Die präklinische Forschung stellt den ersten wichtigen Meilenstein in der Klärung und Untersuchung klinisch-relevanter Erkrankungen dar. Darüber hinaus unterstützt die präklinische Forschung erheblich die Entwicklung von Therapien. Die Kleintier-Positronenemissionstomographie (µ-PET) spielt dabei eine wichtige Rolle, da sie in der Lage ist, funktionelle, physiologische und biochemische Prozesse in vivo darzustellen und zu quantifizieren. Trotz diverser etablierter PET-Datenauswertungs-Programme bleibt die Analyse von in vivo akquirierten Bilddaten aufgrund der Vielzahl an medizinischen Fragestellungen, der Komplexität der Krankheitsbilder, sowie der Etablierung neuer Radiotracer weiterhin eine große Herausforderung in der Medizin. Ziel dieser Doktorarbeit ist es daher, ein geeignetes, brauchbares Auswertungstool für eine einfache und effiziente Analyse von akquirierten µ-PET-Daten zu entwickeln und zu etablieren, welches das Spektrum bereits vorhandener Programme erweitert. Das entwickelte nuklearmedizinische Datenverarbeitungs-Analyseprogramm (engl. nuclear medicine data processing analysis tool, NU_DPA) wurde in Matlab implementiert und anhand dreier präklinischer Versuchs- bzw. Testreihen erprobt und etabliert. Bei den Datenreihen handelt es sich um µ-PET-Datensätze verschiedener Schlaganfall-Rattenhirnmodelle unter Verwendung folgender Radiotracer. Zum einen die im Gehirn homogen akkumulierende 2-[18F]Fluor-2-desoxy-glukose ([18F]FDG) zum anderen das spezifisch an P-Selektin anreichernde [68Ga]Fucoidan. Das NU_DPA umfasst die automatische Selektion des Zielvolumens (volume-of-interest, VOI) aus dem vollständigen PET-Bild und die anschließende Ausrichtung des VOI mit Hilfe eines PET-Templates (gemittelter PET-Datensatz). Dieses PET Template wird aus den eigenen akquirierten PET-Daten erstellt. Durch das Einbinden eines geeigneten anatomischen MRT-Atlas‘ (anpassbar) können die ausgerichteten PET-Daten einzelnen, Atlas-spezifischen Teilregionen zugeordnet werden. Eine solche Subklassifikation des VOI erlaubt eine genauere Betrachtung und Auswertung der Radiotracer-Akkumulation. Des Weiteren bietet NU_DPA die Möglichkeit einer semiquantitativen Auswertung der PET-Bilddaten anhand von drei unterschiedlichen Parametern, der normalisierten Aktivität, dem Standardized Uptake Value und der Uptake Ratio. Durch die Matlab-integrierten Statistik-Algorithmen ist zusätzlich eine Möglichkeit der statistischen Auswertung der zuvor berechneten Parameter gegeben. Das NU_DPA-Programm stellt somit ein semi-automatisiertes Datenauswertungs-Programm dar, das sowohl die Registrierung als auch die semiquantitative Auswertung von PET-Bilddaten innerhalb einer Versuchsreihe ermöglicht und bereits erfolgreich für die Radiotracer [18F]FDG und [68Ga]Fucoidan in Tiermodellen getestet wurde. Nach derzeitigem Kenntnisstand ist kein Datenauswertungs-Programm bekannt, das PET-Bilddaten unter Verwendung des hinzugefügten Atlas‘ semi-automatisiert analysieren kann und potenziell für homogene und Target-spezifisch akkumulierende Radiotracer geeignet ist. / Preclinical research represents the first important milestone in the clarification and investigation of clinically relevant diseases. In addition, preclinical research significantly supports the development of therapies. Small animal positron emission tomography (µ-PET) plays an important role in this context, as it is able to image and quantify functional, physiological and biochemical processes in vivo. Despite various established µ-PET data analysis programs, the analysis of in vivo acquired image data remains a major challenge in medicine due to the multitude of medical questions, the complexity of disease patterns, and the establishment of new radiotracers. Therefore, the aim of this PhD thesis is to develop and establish a suitable, usable evaluation tool for a simple and efficient analysis of acquired µ-PET data, which extends the spectrum of already existing programs. The developed nuclear medicine data processing analysis tool (NU_DPA) was implemented in Matlab and tested and established on the basis of three preclinical experimental or test series. The data series are µ-PET datasets of different stroke rat brain models using the following radiotracers: 2-[18F]fluoro-2-deoxy-glucose ([18F]FDG), which accumulates homogeneously in the brain and [68Ga]fucoidan, which specifically accumulates at p-selectin. The NU_DPA involves automatic segmentation of a volume-of-interest (VOI) from the full PET image and the subsequent alignment of the VOI using a PET template (averaged PET dataset). This PET template is created from the own acquired PET data. By embedding a suitable anatomical MR atlas (customizable), the aligned PET data can be assigned to individual atlas-specific sub-regions. Such a sub-classification of the VOI allows a more detailed analysis and evaluation of the radiotracer accumulation. Furthermore, NU_DPA offers the possibility of a semi-quantitative evaluation of the PET image data based on three different parameters, the normalized activity, the standardized uptake value and the uptake ratio. The Matlab-integrated statistical algorithms provide an additional option for statistical evaluation of the previously calculated semi-quantitative parameters. The NU_DPA program thus represents a semi-automatic data evaluation program that enables both the registration and the semi-quantitative evaluation of PET image data within a series of experiments and it has already been successfully tested for the radiotracers [18F]FDG and [68Ga]fucoidan in animal models. To the best of our current knowledge, there is no known data analysis program that can semi-automatically analyze PET image data using the added atlas and is potentially suitable for homogeneous and target-specific accumulating radiotracers.

Human organoids could facilitate research of complex and currently incurable neuropathologies, such as age-related macular degeneration (AMD) which causes blindness. Here, we establish a human retinal organoid system reproducing several parameters of the human retina, including some within the macula, to model a complex combination of photoreceptor and glial pathologies. We show that combined application of TNF and HBEGF, factors associated with neuropathologies, is sufficient to induce photoreceptor degeneration, glial pathologies, dyslamination, and scar formation: These develop simultaneously and progressively as one complex phenotype. Histologic, transcriptome, live-imaging, and mechanistic studies reveal a previously unknown pathomechanism: Photoreceptor neurodegeneration via cell extrusion. This could be relevant for aging, AMD, and some inherited diseases. Pharmacological inhibitors of the mechanosensor PIEZO1, MAPK, and actomyosin each avert pathogenesis; a PIEZO1 activator induces photoreceptor extrusion. Our model offers mechanistic insights, hypotheses for neuropathologies, and it could be used to develop therapies to prevent vision loss or to regenerate the retina in patients suffering from AMD and other diseases.

Das Bronchialkarzinom ist die häufigste Todesursache bei den Krebserkrankungen und weist eine schlechte Prognose auf. Die Behandlung besteht aus einer Chemotherapie mit platinbasierten Medikamenten, doch der Erfolg ist unbefriedigend. In den letzten Jahren wurden zielgerichtete Therapien gegen Proteine wie den EGFR entwickelt. Klinische Studien zeigten, dass nur Subpopulationen von den Medikamenten Erlotinib und Cetuximab profitieren. Eine bessere (Vor-)Selektion der Patienten ist wünschenswert, um unnötige Behandlungen zu vermeiden. Für diese Analysen bedarf es relevanter präklinischer Modelle. Im Rahmen dieser Arbeit wurden 25 Xenograftmodelle des Lungenkarzinoms vergleichend charakterisiert. Ein Schwerpunkt bestand im Vergleich der Xenografts mit ihren Patiententumoren. Die Analyse der Histologie, der Proliferationsmarker als auch der Genexpressionsprofile fand übereinstimmende Ergebnisse in den Patiententumoren und ihren abgeleiteten Xenografts. Mit Hilfe von mRNA-, Protein- und SNP-Profilen ressistenzassoziierter Marker der Chemotherapie konnte die Bedeutung der Modelle zur Charakterisierung von prädiktiven und prognostischen Markern aufklärt werden. Diese Arbeit untersuchte auch Marker der anti-EGFR-Therapien. mRNA- und Proteinprofile der ERBB-Rezeptoren sowie der Liganden wurden erstellt und stimmten mit publizierten klinischen Daten überein. Genexpressionsstudien in Erlotinib Respondern und Non-Respondern zur Therapieoptimierung identifizierten den Wachstumsfaktor VEGFA als Ziel für eine Kombinationsbehandlung mit dem Angiogeneseinhibitor Bevacizumab. Die Kombination von Bevacizumab mit Erlotinib führte zu einem reduzierten Tumorwachstum. Die Ergebnisse dieser Arbeit machten deutlich, dass die individuellen Tumoreigenschaften in den patientenabgleiteten Xenografts auf Gen- und Proteinebene erhalten bleiben und diese als Modelle zur Markeranalyse sowie zur Therapieoptimierung eingesetzt werden können. / Lung cancer is still one of the most frequent cancers worldwide. The treatment option is classical chemotherapy that is based upon the combination of platin-based drugs. But no further improvement seems to be possible. For some years targeted drugs against single proteins like the EGFR were developed. The clinical trials showed that only subpopulations of patients benefit from the treatment. A better selection of patients to avoid treatment would be helpful. Therefore, pre-clinical models that are suitable for analysis and that represent clinical populations of patients are required. In this work 25 patient derived xenografts from lung cancer were intensely studied. First, the xenografts were compared with their corresponding patient tumor. The analysis of the histology and the expression of proliferation and epithelial or mesenchymal markers showed concordance of the patient tumor and the derived xenograft. The gene expression profiles were also maintained. Further analysis should elucidate the relevance of the xenografts as models for the characterisation and validation of predictive and prognostic markers. SNP, mRNA and protein expression profiles of resistance markers for chemotherapy were generated and showed similarities with clinical data. As marker for the anti-EGFR targeted therapies the ERBB receptors and the ligands of the EGFR were analysed. The mRNA and protein expression profiles resemble clinical data sets. An optimisation of the therapy should be achieved with gene expression studies. The vascular endothelial growth factor A was identified for a combination treatment with the anti-angiogenic drug bevacizumab in erlotinib resistant tumors. The combination of erlotinib and bevacizumab reduced the tumor growth in selected models. In summary, the analysis could show that the individual characteristics of the patient tumor were maintained in the xenograft. The models are a reliable tool for studies designed to improve treatment strategies.

Der ischämische Schlaganfall, der durch eine akut auftretende Durchblutungsstörung des Gehirns zu einem plötzlichen Verschluss eines zerebrovaskulären Gefäßes und somit zu einer massiven und oft lebensgefährlichen Minderung der zerebralen Blutversorgung führt, zählt zu den dritthäufigsten Todesursachen beim Menschen in den Industrieländern der Erde. Da die verfügbaren Therapieverfahren bisher erheblichen Limitationen unterliegen und nicht für alle Patienten gleichermaßen geeignet sind, ist eine kontinuierliche Forschung an neuen Therapieverfahren sowie die Weiterentwicklung der bisher verfügbaren Behandlungsmethoden unabdingbar. Der Erfolg dieser Arbeiten ist von der Übertragbarkeit von Ergebnissen aus präklinischen Testverfahren in die Klinik abhängig. In der Vergangenheit konnten sich beispielsweise zahlreiche Medikamente, insbesondere die sogenannten Neuroprotektiva, trotz hervorragender präklinischer Ergebnisse nicht in der Klinik behaupten. Zahlreiche Untersuchungen, die die methodische Qualität tierexperimenteller Kleintierstudien evaluierten, deckten dabei signifikante Mängel und potentielle Gründe für den Misserfolg der Translation auf. Mit der zunehmenden Bedeutung von Großtierversuchen in im Forschungsfeld steigt die Notwendigkeit, auch diese Studien hinsichtlich ihrer methodischen Qualität zu überprüfen. Dies bildet den Schwerpunkt dieser Dissertation. Die vorliegende Dissertation überprüft anhand eines an speziellen schlaganfallspezifischen Leitlinien und Vorgaben angelehnten Qualitätsscores die methodische Qualität sowie Validität von Großtierversuchen in der translationalen Schlaganfallforschung. Anhand einer systematischen Literaturrecherche nach den Vorgaben der PRISMA-Leitlinien wurden von 1990-2019 publizierte präklinische Großtierstudien (n=208) identifiziert und analysiert. Der Qualitätsscore umfasste essentielle methodische Qualitätsmerkmale. Korrelationen der Studienqualität mit externen Faktoren wie der Tierart, dem Untersuchungsgegenstand, der Region, dem Einflussfaktor der publizierenden Zeitschrift sowie dem Erscheinen schlaganfallspezifischer Leitlinien (STAIR) wurden ebenfalls evaluiert. Gruppenvergleiche von jeweils 2 Gruppen wurden mit dem Wilcoxon-Rangsummentest für nicht-parametrische Daten überprüft, für Gruppenvergleiche von mehr als 2 Gruppen wurde der Kruskal-Wallis Test verwendet. Im Falle einer statistischen Signifikanz wurde diese mittels Dunn-Bonferroni post-hoc-Korrektur verifiziert. Die Korrelation zwischen der Studienqualität und dem Einflussfaktor wurde mit dem Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman untersucht. Der Vergleich der tierarztspezifischen Gruppengrößen wurde mittels ANOVA untersucht, gefolgt von einer Dunn-Bonferroni post-hoc-Korrektur. Die Untersuchungen kamen zu dem Schluss, dass die methodische Qualität der bisherigen Großtierversuche als noch nicht optimal einzustufen ist. Studien wiesen insbesondere in methodischen Kriterien wie der Randomisierung, verdeckten Versuchsgruppenzuteilung, verblindeten Auswertung, primärer Endpunkte, der Effektstärkenberechnung, vorab erfolgten Stichprobenkalkulationen, Festlegung der Ein- und Ausschlusskriterien vor Versuchsbeginn, der Verifizierung der Infarktinduktion, der Dokumentation individueller Datenpunkte sowie einer Dokumentation möglicher Fehlerquellen sowie methodischer Limitierungen Mängel auf. Aufbauend auf den Analyseergebnissen wurden Empfehlungen für die translationale Schlaganfallforschung mit Großtieren erarbeitet. Diese sollen insbesondere zur Verbesserung der Studienplanung sowie des Studiendesigns, zu einer Erhöhung der Studientransparenz sowie zu einer kontinuierlichen, positiven Entwicklung der Studienqualität und zu einer erfolgreichen Translation von der Präklinik in die Klinik beitragen.:Inhaltsverzeichnis Widmung Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung……………………………………………………………………………….. 1 2 Literaturübersicht………………………………………………………………………. 2 2.1 Der Schlaganfall des Menschen………………………………………………… 2 2.1.1 Die akute Schlaganfalltherapie…………………………………………….. 2 2.1.2 Die Rolle von Großtiermodellen in der präklinischen Schlaganfallforschung……………………………………………………………………… 4 2.2 Translation und Studienvalidität in der präklinischen Schlaganfallforschung 6 2.2.1 Leitlinien zur Sicherung des wissenschaftlichen Qualitätsstandards in der präklinischen Schlaganfallforschung………………………………………………..... 9 2.2.2 Die Bedeutung von systematischen Reviews und Meta-Analysen in der Sicherung wissenschaftlicher Qualitätsstandards……………………………………... 12 2.3.1 Ergebnisse aus systematischen Reviews und Meta-Analysen in der tierexperimentellen Schlaganfallforschung……………………………………………... 13 3 Material und Methoden……………………………...………………………………. 17 3.1 Auswahl der Studien……………………………………………………………. 17 3.1.1 Suchstrategie………………………………………………………………. 17 3.1.2 Ein- und Ausschlusskriterien..………….………………………………… 17 3.1.3 Ablauf der Studienselektion ………………………………………..…….. 18 3.2 Datenextraktion.………………………………………………………………… 19 3.2.1 Basisinformationen, Einschlussfaktor und tierartspezifische Gruppengrößen ……………………………………………………………………………. 19 3.3 Studienanalyse.…………………………………………………………………. 20 3.3.1 Analyse der Qualitätskriterien ……………………………………………. 20 3.3.2 Analyse der Studienqualität unter der Berücksichtigung nicht-experimenteller Einflussgrößen ………………………………………………………….. 20 3.4 Statistische Auswertung.……………………………………………………….. 22 4 Ergebnisse ……………………………………………………………………………. 24 4.1 Studienoutput, Basisinformationen.…………………………………………… 24 4.1.1 Gruppengrößen ……………………………………………………………. 26 4.2 Studienqualität.………………………………………………………………….. 28 4.2.1 Tierbezogene Angaben (Kategorie 1) …………………………………... 28 4.2.2 Studienplanung (Kategorie 2) ……………………………………………. 29 4.2.3 Studiendurchführung (Kategorie 3) ……………………………………… 29 4.2.4 Dokumentation der Studienresultate und -auswertung (Kategorie 4).. 30 4.3 Analysen der Studienqualität unter der Berücksichtigung nicht-experimenteller Einflussgrößen ………………………………………………………….. 31 4.3.1 Unterschiede der Studienqualität (regional, tierartspezifisch, interventionsabhängig) ……………………………………………………………………. 31 4.3.1 Entwicklung der Studienqualität nach Einführung der STAIR-Leitlinien 33 4.3.2 Beeinflussung der Studienqualität durch den Einflussfaktor..…………. 34 5 Diskussion …………………………………………………………………………….. 36 5.1 Einschätzung der Studienqualität und -validität von Großtierversuchen in der Schlaganfallforschung …………………………………………………………………….. 36 5.2 Empfehlungen für eine langfristige Verbesserung der Studienqualität und -validität ..……………………………………………………………………………………. 43 5.2.1 Empfehlungen für eine Verbesserung der Studienplanung und des Studiendesigns.……………………………………………………………………………. 44 5.2.2 Empfehlungen zur Erhöhung der Studientransparenz..……………….. 47 5.3 Ausblick ………………………………………………………………………….. 49 6 Zusammenfassung.………………………………………………………………….. 51 7 Summary ……………………………………………………………………………… 53 8 Literaturverzeichnis ………………………………………………………………….. 55 9 Anhang …………….………………………………………………………………….. 62 / Ischemic stroke, which is based on a sudden occlusion of a cerebral artery is characterized by a massive and often life-threatening reduction of cerebral blood supply. Being frequent, ischemic stroke accounts for one in three deaths in the industrialized nations. The complex pathophysiology an acute stroke and the lack of broadly applicable treatment options requires continuous research for novel and refinement of available treatment methods. The success of this work decisively depends on result transferability from preclinical test procedures to clinically available treatments. In the past, numerous drugs, predominantly neuroprotectants, did not show clinical efficacy despite excellent results in preclinical studies. Post-hoc analyses revealed methodological quality issues in most small animal studies that are believed to be responsible for the translational failure. Since large animal experiments become increasingly important in translational stroke research, the need to review these studies regarding their methodological quality became apparent. This dissertation addresses this point. The methodological quality and validity of large animal experiments in translational stroke research was evaluated by using a quality score. This score was based on stroke-specific guidelines and recommendations for high-quality research. Based on a systematic literature search according to the PRISMA guidelines, preclinical large animal studies published from 1990-2019 (n=208) were identified and analyzed. The quality score comprised essential methodological features. Correlations of study quality with external factors such as species, type of intervention, region, journal`s impact factor as well as the implementation of stroke specific guidelines in the past (STAIR) were also evaluated. Group comparisons of 2 groups each were checked with the Wilcoxon rank sum test for non-parametric data while Kruskal-Wallis was used for group comparisons of more than 2 groups. Statistical significance was verified using Dunn-Bonferroni post-hoc correction. The correlation between study quality and impact factor was examined using Spearman correlation coefficient. Comparison of individual group sizes was investigated using ANOVA, followed by a Dunn-Bonferroni post-hoc correction. The methodological quality of the previous large animal experiments was found mediocre with, among others, shortcomings identified in methodological criteria such as blinding and randomization, definition of primary endpoints, effect size estimation and a priori sample size calculation, determination and application of preset inclusion and exclusion criteria, verification of infarct induction, documentation of individual data points, as well as the documentation of possible sources of error and methodological limitations. In summary, resulting recommendations made below are based on these shortages and are intended to improve study planning and design, and to increase study transparency. Furthermore these recommendations are intended to impact positively and continuously study quality and validity as well as translational success.:Inhaltsverzeichnis Widmung Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung……………………………………………………………………………….. 1 2 Literaturübersicht………………………………………………………………………. 2 2.1 Der Schlaganfall des Menschen………………………………………………… 2 2.1.1 Die akute Schlaganfalltherapie…………………………………………….. 2 2.1.2 Die Rolle von Großtiermodellen in der präklinischen Schlaganfallforschung……………………………………………………………………… 4 2.2 Translation und Studienvalidität in der präklinischen Schlaganfallforschung 6 2.2.1 Leitlinien zur Sicherung des wissenschaftlichen Qualitätsstandards in der präklinischen Schlaganfallforschung………………………………………………..... 9 2.2.2 Die Bedeutung von systematischen Reviews und Meta-Analysen in der Sicherung wissenschaftlicher Qualitätsstandards……………………………………... 12 2.3.1 Ergebnisse aus systematischen Reviews und Meta-Analysen in der tierexperimentellen Schlaganfallforschung……………………………………………... 13 3 Material und Methoden……………………………...………………………………. 17 3.1 Auswahl der Studien……………………………………………………………. 17 3.1.1 Suchstrategie………………………………………………………………. 17 3.1.2 Ein- und Ausschlusskriterien..………….………………………………… 17 3.1.3 Ablauf der Studienselektion ………………………………………..…….. 18 3.2 Datenextraktion.………………………………………………………………… 19 3.2.1 Basisinformationen, Einschlussfaktor und tierartspezifische Gruppengrößen ……………………………………………………………………………. 19 3.3 Studienanalyse.…………………………………………………………………. 20 3.3.1 Analyse der Qualitätskriterien ……………………………………………. 20 3.3.2 Analyse der Studienqualität unter der Berücksichtigung nicht-experimenteller Einflussgrößen ………………………………………………………….. 20 3.4 Statistische Auswertung.……………………………………………………….. 22 4 Ergebnisse ……………………………………………………………………………. 24 4.1 Studienoutput, Basisinformationen.…………………………………………… 24 4.1.1 Gruppengrößen ……………………………………………………………. 26 4.2 Studienqualität.………………………………………………………………….. 28 4.2.1 Tierbezogene Angaben (Kategorie 1) …………………………………... 28 4.2.2 Studienplanung (Kategorie 2) ……………………………………………. 29 4.2.3 Studiendurchführung (Kategorie 3) ……………………………………… 29 4.2.4 Dokumentation der Studienresultate und -auswertung (Kategorie 4).. 30 4.3 Analysen der Studienqualität unter der Berücksichtigung nicht-experimenteller Einflussgrößen ………………………………………………………….. 31 4.3.1 Unterschiede der Studienqualität (regional, tierartspezifisch, interventionsabhängig) ……………………………………………………………………. 31 4.3.1 Entwicklung der Studienqualität nach Einführung der STAIR-Leitlinien 33 4.3.2 Beeinflussung der Studienqualität durch den Einflussfaktor..…………. 34 5 Diskussion …………………………………………………………………………….. 36 5.1 Einschätzung der Studienqualität und -validität von Großtierversuchen in der Schlaganfallforschung …………………………………………………………………….. 36 5.2 Empfehlungen für eine langfristige Verbesserung der Studienqualität und -validität ..……………………………………………………………………………………. 43 5.2.1 Empfehlungen für eine Verbesserung der Studienplanung und des Studiendesigns.……………………………………………………………………………. 44 5.2.2 Empfehlungen zur Erhöhung der Studientransparenz..……………….. 47 5.3 Ausblick ………………………………………………………………………….. 49 6 Zusammenfassung.………………………………………………………………….. 51 7 Summary ……………………………………………………………………………… 53 8 Literaturverzeichnis ………………………………………………………………….. 55 9 Anhang …………….………………………………………………………………….. 62

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