La cryptogéine, sécrétée par l’oomycète Phytophthora cryptogea, est un éliciteur protéique des réactions de défense qui active chez le tabac un ensemble d’événements de signalisation conduisant à la mise en place d’une mort cellulaire de type réponse hypersensible et d’une résistance systémique acquise. La caractérisation de la modulation de l’activité de kinases cytosoliques, dont SIPK et WIPK, par des événements de phosphorylation en réponse à la cryptogéine, traduit la place majeure que tiennent les modifications post-traductionnelles dans la cascade de signalisation induite dans les cellules de tabac en réponse à la cryptogéine. Il s’avère que la signalisation cellulaire induite par la cryptogéine, et impliquant ces protéines kinases, converge entre autre vers le noyau à travers la modulation de l’activité d’éléments nucléaires par phosphorylation. Dans ce contexte, d’importants travaux de purification/séquencage, visant à identifier les protéines nucléaires cibles de ces activités kinases, ont permis d’identifier deux isoformes redondantes d’histones désacétylases de type 2 nommés NtHD2a et NtHD2b qui sont rapidement phosphorylées en réponse à la cryptogéine dans les cellules de tabac.Ce travail de thèse s’inscrit dans l’étude du rôle de NtHD2a/b dans l’établissement du processus de mort cellulaire des cellules de tabac et de la RH in planta en réponse à la cryptogéine. Par des approches de pharmacologie ainsi que des approches de surexpression ou d’invalidation de l’expression de NtHD2a/b chez le tabac, nous avons d’une part confirmé l’implication de NtHD2a/b en tant que régulateurs négatifs de la mort cellulaire induite par la cryptogéine ou d’autres élicitines, et d’autre part mieux appréhendé les événements de la cascade de signalisation prépondérants dans l’établissement de cette mort cellulaire. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à la mise en place de la mort cellulaire apparaissent complexes et semblent notamment impliquer la modulation de l’expression de gènes de défense, la synthèse de novo de protéines ainsi que l’activation de protéines kinases, dont notamment WIPK et SIPK.Des travaux relatifs à l’étude des événements de (dé)/acétylation dans les cellules de tabac traitées par la cryptogéine et invalidées dans l’expression de NtHD2a/b suggèrent le concours de modifications post-traductionnelles de protéines nucléaires telles que l’acétylation dans la mise en place de la mort cellulaire induite par la cryptogéine chez le tabac. / Cryptogein, which is secreted by the oomycete Phytophthora cryptogea, is a proteinaceous elicitor of plant defense reactions that activates a set of signaling events leading to the hypersensitive response and to systemic acquired resistance. Although the early cytosolic signaling events induced by cryptogein are well described, the only nuclear events characterized to date are the variations in free calcium concentrations and defense-related gene expression. The characterization of the activation of cytosolic protein kinases, including WIPK and SIPK, by phosphorylation in response to cryptogein highlights the key-role played by posttranslational modifications in cryptogein-induced signaling events in tobacco cells. In this context, purification/sequencing approaches revealed that two redundant isoforms of type-2 nuclear histone deacetylases, NtHD2a and NtHD2b, were rapidly phosphorylated in cryptogein-treated tobacco cells.This thesis work is part of a comprehensive study of the role of NtHD2a/b in the establishment of the cell death process in tobacco cells and of the hypersensitive response in planta, in response to cryptogein. By using a pharmacological approach and overexpression and RNA interference-based approaches, we confirmed the involvement of NtHD2a/b as negative regulators of elicitin-induced cell death and we achieved a better understanding of cell death signaling events. The molecular events that underly the cell death process appear particularly complex and seem to involve the modulation of defense-related gene expression, de novo protein synthesis and protein kinase activation such as WIPK and SIPK.The study of (de)/acetylation events in tobacco cells treated by cryptogein and invalidated in NtHD2a/b expression suggests a role for posttranslational modifications in cryptogein-induced cell death.

La méthylation de l’ADN et les modifications post-traductionnelles des histones sont desmodifications épigénétiques qui interviennent dans la régulation des éléments transposables(ET) chez de nombreuses espèces. La proportion des ET dans les génomes varie selon lesespèces considérées et pose la question des mécanismes de régulation de ces ET. Au sein del’espèce Drosophila simulans, les populations naturelles présentent un polymorphisme uniquedans le nombre de copies des ET, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier cettequestion. L’étude de la méthylation d’ADN et des modifications post-traductionnelles deshistones associées au rétrotransposon à LTR tirant dans la lignée germinale des populationsnaturelles a permis de montrer l’influence d’une copie d’ET sur la structure de la chromatineau site d’insertion. Dans un second volet, nous avons cherché à caractériser la méthylation del’ADN chez la drosophile, chez laquelle la fonction est encore mal connue. Nous avons, pardes approches spécifiques et globales, mesuré l’abondance de cette marque épigénétique chezla drosophile. Nous concluons que les taux de méthylation de l’ADN sont très faibles maisvariables entre espèces. Notre travail n’a pas permis de mettre en évidence un rôle de laméthylation de l’ADN dans le contrôle des ET, toutefois, nous ne pouvons pas exclure cesystème de régulation. / Epigenetic modifications such as DNA methylation and post-translational histonemodifications are involved in transposable elements (TE) silencing in many species. Theirrelative abundance in genomes ask the question of differences in regulation mecanismbetween species. Within the Drosophila simulans species, natural populations exibits a uniquepolymorphism in TE copy number, providing a powerfull tool for the analysis of TEregulation in population from the same specie. We analyzed DNA methylation and posttranslationalhistone modifications associated with the LTR retrotransposon tirant in thegermline of natural populations and report the influence of this element on chromatinestructure. DNA methylation is a wide-conserved epigenetic modification involved in generegulation and TE silencing but its function in drosophila remains missunderstood. Usingdifferent methods, we determined the abundance of methylated cytosines in drosophila, andshowed that methylation level are low and variable between species. Our results show lowevidence for a TE regulation system involving DNA methylation but this cannot be so farexcluded.

C/EBPα und C/EBPβ sind Transkriptionsfaktoren, die die Zellproliferation und Zelldifferenzierung in vielen Geweben regulieren. C/EBPα und C/EBPβ spielen auch eine onkogene Rolle in akuter myeloischer Leukämie und anaplastisch-großzelligen Lymphomen (ALCL). In dieser Studie wird C/EBPα auf neue posttranslationale Modifikationen, wie z. B. Arginin-Methylierungen und Citrullinierungen, sowie Lysin-Methylierungen und Acetylierungen, mit massenspektrometrischen Mitteln untersucht. Es werden eine modifizierbare C/EBPα-Arginin-Citrullinierungsposition und die C/EBPα-Lysinsumoylierung eingehend auf ihren Einfluss auf C/EBPα-Proteininteraktionsnetzwerk überprüft. Außerdem wurde im Verlauf dieser Studie ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren entwickelt, das wir Protein Interaktions-Screening auf einer Peptid Matrix (PrISMa) nennen. Dieses Verfahren dient der Aufklärung des modifikationsabhängigen Proteininteraktionsnetzwerkes von C/EBPβ. PrISMa basiert auf einer Peptidmembran, auf der C/EBPβ-Peptide synthetisiert sind. Viele dieser Peptide enthalten methylierte Arginine und Lysine, acetylierte Lysine, citrullinierte Arginine und phosphorylierte Serine, Tyrosine und Threonine. Mittels PrISMa konnten Interaktionen von C/EBPβ mit Histonacetyltransferasen, dem Mediatorkomplex, Proteinen des nukleären Transports und RNA bindenden und spleißenden Proteinen verifiziert und kartiert werden. Des Weiteren konnte mit Hilfe von PrISMa eine große Anzahl von publizierten C/EBPβ Interaktionspartner spezifischen C/EBPβ-Sequenzen zugeordnet werden. C/EBPβ wird in ALCL in hohem Maße exprimiert und ist für die Zellproliferation dieser Krebsart wichtig. In dieser Studie wird das Proteininteraktionsnetzwerk C/EBPβ in einer ALCL Zelllinie aufgeklärt, um tiefere Einsichten über die Funktion von C/EBPβ als Onkogen zu erlangen. / C/EBPα and C/EBPβ regulate cell proliferation and differentiation in multiple cell types. Moreover, C/EBPα and C/EBPβ are known to play oncogenic roles in acute myeloid leukemia and anaplastic large cell lymphomas (ALCLs). In this study C/EBPα is screened for novel posttranslational modifications (PTMs), such as arginine methylation and citrullination, as well as lysine methylation and acetylation by using mass spectrometry. A in this survey identified C/EBPα site of arginine citrullination and the C/EBPα lysine sumoylation are scrutinized for their impact on C/EBPα protein interaction network. A new high-throughput method named Protein Interaction Screen on peptide Matrices (PrISMa) is introduced in this study. This method was developed to determine the C/EBPβ protein interaction network in a PTM dependent manner. The PrISMa survey is based on a peptide membrane spotted with C/EBPβ peptides. Many of these C/EBPβ peptide sequences contain amino acid sequences comprising arginine and lysine methylation, lysine acetylation, arginine citrullination and serine, tyrosine and threonine phosphorylation. By means of PrISMa the C/EBPβ interplay with histone acetyltransferases, the mediator complex, proteins of the nucleoplasmic transport and RNA processing proteins is verified and specified by mapping these interactions to C/EBPβ amino acid sequences. Furthermore, PrISMa provides a map of C/EBPβ protein interaction patterns for a great number of the up to date published C/EBPβ protein interaction partners. C/EBPβ is highly expressed in ALCL cell lines and is essential for the cell proliferation of this type of cancer. In this study the C/EBPβ protein-protein interaction pattern in an ALCL cell line is unraveled providing valuable insight into the protein interaction network of C/EBPβ as an oncogene.

Une importante avancée dans la compréhension des mécanismes gouvernant le processus de transport des ions iodures à l’intérieur des cellules thyroïdiennes a été le clonage en 1996 de la protéine responsable de ce transport : le symporteur Na/I (ou NIS). De nombreuses recherches ont été conduites depuis afin de caractériser cette protéine ainsi que les mécanismes qui régulent son expression et son activité. Les mécanismes cellulaires de régulation du transport et les protéines impliquées dans la régulation post-traductionnelle du symporteur restent toutefois largement inconnus. La compréhension de l’ensemble de ces mécanismes permettrait pourtant d’améliorer le traitement d’un grand nombre de patients. Le transport d’iode est en effet non seulement impliqué dans différentes pathologies de la thyroïde, mais aussi dans les contaminations à l’iode radioactif consécutives aux accidents nucléaires et dans de prometteuses stratégies de thérapie génique anticancéreuses. La chémogénomique, aussi appelée génétique chimique, est une approche multidisciplinaire dont le but est d’explorer les systèmes vivants au moyen de petites molécules organiques. Afin de mieux comprendre les mécanismes qui gouvernent le transport d’iode, notre laboratoire a mis en place une stratégie de génétique chimique qui a permis dans un premier temps de découvrir 10 molécules capables d’inhiber le transport d’iode. L’objectif de cette thèse était d’identifier les cibles protéiques de deux de ces molécules : ITB5 et ITB2. Des études d’électrophysiologie et de flux isotopique ayant montré que ces deux molécules ont un mode d’action différent, leur étude devait permettre d’identifier au moins deux protéines impliquées dans le transport des ions iodures.Afin d’identifier les protéines cibles d’ITB5 et d’ITB2, des sondes ont été synthétisées. Ces sondes sont constituées du composé d’intérêt, d’un groupement photoactivable permettant de créer, sous irradiation lumineuse, une liaison covalente avec la ou les protéine(s) cible(s) et d’une molécule de Biotine ou de Desthiobiotine afin d’extraire les protéines marquées des lysats cellulaires. Une fois marquées et capturées sur des billes d’agarose Streptavidine, les protéines d’intérêt ont été séparées sur des gels SDS-PAGE colorés au nitrate d’argent ou au bleu de Coomassie. Les bandes correspondantes ont été excisées, digérées à la trypsine et les peptides obtenus analysés par spectrométrie de masse. L’interrogation de la base de données Swissprot avec les données issues des expériences menées avec la sonde ITB5-P2 a permis d’identifier 3 protéines interagissant visiblement avec ce composé. Les expériences basées sur le composé ITB2 ont du être suspendues par manque de temps mais des résultats encourageants ont déjà été obtenus. Une bande pouvant correspondre à une protéine marquée spécifiquement par la sonde ITB2-P1 a en effet pu être observée en Western-blot suite à une première expérience de capture sur billes. Elle n’a toutefois pas pu être visualisée sur gel du fait d’une présence trop importante de protéines captées non spécifiquement par les billes. Les conditions expérimentales de capture ayant été optimisées avec le composé ITB5, leur application au composé ITB2 devrait maintenant permettre d’obtenir des gels plus propres à partir desquels la bande d’intérêt pourra être excisée pour être, elle aussi, analysée par spectrométrie de masse. / An important breakthrough in the understanding of the mechanisms governing the process of iodide transport inside thyroid cells has been the cloning in 1996 of the protein responsible for this transport : the Na/I symporter (NIS). Different studies have been conducted ever since in order characterize this protein as well as the mechanisms which regulate its expression and its activity. Nevertheless, the cellular mechanisms of transport regulation and the proteins implied in the posttranslational regulation of the symporter remain largely unknown. The full understanding of these mechanisms would allow the treatment improvement of a lot of patients. Iodide transport is indeed involved not only in different thyroid pathologies, but also in radioactive iodide contaminations following nuclear accidents and in promising anticancer strategies by gene transfer. Chemogenomics, also called chemical genetics, is a multidisciplinary approach which goal is to explore the living systems thanks to small organic molecules. To better understand the mechanisms which govern iodide transport, our laboratory has set up a direct chemical genetic strategy which allowed us first to discover 10 molecules able to inhibit iodide transport. The objective of this thesis was to identify the protein targets of two molecules : ITB5 and ITB2. Electrophysiological and isotopic flux studies showed that these two molecules have a different mechanism of action. Their study should then allow the identification of at least two proteins involved in iodide transport.To identify the protein targets of ITB5 and ITB2, different probes were synthesized. These probes are made from the compound of interest, a photoactivable group allowing the creation, under light irradiation, of a covalent bound with the protein target(s) and a Biotin or Desthiobiotine molecule to extract the labeled proteins from cellular lysates. Once labeled and captured on agarose-Streptavidin beads, the proteins of interest were separated on SDS-PAGE gels stained either with silver nitrate or Coomassie blue. The corresponding bands were excised, digested by trypsin and the obtained peptides analyzed by mass spectrometry. A query made in the data bank Swissprot with the data obtained after the experiments conducted with the probe ITB5-P2 allowed us to identify 3 proteins apparently interacting with the compound ITB5. The experiments based on ITB2 had to be suspended because of a lack of time but encouraging results have been obtained. A band which may correspond to a protein specifically labeled by the probe ITB2-P1 has indeed been observed on a Western-blot after a first on-bead capture experiment. However, we couldn’t visualize it on a gel because of the important presence of proteins captured non specifically by the beads. The capture experimental conditions were optimized with the compound ITB5. These conditions will now be applied to the compound ITB2 and this should allow us to obtain cleaner gels on which the band of interest will be excised for an analyze by mass spectrometry.

Dans les cellules des eucaryotes, la transcription des gènes est contrôlée par une pléthore de complexes protéiniques. Cependant, la plupart de nos connaissances fondamentales sur la régulation de la transcription viennent des expériences biochimiques ou des expériences d’immunofluorescences utilisant des cellules fixées. Par conséquent, beaucoup d’efforts ont été consacré récemment pour obtenir des informations sur les mouvements dynamiques ou sur l’assemblage des facteurs de transcription directement dans des cellules vivantes. Nous avons développé une stratégie de marquage, appelé « versatile antibody-based imaging approach » (VANIMA), dans laquelle des anticorps marqués avec un fluorochrome sont introduit dans des cellules vivantes pour visualiser spécifiquement des protéines endogènes ou des modifications post-traductionnelle. Nous avons pu montrer que VANIMA peut être utilisé pour étudier des processus dynamique des mécanismes fondamental de la biologie y compris les facteurs de la machinerie de transcription ainsi que les modifications des histones dans des cellules vivantes de cancer humaine en utilisant la microscopie conventionnelle ou à super-résolution. Dans l’avenir VANIMA va servir comme un outil valable pour révéler les dynamiques des processus endogènes en biologie y compris la transcription directement dans des cellules vivantes individuelles. / In eukaryotic cells, gene transcription is controlled by a plethora of protein complexes. However, most of our basic knowledge about transcription regulation originate from biochemical experiments or immunofluorescence experiments using fixed cells. Consequently, many efforts have been devoted recently to obtain information about the dynamic movements or assembly of transcription factors directly from living cells. Therefore, we developed a labeling strategy, named versatile antibody-based imaging approach (VANIMA), in which fluorescently labeled antibodies are introduced into living cells to image specific endogenous proteins or posttranslational modifications. We were able to show that VANIMA can be used to study dynamical processes of fundamental biological mechanisms including factors of the transcription machinery as well as histone modifications in living human cancer cells using conventional or super-resolution microscopy. Hence, in the future VANIMA will serve as a valuable tool to uncover the dynamics of endogenous biological processes including transcription directly in single living cells.

Bei der Herstellung und Lagerung von Milch und Milchprodukten kommt es in unterschiedlichem Ausmaß zur Bildung von reversiblen und irreversiblen Proteinquervernetzungen. Dabei verändern sich neben technologischen auch ernährungsphysiologische Eigenschaften des Produktes. Die für die Oligomerisation verantwortlichen Strukturen sind bisher nur zum Teil bekannt. Daher soll in dieser Arbeit zunächst das Ausmaß der Quervernetzung in einer größeren Anzahl an handelsüblichen Milchprodukten ermittelt und mit den für diese Proben gemessenen Gehalten der für irreversible Quervernetzungsreaktionen in Lebensmitteln wichtigen Aminosäurederivate Lysinoalanin (LAL) und Histidinoalanin (HAL) verglichen werden. Der Beitrag dieser beiden Dehydroalanin-Derivate für Oligomerisationen ist jedoch stark von der Art ihres Bildungsweges abhängig. Da es in der Literatur keine abschließenden Untersuchungen über eine intra- oder intermolekularen Bildung von LAL und HAL gibt, ist dies eine grundlegende Aufgabe, um in der Folge den Anteil von unbekannten Crosslinks für die analysierten Lebensmittel bestimmen zu können. Die Identifizierung dieser vorhandenen, jedoch strukturell unbekannten Crosslinks ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Untersuchungen. Hierbei richtet sich das Interesse vor allem auf Quervernetzungsprodukte, die im Zusammenhang mit der nicht-enzymatischen Bräunung oder Maillard-Reaktion gebildet werden. Aus der Literatur ist eine Vielzahl von Verbindungen, die an der Oligomerisation und den damit verbundenen Eigenschaftsänderungen von Proteinen beteiligt sind, aus Modellansätzen oder in vivo-Studien bekannt. Untersuchungen zum Vorkommen dieser Strukturen in handelsüblichen Lebensmitteln fehlen jedoch in den überwiegenden Fällen. Dazu ist neben der Synthese einzelner Verbindungen als Standardmaterial die Entwicklung bzw. Optimierung der Analytik für Lebensmittelmatrices durchzuführen. Einige der bekannten, aber noch nicht in Lebensmitteln nachgewiesenen Crosslinkaminosäuren zeichnen sich durch eine charakteristische Fluoreszenz aus. Die Zunahme der Fluoreszenz in technologisch hergestellten Milchprodukten ist aus der Literatur bekannt, eine Identifizierung der dafür verantwortlichen Verbindungen fehlt hingegen. Daher ist ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle, fluoreszierende Crosslinks in Milchprodukten zu charakterisieren und zu quantifizieren.

TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) est une protéine très conservée chez l'ensemble des eucaryotes. C’est une protéine vitale impliquée dans divers processus essentiels, et pour de nombreux organismes son absence conduit à la létalité dès les stades embryonnaires.Chez les animaux comme chez les végétaux, TCTP joue un rôle primordial dans la croissance et le développement des individus. En plus de son implication dans l’apoptose et la réparation de l’ADN, TCTP favorise la prolifération cellulaire, et se trouve donc être un élément important de la tumorigenèse. Chez les végétaux, la forte conservation de TCTP a permis la préservation de la plupart des fonctions décrites chez les animaux, mais les facteurs qui interviennent en amont ne sont pas encore connus.Par la mise en place, la conduite et la finalisation de deux cribles génétiques utilisant la plante modèle Arabidopsis thaliana, ce travail de thèse a cherché à identifier des facteurs situés en amont de TCTP. En parallèle, une seconde étude fut menée afin de mesurer l'impact de l'absence de TCTP sur les voies de l’auxine et des cytokinines au cours du développement embryonnaire, permettant de mieux comprendre l’origine de l’embryolétalité du mutant tctp. / TCTP (Translationally Controlled Tumor Protein) is strongly conserved among eukaryotes. It is a vital protein implicated in various major processes, and its absence leads to early embryolethality in many organisms. In plants as in animals, TCTP is a key factor of growth and development. Implicated in apoptosis and DNA repair, TCTP is also an enhancer of cell proliferation, and is a key element of tumorigenesis. Major functions of TCTP are conserved between plants and animals, but upstream factors are not known yet. Using a genetic screen on the model plant Arabidopsis thaliana, the principal goal of this thesis was to discover regulators of TCTP.In parallel, the impact of TCTP knockout on auxin and cytokinin pathways during embryo development was investigated.

Bei der Herstellung und Lagerung von Milch und Milchprodukten kommt es in unterschiedlichem Ausmaß zur Bildung von reversiblen und irreversiblen Proteinquervernetzungen. Dabei verändern sich neben technologischen auch ernährungsphysiologische Eigenschaften des Produktes. Die für die Oligomerisation verantwortlichen Strukturen sind bisher nur zum Teil bekannt. Daher soll in dieser Arbeit zunächst das Ausmaß der Quervernetzung in einer größeren Anzahl an handelsüblichen Milchprodukten ermittelt und mit den für diese Proben gemessenen Gehalten der für irreversible Quervernetzungsreaktionen in Lebensmitteln wichtigen Aminosäurederivate Lysinoalanin (LAL) und Histidinoalanin (HAL) verglichen werden. Der Beitrag dieser beiden Dehydroalanin-Derivate für Oligomerisationen ist jedoch stark von der Art ihres Bildungsweges abhängig. Da es in der Literatur keine abschließenden Untersuchungen über eine intra- oder intermolekularen Bildung von LAL und HAL gibt, ist dies eine grundlegende Aufgabe, um in der Folge den Anteil von unbekannten Crosslinks für die analysierten Lebensmittel bestimmen zu können. Die Identifizierung dieser vorhandenen, jedoch strukturell unbekannten Crosslinks ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Untersuchungen. Hierbei richtet sich das Interesse vor allem auf Quervernetzungsprodukte, die im Zusammenhang mit der nicht-enzymatischen Bräunung oder Maillard-Reaktion gebildet werden. Aus der Literatur ist eine Vielzahl von Verbindungen, die an der Oligomerisation und den damit verbundenen Eigenschaftsänderungen von Proteinen beteiligt sind, aus Modellansätzen oder in vivo-Studien bekannt. Untersuchungen zum Vorkommen dieser Strukturen in handelsüblichen Lebensmitteln fehlen jedoch in den überwiegenden Fällen. Dazu ist neben der Synthese einzelner Verbindungen als Standardmaterial die Entwicklung bzw. Optimierung der Analytik für Lebensmittelmatrices durchzuführen. Einige der bekannten, aber noch nicht in Lebensmitteln nachgewiesenen Crosslinkaminosäuren zeichnen sich durch eine charakteristische Fluoreszenz aus. Die Zunahme der Fluoreszenz in technologisch hergestellten Milchprodukten ist aus der Literatur bekannt, eine Identifizierung der dafür verantwortlichen Verbindungen fehlt hingegen. Daher ist ein weiteres Ziel dieser Arbeit, individuelle, fluoreszierende Crosslinks in Milchprodukten zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Post-translational modifications (PTMs) of proteins play significant roles in regulation of biological activities and signal transduction. Examining their diversity is critical for understanding the mechanisms of cellular regulations. Among the various techniques employed for identification of PTMs, mass spectrometry has become a more and more important tool for detecting and mapping these covalent modifications and quantifying their changes. The two projects described in this dissertation focus mainly on the method development for characterization of two major PTMs, disulfide bonds and glycosylation. In the first project, the disulfide bond pattern of a rhamnose-binding lectin SEL24K from the Chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha was assigned unambiguously based on a multi-enzyme digestion strategy in combination with MALDI-TOF mass spectrometry analysis. The disulfide bond pattern was found to be symmetrical in the tandem repeat sequence of SEL24K. More importantly, an interesting phenomenon of gas-phase scrambling of disulfide bonds was observed during MALDI mass spectrometry analysis and a possible mechanism for this surprising scrambling was proposed. To the best of our knowledge, this is the first report of disulfide bond scrambling in the gas phase during MALDI-MS analysis. This observation has important ramifications for unambiguous assignment of disulfide bonds. In the second project, the glycosylation of a glycoprotein ZPA from the vitelline envelope of Xenopus laevis was determined by applying a strategy of general proteolysis coupled with mass spectrometry. The vitelline envelope glycoproteins were first separated through SDS-PAGE. A nonspecific in-gel pronase digestion was performed on the excised band of ZPA to produce informative small glycopeptides. Lectin affinity chromatography was used for the enrichment of these glycopeptides. An in-gel PNGase F digestion was also carried out to release the N-linked glycans from ZPA. The enriched glycopeptides and glycans were finally analyzed by MS and MS/MS techniques on MALDI-TOF and MALDI-TOF/TOF instruments.

AB T mu hom dise β sign mu liga stab tran sign T the focu disc cate of t cell targ the inte con sec I sign BSTRACT The Wnt si lticellular o meostasis. A eases, most β-catenin is nalling). In ltiprotein c ands when t bilized and nscription f nalling is tig This thesis knowledge uses on seq cusses the enin signall the Wnt pa ls of intest geted mous thesis des eraction wit nditional Hi retory cell t In conclusi nalling path T ignalling pa organisms Accordingly notably can s a central m n unstimula complex and they engage d transloca factors and ghtly regula is based on e of the reg quential po positive ro ling outcom athway whic tinal epithe e strains th scribes unp th members ic1 deletion types and en ion, our fin hway in dev athway is o ensuring s y, mutations ncer. mediator of ated cells d degraded e their recep tes to the to drive th ated at vario n four origin gulation of sttranslation ole of nucle me. The third ch reduces lium. Final at enable st ublished da s of the Wn n in the inte nhanced tum ndings contr velopment an one of the m successful s in the pat f canonical W β-catenin d in the pro ptors, degrad nucleus t he transcrip ous levels b nal articles f the Wnt s nal process ear protein d study repo the levels o lly, the las tudying the ata on the nt pathway, estinal epith mourigenesi ributed to t...