La pneumopathie interstitielle (PI) est devenue la principale cause de décès de la sclérodermie systémique (ScS). Au cours de PI, l’activation immunitaire déclenche une forte production du monoxyde d’azote (NO) et l’augmentation de la concentration de NO dans l’air expiré des patients atteints de ScS avec PI suggère que cette méthode pourrait détecter précocement l’alvéolite, afin de traiter à temps la PI pour éviter son évolution vers la fibrose pulmonaire. En utilisant le modèle à deux compartiments séparant le NO alvéolaire (CANO) du NO bronchique, nous avons montré que la CANO est : (1) augmentée chez les patients atteints de ScS comparativement aux volontaires sains; (2) associée à l’alvéolite et (3) corrélée à la sévérité de la PI. De plus, une valeur de CANO = 10,8 ppb permettait d’affirmer la présence de la PI et une valeur = 3,8 ppb, d’écarter l’existence d’une PI avec une valeur prédictive= 95%. Le modèle bi-compartimenté néglige la distribution arborisée des voies aériennes et la diffusion axiale du NO, que prend en compte le nouveau « modèle de la trompette ». Les résultats de CANO des 2 méthodes sont comparables (rho=0,98, p<0.001). Enfin, La capacité des sérums à induire la prolifération des fibroblastes pulmonaires et sa conversion en myofibroblaste est augmentée chez les patients atteints de ScS avec une CANO > 5ppb par rapport à celle des patients atteints de ScS qui ont une CANO = 5 ppb et à celle des volontaires sains. Nos résultats suggèrent une relation possible entre l’inflammation alvéolaire et la fibrose pulmonaire au cours de la ScS / Interstitial lung disease (ILD) has become the main cause of death in systemic sclerosis (SSc). In ILD, immune activation leads to strong nitric oxide (NO) output by inducible NO synthase. Increased the whole fractional rate of NO in exhaled air has been reported in SSc patients with ILD and suggested that exhaled NO can be an accurate none-invasive marker of early alveolar inflammation in order to initiate in time treatment. The two compartment-model method partitioned exhaled NO into alveolar concentration (CANO) and conducting airway flux, We hypothesized that overproduction of NO in the lung eventually leads to ILD in SSc. We have found that CANO is significantly increased in SSc patients as compared with healthy controls. We have also demonstrated that high levels of CANO were related to alveolitis and the severity of ILD in SSc. Moreover, we have found that ILD could be ruled in (positive predictive value > 95%) when CANO = 10.8 ppb, and ruled out when CANO values = 3.8 ppb (negative predictive value > 95%). The two-compartment model neglected the trumpet shape of airway tree and the axial diffusion of NO that the advanced “trumpet model” takes account. We have found that CANO levels assessed by the two models were comparable (rho=0,98, p<0.001). Finally, we have found that the serum ability to induce lung fibroblast proliferation and myofibroblast transition was increased in SSc patients with high levels of CANO (>5ppb) as compared to SSc patients with low levels of CANO (=5ppb) and healthy controls. Our findings suggest a possible link between alveolar inflammation, and lung fibrosis in SSc. 1624 caractères avec espace

L’évaluation de la gravité et la surveillance des maladies pulmonaires chroniques représentent deux challenges importants pour la prise en charge des patients et l’évaluation des traitements. La surveillance repose principalement sur les données fonctionnelles respiratoires mais l’évaluation morphologique reste un point essentiel pour le diagnostic et l’évaluation de sévérité. Dans la première partie de cette thèse, nous proposons différents modèles pour quantifier la sévérité de pathologies bronchiques chroniques au scanner. Une approche simple par seuillage adaptatif et une méthode plus sophistiquée de radiomique sont évaluées Dans la seconde partie, nous évaluons une méthode d’apprentissage profond pour contourer automatiquement l’atteinte fibrosante de la sclérodermie en scanner. Nous combinons le recalage élastique vers différents atlas morphologiques thoraciques et l’apprentissage profond pour développer un modèle dont les performances sont équivalentes à celles des radiologues. Dans la dernière partie, nous démontrons que l’étude de la déformation pulmonaire en IRM entre inspiration et expiration peut être utilisée pour repérer les régions pulmonaires en transformation fibreuse, moins déformables au cours de la respiration, et qu’en scanner, l’évaluation de la déformation entre des examens successifs de suivi peut diagnostiquer l’aggravation fibreuse chez les patients sclérodermiques. / Disease staging and monitoring of chronic lung diseases are two major challenges for patient care and evaluation of new therapies. Monitoring mainly relies on pulmonary function testing but morphological assessment is a key point for diagnosis and staging In the first part, we propose different models to score bronchial disease severity on computed tomography (CT) scan. A simple thresholding approach using adapted thresholds and a more sophisticated machine learning approach with radiomics are evaluated In the second part, we evaluate deep learning methods to segment lung fibrosis on chest CT scans in patients with systemic sclerosis. We combine elastic registration to atlases of different thoracic morphology and deep learning to produce a model performing as well as radiologists In the last part of the thesis, we demonstrate that lung deformation assessment between inspiratory and expiratory magnetic resonance images can be used to depict fibrotic lung areas, which show less deformation during respiration and that CT assessment of lung deformation on serial CT scans can be used to diagnose lung fibrosis worsening

Ballista est un nouveau système de planification de traitement qui a été développé en alternative à la radiothérapie par modulation d'intensité. L'optimisation à la base de ce dispositif contrôle la configuration des plans de traitement ainsi que le poids des différents champs générés en vue de moduler la radiation. Malgré sa grande flexibilité, Ballista se limite toutefois à la création de plans monoénergétiques. Ce mémoire s'est donc penché sur le rôle de l'énergie dans les plateformes de planification inverse. Le fonctionnement de Ballista s'appuie sur l'emploi de deux engins d'optimisation distincts : un algorithme de recuit simulé qui gère la configuration du traitement et un algorithme de quasi-Newton avec contraintes qui fixe le poids des différents champs. Afin de tirer profit de la nature bidimensionnelle du système, l'introduction de l'énergie en tant que variable versatile se fait par le biais de l'une ou l'autre de ces techniques de calcul. / Cette stratégie permet de créer des plans multiénergétiques qui possèdent une ou plusieurs énergies par incidence. Une étude rétrospective détaillée de l'efficacité du système a été réalisée sur la base de cinq patients atteints d'un cancer pulmonaire avancé. L'optimisation de l'énergie a en fait permis d'améliorer la conformité des traitements, mais surtout de limiter la dose délivrée aux poumons sains, l'organe à risque le plus problématique pour ce type d'irradiation. L'introduction de ce paramètre dans les procédés d'optimisation semble donc améliorer sensiblement la qualité des plans produits sans alourdir inutilement le poids clinique de la planification.

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est un trouble respiratoire qui amène également des effets systémiques tels que de l'inflammation chronique. Cet effet extrapulmonaire semblerait être le facteur central du développement de la perte de poids et de comorbidités diverses. La perte de poids et plus particulièrement la perte de masse musculaire, sont reliées à un faible taux de survie et leurs mécanismes sont toujours inconnus. Cependant, plusieurs hypothèses ont été émises sur le sujet. Un déséquilibre systémique des facteurs anaboliques/catabolîques en faveur du catabolisme ainsi qu'un déséquilibre énergétique négatif associé à un hypermétabolisme et/ou à une dénutrition sont des causes explicatives potentielles signalées dans la littérature. Leurs contributions respectives n'avaient jamais été étudiées dans la MPOC et sont l'objet de la première partie ce travail. Nous avons démontré que l'atrophie musculaire pouvait être reliée à l'activation concomitante d'un signal de dégradation protéique et d'un signal de synthèse protéique musculaire possiblement déficient. De plus, l'inactivité associée à la MPOC prédisposerait le quadriceps à un déséquilibre des signaux cataboliques/anaboliques en faveur d'un catabolisme favorisant ainsi le développement d'atrophie musculaire. Nous avons aussi mis en évidence la présence d'un hypermétabolisme chez des patients MPOC qui s'expliquerait, entre autres, par l'activation du système nerveux sympathique. L'ensemble de ces résultats suggère qu'un amalgame de facteurs favorisant le catabolisme musculaire amènerait inévitablement le patient vers de la cachexie. En plus d'un état de perte de poids, l'augmentation de la fréquence de l'obésité dans cette maladie inquiète. Les effets néfastes que pourrait avoir l'obésité chez le patient MPOC sont l'objet de la deuxième partie de ce travail. Nous avons démontré la présence de plusieurs anormalités métaboliques et inflammatoires chez les patients MPOC obèses. De plus, la fréquence plus élevée du syndrome métabolique retrouvée chez ceux-ci pourrait favoriser le développement de comorbidités graves. En conclusion, tant l'atrophie musculaire que l'obésité ont un impact important sur l'évolution clinique de la MPOC et la compréhension de leurs mécanismes aidera à la mise en place de stratégies thérapeutiques efficaces et mieux ciblées.

La radiothérapie guidée par imagerie permet d'offrir des traitements plus précis, alors que la radiothérapie adaptative semble prometteuse. Afin de caractériser la position d'équilibre de la tumeur au poumon, des séries d'images de tomodensitométrie par faisceau conique (ou CBCT pour Cone-Beam Computed Tomography) ont été utilisées. La variation du volume tumoral macroscopique (ou GTV pour Gross Tumor Volume), le déplacement du centre de masse et des extrémités ont été mesurés pour un ensemble de 34 patients à partir de contours GTV tracés sur chacun des CBCT. Une des façons de faire de la radiothérapie adaptative est d'utiliser le recalage dé-formable d'images (ou DIR pour Deformable Image Registration). Ainsi, deux logiciels de DIR ont été testés afin de comparer leur performance respective. Les CBCTs ainsi que les contours GTV ont été déformés et comparés à ceux tracés manuellement lors de la caractérisation de la position d'équilibre. De grandes variations et déplacements ont été observés chez la tumeur au poumon, ce qui justifie l'utilisation de l'imagerie CBCT lors des traitements de radiothérapie. Les deux logiciels de recalage deformable d'images présentent des avantages et des inconvénients. La méthodologie n'est pas au point, mais les résultats sont intéressants et ouvrent la voie à d'autres investigations.

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste, hautement résistant à une multitude d’antibiotiques qui infecte principalement les patients immunosupprimés. Il représente la cause principale de morbidité et de mortalité chez les patients atteints de fibrose kystique (mucoviscidose). Le but principal de ce projet consistait à identifier et à caractériser des gènes essentiels à l’infection et au maintien de P. aeruginosa dans un modèle animal d’infection pulmonaire chronique. À partir d’une banque de mutants transpositionnels, nous avons identifié 148 mutants de P. aeruginosa déficients à causer l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Suite à des analyses bioinformatiques, le mutant inactivant le gène PA5437 a été sélectionné. L’opéron adjacent code pour les sous unités du pyruvate carboxylase (pycA et pycB) et est régulé par le gène PA5437, d’où l’appellation pycR pour pyruvate carboxylase regulator. Le pycR a été identifié comme étant un régulateur transcriptionnel de type LysR ayant une région typique de liaison à l’ADN. Le codon d’initiation de la transcription des gènes pycR et pycA a été identifié par élongation d’amorce. La capacité de liaison de la protéine PycR à l’ADN a été confirmée à l’aide du gel à retardement. L’implication de PycR dans la virulence bactérienne in vivo a été confirmée par indice de compétition et après 7 jours d’infection le mutant déficient ΔpycR est complètement éliminé du poumon du rat. L’importance de PycR a aussi été confirmée in vitro à l’aide des tests phénotypiques et enzymatiques démontrant la déficience dans la production de la lipase, de l’estérase et du biofilm. Finalement, l’analyse des résultats métaboliques et transcriptomiques a confirmé l’importance de PycR dans la régulation du métabolisme de lipides, de l’activité lipolytique, de la respiration anaérobique, de la formation du biofilm et des gènes régulés par le quorum sensing. Dans un second volet, une étude comparative entre souches prototypes (PAO1 et PA14) de P. aeruginosa et un isolat clinique (LESB58) de la fibrose kystique a été réalisée dans un modèle de l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Cette étude a permis d’identifier des différences significatives au niveau de la localisation bactérienne dans les tissus pulmonaires de l’isolat clinique LESB58. D’importantes différences ont également été notées au niveau des facteurs de virulence comme la mobilité et la formation du biofilm. À long terme, les nouvelles connaissances acquises en génomique fonctionnelle devraient permettre d’identifier et de développer de nouvelles approches thérapeutiques permettant de combattre et mieux comprendre les infections causées par cette bactérie. / The opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa is highly resistant to most classes of antibiotics and causes a wide variety of infections in compromised hosts. In addition, it represents the major cause of morbidity and mortality in cystic fibrosis (CF) patients. The principal goal of the present research project was to identify and to characterise P. aeruginosa genes essential for causing a chronic lung infection. Using a PCR-based signature-tagged mutagenesis, we identified a P. aeruginosa STM5437 mutant having an insertion into the PA5437 gene; its inactivation causes attenuation of virulence in vivo. The PA5437 gene, now called pycR, regulates the adjacent operon encoding the pyruvate carboxylase subunits (pyruvate carboxylase regulator). PycR has the signature of a putative transcriptional regulator with a predicted helix-turn-helix motif binding to a typical LysR DNA-binding motif identified in the PA5436 (pycA)-PA5437 (pycA) intercistronic region. Transcriptional start sites of pycA and pycR were identified by primer extension and the DNA binding capacity of PycR was confirmed by a DNA mobility gel shift assay. Genome-wide transcriptional profiling indicated that the genes whose control were differentially expressed by PycR implicated genes responsible for lipid metabolism, lipolytic activity, anaerobic respiration, biofilm formation and a number of quorum sensing regulated genes. This study defines PycR as a major regulator in virulence and where mutations in pycR have pleiotropic effects on the expression of multiple virulence factors such as lipase, esterase and biofilm formation. The expressions of several of these genes are associated with chronic lung persistence. In the second part of the study, P. aeruginosa prototype strains PAO1 and PA14 were compared with the CF isolate LESB58 in the rat model of chronic lung infection. This comparative study identified major differences for LESB58; in vivo in bacterial localisation in the rat lung and in vitro for motility and biofilm production. Functional genomics of P. aeruginosa will provide new insights for the development of novel therapeutic targets. Genomic biodiversity may explain the variation in severity of the P. aeruginosa infections in CF disease.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste pouvant causer des infections pulmonaires chroniques chez les gens atteints de la Fibrose Kystique (FK). Pour réussir à s’implanter dans les voies respiratoires des patients FK, P. aeruginosa dispose d’un important arsenal de facteurs de virulence, dont la sécrétion de protéases, de lipases, de phospholipases ainsi que la production de toxines spécifiques. Le séquençage complet du chromosome de P. aeruginosa souche PAO1 (6.3 Mb) a révélé une organisation génomique hautement régulée. Dans le but de mieux comprendre l’interaction hôte-pathogène, nous avons utilisé la technique de mutagenèse à étiquette (STM). La STM a permis d’isoler 214 mutants incapables de maintenir l’infection pulmonaire chronique chez le rat. Parmi ceux-ci, le mutant STM2895, contenant un transposon dans le gène PA2895, a été retenu pour des analyses plus approfondies. L'étude phénotypique de STM2895 a permis de constater un défaut dans la production d’exoprotéases lorsque comparé à la souche sauvage PAO1. La caractérisation biochimique de ce défaut, utilisant des tests de dégradation spécifiques et l’immunobuvardage, a démontré qu’au moins deux des quatre protéases majeures sécrétées par P. aeruginosa sont impliquées. En effet, les élastases LasA et LasB ont été démontrées non fonctionnelles probablement dues à un problème de repliement. PA2895, une protéine possédant un domaine transmembranaire prédit, ne code pour aucune fonction connue, mais il est co-transcrit avec le gène PA2896, un facteur sigma putatif de type ECF (extracytoplasmic function). Des analyses en transcriptome sur le mutant STM2895, ainsi que sur un mutant de délétion de PA2896, ont permis de lier l’opéron au métabolisme du fer. De plus, des études in vivo dans le modèle d’infection pulmonaire chronique chez le rat ont clairement démontré que le mutant STM2895 est incapable de se maintenir dans l’hôte au même niveau que la souche sauvage PAO1. Le gène PA2895 est donc essentiel au maintien in vivo de P. aeruginosa dans le poumon de rat. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that can cause pulmonary infections in cystic fibrosis patients (CF). To overcome innate self defense, P. aeruginosa possesses a wide arsenal of virulence factors. These include degradation enzymes such as proteases, lipases and phospholipases and the production of three specific toxins: exotoxin A and exoenzymes S and T. Sequencing of the complete P. aeruginosa chromosome (strain PAO1) of 6.3 Mb revealed a highly regulated and complex genomic organization. In order to better understand host-pathogen molecular interactions, we developped a new signature-tagged mutagenesis (STM) approach based on PCR screening. The PCR-based STM technology lead to the identification of 214 mutants deficient in their ability to maintain a chronic pulmonary infection in the rat lung. In that pool of STM mutants, STM2895, which contains a transposon insertion in functional PA2895, was the most frequently drafted during the whole mutant library screening. Phenotypic analyses of the STM2895 strain allowed us to identify an exoprotease production defect as compared with wild type strain PAO1. The biochemical characterization of that proteolytic default using specific degradation assays combined with western blotting revealed that at least two (LasA and LasB) of the four major exoproteases from P. aeruginosa STM2895 strain are inactive. In fact, LasA and LasB elastases were shown to be present in the STM2895 culture supernatant, correctly processed but inactive due to a probable misfolding of proteins. The PA2895 gene (unknown function) encodes a protein with a predicted transmembrane domain. Basic genomic context analyses strongly suggest a cotranscription unit with the downstream gene PA2896, a putative sigma 70 factor from ECF (extracytoplasmic function) type. Microarray experiments on the STM2895 strain and an insertional mutant of the PA2896 gene were performed to establish a link between the putative PA2895-PA2896 operon and the metabolism of iron. Transcriptome analysis also demonstrated a repressive action of PA2895 on the transcription of PA2896 putative sigma factor. Finally, in vivo studies in the rat lung chronic infection model clearly showed a ten-fold decrease in survival capacity of the mutant strain when compared to the PAO1 wild-type strain.

Les hormones stéroïdiennes comme les androgènes, les estrogènes, les glucocorticoïdes et dans une moindre mesure les progestines, sont des modulateurs reconnus du développement pulmonaire. Plusieurs éléments concernant la régulation de l’action de ces stéroïdes restent encore à être identifiés, surtout lors des stades sacculaire et alvéolaire. Premièrement, nous avons caractérisé l’expression des 17β-hydroxystéroïde déshydrogénases (17β-HSDs) de type 1, 2 et 5, de la 5α-réductase de type 1, de la 3α-HSD et du récepteur des androgènes (AR) dans le poumon murin en développement du jour gestationnel (JG) 19.5 au jour postnatal (PN) 30. Les niveaux de 17β-HSD de type 2 diminuaient dramatiquement à la fin du stade sacculaire alors que l’expression du AR augmentait graduellement de la naissance à l’âge adulte. Le AR fut principalement détecté dans le noyau des cellules épithéliales des voies aériennes et dans certaines cellules des voies respiratoires. Les ARNm de la 17β-HSD de type 2 et le AR colocalisaient durant le stade sacculaire, mais la 17β-HSD de type 2 était absente de l’épithélium des voies aériennes durant le stade alvéolaire. Deuxièmement, les niveaux des androgènes et des estrogènes furent mesurés dans le poumon murin du stade canaliculaire au stade alvéolaire. Les niveaux androgéniques présents dans le poumon étaient significativement différents par rapport à ceux présents dans un tissu de référence. Ces résultats sont compatibles avec la présence d’un métabolisme des androgènes régulé lors du développement pulmonaire. Troisièmement, l’expression de la 20α-HSD et des gènes associés à la voie de synthèse «surrénalienne» des glucocorticoïdes furent caractérisés du JG 15.5 au PN 15. Finalement des expériences de culture d’explants pulmonaires ont démontré qu’au JG 15.5, cette voie de synthèse était capable de produire de la corticostérone à partir d’un substrat de progestérone. L’accumulation de corticostérone n’était cependant observable que dans une sous-population des échantillons prélevés au JG 15.5 et était totalement absente après. Cette observation, la forte expression de la 21-hydroxylase, la présence de fortes activités 20α-HSD et 5α-réductase suggèrent toutes la présence d’une régulation locale de l’action du récepteur des glucocorticoïdes (GR) dans le poumon en développement s’ajoutant à celle détectée pour le AR. / Steroid hormones such as progestogens, estrogens, androgens and glucocorticoids are known modulators of lung development. Several elements concerning the role and regulation of steroid action in the developing lung, especially for the saccular and alveolar stages, remain to be investigated. First, a qPCR analysis of 17β-hydroxysteroid dehydrogenases (17β-HSD) type 1, 2 and 5, of 5α-réductase type 1, of m3α-HSD and of androgen receptor (AR) was performed during the saccular and alveolar stages of mouse lung development. AR expression showed a statistically significant increase during the alveolar stage while levels of 17β-HSD 2 expression decreased at the end of the saccular stage and remained low throughout the alveolar period. The androgen receptor (AR) protein was primarily detected in the nucleus of airway epithelial cells and of a subset of respiratory epithelial cells. 17β-HSD 2 mRNA was co-localized with AR protein during the saccular stage, but was absent from airway epithelium during the alveolar stage. Second, androgen and estrogen levels were measured in the murine developing lung from the canalicular to the alveolar stage. Significant difference of androgen levels between lung and control tissue. This fact added to the nuclear localization of AR is compatible with the presence of a regulated androgen metabolism during lung development. Third, expression of 20α-HSD and of the genes associated with the adrenal glucocorticoid synthesis pathway was characterized in the developing lung, from GD 15.5 to PN 15. Finally, corticosterone synthesis was only observed in a fraction of lung explants from gestation day (GD) 15.5. This observation and strong expression of 21-hydroxylase, of 20α-HSD and of 5α-reductase activities suggests local regulation of GC action. It thus appears that the actions of androgens and of glucocorticoids are both regulated at a pre-receptor level in the developing lung from the canalicular stage until the end of the alveolar stage.

La maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC) est principalement causée par le tabagisme chronique. Les sujets atteints présentent des altérations pulmonaires et systémiques les rendant intolérants à l'effort et réduisant leurs qualité et espérance de vie. Le poumon des sujets MPOC compte un plus grand nombre de cellules inflammatoires, notamment de macrophages, de neutrophiles et de lymphocytes T CD8+, que les sujets non-MPOC. On note également la présence d'un stress oxydant chronique ainsi qu'une augmentation du niveau d'apoptose alvéolaire. Les raisons pour lesquelles le niveau d'apoptose alvéolaire est augmenté chez ces sujets ne sont pas connues. L'accumulation des lymphocytes T CD8+, ou lymphocytes T cytotoxiques, dans le poumon MPOC pourrait expliquer cette augmentation de l'apoptose alvéolaire. Nous avons démontré que les lymphocytes T CD8+ circulants de sujets MPOC n'étaient pas plus activés que ceux de sujets contrôles, suggérant que l'activation des lymphocytes T CD8+ se ferait davantage au niveau pulmonaire. Le stress oxydant chronique, de pair avec les cellules inflammatoires, pourrait également influencer fortement la survie des cellules épithéliales alvéolaires pulmonaires. En effet, nous avons démontré que le tissu pulmonaire MPOC ainsi que les cellules épithéliales alvéolaires exposées in vitro au peroxyde d'hydrogène (stress oxydant) présentaient des niveaux plus élevés des molécules pro-apoptotiques p53, Bax et récepteurs de TRAIL 1 et 2. De plus, ces derniers étaient davantage sensibles à l'apoptose induite de manière extrinsèque par le ligand TRAIL, un ligand de mort relâché par les Natural killer, les lymphocytes T et les macrophages activés. Les résultats retrouvés dans cette thèse ont permis de souligner l'importance de l'activation locale des lymphocytes T CD8+ ainsi que le rôle du stress oxydant dans la sensibilisation du tissu pulmonaire MPOC à l'apoptose induite par TRAIL. Ensemble, ces données mettent l'emphase sur l'importance des cellules cytotoxiques et du stress oxydant dans l'augmentation de l'apoptose alvéolaire observée dans le poumon MPOC.

Le traitement des nouveau-nés prématurés représente un défi de taille en médecine pédiatrique. Plusieurs évidences indiquent que ces enfants ne pourront compléter leur développement alvéolaire. L'importance des facteurs mécaniques en tant que régulateurs de l'alvéolisation est de plus en plus évidente. L'oligoamnios réduit la distension à l'intérieur du poumon, résultant en une hypoplasie pulmonaire alors que l'augmentation de la distension induite par l'occlusion trachéale (OT) foetale stimule le développement pulmonaire de façon significative. L'OT est une technique intéressante pour l'étude du développement pulmonaire, mais son caractère invasif rend souhaitable son remplacement par une approche pharmacologique. Le postulat à la base de nos travaux est qu'une accentuation des forces d'étirements du tissu pulmonaire en fin de gestation accélère le développement pulmonaire selon un patron mimant celui du développement pulmonaire normal et que l'élucidation des mécanismes biomoléculaires impliqués rendra possible la modulation du développement pulmonaire. J'ai participé à l'identification de processus biomoléculaires impliqués dans le développement pulmonaire accéléré par TOT. Je devais ensuite cibler un sentier de signalisation ayant un apport potentiel à la réponse aux changements de tensions intra-luminales et évaluer son rôle fonctionnel en inhibant ou en stimulant son activité in vivo. Nous avons travaillé avec le modèle de souris foetales. L'oligoamnios a été provoqué par ponction utérine à 14,5 jours de gestation et les poumons des foetus ont été récoltés 72 heures plus tard. L'OT a été effectuée chez la souris à 16,5 jours de gestation et les poumons des foetus ont été récoltés 3 ou 24 heures plus tard. Dans un sous-groupe, du fasudil, un inhibiteur des Rho kinases (ROCKs), a été injecté de façon intra-péritonéale à des femelles à 16 jours de gestation. Le facteur nécrosant cytotoxique 1 (CNF1 : cytotoxic m necrotizing factor 1) a été utilisé afin de stimuler le membre A de la famille de gène homologue de Ras (RhoA : Ras homolog gene family, member A), un important régulateur positif de l'activité des ROCKs. Le plasmide contenant CNF1 et la glutathione S-transférase a été inséré et amplifié dans E. coli BL21. Suite à son induction par l'IPTG (isopropyl (3-D-l-thiogalactopyranoside), la protéine de fusion a pu être isolée sur une colonne glutathione sépharose puis injectée dans le liquide amniotique à 16,5 jours de gestation. Les poumons ont été récoltés 24 heures après l'injection. L'expression des ROCKs (ROCK1, ROCK2) et a-actine (a-smooth muscle actin ; a-SMA) a été évaluée par immunobuvardage et le développement pulmonaire a été évalué par la mesure du nombre de générations de saccules alvéolaires. Nous avons démontré au cours des dernières années que l'un des effets les plus importants de l'OT est de favoriser l'expression des gènes du cytosquelette. Nous avons confirmé que l'expression de l'a-actine est accrue très rapidement suite à TOT. De plus, nous avons démontré que l'expression de ROCK2, un important régulateur du cytosquelette d'actine, varie en fonction du niveau de distension intra-luminale pulmonaire. En effet, son expression est diminuée dans le modèle d'oligoamnios alors qu'elle est rapidement augmentée suite à l'OT. L'inhibition de l'activité de ROCK par le fasudil inhibe l'effet bénéfique de l'OT sur le développement pulmonaire. Enfin, la stimulation de RhoA par CNF1 favorise la génération de voies aériennes distales d'une façon similaire à l'OT. En conclusion, la modulation du développement pulmonaire par l'inhibiteur de ROCK2 et de l'activateur de RhoA indique que le sentier RhoA/ROCK joue un rôle critique en tant que mécanosenseur dans le développement pulmonaire foetal.