Regulation of gene expression using small interfering RNA (siRNA) is a promising strategy for research and treatment of numerous diseases. However, siRNA cannot easily cross the cell membrane due to its inherent instability, large molecular weight and anionic nature. For this reason, a carrier that protects, delivers and unloads siRNA is required for successful gene silencing. The goal of this research was to develop a potential siRNA delivery system for in vitro and in vivo applications using cationic polymers, chitosan and polyethylenimine (PEI), poly(ethylene glycol) (PEG), mannose, and poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA). Furthermore, the delivery system was constructed in two different ways to explore the effect of mannose location in the structure. In the first approach, mannose and PEG were directly conjugated to the chitosan/PEI backbone, while mannose was connected to the chitosan/PEI backbone through PEG spacer in the second approach. First, the ability of modified chitosan polymers to complex and deliver siRNA for gene silencing was investigated. Despite the modified chitosan polymers successfully formed nanoplexes with siRNA, entered target cells and reduced cytotoxicity of unmodified chitosan, they showed limited gene silencing efficiency. For this reason, modified PEIs were examined to improve in vitro gene knockdown. The modified PEI polymers also complexed with siRNA and facilitated endocytosis of the nanoplexes. In addition, the modifications reduced inherent cytotoxicity of unmodified PEI without compromising the gene silencing efficiency on both mRNA and protein levels. Interestingly, we found that complexation of siRNA with PEI-PEG-mannose resulted in higher cell uptake and gene silencing than complexes made with mannose-PEI-PEG. Finally, the effect of sustained release of the mannosylated pegylated PEI/siRNA nanoplexes on gene silencing was tested by encapsulating the nanoplexes within PLGA microparticles. The modified PEIs enhanced the entrapment efficiency of siRNA into the particles and resulted in reduced initial burst followed by sustained release. Incorporating the modified PEIs increased cellular uptake of siRNA, whereas it did not enhance in vitro gene knockdown efficiency due to the sustained release properties. The modified PEIs reduced the in vitro cytotoxicity and in vivo hepatotoxicity of the PLGA microparticles. In addition, encapsulating the nanoplexes into PLGA microparticles further reduced the cytotoxicity of PEI. Throughout the study, the second structure was proven more efficacious than the first structure in cellular uptake, gene silencing, siRNA encapsulation, and sustained release. We have developed novel polymeric siRNA delivery systems that enhance delivery efficiency and cellular uptake of siRNA. They have great potential for utility as a long-acting siRNA delivery system in biomedical research.

Effect of ionic strength on the efficiency of heavy metal removal and recovery from aqueous solutions via continuous mode polymer enhanced ultrafiltration (PEUF) method was examined. Application of PEUF to divalent ions of cadmium, nickel and zinc after their prior linking with polyethylenimine (PEI) results in complete removal of metal ions from single component aqueous solutions at high pHs. Binding ability and hence the extent of metal retention in high ionic strength medium exhibits differences between solutions containing single and multicomponent metal mixtures. In single component metal solutions, extent of retention decreases but binding order of metals remains unaffected both in low and high ionic strength medium. But, in binary component metal mixtures, with increase in ionic strength the binding order of metals changes. Fractional separation of Cd, Ni and Zn ions from equimolar binary and ternary mixtures of these metals and effect of ionic strength on fractional separation efficiency were investigated. Depending on pH and salt concentration and metal pairs present in the solution fractional separation can be achieved.Dynamic and static light scattering experiments were performed in order to gain insight about the conformational changes in PEI structure due to the pH and ionic strength alternations in solution. It was found that, the increase in ionic strength reduces the size of the macromolecules. A chemical equilibrium model was developed in order to estimate the apparent binding constants of metal-PEI complexes. Based on the data obtained from continuous and batch mode PEUF experiments apparent binding constants were estimated and compared to reveal the performance differences between these operational modes.

La filière OLED (diode électroluminescente organique) est depuis quelques annéesfortement industrialisée notamment depuis leur utilisation dans les smartphones et les téléviseurs.Cependant, les procédés de fabrication, notamment l’évaporation thermique sous vide, restent coûteuxet ne peuvent pas être utilisés pour développer des applications à faible valeur ajoutée (petitsafficheurs, signalétique, éclairage). Ces travaux de thèse ont pour objectif de développer une OLEDperformante et stable fabriquée à coût réduit afin de répondre à cette problématique. La voie liquide aété privilégiée afin de diminuer les coûts de fabrication de l’OLED et il a été choisi de développer unestructure inverse pour améliorer la stabilité. Dans ce travail de thèse, le polymère PEIE(polyéthylénimine éthoxylate) a été utilisé pour diminuer le travail de sortie de la cathode transparente.Nous avons montré qu’il était possible d’atteindre des performances supérieures en structure inversequ’en structure conventionnelle à partir du même polymère émissif, le Super Yellow. Afin desimplifier le procédé de dépôt, nous avons montré qu’un mélange binaire {PEIE et matériau bloqueurde trous} pouvait être déposé en une seule fois tout en conservant un fonctionnement optimal. Uneétude par TOF-SIMS (Spectrométrie de Masse d’Ions Secondaires à Temps de Vol) a permis de mettreen évidence une ségrégation verticale du mélange binaire. Par ailleurs, l’électrode en oxyde d’étainindium(ITO), qui représente généralement plus d’un quart du coût de fabrication, a été remplacéeavec succès par une électrode de SnO2 (oxyde d’étain), déposée par ALD (dépôt de couches mincesatomiques). / OLED (Organic Light-Emitting Diode) technology has been exploited on an industrialscale for several years, principally in smartphones, TV displays, and similar devices. However, currentfabrication processes, such as thermal evaporation under high vacuum, are expensive and cannot beused for low-cost applications (signage, lighting, etc.). This work aims to develop high-performance,stable, low-cost OLEDs. Fabrication by solution processing was chosen to reduce the processing costsin any future commercialization of the work, while the inverted architecture was used to optimizedevice stability. In this work, ethoxylated polyethylenimine (PEIE) was used to reduce the workfunction of the transparent cathode. It was shown that higher performances could be obtained withinverted OLEDs compared to direct devices incorporating the same emissive polymer (Super Yellow).Furthermore, it was demonstrated that a binary blend, (PEIE and a hole blocking material) could bedeposited in a single step without reducing the OLED device’s performance – greatly simplifying thefabrication process. A TOF-SIMS (Time of Flight-Secondary Ion Mass Spectrometry) study wasconducted which demonstrated a vertical phase segregation of the binary blend. Finally, the indiumtinoxide (ITO) electrode, which represents at least 25% of the fabrication cost, was successfullyreplaced with a tin oxide (SnO2) layer, deposited by ALD (Atomic Layer Deposition).

Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au développement d’un nouveau biocapteur enzymatique ultrasensible pour la détection conductimétrique d’une mycotoxine, l’ochratoxine A (OTA). Une peptidase, la thermolysine (TLN), a été choisie comme élément de reconnaissance. Le biocapteur proposé est basé sur l’immobilisation de la TLN dans une matrice d’alcool polyvinylique (PVA)/polyéthylènimine (PEI) contenant des nanoparticules d’or et réticulée à la surface de microélectrodes interdigitées à l’aide de vapeurs de glutaraldéhyde. Dans les conditions optimales (35 min de réticulation, mesure à pH 7 et 25°C), la réponse du biocapteur est linéaire jusqu’à 60 nM et la limite de détection est de 1 nM. Cette valeur est 700 fois plus basse que celle obtenue en utilisant une méthode d’immobilisation basée sur la co-réticulation de la TLN en présence d’albumine de sérum bovin (BSA). La matrice PVA/PEI crée un environnement aqueux favorable à l’enzyme. Par ailleurs, les interactions entre les groupements amines protonés du PEI et les charges négatives des nanoparticules citratées et de la TLN améliore leur dispersion dans la matrice et favorise la stabilisation de l’enzyme et son accessibilité au substrat (OTA). Le biocapteur conductimétrique développé est très reproductible et stable pendant 30 jours lorsqu’il est stocké à 4°C dans du tampon phosphate 20 mM pH7 entre 2 mesures. Le biocapteur a ensuite été évalué sur des échantillons d’huile d’olive commerciale dopée. Aucun prétraitement de l’échantillon n’a été nécessaire et des taux de recouvrement proches de 100% ont été obtenus, démontrant l’absence d’effet de matrice / A new ultrasensitive enzymatic biosensor for the direct conductometric detection of ochratoxin A (OTA) has been developed in this work. Thermolysin (TLN), a peptidase, was chosen as recognition element. The proposed biosensor is based on TLN immobilization into a polyvinyl alcohol (PVA)/polyethylenimine (PEI) matrix containing gold nanoparticles (AuNPs) and cross-linked at the surface of gold interdigitated microelectrodes using glutaraldehyde vapor. Under optimal conditions (35 min cross-linking time, working pH of 7 and temperature of 25◦C), the biosensor response was linear up to 60 nM OTA and the limit of detection was 1 nM. This value was 700 times lower than the detection limit obtained using the more classical method based on enzyme cross-linking in the presence of bovine serum albumin (BSA). PVA/PEI hydrogel creates a very favorable aqueous environment for the enzyme. In addition, interactions between protonated amino groups of PEI and negative charges of both citrated AuNPs and thermolysin improve their dispersion in the polymer blend, favoring enzyme stabilization and accessibility to the substrate (OTA). The developed OTA biosensor was very reproducible and stable over a 30 days period when stored at 4◦C in 20 mM phosphate buffer between two measurements. The method was further evaluated using commercial doped olive oil samples. No pretreatment of the sample was needed for testing and no matrix effect was observed. Recovery values were close to 100%, demonstrating the suitability of the proposed method for OTA screening in olive oil

Recombinant proteins belong to considerable biofarmaceutics products used in biomedical research and in the treatment of human disease. Recombinant protines can be produced by stable transfection in big amount or by faster transient transfection with smaller amounts. To provide regular biological activity, it is necessary for the protein to be properly folded and post-translationally modified. As these modifications can be accurately performed only in mammalian cells, they have become the major host for complex r-protein expression. In this thesis is described transient transfection HEK 293 EBNA1 cells with linear polyethylenimines. These cells has been adapted to suspension cultivation in serum free medium. The cells were transfected with pcDNA3.1, pCI, pEBSV1, pCEP4, pEAK8 a pcDNA5/FRT/TO plasmids, everyone contained repoter gene SEAP. Concentration of SEAP in cell culture supernatants were determined in order to compare efficiencies of individual transfections. DNA:PEI ratio was another factor which was optimised and two different PEIs were compared. Highest achieved expresion was 50 mg per litre with transfection in 24 well plate when DNA:PEI ratio was 1:5. Comparison of six different plasmids give the bigest expresion pCEP4/SEAP, in well plate as well as in scaled up system.

Moderne analytische Verfahren ermöglichen eine höchst effiziente Auftrennung und eine selektive Detektion von Zielanalyten. Dies ist vor allem in der Medizin von Bedeutung, da eine frühzeitige Diagnose von Krankheiten in den meisten Fällen zu einer wesentlich erfolgreicheren Behandlung beiträgt. In unserer heutigen Industriegesellschaft werden daher hochsensitive und effiziente Analysemethoden stärker benötigt als je zuvor. Diverse Umweltgifte oder gesundheitliche Schadstoffe gelangen vermehrt in Grundwasser und Umwelt. Eine Analyse ist aufgrund der oft nur geringen Konzentrationen und der Komplexität diverser Proben häufig mit großen Schwierigkeiten verbunden. Obwohl die Sensitivität und Effizienz zur Bestimmung von Krankheitsmarkern (Biomarker) und Schadstoffen immer weiter zunimmt, stoßen selbst höchstsensitive Analysemethoden an ihre Grenzen. Gerade bei kleinsten Konzentrationen an Zielanalyten oder bei komplexen Gemischen ist eine direkte Detektion ohne weitere Vorbehandlung, wie Aufkonzentrierungen oder Markierungen, äußerst schwierig oder nicht möglich. Eine Optimierung dieser Methoden, deren Automatisierung sowie sensitivere Detektorsysteme werden benötigt. Darüber hinaus ist die Entwicklung von neuartigen, selektiveren mobilen und stationären Phasen ein hochinteressantes und umfangreich untersuchtes Forschungsgebiet. Die Verwendung von hochselektiven Additiven, wie Cyclodextrinen, Kronenethern, Mizellen und andere chirale Selektoren in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Kapillarelektrophorese (CE)[1,2] oder in der Dünnschicht-Chromatographie (TLC)[3] wurde bereits umfangreich untersucht und etabliert. Hochfunktionalisierte Polymere als äußerst spezifische Selektoren mit hoher Selektivität stellen vielversprechende Materialien dar, die ebenfalls eine Optimierung in der HPLC und CE erzielen.[4-9] Der Einsatz von Polymeren in molekular geprägten Matrizen (molecular imprinted polymers, MIP) oder in monolithischen Trennsäulen wird bereits äußerst erfolgreich in der TLC, HPLC und CE genutzt.[7-11] Eine solch hochselektive Säulenmodifizierung bietet eine sehr gute Performance und hervorragende Trennleistungen. Ein Nachteil dieser hochselektiven Modifizierung ist jedoch die Spezialisierung nur auf das jeweilige Problem. Eine universelle Verwendung für komplexe Gemische und eine Fülle von Analyten ist limitiert. Ein sehr vielversprechender Aspekt ist der Einsatz von Polymeren als chirale Selektoren in der stationären wie auch in der mobilen Phase. Die große Anzahl an kommerziell erhältlichen Trennsäulen mit einer Polymermodifizierung und das ständig umfangreichere Angebot solcher Säulen[12] verdeutlichen diesen Trend und zeigen, dass die Nutzung von polymeren Architekturen für eine weitere Optimierung diverse Möglichkeiten bietet. Hochverzweigte Polymere stellen unter den Polymeren vielversprechende Materialien dar, die aufgrund ihrer Vorteile zu einer effektiven Optimierung beitragen können.[12] Die hohe Anzahl an terminalen Gruppen ermöglichen es, gut zugängliche anwendungsorientierte Modifizierungen durchzuführen, um gewünschte Eigenschaften zu generieren. Durch die hohe Variabilität der Polymere selbst und der diversen Modifizierungsmöglichkeiten zeigen maßgeschneiderte Polymere ein enormes Potential und die Möglichkeit hochselektive Wechselwirkungen mit Zielanalyten zu etablieren. Die Modifizierung mit einer Schale um den polymeren Kern ermöglicht weitere Optimierungen für den Einsatz von Kern-Schale-Architekturen. Beispiele hierfür sind unter anderem die Vermittlung höherer Löslichkeit durch eine Modifizierung des hydrophilen/hydrophoben polymeren Kerns zur Etablierung einer äußeren Schale. Ebenso können durch die Modifizierung gezielte Eigenschaften generiert werden, die eine spezifische Interaktion mit Oberflächen oder Wirkstoffen ermöglichen. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist die Synthese und die Untersuchung von Kern-Schale-Architekturen als chromatographische Selektoren. Als polymerer Kern wird hochverzweigtes Poly(ethylenimin) (PEI) verwendet, das mit einer Oligosaccharidschale modifiziert wird. Das PEI wird mit den Kerngrößen 5 und 25 kDa verwendet, wodurch eine Untersuchung des Kerneinflusses möglich ist. Weiterhin wird die Dichte der Oligosaccharidschale eingestellt. Dafür wird eine dichte, moderate bis offene und eine sehr offene Oligosaccharidschale um den polymeren Kern generiert. Infolge dessen kann der Einfluss der Schalendichte auf die Interaktion mit Beispielanalyten evaluiert werden. Für die Oligosaccharidschale (OS) werden darüber hinaus drei verschiedene Oligosaccharide (Maltose, Lactose und Maltotriose) verwendet, um den Einfluss der Art der Schale zu prüfen. Durch diese Variationen können 15 unterschiedliche PEI-OS Kern-Schale-Architekturen synthetisiert und untersucht werden. Weiterhin soll der hydrophobe Anteil der Kern-Schale-Architekturen durch die Anbindung von unpolaren Seitenketten an einen PEI-Kern erhöht werden. Auf diese Art und Weise können nicht-kovalente Wechselwirkungen mit lipophilen Systemen untersucht werden. Um polymere Kern-Schale-Architekturen möglichst effizient in der TLC, HPLC und CE einsetzen zu können, ist es essentiell, ihre Eigenschaften und die Art und Weise der Wechselwirkungen zu kennen, die sie mit möglichen Gastmolekülen eingehen. Durch die Untersuchung dieser Wechselwirkungen können Informationen über deren Interaktionen und eine mögliche Manipulation bzw. Optimierung dieser erhalten werden. Ein zielgerichteter und effektiver Einsatz mit diesen Kern-Schale Architekturen kann so vorbereitet werden. [1] T. J. Ward, K. D. Ward, Anal. Chem. 2012, 84, 626-35. [2] W. J. Cheong, S. H. Yang, F. Ali, J. Sep. Sci. 2013, 36, 609-28. [3] M. D. Bubba, L. Checchini, L. Lepri, Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 533-554. [4] M. Hanson, K. K. Unger, Trends Anal. Chem. 1992, 11, 368-373. [5] J. Kirkland, J. Chromatogr. A 2004, 1060, 9-21. [6] F. Gasparrini, D. Misiti, R. Rompietti, C. Villani, J. Chromatogr. A 2005, 1064, 25-38. [7] A. Martin-Esteban, Trends Anal. Chem. 2013, 45, 169-181. [8] I. Nischang, J. Chromatogr. A 2013, 1287, 39-58. [9] R. D. Arrua, M. Talebi, T. J. Causon, E. F. Hilder, Anal. Chim. Acta 2012, 738, 1-12. [10] P. Jandera, J. Chromatogr. A 2013, 1313, 37-53. [11] F. Svec, J. Sep. Sci. 2004, 27, 1419-1430. [12] M. Tang, J. Zhang, S. Zhuang, W. Liu, Trends Anal. Chem. 2012, 39, 180-194.

La possibilité de programmer une cellule dans le but de produire une protéine d’intérêt est apparue au début des années 1970 avec l’essor du génie génétique. Environ dix années plus tard, l’insuline issue de la plateforme de production microbienne Escherichia coli, fut la première protéine recombinante (r-protéine) humaine commercialisée. Les défis associés à la production de r-protéines plus complexes et glycosylées ont amené l’industrie biopharmaceutique à développer des systèmes d’expression en cellules de mammifères. Ces derniers permettent d’obtenir des protéines humaines correctement repliées et de ce fait, biologiquement actives. Afin de transférer le gène d’intérêt dans les cellules de mammifères, le polyéthylènimine (PEI) est certainement un des vecteurs synthétiques le plus utilisé en raison de son efficacité, mais aussi sa simplicité d’élaboration, son faible coût et sa stabilité en solution qui facilite son utilisation. Il est donc largement employé dans le contexte de la production de r-protéines à grande échelle et fait l’objet d’intenses recherches dans le domaine de la thérapie génique non virale. Le PEI est capable de condenser efficacement l’ADN plasmidique (vecteur d’expression contenant le gène d’intérêt) pour former des complexes de petites tailles appelés polyplexes. Ces derniers doivent contourner plusieurs étapes limitantes afin de délivrer le gène d’intérêt au noyau de la cellule hôte. Dans les conditions optimales du transfert de gène par le PEI, les polyplexes arborent une charge positive nette interagissant de manière électrostatique avec les protéoglycanes à héparane sulfate (HSPG) qui décorent la surface cellulaire. On observe deux familles d’HSPG exprimés en abondance à la surface des cellules de mammifères : les syndécanes (4 membres, SDC1-4) et les glypicanes (6 membres, GPC1-6). Si l’implication des HSPG dans l’attachement cellulaire des polyplexes est aujourd’hui largement acceptée, leur rôle individuel vis-à-vis de cet attachement et des étapes subséquentes du transfert de gène reste à confirmer. Après avoir optimisées les conditions de transfection des cellules de mammifères CHO et HEK293 dans le but de produire des r-protéines secrétées, nous avons entrepris des cinétiques de capture, d’internalisation des polyplexes et aussi d’expression du transgène afin de mieux comprendre le processus de transfert de gène. Nous avons pu observer des différences au niveau de ces paramètres de transfection dépendamment du système d’expression et des caractéristiques structurelles du PEI utilisé. Ces résultats présentés sous forme d’articles scientifiques constituent une base solide de l’enchaînement dans le temps des évènements essentiels à une transfection efficace des cellules CHO et HEK293 par le PEI. Chaque type cellulaire possède un profil d’expression des HSPG qui lui est propre, ces derniers étant plus ou moins permissifs au transfert de gène. En effet, une étude menée dans notre laboratoire montre que les SDC1 et SDC2 ont des rôles opposés vis-à-vis du transfert de gène. Alors que tous deux sont capables de lier les polyplexes, l’expression de SDC1 permet leur internalisation contrairement à l’expression de SDC2 qui l’inhibe. De plus, lorsque le SDC1 est exprimé à la surface des cellules HEK293, l’efficacité de transfection est augmentée de douze pourcents. En utilisant la capacité de SDC1 à induire l’internalisation des polyplexes, nous avons étudié le trafic intracellulaire des complexes SDC1 / polyplexes dans les cellules HEK293. De plus, nos observations suggèrent une nouvelle voie par laquelle les polyplexes pourraient atteindre efficacement le noyau cellulaire. Dans le contexte du transfert de gène, les HSPG sont essentiellement étudiés dans leur globalité. S’il est vrai que le rôle des syndécanes dans ce contexte est le sujet de quelques études, celui des glypicanes est inexploré. Grâce à une série de traitements chimiques et enzymatiques visant une approche « perte de fonction », l’importance de la sulfatation comme modification post-traductionnelle, l’effet des chaînes d’héparanes sulfates mais aussi des glypicanes sur l’attachement, l’internalisation des polyplexes, et l’expression du transgène ont été étudiés dans les cellules CHO et HEK293. L’ensemble de nos observations indique clairement que le rôle des HSPG dans le transfert de gène devrait être investigué individuellement plutôt que collectivement. En effet, le rôle spécifique de chaque membre des HSPG sur la capture des polyplexes et leur permissivité à l’expression génique demeure encore inconnu. En exprimant de manière transitoire chaque membre des syndécanes et glypicanes à la surface des cellules CHO, nous avons déterminé leur effet inhibiteur ou activateur sur la capture des polyplexes sans pouvoir conclure quant à l’effet de cette surexpression sur l’efficacité de transfection. Par contre, lorsqu’ils sont présents dans le milieu de culture, le domaine extracellulaire des HSPG réduit l’efficacité de transfection des cellules CHO sans induire la dissociation des polyplexes. Curieusement, lorsque chaque HSPG est exprimé de manière stable dans les cellules CHO, seulement une légère modulation de l’expression du transgène a pu être observée. Ces travaux ont contribué à la compréhension des mécanismes d'action du vecteur polycationique polyéthylènimine et à préciser le rôle des protéoglycanes à héparane sulfate dans le transfert de gène des cellules CHO et HEK293. / With the aim to express a protein of interest, the transfer of exogenous genetic material into host cells was established in early 70s with the development of genetic engineering. Approximately ten years later, insulin was the first human recombinant protein (r-protein) produced at large scale in Escherichia coli and commercialized. Challenges associated with the production of more complex and glycosylated r-proteins brought the pharmaceutical industry to develop mammalian expression platforms. Thus, the expressed r-proteins are correctly folded and biologically actives. As a means to transfer genetic materials of interest into mammalian cells, the synthetic vector polyethylenimine (PEI) is probably the most popular due to its efficacy, ease of use, cost-effectiveness and stability in solution. Consequently, PEI is largely employed for the production of r-proteins by large scale and extensively studied in the context of non-viral gene therapy. PEI is capable to efficiently condense plasmid DNA (expression vector containing the gene of interest) to form small nanoparticles termed polyplexes. The latter must circumvent several steps to deliver the gene of interest to the cell nucleus. When formed at the optimum conditions, polyplexes exhibit a net positive charge which can interact electrostatically with negatively charged heparan sulfate proteoglycans (HSPG) located at the cell surface. There are two major families of HSPG that are largely expressed at the surface of mammalian cells: the syndecans (4 members, SDC1-4) and the glypicans (6 members, GPC1-6). Although it is generally accepted that HSPG are involved in the binding of polyplexes, their individual role toward polyplex binding and the subsequent phases of gene transfer need to be confirmed. Following optimization of the mammalian CHO and HEK293 cells transfection conditions, we undertook an in-depth study of polyplexes uptake, internalization kinetics, as well as transgene expression kinetics with the aim to better understand the mechanisms underlying gene transfer. We observed several contrasting differences between the two cell lines and the type of PEI used. Our results presented as a scientific article, establish strong basis of the gene transfer process over-time. Every cell type possesses its own expression profile of HSPG which can display individual potency toward gene transfer. Indeed, a preliminary study conducted in our laboratory showed that SDC1 and SDC2 have distinct features with regard to gene transfer. While both are capable to bind polyplexes at the cell surface, the expression of SDC1 enhances polyplexes internalization whereas the expression of SDC2 drastically inhibits it. Furthermore, when SDC1 is expressed at the surface of HEK293 cells, the transfection efficiency is increased by twelve percent compared to control cells. By using the ability of SDC1 to mediate efficient internalization of polyplexes, we have studied the intracellular traffic of SDC1 / polyplexes complexes. Our conclusions lead to new insights concerning the path by which polyplexes can mediate efficient transfection. In the context of gene transfer, HSPG have been essentially studied in their entirety. Although the role of syndecans is the subject of some studies, that of glypicans is unexplored. Thanks to a series of chemical and enzymatic treatments leading to « loss of functions », the importance of sulfation as post-translational modification, the effect of HS chains and of glypicans on the attachment, internalization of polyplexes as well as transgene expression were investigated in CHO and HEK293 cells. Taken together, our observations indicate clearly that the role of HSPG should be investigated individually instead of collectively. Consequently, the individual potency of each HSPG member regarding gene transfer remains to be defined. We demonstrated that, in fact, the transient expression of some HSPG in CHO cells have a beneficial effect on polyplexes uptake while others have a negative effect. Unfortunately, this method did not allow concluding about their effect on transfection efficacy. However, when present in the culture medium, the extracellular domain of HSPG decreases transfection efficacy of CHO cells without inducing polyplexes dissociation. Strangely, when each HSPG is stably expressed in CHO cells, only subtle modulations of the gene expression level were observed. This study contributed to a better understanding of the mechanisms underlying PEI mediated gene transfer in CHO and HEK293 cells and clarify the role of HSPG in gene transfer.

Nous avons optimisé des liposomes thermosensibles, encapsulant un principe actif anticancéreux, le 5-Fluorouracile (5-FU), afin de déclencher sa libération par une hyperthermie locale modérée (39-42°C) induite par des ultrasons focalisés. L'hyperthermie sera appliquée au niveau de la tumeur, afin d'améliorer l’efficacité thérapeutique et de réduire la toxicité systémique. Les liposomes ont été formulés par hydratation du film lipidique en mélangeant la 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DPPC) pour sa thermosensibilité à 41,5 ± 0,5°C, le cholestérol (CHOL) pour favoriser la stabilité des liposomes vis-à-vis des composants du sang, et le 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[méthoxy(polyéthylène glycol)-2000] (DSPE-PEG) pour assurer la furtivité de la formulation. Les expériences ont confirmé que les liposomes formulés à base de DPPC/CHOL/DSPE-PEG dans un ratio molaire 90 : 5 : 5 mol% sont thermosensibles. Des liposomes composés du même mélange lipidique dans un rapport 65 : 30 : 5 mol% ont été considérés comme contrôle négatif non thermosensible. L’optimisation de l’encapsulation passive du 5-FU a permis d’obtenir une efficacité d’encapsulation (5-FU encapsulé/5-FU total) de 13%, mais le 5-FU est très faiblement retenu (12%) dans la cavité aqueuse des liposomes du fait du gradient osmotique à la dilution. La rétention du 5-FU a été optimisée (93%) par la technique d’encapsulation active basée sur la complexation intraliposomale du 5-FU avec le complexe cuivre-polyéthylèneimine préalablement encapsulé dans les liposomes. Cette technique a également permis d’améliorer l’efficacité d’encapsulation d’un facteur trois environ (37%), avec un taux de charge (ratio final 5-FU/lipides, mole/mole) de 50% environ. Nous avons alors obtenu des liposomes thermosensibles d'un diamètre hydrodynamique de 65 nm et de charge de surface de -10 mV. Les liposomes non thermosensibles, ont été caractérisés par un diamètre hydrodynamique de 105 nm et une charge de surface de -4,9 mV. La libération du 5-FU déclenchée par une hyperthermie induite par des ultrasons focalisés a été mesurée in vitro. En réponse à une hyperthermie de 42°C, les liposomes thermosensibles libèrent 68% de leur contenu, au bout de 10 min, alors que les liposomes non thermosensibles en libèrent moins de 20%. En outre, la cytotoxicité des liposomes encapsulant le complexe 5-FU-cuivre-polyéthylèneimine a été évaluée vis-à-vis de la lignée cellulaire HT-29 du carcinome colorectal humain. Les résultats ont révélé que les lipides à une concentration de 800 µM ne sont pas cytotoxiques (80% de viabilité). De plus, la complexation du 5-FU n’influence pas sa cytotoxicité ce qui prouve que la toxicité provient du 5-FU et non des excipients. En revanche, l’encapsulation du complexe 5-FU-cuivre-polyéthylèneimine dans les liposomes induit une diminution de la concentration inhibitrice médiane de 115 (solution du complexe) à 49 µM environ, corrélée à leur internalisation cellulaire. La pharmacocinétique chez des souris porteuses d’un modèle de tumeur colorectale HT-29 xénogreffée a montré que les liposomes permettent de prolonger d’un facteur 1,4 la demi-vie plasmatique de distribution du 5-FU. De plus, les aires sous la courbe des concentrations plasmatiques sur 24 h sont 1,9 et 2,9 fois plus élevées lorsque le 5-FU est administré sous forme de liposomes thermosensibles et non thermosensibles, respectivement, par rapport à la solution de 5-FU. Enfin, les liposomes non thermosensibles augmentent significativement d'un facteur 2 l'accumulation du 5-FU dans la tumeur par rapport à la solution de 5-FU. En conclusion, les liposomes thermosensibles développés présentent un fort intérêt pour une application thérapeutique en combinaison avec des ultrasons focalisés. / We optimized thermosensitive liposomes encapsulating an anticancer drug, 5-Fluorouracil (5-FU), in order to trigger the release upon focused ultrasound-mediated mild hyperthermia at the tumor. This approach would improve drug efficacy and would lower side effects. Liposomes were prepared by the lipid hydration method by mixing 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC) for its temperature sensitivity at 41.5 ± 0.5°C, cholesterol (CHOL) to promote liposome stability towards blood components, and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE-PEG) to confer stealthiness to the formulation. The experiments confirmed that the liposomes formulated with DPPC/CHOL/DSPE-PEG in a molar ratio 90:5:5 mol% are thermosensitive, while liposomes composed of the same lipid mixture in a ratio 65:30:5 mol% were considered non thermosensitive negative control. The optimization of passive encapsulation of 5-FU yielded an encapsulation efficacy (encapsulated 5-FU/total 5-FU) of 13%. 5-FU was, however, very weakly retained (12%) in the aqueous core of liposomes following dilution due to the generation of an osmotic gradient. The retention of 5-FU has been optimized (93%) by the active encapsulation technique based on the intraliposomal complexation of 5FU with copper-polyethylenimine complex encapsulated beforehand into liposomes. This technique also improved 5-FU encapsulation efficacy by 3-fold (37%), yielding a loading efficiency (final drug/lipid ratio, mol/mol) of approximately 50%. The resulting thermosensitive liposomes and non thermosensitive liposomes have a hydrodynamic diameter and a surface charge around 65 nm and -10 mV, and 105 nm and -4.9 mV, respectively. Heat-triggered drug delivery was evaluated using focused ultrasound, and showed a release of 68% of the encapsulated 5-FU from thermosensitive liposomes, within 10 min, whereas release remained below 20% for the non thermosensitive formulation. Furthermore, the cytotoxicity of 5-FU-copper-polyethylenimine complex-loaded liposomes towards HT-29 human colorectal carcinoma cell line was evaluated. Results revealed that lipids at a concentration of 800 µM are not cytotoxic (80% viability). Moreover, 5-FU complexation has no impact on its cytotoxic activity, disclosing that liposomes toxicity arose from 5-FU and not from the excipients. Nevertheless, 5-FU-copper-polyethylenimine complex-loaded liposomes exhibited a lower half maximal inhibitory concentration of 49 µM compared to 115 µM for complex solution. This enhancement of cytotoxicity was attributed to the cellular internalization of liposomes. Pharmacokinetics in mice bearing HT-29 xenograft tumor showed that liposomes can extend the plasma distribution half-life of 5-FU by a factor 1.4. Furthermore, areas under the concentration-time curve over 24 h were higher by 1.9- and 2.9-fold when the drug was encapsulated into thermosensitive and non thermosensitive liposomes, respectively, compared to free 5-Fluorouracil. Finally, non thermosensitive liposomes significantly increased 5-FU accumulation in tumor by 2-fold, compared to 5-FU solution. In conclusion, these 5-FU-loaded thermosensitive liposomes represent valuable carriers to investigate the therapeutic efficacy following focused ultrasound-mediated heat application.

Technologies such as horizontal wells and multi-stage hydraulic fracturing have made ultra-low permeability shale and tight gas reservoirs productive but the industry is still on the learning curve when it comes to addressing various production issues. Some of the problems encountered while hydraulically fracturing these reservoirs are the absence of frac barriers, thinner shales and the increased presence of geological hazards. Induced vertical fractures sometimes extend to an underlying aquifer and become a conduit to the well. We have developed a low-concentration, low-viscosity and delayed-crosslink polymeric gel system as a water shutoff agent for hydraulically-fractured tight gas and shale reservoirs, where some fractures might connect to water rich zones. The system also is a significant improvement over traditional flowing gels for fracture water shutoff in conventional reservoirs because of these features. The gel uses high molecular weight hydrolyzed polyacrylamide (HPAM) at low polymer concentrations with a delayed organic crosslinker. This crosslinker is more environmentally benign and provides much longer gelation time and stronger final gels than comparable polymer loadings with chromium carboxylate crosslinkers at higher temperatures. The low viscosity system allows low-pressure extrusion of gelant into the narrow-aperture fractures present in unconventional gas reservoirs. The gelant can be pumped at low pressures due to lower polymer concentrations and delayed gelation point. This allows the potential to seal problem zones that are producing excess water even when the fractures conducting water have very narrow apertures. By impeding water production, the gel system developed here can effectively delay water loading thereby avoiding abandonment or installation of expensive equipment with increased operational costs, thus extending life and reserves of unconventional gas wells.

Moderne analytische Verfahren ermöglichen eine höchst effiziente Auftrennung und eine selektive Detektion von Zielanalyten. Dies ist vor allem in der Medizin von Bedeutung, da eine frühzeitige Diagnose von Krankheiten in den meisten Fällen zu einer wesentlich erfolgreicheren Behandlung beiträgt. In unserer heutigen Industriegesellschaft werden daher hochsensitive und effiziente Analysemethoden stärker benötigt als je zuvor. Diverse Umweltgifte oder gesundheitliche Schadstoffe gelangen vermehrt in Grundwasser und Umwelt. Eine Analyse ist aufgrund der oft nur geringen Konzentrationen und der Komplexität diverser Proben häufig mit großen Schwierigkeiten verbunden. Obwohl die Sensitivität und Effizienz zur Bestimmung von Krankheitsmarkern (Biomarker) und Schadstoffen immer weiter zunimmt, stoßen selbst höchstsensitive Analysemethoden an ihre Grenzen. Gerade bei kleinsten Konzentrationen an Zielanalyten oder bei komplexen Gemischen ist eine direkte Detektion ohne weitere Vorbehandlung, wie Aufkonzentrierungen oder Markierungen, äußerst schwierig oder nicht möglich. Eine Optimierung dieser Methoden, deren Automatisierung sowie sensitivere Detektorsysteme werden benötigt. Darüber hinaus ist die Entwicklung von neuartigen, selektiveren mobilen und stationären Phasen ein hochinteressantes und umfangreich untersuchtes Forschungsgebiet. Die Verwendung von hochselektiven Additiven, wie Cyclodextrinen, Kronenethern, Mizellen und andere chirale Selektoren in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Kapillarelektrophorese (CE)[1,2] oder in der Dünnschicht-Chromatographie (TLC)[3] wurde bereits umfangreich untersucht und etabliert. Hochfunktionalisierte Polymere als äußerst spezifische Selektoren mit hoher Selektivität stellen vielversprechende Materialien dar, die ebenfalls eine Optimierung in der HPLC und CE erzielen.[4-9] Der Einsatz von Polymeren in molekular geprägten Matrizen (molecular imprinted polymers, MIP) oder in monolithischen Trennsäulen wird bereits äußerst erfolgreich in der TLC, HPLC und CE genutzt.[7-11] Eine solch hochselektive Säulenmodifizierung bietet eine sehr gute Performance und hervorragende Trennleistungen. Ein Nachteil dieser hochselektiven Modifizierung ist jedoch die Spezialisierung nur auf das jeweilige Problem. Eine universelle Verwendung für komplexe Gemische und eine Fülle von Analyten ist limitiert. Ein sehr vielversprechender Aspekt ist der Einsatz von Polymeren als chirale Selektoren in der stationären wie auch in der mobilen Phase. Die große Anzahl an kommerziell erhältlichen Trennsäulen mit einer Polymermodifizierung und das ständig umfangreichere Angebot solcher Säulen[12] verdeutlichen diesen Trend und zeigen, dass die Nutzung von polymeren Architekturen für eine weitere Optimierung diverse Möglichkeiten bietet. Hochverzweigte Polymere stellen unter den Polymeren vielversprechende Materialien dar, die aufgrund ihrer Vorteile zu einer effektiven Optimierung beitragen können.[12] Die hohe Anzahl an terminalen Gruppen ermöglichen es, gut zugängliche anwendungsorientierte Modifizierungen durchzuführen, um gewünschte Eigenschaften zu generieren. Durch die hohe Variabilität der Polymere selbst und der diversen Modifizierungsmöglichkeiten zeigen maßgeschneiderte Polymere ein enormes Potential und die Möglichkeit hochselektive Wechselwirkungen mit Zielanalyten zu etablieren. Die Modifizierung mit einer Schale um den polymeren Kern ermöglicht weitere Optimierungen für den Einsatz von Kern-Schale-Architekturen. Beispiele hierfür sind unter anderem die Vermittlung höherer Löslichkeit durch eine Modifizierung des hydrophilen/hydrophoben polymeren Kerns zur Etablierung einer äußeren Schale. Ebenso können durch die Modifizierung gezielte Eigenschaften generiert werden, die eine spezifische Interaktion mit Oberflächen oder Wirkstoffen ermöglichen. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist die Synthese und die Untersuchung von Kern-Schale-Architekturen als chromatographische Selektoren. Als polymerer Kern wird hochverzweigtes Poly(ethylenimin) (PEI) verwendet, das mit einer Oligosaccharidschale modifiziert wird. Das PEI wird mit den Kerngrößen 5 und 25 kDa verwendet, wodurch eine Untersuchung des Kerneinflusses möglich ist. Weiterhin wird die Dichte der Oligosaccharidschale eingestellt. Dafür wird eine dichte, moderate bis offene und eine sehr offene Oligosaccharidschale um den polymeren Kern generiert. Infolge dessen kann der Einfluss der Schalendichte auf die Interaktion mit Beispielanalyten evaluiert werden. Für die Oligosaccharidschale (OS) werden darüber hinaus drei verschiedene Oligosaccharide (Maltose, Lactose und Maltotriose) verwendet, um den Einfluss der Art der Schale zu prüfen. Durch diese Variationen können 15 unterschiedliche PEI-OS Kern-Schale-Architekturen synthetisiert und untersucht werden. Weiterhin soll der hydrophobe Anteil der Kern-Schale-Architekturen durch die Anbindung von unpolaren Seitenketten an einen PEI-Kern erhöht werden. Auf diese Art und Weise können nicht-kovalente Wechselwirkungen mit lipophilen Systemen untersucht werden. Um polymere Kern-Schale-Architekturen möglichst effizient in der TLC, HPLC und CE einsetzen zu können, ist es essentiell, ihre Eigenschaften und die Art und Weise der Wechselwirkungen zu kennen, die sie mit möglichen Gastmolekülen eingehen. Durch die Untersuchung dieser Wechselwirkungen können Informationen über deren Interaktionen und eine mögliche Manipulation bzw. Optimierung dieser erhalten werden. Ein zielgerichteter und effektiver Einsatz mit diesen Kern-Schale Architekturen kann so vorbereitet werden. [1] T. J. Ward, K. D. Ward, Anal. Chem. 2012, 84, 626-35. [2] W. J. Cheong, S. H. Yang, F. Ali, J. Sep. Sci. 2013, 36, 609-28. [3] M. D. Bubba, L. Checchini, L. Lepri, Anal. Bioanal. Chem. 2013, 405, 533-554. [4] M. Hanson, K. K. Unger, Trends Anal. Chem. 1992, 11, 368-373. [5] J. Kirkland, J. Chromatogr. A 2004, 1060, 9-21. [6] F. Gasparrini, D. Misiti, R. Rompietti, C. Villani, J. Chromatogr. A 2005, 1064, 25-38. [7] A. Martin-Esteban, Trends Anal. Chem. 2013, 45, 169-181. [8] I. Nischang, J. Chromatogr. A 2013, 1287, 39-58. [9] R. D. Arrua, M. Talebi, T. J. Causon, E. F. Hilder, Anal. Chim. Acta 2012, 738, 1-12. [10] P. Jandera, J. Chromatogr. A 2013, 1313, 37-53. [11] F. Svec, J. Sep. Sci. 2004, 27, 1419-1430. [12] M. Tang, J. Zhang, S. Zhuang, W. Liu, Trends Anal. Chem. 2012, 39, 180-194.