Chez les eucaryotes, l'ARN polymérase (RNAP) III transcrit les ARN de transferts, l'ARN ribosomique 5S, et plusieurs douzaines d'autres ARNs non traduits. Le génome des mammifères contient plusieurs milliers d'éléments répétés, les SINEs. In vitro, leur transcription dépend de la RNAP III. Le taux de transcription de la RNAP III détermine la croissance et la prolifération cellulaires, sa dérégulation a été associée à de nombreux cancers. Afin de caractériser la distribution sur l'ensemble du génome de la RNAP III et de ses facteurs de transcription TFIIIB et TFIIIC, nous avons développé un protocole très spécifique de ChIP-seq en tandem. Nous avons déterminé l'ensemble des gènes liés par la RNAP III dans les cellules souches embryonnaires de souris. Cet ensemble est bien inférieur au nombre de gènes prédits dans le génome. Nous avons également observé la RNAP III et ses facteurs de transcription liés à 30 régions non annotées, seule une d'entre elles est conservée chez l'humain. Un très faible nombre de SINEs sur un demi-million prédits est associé à la RNAP III. Notre étude révèle de nombreux sites liés uniquement par TFIIIC, nommés " extra-TFIIIC loci ", ETC chez la levure. Ces sites sont associés à la protéine CTCF, et à la cohésine. La cohésine occupe les sites liés par CTCF, et contribue à la formation de boucles ADN, associées à la répression ou à l'activation de l'expression des gènes. Ces données suggèrent que TFIIIC peut jouer un rôle dans l'organisation de l'architecture chromosomique chez les souris. Nous avons également démontré que TCEA1, l'isoforme ubiquitaire de TFIIS, le facteur d'élongation de la RNAP II, est associée aux gènes actifs de classe III. Ceci suggére que TFIIS est un facteur de transcription de classe III. Finalement, la distribution de TFIIS aux gènes de classe II indique que le recrutement de TFIIS n'est pas suffisant pour contrôler la transition de la RNAP II pausée en 5' des gènes en élongation.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2008. / Härtill 4 uppsatser.

Chez les cellules eucaryotes, la transcription est réalisée par les ARN polymérases I, II et III. L’ARN polymérase III (Pol III) transcrit des petits ARNs non codants tels que les ARNt, l’ARN U6, l’ARNr 5S et certains microARN. Il a été montré précédemment que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de la Pol III était associée à la transformation tumorale. Au sein du laboratoire, nous avons décrit une nouvelle sous–unité de la Pol III, RPC32α, qui met en évidence l’existence de deux isoformes de la Pol III humaine : la Pol IIIα et la Pol IIIβ. La sous-unité RPC32β, présente dans la Pol III, est exprimée de façon ubiquitaire et parait comme essentielle pour la croissance cellulaire. La sous-unité RPC32α n’est pas essentielle pour la survie cellulaire et son expression est limitée aux cellules souches non différenciées et aux cellules tumorales. De plus, l’expression ectopique de RPC32α induit la transformation tumorale des cellules fibroblastes IMR90 et change totalement l’expression de nombreux transcrits Pol III mais aussi d’autres ARNm impliqués dans la tumorogenèse (Haurie et al., 2010). Les travaux décrits dans ce manuscrit ont eu pour but de mieux caractériser et comprendre les deux isoformes de la Pol III humaine. Nous avons purifié les Pol IIIα et Pol IIIβ afin d’identifier tous les composants protéiques des deux isoformes du complexe. Au cours de cette étude nous avons observé que des modifications post-traductionnelles de RPC32α semblaient jouer un rôle déterminant dans la capacité oncogénique de la Pol IIIα. Pour comprendre par quel mécanisme moléculaire les Pol IIIα et Pol III pouvaient influencer l’expression de transcrits Pol II, notamment lors de la transformation cellulaire induite par l’expression de RPC32α, nous avons étudié cette régulation lors de la surexpression des deux sous unités paralogues. Ainsi, nous avons mené des analyses ciblées révélant la régulation de certains gènes impliqués dans le développement, la différenciation et la tumorogenèse. Nous avons également essayé de décrire les changements d'expression des gènes au niveau globale en utilisant la technologie des puces à ADN. Cette approche innovante et puissante nous a permis d’obtenir une vision d’ensemble des transcrits Pol II différentiellement régulés lors de la surexpression de RPC32α et RPC32β Nous avons pu apprécier l’impact de la Pol III pour le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire, la survie de la cellule, la prolifération tumorale ou encore à la réponse immunitaire innée. Les résultats de cette étude qui demandent à être confirmés ouvrent des voies de recherches particulièrement intéressantes qui mériteront d’être approfondies dans le futur / Transcription in eukaryotic nuclei is carried out by DNA-dependent RNA polymerases I, II, and III. Human RNA polymerase III (Pol III) transcribes small untranslated RNAs that include tRNAs, 5S RNA, U6 RNA, and some microRNAs. Increased Pol III transcription has been reported to accompany or cause cell transformation. In the laboratory, we described a Pol III subunit (RPC32β) that led to the demonstration of two human Pol III isoforms (Pol IIIα and Pol IIIβ). RPC32β-containing Pol IIIβ is ubiquitously expressed and essential for growth of human cells. RPC32α-containing Pol IIIα is dispensable for cell survival, with expression being restricted to undifferentiated ES cells and to tumor cells. In this regard, and most importantly, ectopic expression of RPC32α in fibroblast IMR90 enhances cell transformation and dramatically changes the expression of several tumor-related mRNAs and that of a subset of Pol III RNAs. These results identify a human Pol III isoform and isoform-specific functions in the regulation of cell growth, the differentiation and transformation. (Haurie et al., 2010).The work described in this manuscript enables identification and understanding the function of the two human Pol III isoforms. Pol IIIα and Pol IIIβ are purified in order to describe all the protein components of the two Pol III complex. During this study, we observed that post-translated modifications of RPC32α seem to have a crucial function in oncogenic capacity of Pol IIIα. To understand how Pol IIIα and Pol IIIβ can affect Pol II RNA expression, in particular during cell transformation induced by RPC32α, we studied this regulation during the overexpression of the two paralogue subunits. We performed focused analysis, this study revealed the regulation of certain genes involved in the development, the differentiation and the tumorigenesis. We also tried to describe global gene expression modification using microarray technology. This new and powerful approach enables to obtain a global view on mRNA regulation by overexpression of RPC32α and RPC32β. We observed the effect of Pol III on embryo development, cell differentiation, cell survival, tumor proliferation and on innate immune response. The results of this study need further confirmation pave the way for interesting projects which are worth going into detail for the future.

Deux phénomènes liés au TFIIH ont été étudiés : l'influence des mutations spécifiques dans la sous-unité XPD de TFIIH sur la réponse transcriptionnelle de certains gènes après l'irradiation UV, et l'interaction entre le TFIIH et la transcription des gènes de classe III. Une analyse détaillée de la dynamique du transcriptome a été effectuée pour la réponse des cellules humaines mutantes XP-D/CS à l'UV. Il a été démontré que la dysrégulation sélective observée de l’expression des gènes était liée à l'incapacité pour la ré-initiation transcriptionnelle et à l'hétérochromatinisation suivante, où l'histonedésacétylase SIRT1 a été identifiée comme le principal facteur. Son inhibition a permis de recouvrer l'expression normale d'un nombre substantiel des gènes affectés. Une étude de la participation pangénomique du coeur de TFIIH dans latranscription a découvert son association avec les gènes actifs de classe III. Cette association a été démontrée être indépendante de Pol II. Le coeur de TFIIH a été montré participer directement à la transcription effectuée in vitro par Pol III. / In this work, two TFIIH-related phenomena were investigated : the influence of specific mutations in TFIIH XPD subunits on the transcriptional response of different genes on UV irradiation and the interaction between TFIIH and transcription of class III genes. For the first time the detailed investigation of transcriptome dynamics was carried out for the response of XP-D/CS mutant human cells to UV-irradiation. The transcription regulation nature of the observed selective gene expression dysregulation was clearly observed. Its relation to failure of transcription re-initiation and consequentheterochromatisation was demonstrated. SIRT1 histone deacetylase was identified as the main driver of the repressive chromatin establishment on the certain genes upon UV. Inhibition of SIRT1 was found to recover normal expression of substantial number of affected genes. SIRT1 mediated mechanism was shown to be XP-D/CS specific. A potential link between this longevity related protein and progeria features of XP-D/CS mutants was hypothesised. Genome-wide study of the involvement of the core TFIIH in transcription revealed its association with active class III genes, not described previously. This association was demonstrated to be Pol II-independent. The core TFIIH was shown to be directly involved in Pol III mediated transcription in vitro.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T05:36:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Soprano_AdrianaSantos_D.pdf: 24018757 bytes, checksum: 29724fbb81a588e3bb656bf4c2df3390 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri (X. citri), afeta a maioria das espécies de Citrus, ocorre praticamente em todos continentes e se destaca como uma séria ameaça à citricultura brasileira. O mecanismo molecular pelo qual X. citri causa cancro não é inteiramente conhecido, entretanto, sabe-se que a bactéria utiliza o sistema secretório tipo III para injetar proteínas de patogenicidade, entre elas, PthAs da família AvrBs3/PthA, também conhecidas como efetores TAL (transcriptional activator-like). Os efetores TAL atuam como fatores de transcrição transativando genes específicos da planta que vão beneficiar a bactéria ou desencadear respostas de defesa. Com o objetivo de entender os mecanismos moleculares pelos quais os efetores TAL atuam, a técnica de duplo híbrido foi usada para identificar proteínas de laranja doce (Citrus sinensis) que interagem com PthA4, um dos efetores TAL de X. citri necessário para o desenvolvimento do cancro cítrico. A maioria das proteínas de laranja identificadas como alvos de PthA4 apresenta domínios de ligação à DNA ou RNA e está envolvida no controle da transcrição, estabilização de mRNAs e tradução. Várias dessas proteínas interagem entre si, sugerindo a presença de um complexo multiproteico como alvo de efetores TAL. Entre as proteínas envolvidas no controle da transcrição, destacamos a CsMAF1, uma proteína homóloga à MAF1 humana que atua como regulador negativo da RNA Polimerase III. Os resultados obtidos nesse trabalho revelam que CsMAF1 complementa o fenótipo do mutante maf1 de levedura, reprimindo a expressão de tRNAHis e que a expressão de PthA4 na cepa complementada restaura a síntese desse tRNA. Portanto, os dados mostram que CsMAF1 atua como um repressor da RNA Pol III em levedura e que PthA4 altera o estado repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III. De forma surpreendente, verificamos que plantas de citros com níveis reduzidos de CsMAF1 apresentaram aumento significativo no número e intensidade de lesões hiperplásticas ou eruptivas quando infiltradas com X. citri, indicando que CsMAF1 desempenha um papel crítico no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico. O aumento das lesões do cancro nas plantas silenciadas para CsMAF1 se correlaciona com um aumento expressivo de tRNAs, incluindo o tRNAHis, confirmando assim o papel repressor de CsMAF1 sobre a RNA Pol III em citros. Além disso, mostramos nesse trabalho que CsMAF1 é uma fosfoproteína que se encontra na forma dimérica em solução, uma característica singular ainda não descrita para membros dessa família de proteínas. Verificamos que CsMAF1 é fosforilada in vitro pelas quinases PKA e PKC e que apresenta sítios adicionais de fosforilação conservados para a quinase TOR, incluindo o resíduo Thr62. Curiosamente, tais sítios se localizam na interface de dimerização de CsMAF1, sugerindo que a fosforilação desses sítios deve regular a função da proteína e/ou seu estado multimérico. De fato, verificamos que a substituição do resíduo de treonina Thr 62 para ácido aspártico (Asp 62) diminui a proporção dímero:monômero de CsMAF1, indicando que a fosforilação de resíduos na interface do dímero desestabiliza o dímero, e que esse pode ser um mecanismo regulatório novo para essa classe de proteína. Desse modo, esses achados abrem novas perspectivas para o entendimento não só dos mecanismos moleculares envolvidos na regulação da RNA Pol III pela CsMAF1, como também do papel de PthA4 na interação com CsMAF1 e sua modulação da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by Xanthomonas citri (X. citri), is a disease that affects most of the Citrus species, occurs in almost all continents and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The molecular mechanism by which X. citri causes canker is poorly understood, however the bacterium injects pathogenicity proteins via the type III secretion system (T3S) including proteins of AvrBs3/PthA family, also known as transcriptional activator-like (TAL) effectors. TAL effectors have been extensively studied and are known to act as transcription factors that transactivate specific plant genes which either benefit the bacteria or trigger defense responses. To gain insights into the molecular mode of action of TAL effectors, a twohybrid screening was performed to identify sweet orange (Citrus sinensis) proteins that interact with PthA4, one of the X. citri TAL effectors required for citrus canker development. Among the proteins identified as PthA4 interactors, most are DNA and/or RNA-binding factors involved in chromatin remodeling and repair, transcriptional control and mRNA stabilization/modification. Several of these proteins interact with each other, suggesting the presence of a multiprotein complex as a target of TAL effectors. Among the proteins involved in transcription control, we selected for further studies the CsMAF1, a homolog of the human MAF1 that acts as a negative regulator of RNA polymerase III. The results presented here reveal that CsMAF1 complements the yeast maf1 mutant phenotype by repressing the tRNAHis transcription, and that PthA4 expression in the complemented strain restores the tRNAHis synthesis. Thus, the data show that CsMAF1 acts as a RNA Pol III repressor in yeast and that PthA4 somehow suppresses the repressor activity of CsMAF1 upon on the RNA Pol III. Surprisingly, we found that citrus plants with reduced levels of CsMAF1 showed a significant increase in the number, morphology and size of eruptive or hyperplastic lesions when infiltrated with X. citri, indicating the CsMAF1 plays a critical role in canker development. Increased canker lesions in CsMAF1 silenced plants correlated with a significant increase of tRNAs expression, including tRNAHis, thus confirming the repressor role of CsMAF1 upon the citrus RNA Pol III. Furthermore, we showed in this work that CsMAF1 is a phosphorylated and a dimer in solution, a feature that so far has not been reported for any member of this protein family. We found that CsMAF1 is phosphorylated in vitro by PKA and PKC, and has additional phosphorylation sites for the TOR kinase, including the Thr 62 residue. Interestingly, these phosphorylation sites are located at the dimerization interface of CsMAF1, suggesting that phosphorylation of such sites might regulate the function of the protein and / or its multimeric state. Indeed, mutation of threonine residue Thr62 to aspartic acid (Asp62) decreases the dimer:monomer CsMAF1 ratio, indicating that phosphorylation of the residues at the interface of the dimer destabilizes the dimer, and this may be a novel regulatory mechanism for this class of protein. Thus, these findings open new perspectives for the understanding of the molecular mechanisms involved in RNA Pol III regulation by CsMAF1, as well as for the role of PthA4 in the modulation of RNA Pol III transcription mediated by CsMAF1 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular