαγόμενη από ΡΤΝ κυτταρική μετανάστευση in vitro, πιθανά μέσω της επίδρασης της αυξημένης ωσμωτικής πίεσης που ασκείται στα κύτταρα. Επιπλέον, παρόλο που η RSG φαίνεται να επηρεάζει την έκφραση και έκκριση της ΡΤΝ, την παραγωγή ενδογενών ROS και τη μετανάστευση των μη διεγερμένων κυττάρων HUVEC, δεν επηρεάζει την επαγόμενη από PTN μετανάστευση των HUVEC, υποδηλώνοντας ότι η ΡΤΝ δεν εμπλέκεται πιθανά στις αντιαγγειογενετικές της δράσεις. / Diabetes Mellitus (DM) is a group of metabolic disorders characterized by high blood sugar either because of inadequate insulin production or insulin resistance. The incidence of DM is rising globally, increasing the concern about the complications of the disease, such as renal failure, blindness and slow healing wounds. The common factor between them lies on either increased or inadequate angiogenesis. Growth factors are key molecules and are involved in the vascular effects of DM. Pleiotrophin (PTN) is an 18‐kDa secreted growth factor that has high affinity for heparin. PTN is expressed in various cancer cell lines and affects many different processes, such as cell growth, survival, migration and angiogenesis. In the present work we studied the influence of high D‐ and L‐glucose levels on the secretion or the effect on migration of PTN on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Both D‐ and L‐glucose reduced PTN secretion in vitro, suggesting that this effect was due to high osmotic pressure. In contrast, HUVEC isolated from diabetic patient secreted increased amounts of PTN compared with cells from non diabetic donors. Although this effect needs to be verified, it raises the question οf the validity of the results from in vitro simplified models translated into what is happening in diabetic patients. In wound‐healing and boyden assays, D‐glucose‐treated cells migrated faster than L‐glucose‐treated cells, although in both cases, migration was inhibited compared to cells treated with normal glucose levels. PTN‐induced cell migration was inhibited in the presence of either D‐ or L‐glucose, suggesting that osmotic pressure may be responsible. Thiazolidinediones are a class of peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARγ) agonists that reduce insulin resistance in type 2 diabetic patients. In recent years, there has been increasing appreciation of the fact that PPARγ agonists might be involved in the molecular mechanisms that regulate angiogenesis, by either affecting the expression levels of growth factors, such as vascular endothelial growth factor, or by inhibiting the stimulatory activities of growth factors on endothelial cell proliferation, survival, or migration. In the present study, we examined the effect of the PPARγ agonist rosiglitazone (RSG) on the expression and secretion of PTN, as well as on the stimulatory effect of PTN in human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) migration and reactive oxygen species (ROS) production. RSG inhibited secretion of PTN into the cell culture medium of HUVEC but had a biphasic effect on the intracellular levels of PTN, as well as on ptn gene transcription, with the lowest concentrations causing increase and the highest concentrations causing a decrease in PTN amounts. RSG significantly decreased endogenous levels of ROS, as well as unstimulated endothelial cell migration. The selective antagonist of PPARγ, GW9662, also inhibited both HUVEC migration and ROS production to a similar degree compared with RSG, suggesting that these effects of RSG are PPARγ‐independent. These data also suggest that GW9662 should be treated cautiously as a PPARγ antagonist. Although RSG completely inhibited PTN‐induced production of ROS, it did not affect PTN‐induced HUVEC migration, in contrast to its effect on VEGF‐induced endothelial cell migration. Collectively, the data from the present study suggest that high glucose levels affect PTN expression and effect on migration, possibly due to high osmotic pressure, although this needs to be further examined. RSG affects PTN expression, endogenous ROS levels and migration of unstimulated HUVEC; however, it did not affect PTN‐induced HUVEC migration, suggesting that the signaling pathways activated by PTN may not be involved in its anti‐angiogenic effects.

Η πλειοτροπίνη αποτελεί έναν αυξητικό παράγοντα με ποικίλες δράσεις και σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη των όγκων και την αγγειογένεση. Η ερευνητική μας ομάδα έχει δείξει σε προηγούμενη μελέτη ότι η πλειοτροπίνη επάγει τη μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων, μέσω πρόσδεσής της στον υποδοχέα της RPTPβ/ζ. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι της ιντεγκρίνης ανβ3, αλλά όχι έναντι της α5β1, ανέστειλε την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Η πλειοτροπίνη βρέθηκε να αλληλεπιδρά με την ιντεγκρίνη ανβ3 και η αλληλεπίδραση αυτή είναι ανεξάρτητη από τη θέση δέσμευσης της αλληλουχίας RGD της ιντεγκρίνης. Αντίθετα, ένα συνθετικό πεπτίδιο το οποίο αντιστοιχεί στην κυστεϊνική θηλιά (177CYDMKTTC184) στο εξωκυτταρικό τμήμα της υπομονάδας β3 ανέστειλε την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3 και την επαγόμενη από την πλειοτροπίνη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, η ιντεγκρίνη ανβ3 βρέθηκε να αλληλεπιδρά και με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, ενώ η επαγόμενη από την πλειοτροπίνη φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 της ιντεγκρίνης β3 διαμεσολαβείται μέσω του RPTPβ/ζ και της καθοδικής αυτού κινάσης c-Src, η οποία επιπλέον αλληλεπιδρά και με την ιντεγκρίνη β3. Η midkine βρέθηκε ότι αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα RPTPβ/ζ, αλλά όχι με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ προκάλεσε μια μικρή, αλλά στατιστικά σημαντική αναστολή στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο ίδιο πλαίσιο, η πλειοτροπίνη ανέστειλε τη μετανάστευση διαφορετικών κυτταρικών σειρών γλοιώματος τα οποία εκφράζουν τον RPTPβ/ζ, αλλά όχι την ιντεγκρίνη ανβ3¬, ενώ προκάλεσε επαγωγή της μετανάστευσης στα κύτταρα U87MG, που εκφράζουν την ιντεγκρίνη ανβ3 στην κυτταρική τους μεμβράνη. Υπερέκφραση της ιντεγκρίνης β3 σε κύτταρα γλοιώματος είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Παρόμοια, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση στη μετανάστευση κυττάρων CHO που δεν εκφράζουν την ιντεγκρίνη β3, ενώ προκάλεσε σημαντική επαγωγή στη μετανάστευση των ίδιων κυττάρων σταθερά διαμολυσμένων ώστε να υπερεκφράζουν την ιντεγκρίνη β3. Σε κύτταρα CHO σταθερά διαμολυσμένα ώστε να υπερεκφράζουν μία μεταλλαγμένη μορφή της ιντεγκρίνης β3, στην οποία οι τυροσίνες 773 και 785 έχουν αντικατασταθεί με φαινυλαλανίνη, η πλειοτροπίνη δεν είχε καμία δράση, γεγονός που υποδηλώνει ότι η φωσφορυλίωση της τυροσίνης 773 είναι απαραίτητη για τη μεταγωγή του σήματος της πλειοτροπίνης που οδηγεί σε κυτταρική μετανάστευση. Το γεγονός ότι και η midkine προκάλεσε επαγωγή της φωσφορυλίωσης της τυροσίνης 773 δείχνει επιπλέον ότι η φωσφορυλίωση αυτή από μόνη της δεν είναι ικανή να οδηγήσει σε επαγωγή της κυτταρικής μετανάστευσης. Συνοπτικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η ιντεγκρίνη ανβ3 είναι ένα μόριο που καθορίζει την επαγωγική ή ανασταλτική δράση της πλειοτροπίνης στην κυτταρική μετανάστευση. Επιπλέον, στα πλαίσια της παρούσας εργασίας εξιχνιάσθηκε ο μηχανισμός δράσης ενός πεπτιδίου που αντιστοιχεί στα 26 τελευταία αμινοξέα του καρβοξυτελικού άκρου της πλειοτροπίνης (πεπτίδιο S1), και το οποίο έχει βρεθεί να αναστέλλει την αγγειογένεση in vivo και την επαγωγική δράση της πλειοτροπίνης στη μετανάστευση και το σχηματισμό αυλών των ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro. Το πεπτίδιο S1 βρέθηκε ότι αναστέλλει την αλληλεπίδραση της πλειοτροπίνης με την ιντεγκρίνη ανβ3, ενώ δεν επηρεάζει την αλληλεπίδρασή της με τον RPTPβ/ζ στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η ανταγωνιστική δράση μεταξύ της πλειοτροπίνης και του πεπτιδίου S1 για πρόσδεση στην ιντεγκρίνη ανβ3 θα μπορούσε να εξηγήσει την ανασταλτική δράση του πεπτιδίου στις επαγόμενες από την πλειοτροπίνη βιολογικές δράσεις, αλλά το κυριότερο, δείχνει ότι η το καρβοξυτελικό άκρο της πλειοτροπίνης είναι υπεύθυνο τμήμα για τη δέσμευσή της στην ιντεγκρίνη ανβ3. Επιπλέον, ανοίγει το δρόμο για την ανάπτυξη μορίων που θα αναστέλλουν τις δράσεις της πλειοτροπίνης μέσω της ιντεγκρίνης ανβ3 και θα μπορούν να χρησιμοποιηθούν θεραπευτικά σε καταστάσεις, στις οποίες η αλληλεπίδραση αυτή παίζει σημαντικό ρόλο. / Pleiotrophin is a growth factor that among other functions, plays a significant role on tumor growth and angiogenesis. Our group has previously shown that pleiotrophin is able to induce migration of endothelial cells through binding to its receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ). In the present study we show that a monoclonal antibody against ανβ3 but not α5β1 integrin abolished pleiotrophin-induced human endothelial cell migration in a concentration-dependent manner. Integrin ανβ3 was found to directly interact with pleiotrophin in an RGD-independent manner, whereas a synthetic peptide corresponding to the specificity loop of the β3 integrin extracellular domain (177CYDMKTTC184) inhibited pleiotrophin-ανβ3 interaction and totally abolished pleiotrophin-induced endothelial cell migration. Interestingly, ανβ3 was also found to directly interact with RPTPβ/ζ, and pleiotrophin-induced Y773 phosphorylation of β3 integrin was dependent on both RPTPβ/ζ and the downstream c-Src kinase activation, which furthermore interacts with β3 integrin. Midkine was found to interact with RPTPβ/ζ, but not with ανβ3, and caused a small but statistically significant decrease in cell migration. In the same line, pleiotrophin decreased migration of different glioma cell lines that express RPTPβ/ζ but do not express ανβ3, while it stimulated migration of U87MG cells that express ανβ3 on their cell membrane. Overexpression of β3 in glioma cells stimulated the effect of pleiotrophin on cell migration. In the same line, pleiotrophin had no effect on migration of CHO cells that do not express β3, while it induced proliferation of the same cells, stably transfected to over-express wild-type β3. In cells over-expressing mutant β3 with replacement of cytoplasmic tyrosines 773 and 785 to phenylalanines, PTN had no effect on migration, suggesting that PTN-induced phosphorylation of tyrosine 773 is required for PTN-induced cell migration. However, the fact that midkine also induces phosphorylation of tyrosine 773 suggests that it is not sufficient by itself to transducer the stimulatory effect of PTN. Collectively, these data suggest that ανβ3 is a key molecule that determines the stimulatory or inhibitory effect of pleiotrophin on cell migration. Furthermore, the mode of action of a synthetic peptide that corresponds to the last 26 aminoacids of the C-terminal region of pleiotrophin (S1 peptide) and has inhibitory effects on angiogenesis in vivo and on pleiotrophin-induced endothelial cell migration and tube formation in vitro was further clarified. The peptide was found to inhibit pleiotrophin binding to ανβ3 integrin whereas it did not affect pleiotrophin binding to RPTPβ/ζ in human endothelial cells. These data explain the inhibitory effects of peptide S1 on pleiotrophin-induced biological activities and clarify that the C-terminal region of pleiotrophin is the domain responsible for the interaction with ανβ3 integrin. Finally, peptide S1 can be used to develop effective molecules in inhibiting actions of pleiotrophin through integrin ανβ3, in order to be used for treating pathologies where pleiotrophin seems to have significant role.

Ο αυξητικός παράγοντας πλειοτροπίνη (Pleiotrophin, PTN) έχει μοριακή μάζα 18 kDa και ανήκει σε μια διακριτή οικογένεια αυξητικών παραγόντων που δεσμεύονται στην ηπαρίνη και σχετίζονται με αγγειογένεση και καρκινική ανάπτυξη. Στην παρούσα εργασία, μελετήσαμε τη συμμετοχή των ενδοκυτταρικών κινασών FAK και ILK στην επαγόμενη από PTN κυτταρική μετανάστευση σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα από φλέβα ομφάλιου λώρου (HUVEC). Εξωγενής χορήγηση ΡΤΝ επάγει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στις τυροσίνες 397 και 925, ενώ μειώνει τη φωσφορυλίωση της κινάσης FAK στη τυροσίνη 576. Η κινάση ILK φαίνεται να εμπλέκεται στη διεγερτική δράση της PTN στη μετανάστευση των κυττάρων HUVEC, αφού μείωση της έκφρασης της κινάσης ILK με παρεμβαλλόμενο RNA στα κύτταρα HUVEC, οδήγησε σε αναστολή της επαγόμενης από ΡΤΝ κυτταρικής μετανάστευσης. Επιπλέον, διέγερση των κυττάρων HUVEC με PTN είχε ως αποτέλεσμα την επαγωγή της ενεργοποίησης της κινάσης ILK. Με σκοπό να διερευνηθεί η θέση της κινάσης ILK στο μονοπάτι μεταγωγής σήματος που ενεργοποιείται από τη PTN στα κύτταρα HUVEC, μελετήσαμε την πιθανή αλληλεπίδραση της ILK με μόρια που είναι γνωστό ότι συμμετέχουν σε αυτό το μονοπάτι. Παρατηρήθηκε ότι η κινάση ILK αλληλεπιδρά σε μεγάλο βαθμό με την κινάση FAK, ενώ μικρού βαθμού αλληλεπίδραση φαίνεται και με τις ιντεγκρίνη β3 και κινάση c-Src. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η διέγερση με PTN των κυττάρων HUVEC αυξάνει την αλληλεπίδραση μεταξύ των κινασών FAK και ILK. Τέλος, με δεδομένο ότι η β-κατενίνης εμπλέκεται στη κυτταρική μετανάστευση, ερευνήσαμε κατά πόσο η PTN και η κινάση ILK εμπλέκονται στο σηματοδοτικό μονοπάτι της β-κατενίνης στα κύτταρα HUVEC. Η ΡΤΝ αυξάνει με δοσο-εξαρτώμενο και χρονο-εξαρτώμενο τρόπο τη φωσφορυλίωση της β-κατενίνης σε κύτταρα HUVEC, φαινόμενο που αναστέλλεται μετά τη μείωση της έκφρασης της κινάσης ILK με siRNA. Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία καταδεικνύεται ότι η ΡΤΝ έχει διαφορική δράση στη φωσφορυλίωση τυροσινών της κινάσης FAK διαφορετικών θέσεων και ότι η κινάση ILK συμμετέχει στη διεγερτική δράση της PTN στη μετανάστευση των κυττάρων. / Pleiotrophin (PTN) is an 18 kDa secreted growth factor that displays high affinity for heparin. A growing body of evidence indicates that PTN is involved in cell proliferation, migration and differentiation. In the present work, we studied the possible role of two intracellular kinases, focal adhesion kinase (FAK) and integrin-linked kinase (ILK), in the PTN-induced migration of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Exogenous administration of PTN significantly increased the phosphorylation of FAK kinase in tyrosines 397 and 925 and decreased phosphorylation in tyrosine 576. ILK seems to be involved in PTN-induced migration of HUVEC, since suppression of the ILK kinase using small interfering RNA (siRNA) abolished the stimulatory effect of PTN in migration of HUVEC. In addition, stimulation of HUVEC with PTN increased the ILK kinase activity. In order to determine which other signaling mediators are involved in the PTN signaling pathway, we studied the interaction of ILK with other proteins that have been implicated in the PTN-induced signal transduction. ILK strongly interacted with FAK kinase and to a lesser extent with c-src kinase and integrin ανβ3. Interestingly, PTN increased the degree of interaction between ILK and FAK kinases. Finally, it has been well described that β-catenin is involved in cell migration and that PTN increases β-catenin phosphorylation. We therefore investigated whether PTN affects β-catenin phosphorylation in HUVEC through activation of ILK kinase. PTN significantly increased phosphorylation of β-catenin in a concentration and time dependent manner, which seemed to be abolished after suppression of the ILK kinase using siRNA. Collectively, these results suggest a role of FAK and ILK kinases in the PTN-related signaling cascade which leads to cell migration both human endothelial cells.