A cultura de sorgo granífero no país é amplamente utilizada na alimentação animal. Através deste estudo, decidimos avaliar a micobiota e a ocorrência de ácido tenuazônico em grãos de sorgo cultivados em duas safras. Além disso, através de abordagem polifásica, caracterizamos cepas de E. sorghinum, bem como avaliamos os aspectos ecofisiológicos desta espécie. E. sorghinum foi o fungo mais prevalente nos de grãos de sorgo. O ácido tenuazônico foi detectado na totalidade das amostras avaliadas, com maiores níveis nos grãos cultivados na safra verão. Foi possível verificar considerável variabilidade genética nas cepas de E. sorghinum, apresentando-se como complexo de espécies filogenéticas. Avaliando os fatores abióticos ocorridos no campo, bem como acessando a ecofisiologia de E. sorghinum, foi possível verificar que condições quentes e úmidas são favoráveis a produção de ácido tenuazônico. Estes resultados alertam para presença de compostos tóxicos em grãos de sorgo cultivados no país, bem como contribuem com informações aplicáveis para o manejo desta cultura. / The culture of sorghum in Brazil is widely used in animal feed. The aim of this study was evaluate the mycobiota and occurrence of tenuazonic acid in sorghum grains cultivated in two sowing periods. In addition, through a polyphasic approach, we characterized strains of Epicoccum sorghinum, as well as evaluated the ecophysiological of this species. E. sorghinum was the most prevalent fungus in sorghum grains. Tenuazonic acid was detected in all the samples, with higher levels in the grains grown in the summer crop. It was possible to verify considerable genetic variability in the strains of E. sorghinum, presenting as a complex of phylogenetic species. By evaluating the abiotic factors occurring in the field, as well as the access to an ecophysiology of E. sorghinum, it was possible to verify that hot and wet conditions are favorable for tenuazonic acid production. These results indicate the presence of toxic compounds in sorghum grains cultivated in Brazil, as well as contribute with information for crop management.

Orientador: Lara Durães Sette / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T06:41:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Passarini_MichelRodrigoZambrano_D.pdf: 6997453 bytes, checksum: 0a905c32bd8d912eb875c88cff54de8e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O oceano representa um habitat promissor na busca por novos micro-organismos, os quais podem apresentar capacidade de produzir enzimas de interesse industrial diferentes das produzidas por seus parceiros terrestres. Neste contexto, duas amostras da esponja marinha Dragmacidon reticulatum foram coletadas no litoral Norte do Estado de São Paulo, objetivando a caracterização da diversidade fúngica por métodos dependentes e independentes de cultivo, bem como a avaliação da produção, expressão da enzima e caracterização do gene da lacase. Com relação à parcela cultivada das amostras, 108 fungos filamentosos foram isolados. Destes, 64 ribotipos distintos foram submetidos aos experimentos de taxonomia polifásica e aos relacionados com a lacase. Análises macro- e microscópicas, moleculares (genes ribossomais ITS/28S) e pela técnica de MALDI TOF ICMS, resultaram na caracterização de 38 isolados distribuídos em 23 gêneros pertencentes ao Filo Ascomycota e um ao Filo Zygomycota. Este foram posteriormente depositados na Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Indústria (CBMAI). Dentre os isolados obtidos, uma potencial espécie nova de Penicillium foi identificada. Os resultados da triagem enzimática permitiram a seleção de dois isolados identificados como Nigrospora sp. CBMAI 1328 (0,30 U L-1) e Arthorpyrenia sp. CBMAI 1330 (0,40 U L-1), os quais foram submetidos à uma nova avaliação da atividade e expressão (RT-PCR) com indução de íons cobre e caracterização do genes da lacase. A adição de íons cobre na concentração de 5 mM, proporcionou aumento das atividades enzimáticas dos isolados CBMAI 1328 e CBMAI 1330 em 3,9X (25,2 U L-1) e 1,2X (9,0 U L-1) após 120 h, respectivamente. Os resultados da expressão dos genes da lacase para o isolado CBMAI 1328 foram os mesmos encontrados pela indução com cobre (maior expressão em 5 mM após 120 h), entretanto para o isolado CBMAI 1330, a maior expressão foi após 96 h sem adição de cobre. Os resultados da caracterização dos genes da lacase revelaram a possivel existência de 3 novos putativos genes de lacases marinhas. Com relação à parcela não cultivada, foi possível a identificação de 7 gêneros e de um fungo não cultivado (uncultured fungi) do Filo Ascomycota bem como 3 gêneros e um fungo não cultivado (uncultured fungi) do Filo Basidiomycota a partir da técnica de DGGE e do sequenciamento direto do gene RNAr ITS e do gene 18S. Em ambas as abordagens utilizadas, a maior diversidade foi encontrada na amostra DR9. Os dados derivados do presente trabalho, ressaltam a importância em se utilizar a taxonomia polifásica, bem como empregar metodologias dependente e independente de cultivo (em paralelo) para um melhor e maior conhecimento da real diversidade em amostras ambientais. Estes resultados ampliam o conhecimento dos fungos filamentosos recuperados de esponjas marinhas e demonstram o potencial biotecnológico destes micro-organismos / Abstract: The ocean represents a promissing habitat in the search for new microorganisms, which may have the ability to produce enzymes of industrial interests different from that produced by their terrestrial counterparts. In this context, two samples of the marine sponge Dragmacidon reticulatum were collected on northern coast of São Paulo State, aiming at the characterization of fungal diversity by cultureddependent and -independent approaches as well as the evaluation of the production, characterization and expression of laccase enzyme gene. Regarding the cultivated portion of the samples, around 108 filamentous fungi were isolated, belonging to 64 different taxonomic groups (ribotypes), which were subjected to enzymatic activity assays. Polyphasic taxonomy approaches (macro- and microscopic, molecular - ITS/28S ribosomal genes - and MALDI TOF ICMS analyses) resulted in the characterization of 38 isolates distributed in 23 genera belonging to the phylum Ascomycota and one to the phylum Zygomycota, which were deposited in the Brazilian Collection of Micro-organisms from Environment and Industry (CBMAI). Among the isolates recovered one possible new species of Penicillium was identified. Enzymatic screening allowed the selection of two isolates identified as Nigrospora sp. CBMAI 1328 (0,30 U L-1) and Arthorpyrenia sp. CBMAI 1330 (0,40 U L-1), which were subjected to a new activity evaluation and expression (RT-PCR) with the induction of copper ions and the laccase genes characterization. The addition of copper ions in a concentration of 5 mM resulted in an increase in the enzymatic activities of CBMAI 1328 and CBMAI 1330 strains in 3,9X (25,2 U L-1) and 1,2X (9,0 U L-1) after 120h, respectively. The results of the expression of the laccase genes for CBMAI 1328 strain were the same found by induction with copper (expression increased in 5 mM after 120 h), however for CBMAI 1330 the higher expression was after 96 h without addition of copper. Results of laccase genes characterization revealed the existence of three possible putative new marine laccase genes. Regarding to the uncultured portion of the samples, from the DGGE and direct sequencing of the ITS rRNA gene and 18S gene approaches, was possible to identify seven species of fungi and one uncultured fungus from phylum Ascomycota and three species and one uncultured fungus from phylum Basidiomycota. For both approaches used the greatest diversity was achieved in the DR9 sample. Data derived from the present work highlight the importance of using polyphasic taxonomy as well as applying culturedependent and culture-independent methodologies (in parallel) in order to have a better and greater knowledge of the real diversity in environmental sample. These results expand the knowledge of fungi recovery from marine sponges and demonstrate the biotechnological potential of these micro-organisms / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Le biogaz est une source d’énergie qui intéresse de plus en plus l’Europe et notamment la France pour ses avantages environnementaux et économiques. Produit de la fermentation de matière organique, il contient du biométhane. Ce dernier est une alternative plus durable aux énergies fossiles. Cependant, à l’état brut, les polluants dans le biogaz peuvent provoquer des dégâts sur la santé et l’environnement, notamment en raison de la présence de siloxanes et des composés soufrés. L’objectif de cette recherche consiste donc à développer des méthodes améliorant à la fois économiquement et écologiquement la désulfuration du biogaz, dans le but de les intégrer aux unités de traitement du biogaz déjà existantes et présentes sur le territoire. A partir d’un état de l’art sur les propriétés du biogaz et ses traitements de purification, deux procédés ont été particulièrement mis en avant et étudiés dans cette thèse. Le premier correspond au traitement de la désulfuration en précombustion consistant à éliminer le H2S et les siloxanes à travers un réacteur polyphasé à barbotage gaz-liquide spécifique, utilisant un nouveau solvant avec des propriétés « superacides ». Le second, quant à lui, correspond au traitement en postcombustion de la désulfuration des fumées provenant de la combustion du gaz, via un réacteur polyphasé à lit fixe gaz-solide. Pour ce faire, un prototype de l’unité de désulfuration est intégralement conçu, construit et testé dans le cadre de la thèse. Cette thèse présente notamment le développement des différents modèles numériques, ainsi que les résultats d’expériences en laboratoire, confirmant l’efficacité de ces procédés innovants. / Biogas. It is an energy source increasingly popular in Europe, remarkably in France, due to its environmental-friendly and economic-saving capabilities. It is produced by the organic matter fermentation, leading to biomethane production, as a sustainable alternative to fossil fuels. Nevertheless, as a raw gas, pollutants in biogas lead to environmental, health and process-related issues, especially because of its unique content on sulfur compounds. The objective of this research is to develop new processes, economically and environmentally feasible, for biogas desulfurization, seeking a process integration in existing biogas treatment units in France. Considering the state of the art on biogas properties and its possible purification treatments, two processes have been identified and studied in this thesis. The first process is a precombustion desulfurization treatment aiming to eliminate the H2S and the siloxanes through a gas-liquid bubbling-typed polyphasic reactor. This reactor is equipped with a new solvent with “superacid” properties. The second process is a postcombution desulfurization treatment for stack gas, through a gas-solid fixed-bed polyphasic reactor. A prototype of this unit was entirely designed, built and tested in the thesis. This thesis describes the applied research method, the developed numerical models, and the experimental results confirming the efficiency of the novel processes.

Le corps humain est un ensemble de microflores où cohabitent bactéries, archées, virus et eucaryotes. Ces écosystèmes complexes sont appelés microbiotes. Parmi ceux-ci figure le microbiote intestinal qui compte 1011 à 1014 bactéries/g de selle. Les modifications de la flore intestinale peuvent être à l'origine de pathologies comme les diarrhées infectieuses. Il s'agit d'un véritable problème de santé publique puisqu'environ 2.16 millions de décès sont liés à cette pathologie chaque année. Les virus intestinaux jouent un rôle prépondérant mais les infections bactériennes restent également importantes. Le diagnostic de ces infections bactériennes reste compliqué puisque le microbiote intestinal comporte 75% d'espèces non cultivables. De plus, on ne dispose pas réellement d'une liste exhaustive des bactéries pouvant être responsables de diarrhées infectieuses. Nous avons donc choisi d'étudier le microbiote intestinal dans des selles normales et pathologiques, par une approche polyphasique alliant une étape préliminaire de concentration des selles diarrhéiques par la lyophilisation, à des techniques de culture et des méthodes de biologie moléculaire. Pour cela nous avons mis au point une nouvelle technologie pour la détection des entéropathogènes par hybridation sur puce à ADN permettant la détection des bactéries et des virus ADN entéropathogènes, en présence d'un témoin archae. Notre outil permet le diagnostic multiplexe des diarrhées infectieuses puisque nous avons correctement identifié un adénovirus et la bactérie Campylobacter jejuni présents dans une même selle. / The human body is a collection of microflora where cohabit bacteria, archaea, viruses and eukaryotes. These complex ecosystems are called microbiota. Among these is the intestinal microbiota that counts 1011 to 1014 bacteria/g of stool. Changes in the intestinal flora can cause of pathologies such as infectious diarrhea. This is a real public health problem since about 2.16 million deaths are related to this disease each year. Enteric viruses play a preponderant role but bacterial infections are also important. The diagnosis of bacterial infections is complicated because the intestinal microbiota includes 75% non-cultivable species. In addition, there is not really a list of bacteria could be responsible for infectious diarrhea. We therefore decided to study the intestinal microbiota in normal stool and also pathological stools by a polyphasic approach combining a preliminary step of diarrheal stools concentration by lyophilization, with cultivation techniques and molecular biology methods. We developed a new technology for the detection of enteropathogens by hybridization on DNA microarray for the detection of bacteria and enteric viruses (DNA) in the presence of a control archaea. Our tool allows multiplexed diagnostic of infectious diarrhea since we correctly identified an adenovirus and Campylobacter jejuni present in a same sample. This is the first DNA microarray for multiplex detection of bacteria and viruses (DNA) enteropathogens. An improvement of our protocol for nucleic acid extraction is proposed to allow the detection of RNA viruses such as rotavirus and calicivirus which are currently dominant.

The delineation of desmid species was traditionally based on purely morphological features. However, a frequent misinterpretation of morphological variability in desmids has led in the past to extensive taxonomical confusion within this important group of green algae which complicates the interpretation of their biodiversity in freshwater ecology, biogeography and biomonitoring. Consequently, I focused in this thesis predominantly on a previously neglected issue, the application of polyphasic approaches in the species-level taxonomy of desmids. In the most studies, a combination of both traditional morphological and modern molecular phylogenetic and geometric morphometric methods has been used to evaluate the taxonomy of selected desmid species, particularly representatives of the morphologically complex genera Micrasterias and Xanthidium. In two papers, I used the combination of traditional morphological and autecological data to clear up the taxonomy of several morphologically less prominent desmid taxa. Generally, the results of the thesis demonstrated that the way we recently see the diversity and distribution of desmids should be thoroughly changed. The real species diversity is mostly distinctly finer than that estimated by classical morphological taxonomy, often corresponds to varieties of...

A filosfera da Mata Atlântica é um importante nicho de colonização por micro-organismos, cuja comunidade ainda é pouco conhecida. Algumas bactérias associadas à superfície das folhas possuem habilidade de fixar nitrogênio, mineralizar substratos orgânicos e também suprir as árvores com dióxido de carbono e fatores de crescimento. Este trabalho teve como objetivo gerar informações sobre a comunidade cianobacteriana que coloniza a filosfera de algumas plantas da Mata Atlântica e investigar a comunidade diazotrófica presente nesse habitat. Um total de 40 linhagens de cianobactérias da filosfera de Merostachys neesii (bambu), Euterpe edulis (palmeira Juçara), Guapira opposita e Garcinia gardneriana foram isoladas e cultivadas. Os isolados foram caracterizados por análises morfológicas e filogenia do gene 16S RNAr. Essa abordagem permitiu a identificação de uma linhagem do gênero Nostoc, sete Desmonostoc, seis Leptolyngbya, uma Oculatella, cinco Brasilonema, uma Pleurocapsa e duas Chroococcidiopsis. Dezessete linhagens (uma Microchaetaceae, dez Nostocaceae e seis Pseudanabaenaceae) não puderam ser identificadas ao nível de gênero. Vinte e seis linhagens (24 pertencentes às ordens Nostocales e duas à Pseudanabaenales) foram caracterizadas como diazotróficas pela amplificação, sequenciamento e filogenia do gene nifH. Além disso, caracterizou-se o perfil de fixação biológica de nitrogênio da linhagem Desmonostoc sp. CENA362. Com relação ao potencial biotecnológico dessas linhagens, treze isolados foram identificados como potenciais produtores de ácido indol acético (IAA) de acordo com o teste Salkowski. Diversas linhagens apresentaram genes associados à via biossintética do inibidor de protease microviridina, sendo que três delas codificam para novas variantes. Além disso, dez linhagens foram identificadas como potenciais produtoras aeruginosina, três de cianopeptolina e três de microcistina. A comunidade bacteriana diazotrófica avaliada por pirosequenciamento do gene nifH apresentou um perfil de variação espécie-específica para Proteobacteria e uma correlação positiva entre a riqueza e a fixação biológica de nitrogênio. Neste estudo, cianobactérias que habitam a filosfera da Mata Atlântica foram isoladas estão sendo mantidas em condições de cultivo. Novos táxons foram descobertos e vários gêneros conhecidos foram descritos pela primeira vez neste hábitat, o que contribuiu para o aprimoramento da sistemática de Cyanobacteria. As linhagens em cultivo e as informações geradas sobre os seus compostos metabólitos representam uma valiosa fonte para estudos posteriores. Além disso, informações sobre a comunidade bacteriana diazotrófica da filosfera pode auxiliar no entendimento da dinâmica do nitrogênio, elemento limitante e pouco disponível na Mata Atlântica / The phyllosphere of the Atlantic Forest is an important niche for colonization by microorganisms, whose community is still little known. Some bacteria associated with leaf surfaces may possess the ability to fix nitrogen, mineralize the organic substrates and also supply the trees with carbon dioxide and growth factors. Therefore, this study aimed to generate information about cyanobacterial community that colonize the phyllosphere of some plants of the Atlantic Forest and investigated the diazotrophic community in this habitat. A total of 40 strains of Cyanobacteria from the phyllosphere of Merostachys neesii (bamboo), Euterpe edulis (Juçara palm), Garcinia gardneriana and Guapira opposita was isolated and cultivated. The isolates were characterized by morphological analyses and phylogeny of the 16S rRNA gene. This approach allowed the identification of one strain of the genus Nostoc, seven Desmonostoc, six Leptolyngbya, one Oculatella, five Brasilonema, one Pleurocapsa and two Chroococcidiopsis. Seventeen strains (one Microchaetaceae, ten Nostocaceae and six Pseudanabaenaceae) could not be identified at the genus level. Twenty-six strains (24 belonging to Nostocales and two belonging to Pseudanabaenales) were characterized as diazotrophic by amplification, sequencing and phylogeny of nifH gene. Also, it was characterized the profile of biological nitrogen fixation for the strain Desmonostoc sp. CENA362. Regarding the biotechnological potential of these strains, thirteen strains were identified as potential producers of indole acetic acid (IAA) according to Salkowski test. Several strains presented genes involved in the biosynthetic pathway of the protease inhibitor microviridin, three of them encoding putative novel variants. Moreover, ten strains were identified as potential producers of aeruginosin, three of cyanopeptolin and three of microcystin. The diazotrophic bacterial community evaluated by pyrosequencing of the nifH gene showed a profile of variation plant species-specific for Proteobacteria, and a positive correlation between richness and biological nitrogen fixation. In this study, cyanobacteria that inhabiting Brazilian Atlantic Forest phyllosphere were isolated and are been maintained in culture conditions. New taxa were discovered and several known genera were described for the first time in this habitat, which contributed to improvement of the cyanobacterial systematic. The culturable strains and the information generated about their metabolites compounds represent a valuable source for further studies. In addition, information about the diazotrophic bacterial community inhabiting the phyllosphere may help in understanding the dynamics of nitrogen, a limiting and low available element in Atlantic Forest

Este estudo descreve a diversidade e composição das comunidades bacterianas associadas a cinco esponjas marinhas, e o potencial destes microrganismos como produtores de substâncias bioativas com propriedades fungicidas. As esponjas vivem em simbiose com microrganismos que apresentam alto interesse ecológico, evolutivo e biotecnológico. Contudo, este sistema microbiano permanece pobremente entendido. Para totalmente compreender a biologia desses animais é necessário descrever os fatores ecológicos e evolutivos influenciando a estrutura e dinâmica de sua microbiota. Nesta tese é defendida a hipótese de que a composição taxonômica e estrutura das comunidades bacterianas se correlaciona com o parentesco filogenético de seus hospedeiros. Neste trabalho, as comunidades bacterianas associadas às esponjas Aplysina fulva, Aiolochroia crassa, Chondrosia collectrix, Didiscus oxeata e Scopalina ruetzleri foram examinadas usando a plataforma Ion torrent para sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. A água do mar circundante aos espécimes foram coletadas para comparações com a microbiota de esponjas. As análises detectaram um complexo e específico sistema microbiano vivendo em esponjas, com as unidades taxonômicas operacionais dominantes classificadas nos filos: Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Proteobacteria e Gemmatimonadetes. Apesar da ocorrência simpátrica dos espécimes, as comunidades bacterianas diferiram significativamente entre as espécies de esponjas e a água do mar. Contudo, foi observado que as comunidades bacterianas habitando esponjas filogeneticamente mais próximas (A. fulva e A. crassa) são mais similares uma para com a outra, do que quando comparado com as comunidades em um táxon mais distante filogenitacamente (C. collectrix). O isolamento de bactérias foi realizado nas esponjas D. oxeata e S. ruetzleri. Cinquenta e seis linhagens foram isoladas e classificadas em três filos: Actinobacteria, Proteobacteria e Firmicutes. As análises filogenéticas indicaram cinco possíveis novas espécies bacterianas. Com base na taxonomia polifásica, um dos isolados, denominado ASPSP 40, foi caracterizado como pertencente a uma nova espécie do gênero Saccharopolyspora, para qual o nome Saccharopolyspora spongiae sp. nov. foi proposto. Dois isolados bacterianos demonstraram forte atividade antagônica contra as seguintes espécies de Pythium: P. aphanidermatum, P. graminicola e P. ultimum. Os metabólitos secundários desses isolados, assim identificados como pertencentes aos gêneros Terrabacter sp. ASPSP 140 e Bacillus sp. ASPSP 434, foram identificados por LC-MS/MS como sendo uma mistura de dipepitídeos cíclicos pertencentes à classe das dicetopiperazinas (DKP). Este é o primeiro relato da atividade fungicida e, consequentemente, a detecção de DKP a partir do gênero Terrabacter. / This study describes the diversity of associated bacterial communities to five marine sponges, and the potential of these microorganisms as producers of bioactive substances with fungicidal properties. Sponges live in symbiosis with microorganisms that have a high ecological interest, evolutionary and biotechnological. However, this microbial system remains poorly understood. To fully understand sponge biology, it is necessary to describe the ecological and evolutionary factors that influence the structure and dynamics of their microbial communities. In this work, it is supported the hypothesis that the taxonomic composition and structure of bacterial communities correlate with phylogenetic relatedness of their corresponding hosts. Bacterial communities associated with the sponges Aplysina fulva, Aiolochroia crassa, Chondrosia collectrix, Didiscus oxeata and Scopalina ruetzleri were examined using the Ion Torrent platform for partial sequencing of the 16S rRNA gene. Seawater surrounding specimens were collected for comparisons. The analysis detected a complex and specific microbial system living in sponges, with the operational taxonomic units dominant classified in the phyla: Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Proteobacteria and Gemmatimonadetes. Despite sympatric occurrence of the specimens, the studied sponges presented different bacterial compositions that differed from those observed in seawater. However, lower dissimilarities in bacterial communities were clearly observed within sponges from the same phylogenetic group (A. fulva and A. crassa). Isolation of bacteria was done from the sponges D. oxeata and S. ruetzleri. Fifty-six strains were isolated and classified into three phyla: Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. Phylogenetic analysis indicated five possible novel bacterial species. Based in a polyphasic taxonomy approach, one of the isolates denominated ASPSP 40 was identified as belonging to a novel species of the genus Saccharopolyspora for which the name, Saccharopolyspora spongiae sp. nov. has been proposed. All bacterial isolates were evaluated by their antagonisms against Pythium species. Two of them, Terrabacter sp. ASPSP 140 and Bacillus sp. ASPSP 434 demonstrated strong potential in inhibiting the following species P. aphanidermatum, P. ultimum and P. graminicola. The bioactive secondary metabolites of both, characterized by LC-MS/MS, were identified as a mixture of cyclic dipepitides belonging to the class of diketopiperazine (DKP). This is the first report of fungicidal activity, and thus the detection of DKP of the genus Terrabacter.

A filosfera da Mata Atlântica é um importante nicho de colonização por micro-organismos, cuja comunidade ainda é pouco conhecida. Algumas bactérias associadas à superfície das folhas possuem habilidade de fixar nitrogênio, mineralizar substratos orgânicos e também suprir as árvores com dióxido de carbono e fatores de crescimento. Este trabalho teve como objetivo gerar informações sobre a comunidade cianobacteriana que coloniza a filosfera de algumas plantas da Mata Atlântica e investigar a comunidade diazotrófica presente nesse habitat. Um total de 40 linhagens de cianobactérias da filosfera de Merostachys neesii (bambu), Euterpe edulis (palmeira Juçara), Guapira opposita e Garcinia gardneriana foram isoladas e cultivadas. Os isolados foram caracterizados por análises morfológicas e filogenia do gene 16S RNAr. Essa abordagem permitiu a identificação de uma linhagem do gênero Nostoc, sete Desmonostoc, seis Leptolyngbya, uma Oculatella, cinco Brasilonema, uma Pleurocapsa e duas Chroococcidiopsis. Dezessete linhagens (uma Microchaetaceae, dez Nostocaceae e seis Pseudanabaenaceae) não puderam ser identificadas ao nível de gênero. Vinte e seis linhagens (24 pertencentes às ordens Nostocales e duas à Pseudanabaenales) foram caracterizadas como diazotróficas pela amplificação, sequenciamento e filogenia do gene nifH. Além disso, caracterizou-se o perfil de fixação biológica de nitrogênio da linhagem Desmonostoc sp. CENA362. Com relação ao potencial biotecnológico dessas linhagens, treze isolados foram identificados como potenciais produtores de ácido indol acético (IAA) de acordo com o teste Salkowski. Diversas linhagens apresentaram genes associados à via biossintética do inibidor de protease microviridina, sendo que três delas codificam para novas variantes. Além disso, dez linhagens foram identificadas como potenciais produtoras aeruginosina, três de cianopeptolina e três de microcistina. A comunidade bacteriana diazotrófica avaliada por pirosequenciamento do gene nifH apresentou um perfil de variação espécie-específica para Proteobacteria e uma correlação positiva entre a riqueza e a fixação biológica de nitrogênio. Neste estudo, cianobactérias que habitam a filosfera da Mata Atlântica foram isoladas estão sendo mantidas em condições de cultivo. Novos táxons foram descobertos e vários gêneros conhecidos foram descritos pela primeira vez neste hábitat, o que contribuiu para o aprimoramento da sistemática de Cyanobacteria. As linhagens em cultivo e as informações geradas sobre os seus compostos metabólitos representam uma valiosa fonte para estudos posteriores. Além disso, informações sobre a comunidade bacteriana diazotrófica da filosfera pode auxiliar no entendimento da dinâmica do nitrogênio, elemento limitante e pouco disponível na Mata Atlântica / The phyllosphere of the Atlantic Forest is an important niche for colonization by microorganisms, whose community is still little known. Some bacteria associated with leaf surfaces may possess the ability to fix nitrogen, mineralize the organic substrates and also supply the trees with carbon dioxide and growth factors. Therefore, this study aimed to generate information about cyanobacterial community that colonize the phyllosphere of some plants of the Atlantic Forest and investigated the diazotrophic community in this habitat. A total of 40 strains of Cyanobacteria from the phyllosphere of Merostachys neesii (bamboo), Euterpe edulis (Juçara palm), Garcinia gardneriana and Guapira opposita was isolated and cultivated. The isolates were characterized by morphological analyses and phylogeny of the 16S rRNA gene. This approach allowed the identification of one strain of the genus Nostoc, seven Desmonostoc, six Leptolyngbya, one Oculatella, five Brasilonema, one Pleurocapsa and two Chroococcidiopsis. Seventeen strains (one Microchaetaceae, ten Nostocaceae and six Pseudanabaenaceae) could not be identified at the genus level. Twenty-six strains (24 belonging to Nostocales and two belonging to Pseudanabaenales) were characterized as diazotrophic by amplification, sequencing and phylogeny of nifH gene. Also, it was characterized the profile of biological nitrogen fixation for the strain Desmonostoc sp. CENA362. Regarding the biotechnological potential of these strains, thirteen strains were identified as potential producers of indole acetic acid (IAA) according to Salkowski test. Several strains presented genes involved in the biosynthetic pathway of the protease inhibitor microviridin, three of them encoding putative novel variants. Moreover, ten strains were identified as potential producers of aeruginosin, three of cyanopeptolin and three of microcystin. The diazotrophic bacterial community evaluated by pyrosequencing of the nifH gene showed a profile of variation plant species-specific for Proteobacteria, and a positive correlation between richness and biological nitrogen fixation. In this study, cyanobacteria that inhabiting Brazilian Atlantic Forest phyllosphere were isolated and are been maintained in culture conditions. New taxa were discovered and several known genera were described for the first time in this habitat, which contributed to improvement of the cyanobacterial systematic. The culturable strains and the information generated about their metabolites compounds represent a valuable source for further studies. In addition, information about the diazotrophic bacterial community inhabiting the phyllosphere may help in understanding the dynamics of nitrogen, a limiting and low available element in Atlantic Forest

Este estudo descreve a diversidade e composição das comunidades bacterianas associadas a cinco esponjas marinhas, e o potencial destes microrganismos como produtores de substâncias bioativas com propriedades fungicidas. As esponjas vivem em simbiose com microrganismos que apresentam alto interesse ecológico, evolutivo e biotecnológico. Contudo, este sistema microbiano permanece pobremente entendido. Para totalmente compreender a biologia desses animais é necessário descrever os fatores ecológicos e evolutivos influenciando a estrutura e dinâmica de sua microbiota. Nesta tese é defendida a hipótese de que a composição taxonômica e estrutura das comunidades bacterianas se correlaciona com o parentesco filogenético de seus hospedeiros. Neste trabalho, as comunidades bacterianas associadas às esponjas Aplysina fulva, Aiolochroia crassa, Chondrosia collectrix, Didiscus oxeata e Scopalina ruetzleri foram examinadas usando a plataforma Ion torrent para sequenciamento parcial do gene 16S rRNA. A água do mar circundante aos espécimes foram coletadas para comparações com a microbiota de esponjas. As análises detectaram um complexo e específico sistema microbiano vivendo em esponjas, com as unidades taxonômicas operacionais dominantes classificadas nos filos: Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Proteobacteria e Gemmatimonadetes. Apesar da ocorrência simpátrica dos espécimes, as comunidades bacterianas diferiram significativamente entre as espécies de esponjas e a água do mar. Contudo, foi observado que as comunidades bacterianas habitando esponjas filogeneticamente mais próximas (A. fulva e A. crassa) são mais similares uma para com a outra, do que quando comparado com as comunidades em um táxon mais distante filogenitacamente (C. collectrix). O isolamento de bactérias foi realizado nas esponjas D. oxeata e S. ruetzleri. Cinquenta e seis linhagens foram isoladas e classificadas em três filos: Actinobacteria, Proteobacteria e Firmicutes. As análises filogenéticas indicaram cinco possíveis novas espécies bacterianas. Com base na taxonomia polifásica, um dos isolados, denominado ASPSP 40, foi caracterizado como pertencente a uma nova espécie do gênero Saccharopolyspora, para qual o nome Saccharopolyspora spongiae sp. nov. foi proposto. Dois isolados bacterianos demonstraram forte atividade antagônica contra as seguintes espécies de Pythium: P. aphanidermatum, P. graminicola e P. ultimum. Os metabólitos secundários desses isolados, assim identificados como pertencentes aos gêneros Terrabacter sp. ASPSP 140 e Bacillus sp. ASPSP 434, foram identificados por LC-MS/MS como sendo uma mistura de dipepitídeos cíclicos pertencentes à classe das dicetopiperazinas (DKP). Este é o primeiro relato da atividade fungicida e, consequentemente, a detecção de DKP a partir do gênero Terrabacter. / This study describes the diversity of associated bacterial communities to five marine sponges, and the potential of these microorganisms as producers of bioactive substances with fungicidal properties. Sponges live in symbiosis with microorganisms that have a high ecological interest, evolutionary and biotechnological. However, this microbial system remains poorly understood. To fully understand sponge biology, it is necessary to describe the ecological and evolutionary factors that influence the structure and dynamics of their microbial communities. In this work, it is supported the hypothesis that the taxonomic composition and structure of bacterial communities correlate with phylogenetic relatedness of their corresponding hosts. Bacterial communities associated with the sponges Aplysina fulva, Aiolochroia crassa, Chondrosia collectrix, Didiscus oxeata and Scopalina ruetzleri were examined using the Ion Torrent platform for partial sequencing of the 16S rRNA gene. Seawater surrounding specimens were collected for comparisons. The analysis detected a complex and specific microbial system living in sponges, with the operational taxonomic units dominant classified in the phyla: Acidobacteria, Actinobacteria, Chloroflexi, Proteobacteria and Gemmatimonadetes. Despite sympatric occurrence of the specimens, the studied sponges presented different bacterial compositions that differed from those observed in seawater. However, lower dissimilarities in bacterial communities were clearly observed within sponges from the same phylogenetic group (A. fulva and A. crassa). Isolation of bacteria was done from the sponges D. oxeata and S. ruetzleri. Fifty-six strains were isolated and classified into three phyla: Actinobacteria, Proteobacteria and Firmicutes. Phylogenetic analysis indicated five possible novel bacterial species. Based in a polyphasic taxonomy approach, one of the isolates denominated ASPSP 40 was identified as belonging to a novel species of the genus Saccharopolyspora for which the name, Saccharopolyspora spongiae sp. nov. has been proposed. All bacterial isolates were evaluated by their antagonisms against Pythium species. Two of them, Terrabacter sp. ASPSP 140 and Bacillus sp. ASPSP 434 demonstrated strong potential in inhibiting the following species P. aphanidermatum, P. ultimum and P. graminicola. The bioactive secondary metabolites of both, characterized by LC-MS/MS, were identified as a mixture of cyclic dipepitides belonging to the class of diketopiperazine (DKP). This is the first report of fungicidal activity, and thus the detection of DKP of the genus Terrabacter.

Este estudo descreve a diversidade de actinobactérias isoladas da esponja marinha Aplysina fulva e o potencial destes microorganismos como produtores de metabólitos bioativos com propriedades fungicidas e herbicidas. Actinobactérias são prolíficas produtoras de compostos farmacologicamente importantes, pois cerca de 70% dos antibióticos naturalmente derivados que estão atualmente em uso clínico são produzidos por estes microorganismos. Entretanto este valor é ainda inexpressivo na indústria agrícola. Agroquímicos sintéticos ainda são dominantes no mercado apesar de estarem menos efetivos contra plantas daninhas e patógenos cada vez mais resistentes. Neste trabalho, um total de 21 actinobactérias foram isoladas com a utilização de meios seletivos. Análises filogenéticas baseadas no sequenciamento parcial do gene que codifica para o rRNA 16S mostrou que estes microorganismos pertencem a oito gêneros do filo Actinobacteria: Kocuria; Citricoccus; Terrabacter; Gordonia; Agrococcus; Tsukamurella; Brevibacterium e Streptomyces. Os extratos de todos os isolados foram testados para verificar a produção de metabólitos secundários com propriedades fungicidas contra os fungos fitopagênicos de importância agrícola: Pythium aphanidermatum; Phytophthora capsici e Magnaporthe grisea. O extrato bruto de 43% dos isolados mostrou atividade fungicida para ao menos um dos patógenos. O perfil químico do extrato dos isolados com bioatividade positiva foram similares mesmo entre gêneros diferentes. Os metabólitos do Streptomyces ASPSP 103 foram mais eficientes devido à forte inibição contra todos os patógenos testados. Portanto este isolado foi selecionado e testado para atividade herbicida por meio de screening que teve início com testes de atividade algicida contra a microalga Selenastrum capricornutum. Acreditamos que actinobactérias associadas a esponjas marinhas desempenham um papel de defesa química contra microalgas que possam obstruir os porócitos asfixiando o animal, e que estes compostos algicidas possivelmente tenham ação herbicida. Foi verificada atividade do extrato bruto do Streptomyces ASPSP 103 contra S. capricornutum, e a atividade herbicida pré-emergência com um efeito fraco em Lactuca sativa (dicotiledônea) e uma forte inibição em Agrostis stolonifera (monocotiledônea). A purificação do extrato bruto para isolamento do composto bioativo foi guiado por bioensaio contra Pythium aphanidermatum, um oomiceto de rápido crescimento e sensível aos metabólitos de ASPSP 103 previamente testados. Foi identificado o composto da classe butenolida com atividade herbicida préemergência contra Agrostis stolonifera (IC50 33.43 μg/mL). Este é o primeiro relato da atividade de butenolida para atividade herbicida. Estudos aprofundados em taxonomia mostraram que as características filogenéticas, morfológicas e químicas do isolado ASPSP 103 são consistentes com o gênero Streptomyces. Portanto devido algumas diferenças em parâmetros taxonômicos, ASPSP 103T foi proposto como linhagem tipo para uma nova espécie de Streptomyces, para qual o nome Streptomyces atlanticus sp. nov. foi sugerido. Estes resultados enfatizam o potencial de Streptomyces marinhos para produzir compostos bioativos com potencial de aplicação em agrobiotecnologia. / Actinobacteria are producers of important pharmacological compounds. About 70% of natural antibiotics are derived from these microorganisms. However, the use of natural compounds are still limited in the agricultural industry, even considering that synthetic pesticides are less effective against pathogens and weed plants. This study describes the diversity of actinobacteria associated with the marine sponge Aplysina fulva and their potential as producers of bioactive compounds with fungicidal and herbicidal properties. In this study, a total of 21 actinomycetes were isolated with the use of selective media. Phylogenetic analyzes based on partial sequencing of the gene encoding for 16S rRNA showed that these microorganisms belong to eight Actinobacteria genera, including Kocuria, Citricoccus, Terrabacter, Gordonia, Agrococcus, Tsukamurella, Brevibacterium and Streptomyces. The extracts of all isolates were tested for the production of secondary metabolites with fungicidal properties against the following phytopathogenic fungi: of Pythium aphanidermatum, Phytophthora capsici and Magnaporthe grisea. The crude extract of 43% of the isolates showed fungicidal activity for at least one of the pathogens. The chemical profiles of the actinobacteria extracts with positive bioactivity were similar even among different genus. The metabolites of Streptomyces ASPSP 103 were more efficient because of the strong inhibition against all tested pathogens. So, the isolate ASPSP 103 was selected and tested for herbicide activity through screening for algaecide activity towards microalgae Selenastrum capricornutum. We believe that actinobacteria associated with marine sponges play a role in chemical defense against algae that can obstruct the pores, choking the animal. These algaecides compounds possibly have herbicide action. Activity of the Streptomyces ASPSP 103 crude extract against S. capricornutum was observed. In addition, it was observed a weak pre-emergence herbicide activity on Lactuca sativa (dicot) and a strong inhibition in Agrostis stolonifera (monocot). The purification of the crude extract to isolate the bioactive compound was guided by bioassay against Pythium aphanidermatum, a fast growing oomycete and sensitive to metabolites from ASPSP 103 previously tested. The butenolide compound was identified with pre-emergence herbicidal activity against Agrostis stolonifera (IC50 33.43 μg/mL). This is the first report of butenolide activity with herbicide activity. Taxonomy studies showed that the phylogenetic, morphological and chemical characteristics of the isolated ASPSP 103 are consistent with the Streptomyces genus. Then, considering some differences in taxonomic parameters, ASPSP 103T was proposed as line type for a new species of Streptomyces, for which the name Streptomyces atlanticus sp. nov. was suggested. These results emphasize the potential of marine Streptomyces to produce bioactive compounds with potential biotechnological application in agricultural industry.