La cytokinèse est un processus fondamental prenant place à la fin de la mitose et permettant la séparation des deux cellules filles. Un défaut de cytokinèse peut mener à une ségrégation anormale des chromosomes et engendrer des phénomènes de cancer. Dans beaucoup d'organismes eucaryotes, la cytokinèse nécessite l'assemblage et la contraction d'un anneau d'actomyosine permettant la formation d'un sillon et la réorganisation de la membrane cellulaire au site de clivage. Dans la plupart de ces organismes, des protéines du cytosquelette appelées septines participent à la cytokinèse. Chez la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae, cinq septines sont exprimées durant la mitose (Cdc3, Cdc10, Cdc11, Cdc12 et Shs1). Ces protéines ont la capacité de s'assembler en un anneau au niveau du site de bourgeonnement, lieu de séparation entre la cellule mère et la cellule fille. Cet anneau de septines permet la fixation et le recrutement de nombreuses protéines intervenant dans la cytokinèse. La dynamique des septines change durant le cycle cellulaire, ce qui a une importance dans la régulation de la cytokinèse. La stabilisation de cet anneau est accompagnée d'un changement du niveau de phosphorylation des septines, mais les kinases responsables de ces modifications restent inconnues. Les travaux de l'équipe de Simonetta Piatti ont mis en évidence un nouveau rôle de la GTPase Rho1 et de sa cible, la protéine kinase C (Pkc1), dans la régulation de la dynamique des septines. Le but de ce travail de thèse était de déterminer les voies moléculaires par lesquelles la protéine Pkc1 intervient dans le recrutement et la stabilisation de l'anneau de septines. Pour se faire nous avons purifié le complexe de septines chez la levure bourgeonnante en présence ou en absence de la protéine Pkc1 et nous l'avons analysé par spectrométrie de masse. Cette analyse nous a permis d'observer que le niveau de phosphorylation d'un cluster (îlot) de 5 sérines était diminué sur Shs1. L'alignement de séquence nous a permis de constater que ce domaine était conservé dans la septine Cdc11. Par ailleurs ces deux protéines sont connues pour jouer un rôle dans l'assemblage des filaments et la formation de l'anneau de septines. Il a déjà été observé qu'un mutant phosphomimétique du cluster de sérine de la septine Shs1 empêche la formation des filaments in-vitro. Nous avons voulu caractériser le rôle de ce cluster dans la protéine Cdc11 en créant un mutant non-phosphorylable (CDC11-9A) et un mutant phosphomimétique (CDC11-9D). De manière très évidente, le mutant phosphomimétique provoque des problèmes de cytokinèse dans les cellules dont le gène codant la protéine Shs1 a été supprimé. A l'inverse le mutant non-phosphorylable améliore le phénotype des cellules ne comportant pas Shs1. Ces résultats sont en parfait accord avec l'observation selon laquelle les protéines Shs1 et Cdc11 pourraient avoir des fonctions très similaires, et mettent en avant le rôle important du cluster de sérines phosphorylées de Cdc11 lors de la cytokinèse. Nous avons constaté que Pkc1 ne phosphoryle pas directement les septines, mais agit par l'intermédiaire de kinases et de phosphatases impliquées dans la régulation des septines. Nous avons pu montrer que Pkc1 régule l'interaction de Gin4 avec les septines, cette kinase étant connue pour sa capacité à phosphoryler Shs1. De plus, nous avons observé que Pkc1 impacte sur le niveau de phosphorylation des deux autres kinases de la même famille, Hsl1 et Kcc4. Par ailleurs, la délétion de PKC1 diminue drastiquement la quantité de protéines Kcc4 dans la cellule.L'absence de Pkc1 augmente également l'interaction entre les septines et Bni4, une sous-unité régulatrice de la phosphatase PP1. Nous avons également observé que Bni4-PP1 peut déphosphoryler Cdc11, expliquant la diminution de son niveau de phosphorylation en cas d'absence de la protéine Pkc1.Ces travaux mettent en évidence que Pkc1 est un nouveau régulateur majeur des septines dans la levure. / Cytokinesis is the last step of mitosis and is the fundamental process leading to the physical separation of two daughter cells. Defects in cytokinesis generate polyploid cells that are prone to chromosome missegregation and cancer development. In animal cells and fungi, cytokinesis requires the formation and contraction of an actomyosin ring that drives ingression of the cleavage furrow. Additional cytoskeletal proteins called septins contribute to cytokinesis. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, five different septins are expressed during the mitotic cell cycle (Cdc3, Cdc10, Cdc11, Cdc12 and Shs1). All septins, except for Shs1, are essential for cell viability. Yeast septins form filaments that in turn organize into a ring at the bud neck, which is the constriction between the mother and the future daughter cell where cytokinesis takes place. The septin ring then expands into a rigid septin collar that acts as scaffold for cytokinesis by recruiting most cytokinetic proteins to the bud neck. Cell cycle-regulated changes in septin ring dynamics are thought to be important for its cytokinetic functions and formation of the rigid septin collar is accompanied by septin phosphorylation. However, the kinases responsible for these modifications have not been fully characterized. Unpublished data from our laboratory indicate that the Rho1 GTPase, which is essential for actomyosin ring formation and contraction, and its target protein kinase C (Pkc1) contribute to deposition and stabilization of the septin ring. Here, we have addressed how Pkc1 regulates septin ring deposition and/or stability. To this end, septin complexes were purified from yeast and analyzed by mass spectrometry, comparing wild type and pkc1Δ mutant cells. This mass spectrometry analysis clearly showed that phosphorylation of a cluster of residues in Shs1 decreased in the absence of Pkc1. Interestingly, we found that this cluster is conserved in the septin Cdc11, which together with Shs1 is known to play an important role in the assembly of high-order structures like filaments and rings. Phosphomimetic mutations of the phosphorylatable cluster in Shs1 have been previously shown to disrupt filament formation in-vitro. We therefore proceeded to mutagenise the same cluster in Cdc11, generating a phosphomimetic (CDC11-9D) and in a non-phosphorylatable mutant (CDC11-9A). Strikingly, the phosphomimetic CDC11-9D caused cytokinesis defects in cells lacking Shs1, whereas the non-phosphorylatable CDC11-9A allele partially rescued the sickness of shs1∆ mutant cells. These observations are in agreement with the notion that Cdc11 and Shs1 share overlapping functions and highlight an important role of the phosphorylatable cluster of Cdc11 for cytokinesis. We also found that Pkc1 does not phosphorylate septins directly, but rather regulates the activity of septin kinases and phosphatases. Consistently, we show that Pkc1 affects the interaction between septins and the bud neck kinase Gin4, which is known to interact with septins and to phosphorylate them. In addition, Pkc1 impacts on the phosphorylation of two additional bud neck kinases, Hsl1 and Kcc4, which are part of the same family of Nim1-related kinases as Gin4. In addition, PKC1 deletion leads to a dramatic decrease in the levels of Kcc4 , so that it is barely detected at the bud neck.Deletion of PKC1 affects also the interaction between septins and the Bni4 protein, which is a regulatory subunit for the PP1 phosphatase at the bud neck. In turn, we found that Bni4-PP1 modulates Cdc11 phosphorylation, thereby explaining how the latter is decreased in the absence of Pkc1. Altogether, our data strongly suggest that Pkc1 is a novel major regulator of septins in yeast.

The influences of posttranslational modifications on the functions of the versatile serpin protein C inhibitor (PCI) were studied. PCI is a serine protease inhibitor that is expressed in many tissues and secreted to various fluids in human, including blood plasma, seminal plasma, and urine. PCI in blood can act both as an anticoagulant and a procoagulant and is believed to play a role in pathogen defence. PCI in reproductive tissues is believed to regulate human reproduction at several steps, including the fertilization process. Due to the broad protease specificity and the contradictory activities, the physiological role of PCI is elusive. In this work the inhibitor was purified from blood and seminal plasma by immunoaffinity chromatography. Blood-derived PCI was found to be highly heterogeneous, due to variations in posttranslational modifications. The occupancy and structures of N- and O-glycans attached to blood plasma PCI and N-glycans of seminal plasma PCI were determined by mass spectrometry. An O-glycosylation site at Thr 20 was identified in PCI derived from blood. N-glycan structures of PCI isolated from blood and seminal plasma differed markedly, demonstrating that they are expressed in a tissue-specific manner. Proteolytic processing also appeared to be tissue-specific, since N-terminally cleaved PCI was found in PCI isolated both from blood and seminal plasma, but the length of the lacking segment differed. The effects of the N-linked glycans and the N-terminus of PCI on protease inhibition were determined using enzymatic measurements with chromogenic substrates. The N-glycans and the N-terminus had different effects on the inhibition of thrombin, factor Xa and prostate specific antigen, demonstrating that posttranslational modifications of PCI affect its functional specificity. These findings enhance the understanding of the regulation of the various functions of PCI and may potentially be used for the production of specialized PCI variants for medical purposes.

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Parkinson disease (PD) is the most common movement disorder and the second most common neurodegenerative disease. PINK1, PTEN-induced kinase 1, functions as a serine/threonine kinase as well as a protector of mitochondrial function. Mutations in PINK1 gene result in either mitochondria dysfunction or disruption of kinase signaling pathways involved in the pathogenesis of PD. In this thesis, oxidative stress levels were examined in the brain of PINK1 knockout mice, and also how heme oxygenase-1 and biliverdin reductase are affected in brain of PINK1 knockout mice. In addition, posttranslational modifications are a way to control the behavior of proteins, so posttranslational modifications of the brain of PINK1 knockout mice, including both oxidative modification and phosphorylative modification, were examined.

Oxidative stress is an important factor in carcinogenesis of oncohematological diseases. However its role in the pathogenesis of myelodysplastic syndromes (MDS) remains unclear. In this study, we have determined the oxidative status and evaluated proteomic changes in plasma of MDS patients as a consequence of oxidative dysbalance (oxidative modifications, protein-protein interaction and complex forming). We measured the levels of total cysteine, homocysteine, cysteinyglycine, glutathione, nitrites and nitrates in the plasma from 61 MDS patients and 23 healthy donors using high performance liquid chromatography. Glutathione and nitrites levels reduced significantly while other aminothiols levels increased significantly in plasma of MDS patients. This association with oxidative stress did not correlate with iron overload. We also found enhanced levels of asymmetric dimethylarginine in serums of middle aged patients with MDS that correlate to posttranslational modifications of proteins arginyl residues. Furthermore, carbonylated proteins level was significantly elevated in MDS patients compared to healthy donors. Using mass spectrometry, 5 S-nitrosylated blood platelets proteins were identified in plasma and blood platelets of MDS patients and set of 16 plasma proteins with high probability of...

Circadiane Uhren sind endogene Oszillatoren, die tägliche Rhythmen in Physiologie, Metabolismus und Verhalten steuern. Auf molekularem Level wird die Dynamik der circadianen Oszillation über ein genregulatorisches Netzwerk aus transkriptionellen-translationalen Rückkopplungsschleifen gesteuert. Posttranslationale Modifikationen von Uhrproteinen sind für eine präzise Justierung der circadianen Periode essentiell. Dabei spielt die Phosphorylierung von Uhrproteinen für die Regulation von Aktivität, Stabilität und intrazellulärer Lokalisation eine wichtige Rolle. Bisher sind verschiedene Kinasen als Modulatoren der circadianen Uhr charakterisiert worden, jedoch ist eine funktionale Rolle von Protein Phosphatasen bisher nur unzureichend untersucht. In dieser Arbeit wurde mittels eines RNAi-basierten Screenings in oszillierenden humanen Zellen untersucht, ob sich die gezielte Depletion katalytischer Untereinheiten der Serin/Threonin-Phosphatasen auf die normale Oszillationsdynamik auswirkt und welche Rolle ausgewählte Phosphatase-Kandidaten für die posttranslationale Kontrolle des molekularen Oszillators spielen. Die RNAi vermittelte Depletion von Protein Phosphatase 4 führte gewebe- und speziesübergreifend zu einer signifikant kurzen circadianen Periode, während die Überexpression von wildtypischer Pp4c in einer stark reprimierten Amplitude resultierte. Mechanistische Untersuchungen zur funktionellen Relevanz von PP4c für die Regulation der circadianen Uhr zeigten, dass PP4c womöglich eine duale Rolle spielt: Einerseits ist PP4c in die direkte Aktivierung des Bmal1-Promotors über RRE-Elemente involviert. Anderseits wirkt PP4c inhibierend auf die CLOCK/BMAL1-vermittelte, E-Box getriebene Genexpression. Ein favorisiertes Modell fundiert auf der Vermutung, dass eine durch PP4c induzierte Modulation des Phosphorylierungsstatus von BMAL1 zu einem stabilen, aber transktiptionsinaktiven BMAL1 und damit zu einer verstärkten Repression der Uhrgentranskription führt. / Circadian clocks are endogenous oscillators that drive daily rhythms in physiology, metabolism and behavior. On the molecular level the dynamics of circadian oscillations are regulated by a transcriptional-translational gene-regulatory network. Posttranslational modifications of clock proteins are essential for the precise timing of an about 24 hour-period. Among these modifications, protein phosphorylation plays an important role in regulating activity, stability and intracellular localization of clock proteins. Several kinases were characterized as regulators of the circadian clock. However, the function of protein phosphatases, which balance phosphorylation events, in the mammalian clock mechanism is less well understood. By using a systematic RNAi-based approach in oscillating human cells, this work aimed to study the impact of catalytic subunits of Serine/Threonin-phosphatases on normal circadian dynamics and the functional role of potential candidates in the posttranslational control of the mammalian molecular oscillator. This study demonstrates, that genetic depletion of the catalytic subunit of protein phosphatase 4 results independently from tissue and species in a significant shorter period, whereas overexpression of wildtype PP4c results in a severely reduced amplitude rhythm. Mechanistic experiments to uncover the functional relevance of PP4c in the regulation of the circadian clock showed, that PP4c plays a dual role: Firstly, PP4 is involved in the direct activation of the Bmal1-promotor via RRE elements. Secondly, PP4c is inhibiting the CLOCK/BMAL1-mediated gene expression. A favored model is based on the assumption, that PP4c-induced modulation of the phosphorylation status of BMAL1 leads to a more stable and transcriptional inactive protein and thereby to a repression of the transcription of clock genes.

Zusammenfassung Die hier vorgelegte Arbeit analysiert funktionelle Domänen von Sec71p und Sec72p, zwei Komponenten des posttranslationalen Transports in das ER von Saccharomyces cerevisiae. Die Kombination von Nullmutanten von SEC71, SEC72 und SBH1 führte zu den letalen Doppeldeletionsmutanten -sec71/-sbh1 und -sec72/-sbh1. Beide Hefestämme zeigen starke Akkumulation von Präkursoren verschiedener Transportsubstrate in vivo und in vitro. Ausgehend von den letalen Doppeldeletionsstämmen war es möglich, für die Funktion von Sec71p und Sec72p wesentliche Domänen zu bestimmen. Der cytosolische Bereich von Position 120-160 des Sec71p ist ausreichend für die Assoziation mit Sec62p und bildet außerdem einen Teil der Sec72p-Bindungsdomäne. Der sich anschließende C-terminale Bereich von 46 Aminosäuren ist ebenfalls ein Teil der Sec72p-Bindungsdomäne. Jede Teildomäne für sich kann Sec72p eingeschränkt anlagern, zusammen binden sie Sec72p Hochsalz-resistent und Alkali-beständig. Sowohl eine C-terminale Verkürzung von Sec71p bis Position 160, als auch eine Sec71p-Variante ohne Membrananker und luminalen Teil können Sec71p funktionell ersetzen. Fusionsproteine von cytosolischen Bereichen des Sec71p und dem Membrananker des P450 aus Candida maltosa können es nicht. Der Membrananker von Sec71p ist somit nicht essentiell, kann aber auch nicht durch einen beliebigen Membrananker ersetzt werden. Eine Sequenzanalyse von Sec72p identifizierte im C-Terminus von Sec72p eine potentielle TPR-Domäne. TPR-Domänen sind Bestanteile von Protein-Interaktionen, unter anderem auch im Protein-Targetingmechanismus von Mitochondrien und Peroxisomen. Es lag daher nahe, nach cytosolischen Interaktionspartnern von Sec72p zu suchen, die Teil eines posttranslationalen Targetingmechanismus sein könnten. Die Ergebnisse photochemischer Quervernetzungsexperimente werden genauso vorgestellt, wie die eines Screens zur Identifizierung synthetisch letaler Mutanten. Durch Coimmunpräzipitationen wurde gezeigt, daß in Abwesenheit von Sec71p, Sec72p und Sbh1p die Assoziation von Sec61p mit Sec62p nicht beeinträchtigt wird. Die hier präsentierten Daten in Kombination mit anderen Ergebnissen führen zu der Hypothese, daß Sec71p/Sec72p zusammen mit Sbh1p eine essentielle Funktion während eines frühen Schrittes der posttranslationalen Translokation ausüben. Wegen der möglichen gegenseitigen Komplementation wurden die drei Proteine bisher in genetischen Screens jedoch nie als essentiell für den posttranslationalen Transportprozeß gefunden. / Abstract This work is focused on the functional domains of Sec71p and Sec72p. These proteins are components of the posttranslational transport complex of the ER in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Deletion mutants of SEC71, SEC72 or SBH1 are viable. However the deletion of two genes - either SEC71 and SBH1 or SEC72 and SBH1 resulted in a lethal phenotyp. Both double deletion strains accumulate different transport substrats in vivo and in vitro. Exploiting the lethal strains it was possible to investigate the function of special domains of Sec71p and Sec72p in detail. The cytosolic part of Sec71p from amino acid (aa) 120 to 160 is sufficient for the association of Sec71p with Sec62p. It is also part of the Sec72p binding domain since it binds Sec72p weakly. A tight association (resistant to high salt and alkaline pH) is achived by the additional interaction of Sec72p with the C-terminal aa 160-206 of Sec71p. The C-terminal truncation of Sec71p up to aa 160 is able to rescue a -sec71/-sbh1 deletion strain. Even a Sec71p-variation without the luminal part and membrane anchor can functionaly replace the wt-protein whereas fussion proteins of different cytosolic parts of Sec71p with a transmembrane domain of P450 of Candida maltosa are not able to do it. The transmembrane domain of Sec71p seems not to be essential for proteins function. A membrane anchor of a different protein abolishes the correct interaction of Sec71p with its partners of the translocon. A sequence analysis of SEC72 identified a C-terminal domain with similarity to a TPR-domain. TPR-domains mediat protein interactions and they participate for instance in the targeting of proteins to the mitochondria or peroxisomes. Therefore we searched for cytosolic interaction partners of Sec72p. The results of photoreactive crosslinking studies and of a screen for synthetic lethality are presented in this work. By co-immunoprecipitation we showed that the association between Sec61p and Sec62p is not altered in the abscence of Sec71p, Sec72p and Sbh1p. The results presented herein combined with other data gave rise to the hypothesis that Sec71p/Sec72p together with Sbh1p are essential for an early step of the posttranslational translocation. Because of their overlapping functions neither one of them was found to be essential for the posttranslational transport in former genetic screens.

Les neurodégénérescences avec accumulation de fer dans le cerveau (Neurodegeneration with Brain Iron Accumulation, NBIA) sont des maladies neurodégénératives progressives, génétiquement hétérogènes. On connait actuellement 11 gènes de ces maladies mais pour la plupart d’entre eux leur lien avec l’accumulation en fer est encore incompris. Ce travail de thèse présente deux nouveaux gènes de NBIA identifiés par séquençage d’exome dans deux familles indépendantes. Le premier gène, REPS1, est impliqué dans le recyclage de l’endosome. Les fibroblastes de patients sont caractérisés par une accumulation de fer qui est corrigée par l’expression de l’ADNc de REPS1 dans ces cellules. Le deuxième gène, CRAT, code une carnitine acétyltransferase et le déficit de β-oxydation détecté dans les fibroblastes du patient a été corrigé par l’expression de l’ADNc CRAT normal. Le rôle de REPS1 dans le recyclage de l’endosome a mis sur la voie du mécanisme physiopathologique des NBIA. En effet, les fibroblastes des patients REPS1 et CRAT mais aussi d’autres patients avec des mutations d’autres gènes connus de NBIA (PANK2, PLA2G6, FA2H, C19ORF12) ont une accumulation massive en fer et une anomalie de recyclage du récepteur à la transferrine (TfR1). TfR1 permet l’entrée du fer par endocytose et son expression est régulée par le contenu en fer des cellules. La seule régulation connue de l’homéostasie du fer se fait au niveau post-transcriptionnel par le système IRP/IRE qui est fonctionnel dans les fibroblastes NBIA alors que la protéine TfR1 s’accumule. Cette accumulation de fer montre ainsi qu’il existe une régulation post-traductionnelle, jusqu’ici inconnue, et qui n’est pas fonctionnelle dans les NBIA. Nous avons pu montrer que cette régulation se faisait par une palmitoylation du TfR1, déficitaire dans les NBIA, mais restaurée par l’artesunate. Ainsi quel que soit le gène muté, tous les NBIA résultent d’une anomalie de recyclage du TfR1 permettant de les définir comme des maladies du trafic intracellulaire. La deuxième partie de la thèse s’intéresse au mécanisme physiopathologique de l’ataxie de Friedreich (FRDA) caractérisée elle aussi par une accumulation de fer dans le cerveau. FRDA est due à des expansions de triplets dans le premier intron du gène FXN conduisant à l’extinction de FXN et de PIP5K1B situé en amont. L’étude de modèles cellulaires dans lesquels le gène FXN et/ou PIP5K1B ont été éteints par siRNA et de fibroblastes de patients a permis de mettre en évidence une anomalie de l’homéostasie du fer qui rappelle celle observée dans les NBIA. L’ensemble de ces résultats a permis de comprendre le mécanisme physiopathologique des NBIA, de mettre à jour une régulation encore inconnue de l’homéostasie du fer mais aussi d’envisager une voie de traitement des NBIA. / Neurodegeneration with brain iron accumulation (NBIA) encompasses a group of rare neurogenerative disorders with different clinical and molecular features, underlined by progressive extrapyramidal dysfunction and iron accumulation in the brain. To date, mutations in 11 genes are currently known. Nevertheless for most of them their link with iron accumulation is still misunderstood. This work presents two novel NBIA genes identified by exome sequencing in two independent families. The first gene, REPS1, is involved in endosome recycling. Patient’s fibroblasts are characterized by iron overload corrected by wild-type REPS1 cDNA overexpression. The second gene, CRAT, encodes a carnitine acetyltransferase and a β-oxidation deficit in patient’s fibroblasts has been fixed by overexpression of wild-type CRAT cDNA. The function of REPS1 in endosome recycling put on the path of the NBIA pathophysiological mechanism. Indeed, fibroblasts of REPS1 patients but also from other patients mutated in various NBIA genes (CRAT, PANK2, PLA2G6, FA2H, C19ORF12) present massive iron accumulation and abnormal transferrin receptor (TfR1) recycling. TfR1 allows iron uptake by endocytosis and its expression is regulated by the iron cellular status. The only known regulation of iron homeostasis occurs at the posttranscriptional level by the IRE/IRP system which is functional in NBIA fibroblasts whereas TfR1 protein accumulates. This iron accumulation highlights a yet unknown posttranslational regulation which is not functional in NBIA. We have been able to demonstrate that this regulation occurs via TfR1 palmitoylation, which is defective in NBIA, but restored by artesunate. Hence, whatever the disease gene, all NBIA gave rise to abnormal TfR1 recycling which allows defining NBIA as intracellular trafficking disease. The second part of the thesis focused on the pathophysiological mechanism of the Friedreich ataxia (FRDA) also characterized by brain iron overload . FRDA is related to triplets expansions in the first intron of FXN gene leading to the extinction of FXN and PIP5K1B upstream gene. Studying cellular models knocked down for FXN and/or PIP5K1B by siRNA and patients’ fibroblasts of patients allowed to detect abnormal iron homeostasis reminiscent of NBIA. All these results allowed to decipher the NBIA pathophysiological mechanism, to highlight a yet unknown iron homeostasis regulation and to open possible ways towards therapeutic drugs for NBIA.

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