Tierärztl. Hochsch., Diss., 2003--Hannover.

Traditional serologic assays of Actinobacillus pleuropeumoniae often have problems with cross-reactivity. To avoid the complications of antibody-antigen reactions, a PCR assay was developed to detect Actinobacillus pleuropneumoniae and identify serotype 5 strains. Primers specific to the conserved capsular export region of A. pleuropneumoniae amplified a 0.7 kb DNA band in all strains with the exception of serotype 4. A second set of primers specific to the unique capsular biosynthesis region of serotype 5 amplified a unique 1.1 kb band for serotype 5 only. The sensitivity of this assay was determined to be less than 100 colony forming units. This PCR assay enables us to detect A. pleuronpeumoniae and definitively distinguishes serotype 5 strains from other serotyes. / Master of Science

Traditional immunological assays used to serotype Actinobacillus pleuropneumoniae have been problematic due to cross- reactivity between serotypes, particularly serotypes 6 and 8. To avoid these serological cross-reactions, a multiplex PCR assay was developed to detect A. pleuropneumoniae and identify serotypes 1, 2, and 8. Primers specific to the conserved capsular polysaccharide export region of A. pleuropneumoniae serotype 5 amplified a 880 bp fragment in all serotypes excluding serotype 4 or a 489 bp DNA fragment in all serotypes including serotype 4. Primers specific to the capsular polysaccharide biosynthesis regions of A. pleuropneumoniae serotypes 1, 2, and 8 amplified a 1.6 kb, a 1.7 kb, and 970 bp fragment in the respective serotype. This PCR assay detects A. pleuropneumoniae and identifies serotypes 1, 2, and 8. / Master of Science

Thesis (M.Sc.). / Written for the Dept. of Microbiology and Immunology. Title from title page of PDF (viewed 2008/01/15). Includes bibliographical references.

Zugl.: Berlin, Freie Univ., Diss., 2010

Tierärztliche Hochsch., Diss., 2005--Hannover.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-12T17:02:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2714432 bytes, checksum: b2433146284f70c56705fc1be093c259 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T17:02:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2714432 bytes, checksum: b2433146284f70c56705fc1be093c259 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Actinobacillus pleuropneumoniae é o agente etiológico da pleuropneumonia suína, uma doença respiratória severa que resulta em significantes perdas econômicas no setor da suinocultura. Atualmente, A. pleuropneumoniae é classificado em 16 sorotipos diferentes que podem causar a doença com virulência distinta entre eles. Em Minas Gerais, Brasil, A. pleuropneumoniae é encontrado nas granjas e a maior distribuição é do sorotipo 8, sendo este até pouco tempo negligenciado em estudos de epidemiologia devido a problemas de identificação. Da mesma forma, atualmente é aceito que este sorotipo é também o de maior distribuição nos Estados Unidos, Canadá, Reino Unido além do Brasil. Até recentemente, não havia disponibilidade de genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 em banco de dados, por isso não existem informações genômicas específicas para este sorotipo, especialmente provenientes de isolados clínicos recentemente circulantes nas granjas. Neste contexto, somente a partir de 2015 os primeiros genomas foram disponibilizados para serem analisados, sendo assim sete genomas de isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 estão hoje disponíveis e estes foram analisados neste estudo. A partir das sequências genômicas dos isolados clínicos de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 foi proposto um modelo de proteoma referência desse sorotipo com um total de 2.396 proteínas categorizadas nas diferentes classes de grupos de ortólogos. Na análise comparativa realizada entre genomas de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 e demais sorotipos foi observado um padrão de conservação na organização do genoma entre esses. No entanto, foram identificadas algumas diferenças pontuais e dois segmentos genômicos diferenciais entre os genomas analisados com rearranjos e /ou inversões de 42,2 Kb e 59,6 Kb. O primeiro segmento foi encontrado nos genomas dos sorotipos 5 (L20), 7 (AP76) e em quatro dos isolados clínicos do sorotipo 8 investigados, sendo eles MV518, MV780, MV1022 e MV5651 contendo sequências de profago. O segundo segmento diferencial foi identificado apenas no genoma de A. pleuropneumoniae sorotipo 7 (AP76) e contém sequências como transposases caracterizando a presença de uma sequência de inserção no segmento. De acordo com a análise dos códons preferenciais de todos os sorotipos investigados, não foram observadas diferenças marcantes entre eles. Na análise comparativa dos proteomas, a maioria das sequências do proteoma referência de A. pleuropneumoniae sorotipo 8 que apresentaram baixa similaridade com os demais sorotipos foram caracterizadas como hipotéticas, não tendo sua função conhecida. Nessa porção diferencial específica foram relatadas sequências codificadoras relacionadas à plasmídeos o que caracteriza possíveis eventos de transferência horizontal de genes (THG) ao longo da história evolutiva do genoma e fatores de resistência a antibióticos como cloranfenicol, sulfonamida e tetraciclina. Na análise de similaridade entre os proteomas houve maior similaridade das proteínas do proteoma referência do sorotipo 8 com as proteínas do sorotipo 6, o que pode estar associado à dificuldade em separar esses sorotipos nas técnicas de sorotipagem. Com as análises comparativas e a caracterização das diferenças entre os sorotipos e isolados será possível compreender os mecanismos de virulência dos isolados de A. pleuropneumoniae e identificar potenciais candidatos vacinais mais eficientes. / Actinobacillus pleurapneumoniae is the causative agent of porcine pleuropneumonia, a severe respiratory illness that it results in significant economic losses in the swine industry. Currently, A. pleuropneumoniae is classified into 16 different serotypes that it can cause disease with distinct virulence between them. In Minas Gerais, Brazil, A. pleuropneumoniae is found on the farms and the largest distribution is of serotype 8, which, until shortly time, it was neglected in epidemiological studies because of the identification problems. Similarly, it is currently accepted that this serotype is also the most widely distributed in the United States of America, Canada, the United Kingdom as well as Brazil. Until recently, there was no availability of genomes of A. pleuropneumoniae serotype 8 in the database, because of this, there are no specific genomic information for this serotype, especially from of the clinical isolates that, recently, it are circulating on the farms. In this context, only from 2015, the first genomes were available to be analysed, so, today there are seven genomes of clinical isolates of A. pleuropneumoniae serotype 8 available and these were analyzed in this study. From the genomic sequences of clinical isolates of A. pleuropneumoniae serotype 8 was proposed a model of proteome which it is reference for this serotype with a total of 2.396 proteins categorized into different classes of orthologous groups. In a comparative analysis of genomes of A. pleuropneumoniae serotype 8 and other serotypes, it was observed a pattern of conservation in the organization of the genome between these. However, it were identified some specific differences and two genomic segments differentials between the genomes analyzed with rearrangements and/or reversals of 42.2 Kb and 59.6 Kb. The first segment was found in the genome of the serotype 5 (L20), 7 (AP76) and in four of the clinical isolates of serotype 8 that it were investigated: MV518, MV780, MV1022 and MV5651, which it containing prophage sequences. The second differential segment was identified only in the genome of A. pleuropneumoniae serotype 7 (AP76) and it contains sequences as transposases that it characterizes the presence of an insertion sequence in the segment. Regarding the use and the preference of codons between the serotypes investigated, there were no significant differences among them. In the comparative analysis of proteomes, the sequences of the reference proteome of A. pleuropneumoniae serotype 8, which it showed low similarity with the remaining serotypes, it were identified as hypothetical, it does not having its known function. In this specific differential portion, coding sequences associated to plasmids were described, that it characterize possible events by horizontal transfers of genes (HTG) throughout the evolutionary history of the genome and antibiotic resistance factors, such as chloramphenicol, tetracycline and sulfonamide. In the similarity analysis between the proteomes, there was greater similarity of the proteome reference of serotype 8 with the proteins of the serotype 6, which it may be associated on difficulty to separate these serotypes in the serotyping techniques. With the comparative analysis and the characterization of the differences between the serotypes and the isolates, it will be possible to understand the virulence mechanisms of the isolates of A. pleuropneumoniae and to identify vaccine candidate potential more effective.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A infecção por Actinobacillus pleuropneumoniae, doença conhecida como pleuropneumonia suína, assumiu grande importância na suinocultura moderna devido à alta ocorrência observada nos rebanhos. O impacto da doença está relacionado à capacidade do agente em causar pneumonia severa, levando os animais a óbito ou doença crônica, resultando em graves prejuízos zootécnicos. Diante desse cenário, o controle e monitoramento do agente se faz importante por meio da identificação dos diferentes sorotipos, da análise genética e da determinação dos perfis de resistência aos antimicrobianos. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotípica e genotípicamente estirpes de Actinobacillus pleuropneumoniae isoladas a partir de quadros de pneumonia em suínos. Um total de 85 estipes de A. pleuropneumoniae foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para identificação e sorotipagem, determinação da concentração inibitória mínima de antimicrobianos, polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP) e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Os sorotipos mais frequentes foram: 5 (38,8%), 10 (29,4%), 7 (5,9%), 8 (5,9%) e 6 (3,5%), sendo que 14 (16,5%) estirpes foram não tipáveis. Foi observada alta heterogeneidade de perfil genético entre as estirpes analisadas, tanto pelo AFLP quanto pelo PFGE, e o índice discriminatório para cada técnica foi 0,97 e 0,84, respectivamente. Todas as estirpes foram sensíveis ao ceftiofur, gentamicina, tulatromicina e tilmicosina, sendo que 98,8% das estirpes foram resistentes à tilosina e altas taxas de resistência foram observadas ainda para as tetraciclinas, clindamicina e sulfadimetoxina. / Infection by Actinobacillus pleuropneumoniae, a disease known as swine pleuropneumonia, has gained greater relevance to modern pig farming due to the high recurrence rate observed in herds. The impact of the disease relates to the capacity of the agent to cause severe pneumonia, leading to animal death or chronic conditions, thus resulting in severe zootechnical losses. In view thereof, the control and monitoring of the agent is key, being performed through the identification of different serotypes, genetic analysis and determination of antimicrobial resistance profiles. The objective of this study was to characterize phenotypically and genotypically Actinobacillus pleuropneumoniae strains isolated from swine with clinical presentation of pneumonia. A total of 85 strains of A. pleuropneumoniae were subject to polymerase chain reaction (PCR) for identification and serotyping, determination of the minimal inhibitory concentration, amplified fragment length polymorphism (AFLP) and pulsed field gel electrophoresis typing techniques (PFGE). Most recurring serotypes were: 5 (38.8%), 10 (29.4%), 7 (5.9%), 8 (5.9%) and 6 (3.5%), of which 14 (16.5%) strains were nontypeable. High genetic heterogeneity was observed for both AFLP and PFGE, and the discriminatory index for each technique was 0.97 and 0.84, respectively. All 85 strains were susceptible to ceftiofur, gentamicin, tulatromicin and tilmicosin, 84 of which were resistant to tylosin, and high resistance rates were also observed for clindamycin, tetracyclines and sulfadimethoxine.

A infecção por Actinobacillus pleuropneumoniae, doença conhecida como pleuropneumonia suína, assumiu grande importância na suinocultura moderna devido à alta ocorrência observada nos rebanhos. O impacto da doença está relacionado à capacidade do agente em causar pneumonia severa, levando os animais a óbito ou doença crônica, resultando em graves prejuízos zootécnicos. Diante desse cenário, o controle e monitoramento do agente se faz importante por meio da identificação dos diferentes sorotipos, da análise genética e da determinação dos perfis de resistência aos antimicrobianos. O objetivo do presente estudo foi caracterizar fenotípica e genotípicamente estirpes de Actinobacillus pleuropneumoniae isoladas a partir de quadros de pneumonia em suínos. Um total de 85 estipes de A. pleuropneumoniae foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase (PCR) para identificação e sorotipagem, determinação da concentração inibitória mínima de antimicrobianos, polimorfismo do comprimento de fragmentos amplificados (AFLP) e eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE). Os sorotipos mais frequentes foram: 5 (38,8%), 10 (29,4%), 7 (5,9%), 8 (5,9%) e 6 (3,5%), sendo que 14 (16,5%) estirpes foram não tipáveis. Foi observada alta heterogeneidade de perfil genético entre as estirpes analisadas, tanto pelo AFLP quanto pelo PFGE, e o índice discriminatório para cada técnica foi 0,97 e 0,84, respectivamente. Todas as estirpes foram sensíveis ao ceftiofur, gentamicina, tulatromicina e tilmicosina, sendo que 98,8% das estirpes foram resistentes à tilosina e altas taxas de resistência foram observadas ainda para as tetraciclinas, clindamicina e sulfadimetoxina. / Infection by Actinobacillus pleuropneumoniae, a disease known as swine pleuropneumonia, has gained greater relevance to modern pig farming due to the high recurrence rate observed in herds. The impact of the disease relates to the capacity of the agent to cause severe pneumonia, leading to animal death or chronic conditions, thus resulting in severe zootechnical losses. In view thereof, the control and monitoring of the agent is key, being performed through the identification of different serotypes, genetic analysis and determination of antimicrobial resistance profiles. The objective of this study was to characterize phenotypically and genotypically Actinobacillus pleuropneumoniae strains isolated from swine with clinical presentation of pneumonia. A total of 85 strains of A. pleuropneumoniae were subject to polymerase chain reaction (PCR) for identification and serotyping, determination of the minimal inhibitory concentration, amplified fragment length polymorphism (AFLP) and pulsed field gel electrophoresis typing techniques (PFGE). Most recurring serotypes were: 5 (38.8%), 10 (29.4%), 7 (5.9%), 8 (5.9%) and 6 (3.5%), of which 14 (16.5%) strains were nontypeable. High genetic heterogeneity was observed for both AFLP and PFGE, and the discriminatory index for each technique was 0.97 and 0.84, respectively. All 85 strains were susceptible to ceftiofur, gentamicin, tulatromicin and tilmicosin, 84 of which were resistant to tylosin, and high resistance rates were also observed for clindamycin, tetracyclines and sulfadimethoxine.