L'objectif de ce travail de thèse vise à élaborer un dispositif de dépistage de maladies à prions à partir de la synthèse et greffage sur support de molécules actives vis-à-vis de la structure de la protéine prion pathogène (PrPSc). Dans les résultats antérieurs, l'équipe du Dr. Mike Robitzer a mis en évidence des molécules qui présentent une forte affinité vis-à-vis de la protéine prion pathologique. Les tests réalisés (du type Western-Blot) avec les homogénats de cerveaux contaminés avec le prion traités avec ces composés, montrent la formation d'oligomères (dimères et trimères) de la PrPSc uniquement avec les échantillons contaminés. L'identification de ces formes oligomériques caractérise l'échantillon comme étant contaminé. Les molécules synthétisées ouvrent les portes à une nouvelle famille de molécules avec une activité sélective confirmée avec la PrPSc.Parmi les molécules synthétisées par l'équipe du Dr. Mike Robitzer, une en particulier présente une affinité accentuée dans le processus d'oligomerisation de la protéine prion pathologique. Cette molécule, nommée MR100, porte deux fonctions du type 1,3,5-triazine-2,4-diamine couplées à un espaceur quaterthiophène et présente une forte activité d'oligomerization de la PrPSc.Les tests réalisés et le mécanisme d'action de cette molécule sont encore en début d'étude (en partenariat avec l'unité 710 d'INSERM et l'EFS) et pour cela, l'amélioration de la synthèse du MR100 et la synthèse de nouvelles molécules porteuses de fonctions chimiques différentes augmentant l'affinité avec la PrPSc ont été réalisée dans cette thèse doctorale.La synthèse du dispositif de dépistage de maladies à prion a été réalisée en deux étapes principales. La première était basée sur la synthèse de molécules actives et les tests in vitro pour l'induction de l'oligomérisation du prion pathogène.La deuxième étape a consisté à sélectionner et à greffer les meilleurs candidats sur des supports solides pour tester leur stabilité, réactivité et réponse vis-à-vis des échantillons contaminés.Ces dispositifs sensibles au prion pathogène ont été utilisés pour la détection de la maladie avec les échantillons contaminés. / The objective of this thesis was to develop a diagnostic device to prion diseases departing from the synthesis and functionalization of molecules having a high selectivity with the pathogenic form of the prion protein (PrPSc).In previous results, the Dr. Mike Robtizer's team has highlighted molecules that exhibit a strong affinity with the pathological form of the prion protein. The Western-Blot tests with contaminated brains homogenates treated with these compounds showed the formation of oligomeric forms (dimers and trimers) of the PrPSc only with contaminated samples. The identification of these oligomeric forms characterizes the sample as contaminated. The synthesized molecules represent a new family of compounds with a confirmed selectivity with the PrPSc.Among the synthesized molecules, one in particular has a pronounced affinity in the process of oligomerization of the pathological prion protein. This molecule, named MR100, has two 1,3,5-triazine-2,4-diamines functions coupled to a quaterthiophene spacer presents a high activity with the PrPSc.The tests with this molecule are still in the beginning (in partnership with INSERM - Unité 710 and EFS) and for this reason the improved synthesis of MR100 and the synthesis of new compounds carrying different chemical functions were developed in this doctoral thesis.The elaboration of the diagnostic device was made in two main steps. The first one was based on the synthesis of active molecules and its in vitro tests to verify their oligomeric-induced activity with PrPSc contaminated samples, inspired by the molecular approach developed in previous work.The active molecules have a high selectivity and specificity to the pathogenic forms of prion proteins and induce the formation of dimers and trimers of the PrPSc. The identification by Western Blot of these oligomeric forms characterizes the sample as contaminated.The second step was to select and graft the best candidates on solid supports to test their stability, reactivity and response in the same conditions.

La mucoviscidose est une maladie génétique, autosomale et récessive. Elle est caractérisée par une inflammation précoce des voies aériennes observée en absence de toute infection bactérienne, virale ou fongique. Aujourd’hui, l’origine de cette inflammation précoce reste très discutée. Plusieurs études mettent en avant la participation du stress oxydatif, une composante pathologique majeure de la mucoviscidose. Cependant, le lien entre le stress oxydatif et l’inflammation dans un contexte mucoviscidosique reste à démontrer.Mon projet de thèse a porté sur la caractérisation du rôle du stress oxydatif dans le déclenchement de l'inflammation dans la mucoviscidose. Pour cela j’ai utilisé des cellules épithéliales bronchiques humaines saines (HBE) et mucoviscidosiques(CFBE). J'ai également utilisé deux modèles de cellules dérivées de la cellule CFBE; les cellules CFBE corrigées par la protéinenormale et celles surexprimant la protéine CFTR mutée ; CFTR-delF508 (CFBE-delF508). La caractérisation du profil inflammatoire dans les trois modèles cellulaires a confirmé la présence d'une inflammation intrinsèque dans les cellules CFBE. Cependant, ce profil serait indépendant de l'expression de la protéine CFTR, car il n’est pas modifié suite à l’utilisation de traitements avec des correcteurs de l’expression de la protéine CFTR mutée. Ces résultats suggèrent que le statut inflammatoire dans les cellules mucoviscidosiques serait dû à des protagonistes autres que CFTR. Des études récentes de notre groupe ont montré que les cellules de patients atteints de mucoviscidose présentent une diminution de la concentration en cuivre (Cu), une augmentation de la production de radicaux libres (ROS) et une diminution des activités enzymatiques anti-oxydantes, notamment celle de la Cu/Zn-SOD. La caractérisation du statut du métal cuivre dans nos modèles, nous a permis d'établir un lien entre les niveaux de Cu, le stress oxydatif et l'inflammation dans la mucoviscidose. La comparaison des niveaux d'expression de gènes codants pour des protéines impliquées dans l'homéostasie du Cu dans les cellules HBE et CFBE, nous a permis d’identifier la protéine prion cellulaire (PrPC) comme protéine surexprimée dans les cellules CFBE. PrPC est une glycoprotéine ancrée à la surface des cellules grâce à son ancre Glycosyl-Phosphatidyl-Inositol(GPI). Plusieurs études menées in vitro et in vivo ont montré la capacité du PrPC à interagir avec différentes protéines, à lier le Cu avec une forte affinité, et à protéger les cellules contre le stress oxydatif. Néanmoins, ses fonctions restent à caractériserdans des tissus extra-neuronaux comme l'épithélium bronchique. Nous avons étudié le rôle de la protéine PrPC dans le contrôle de l'homéostasie du Cu et du stress oxydatif dans les cellules épithéliales bronchiques. Nous avons aussi étudié son implication dans le contrôle des jonctions cellulaires des cellules pulmonaires. Afin de mieux comprendre la fonction PrPC dans les processus inflammatoires associés à la mucoviscidose, nous avons développé une nouvelle lignée cellulaire invalidée pour la protéine PrPC, en utilisant la stratégie CRISPR / Cas9. Dans l'ensemble, notre projet a avancé nos connaissances sur la compréhension de l'implication de la protéine CFTR dans l’inflammation et le stress oxydatif associé aux cellules bronchiques mucoviscidosiques. Nous avons aussi mis en évidence l’implication du cuivre dans le stress et l’inflammation dans les cellules mucoviscidosiques. Finalement, nous avons montré que dans les cellules bronchiques humaine, la protéine PrPC est exprimée et localisée dans les jonctions cellulaires où elle participe à la protection contre le stress d’origine cuprique. / In cystic fibrosis (CF), inflammation is detected early on in the airways, even before the onset of bacterial infection, suggesting that mechanisms other than infection are at the origin of the initial inflammatory processes. Among these processes, there is the oxidative stress. The latter is widely accepted as a critical component of several diseases. My PhD project was focused on the characterization of the role of the oxidative stress in triggering inflammation in the CF disease. I used normal (HBE) and cystic fibrosis (CFBE) human bronchial epithelial cells. I also used two cell models derived from CFBE upon either, a stable expression of the wild-type protein (CFBE-wt), or its mutant form; delF508 (CFBEdeltaF508). The characterization of the inflammatory profile in our cellular models confirmed the presence of an intrinsic inflammation inCFBE cells. This profile was independent of the expression of the CFTR protein and was not modified upon the treatments with different molecules known to correct the trafficking of the mutant CFTR (delF508) protein. This suggest that other parameters might be the cause of the CF intrinsic inflammation. Recent studies from our group showed that cells from bronchial CF patients displayed a decrease in copper (Cu) concentrations, and increase in the production of free radicals, and a decrease in antioxidant enzyme activities, such as Cu/Zn-SOD. These results allowed us to establish a link between Cu levels, oxidative stress and inflammation. While investigating the levels of expression of a number of genes encoding proteins that control Cu homeostasis in HBE and CFBE cells, we found that the expression of the cellular prion protein (PrPC) was altered in CFBE cells. PrPC is a glycosyl phosphatidyl inositol (GPI)-anchored glycoprotein involved in prion infection, propagation and aggregation in the central nervous system that leads to transmissible spongiforme encephalopathies (TSE) diseases. Despite several in vitro and in vivo studies demonstrating the capacity of PrPC to interact with other proteins, to bind copper (Cu) with high affinity and to protect cells against oxidative stress, its physiological functions were still under investigations, particularly in extra-neuronal tissues, such as the bronchial epithelium. We have addressed the role of PrPC in the lung cellular architecture, by determining its impact on the integrity of the lung epithelial junctions. This was performed in relation to Cu homeostasis and oxidative stress in bronchial epithelial cells. To further understand PrPC function, we developed a new HBE PrPC knock-out cell line using the CRISPR/Cas9 strategy. Overall, my project brought new insights into the understanding copper involvement in inflammation, oxidative stress and jonctionnal barriers, and how PrPC protein protect bronchial epithelial cells form copper-associated oxidative stress.

Les principales maladies neurodégénératives humaines, qui reposent toutes sur des mécanismes de type prion (auto-propagation d’agrégats protéiques pathogéniques), représentent un risque sociétal majeur avec une augmentation de leur prévalence directement corrélée avec l’augmentation de la longévité de la population mondiale. Il n’existe à ce jour aucun traitement curatif ni aucun modèle expérimental suffisamment pertinent pour ces maladies.L'objectif de ce travail a été d'utiliser le potentiel des mini-cerveaux humains comme modèle in vitro auto-assemblé en trois dimensions (3D) capable de restituer la complexité du cortex cérébral et d’étudier les mécanismes de type prion en développant une méthodologie de validation basée sur la microscopie 3D. Ces nouvelles structures 3D qui peuvent être obtenues à partir de cellules adultes reprogrammées de patients en cellules souches pluripotentes induites (iPSC), offrent des possibilités uniques pour accéder, observer et perturber les processus biologiques dans le cerveau humain sans les biais ni les complications des modèles animaux ou des échantillons de cerveau humain ex vivo. Ce modèle permet notamment d’observer l’apparition d’agrégats d’Aß et de Tau phosphorylée, deux protéines qui s’accumulent et se propagent de cellule en cellule dans la maladie d’Alzheimer.Nous avons été en mesure de rendre le modèle des mini-cerveaux compatible avec une future approche de criblage de molécules thérapeutiques en modifiant la méthodologie de différenciation pour augmenter leur rendement de production. D’autre part, nous avons pu tester différentes modalités de modélisation pour la Maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, la Démence Fronto-Temporale et la maladie de Creutzfeldt-Jakob : à l’aide de molécules d’induction chimique, à l’aide de cellules issues de patients, par modification génétique et par mise en contact de matériel infectieux. Ces différentes approches nous ont permis d’établir que le modèle d’organoïde cérébral permet de reproduire des aspects-clés retrouvés dans l’apparition de la pathologie chez les patients. Pour compenser l’hétérogénéité de notre modèle, nous avons réalisé une analyse in toto par imagerie, c’est-à-dire dans sa totalité sans coupes préalables. La modalité retenue pour cette acquisition est la microscopie à feuillet de lumière utilisée après marquage et clarification des mini-cerveaux. Pour ce faire, nous avons évalué et développé différentes stratégies en vue d’obtenir une plateforme d’analyse à haut contenu pour nos organoïdes cérébraux.Cette plateforme centrée autour de l’organoïde cérébral, sous-tendue par l’analyse en microscopie 3D, a été développée dans le cadre du projet « Investissements d’Avenir » 3DNeuroSecure. Ce projet a pour ambition d’apporter des solutions de calcul haute performance au domaine de la biologie, notamment avec la possibilité de traiter des informations de très grand volume, dit « exascale », telles que celles que nous obtenons avec la microscopie 3D. Le développement de cet aspect nous permettrait à terme de pouvoir établir les bases d’un outil de criblage thérapeutique par les organoïdes cérébraux pour les maladies neurodégénératives. Nous avons démontré que les mécanismes de type prion pouvaient être étudiés dans ce modèle de mini-cerveaux humains et de multiples voies de recherche fondamentale et appliquée sont désormais possibles. A plus long terme, une telle plateforme pourrait accueillir tout type d’organoïdes pour modéliser l’ensemble du corps humain et s’inscrire comme un compagnon biologique dans le cadre des futurs développements de la médecine personnalisée. / Human neurodegenerative diseases, which are all based on prion-like mechanisms (self-propagation of pathogenic protein aggregates), represent a major societal risk with the increase of their prevalence directly correlated to the increasing longevity of the world population. There is to date neither any cure nor any pertinent experimental model for their study.The objective of this work was to use the potential of human mini-brains, a self-assembled three-dimensional in vitro model able to restitute the complexity of the cerebral cortex. This model will allow us to study prion-like mechanism by developing a validation methodology based on 3D microscopy. These novel 3D structures can be obtained from reprogrammed adult cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) and offer unique possibilities to access, observe and disrupt biological processes in the human brain without bias nor complications as in animal models and ex vivo human brain samples. This model makes it possible to observe the development of aggregates of Aβ and hyper-phosphorylated Tau, two proteins that accumulate and propagate from cell to cell during Alzheimer’s disease.We have been to able to adapt the cerebral organoid model for a future screening approach by modifying the differentiation methodology to enhance its production ratio. We also have been able to test different modalities for disease modeling for Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Fronto-Temporal Dementia and Creutzfeldt-Jakob disease: with chemical induction, with patient specific cells, through genetic modification and through contact with infectious material. These different approaches allowed us to validate that the cerebral organoid can indeed reproduce key aspects found during pathological development within patients. To compensate for the heterogeneity of the cerebral organoid, we performed an in toto analysis through microscopy, meaning in its totality without prior slicing. The chosen method of acquisition is fluorescence light-sheet microscopy used after staining and optical clearing of cerebral organoids. To do so, we have evaluated and established different strategies in order to obtain a high content screening platform for our cerebral organoid model.This platform centered around the cerebral organoid model, underpinned by 3D microscopy analysis, was developed during the “Investissements d’Avenir” project 3DNeuroSecure. This project has for ambition to bring high performance computing to the biological sciences, notably with the possibility to deal with large scale data, also called “exascale”, like the ones obtained with 3D microscopy. The development of this aspect would allow us to establish the basis for a therapeutic screening tool based on cerebral organoids for neurodegenerative diseases. We have demonstrated that prion-like mechanisms can be studied in a human mini-brain model and multiple research avenues are now opened for both fundamental and applied research. This platform could in turn become the basis for any kind of organoids derived from patients to model the whole human body and become a biological companion for personalized medicine.

La maladie d’Alzheimer (MA) est caractérisée par l’accumulation de protéines β-amyloïde (Aβ) et Tau malconformées. L’hypothèse que la MA soit transmissible de manière similaire à celles des maladies à prion est un sujet d’intense recherche. L’objectif de cette thèse est d’étudier la transmission des endophénotypes de la maladie d’Alzheimer par l’inoculation intracérébral d’homogénats de patients souffrant de MA.Tout d’abord, nous avons montré que la transmission expérimentale de la MA accélère l’amyloïdose dans des modèles murins d’amyloïdose génétique précoce et tardive. Ensuite, nous avons observé le développement d’altérations fonctionnelles et morphologiques semblables à celles observées dans la MA chez le primate microcèbe (Microcebus murinus) et accompagnées d’une amyloïdose subtile sans pathologie Tau. Une telle transmission en l’absence de sévères lésions neuropathologiques a été rapportée dans les maladies à prions mais jamais dans le contexte de la MA. Nos résultats suggèrent que les agents responsables des altérations observées puissent être des formes d’Aβ et/ou Tau non détectées en immunohistochimie et pouvant être transmises expérimentalement. En conclusion, nos résultats supportent l’hypothèse de type prion de la MA et le consensus actuel sur la toxicité des formes solubles d’Aβ et Tau. Pour finir, ils soutiennent la possibilité que l’amyloïdose soit transmissible chez l’Homme sous certaines conditions et appellent à l’évaluation des impacts fonctionnels chez les sujets à risque de contamination. / Alzheimer's disease (AD) is characterized by the accumulation of misfolded β-amyloid (Aβ) and Tau proteins. There has been longstanding interest as to whether AD might be transmissible similarly to prion diseases. Our objective was to study the transmissibility of AD endophenotypes after AD brain intracerebral inoculation in mice and primates.First, we showed that AD experimental transmission accelerated Aβ pathology in two rodent models of early or late genetic β-amyloidosis. Then, we focused on a primate model of sporadic AD, the mouse lemur (Microcebus murinus). AD-inoculated adult lemurs progressively developed cognitive impairments, neuronal activity alterations and cerebral atrophy. AD-inoculated mouse lemurs also developed subtle β-amyloidosis in the absence of Tau pathology, 18 months after inoculation. The transmission of an AD-like pathology in the absence of severe neuropathological lesions is striking. Such observations have already been reported for prion diseases but never in the context of AD. Our results suggest that agents leading to AD-like alterations may be not immunohistopathological-detectable forms of Aβ or Tau proteins and transmitted experimentally.In conclusion, our results support the “prion-like” hypothesis of AD and provide further arguments for a dichotomy between the toxicity of deposited and soluble assemblies of Aβ or Tau proteins. Finally, they complement recent evidence supporting iatrogenic β-amyloidosis in humans and provide strong arguments to evaluate functional outcomes in potentially contaminated individuals.

La Protéine Prion (PrP) est une glycoprotéine ubiquitaire attachée au feuillet externe de la membrane plasmique par une ancre glycosylphosphatidylinositole (GPI). Cette dernière est l’agent infectieux responsable de la maladie Creutzfeld-Jacob ou « maladie de la vache folle ». Cette protéine existe sous sa forme cellulaire mais également sous sa forme infectieuse, nommée PrPSc (Scrapie). Alors que la fonction de PrPSc est établie au cours de la pathogenèse, la fonction de la protéine cellulaire est beaucoup plus énigmatique notamment chez les mammifères. Il est clairement admis que la forme infectieuse découle d’un changement de conformation de la forme cellulaire. Ainsi afin de mieux appréhender le rôle de la protéine prion dans les cellules saines mais également lors de la pathogenèse il apparaît essentiel d’étudier le trafic de cette protéine. La protéine prion est exprimée dans les cellules neuronales qui sont comme les cellules épithéliales des cellules polarisées. J’ai au cours de ma thèse étudié le trafic de la protéine prion dans les cellules polarisées MDCK. MDCK est la lignée épithéliale sur laquelle nous avons la plus grande connaissance. Dans mon travail j’ai utilisé des cellules MDCK polarisées classiquement en culture bidimensionnelle (2D) mais également en culture tridimensionnelle (3D) où les cellules forment des kystes, structures hautement polarisées, physiologiquement proches de l’épithélium in vivo. Il apparaît que dans les cellules MDCK polarisées sur filtre (en 2D) la localisation de la PrP est controversée. Nous avons trouvé que, contrairement à la majorité des protéines à ancre GPI, la PrP suit la voie de transcytose. La PrP qui se retrouve à la membrane basolatérale est transcytosée vers la membrane apicale. De plus la PrP envoyée à la surface apicale est clivée (clivage alpha) générant deux fragments distincts : le fragment C1, pourvu de l’ancre GPI qui reste associé à la surface apicale et le fragment soluble N1 qui est sécrété dans le milieu de culture des cellules MDCK cultivées en 2D ou dans le lumen des cellules MDCK cultivées en 3D. Mon travail permet de mieux comprendre les études réalisées auparavant mais surtout révèle l’existence d’un mécanisme de transcytose de la protéine prion dans les cellules épithéliales. Cette information est essentielle et nous permet de supposer que ce mécanisme pourrait être également utilisé par les cellules neuronales. / The Prion Protein (PrP) is a ubiquitously expressed glycosylated membrane protein attached to the external leaflet of the plasma membrane via a glycosylphosphatidylinositol anchor (GPI). While the misfolded PrPSc scrapie isoform is the infectious agent of “prion diseases” the cellular isoform (PrPC) is an enigmatic protein with unclear function. Prion protein has received considerable attention due to its central role in the development of Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) known as “prion diseases”, in animals and humans. Understanding the trafficking, the processing and degradation of PrP is of fundamental importance in order to unravel the mechanism of PrPSc mediated pathogenesis, its spreading and cytotoxicity. The available data regarding PrP trafficking are contradictory. To investigate PrP trafficking and sorting we used polarized MDCK cells (two-dimensional and tree-dimensional cultures) where the intracellular traffic of GPI-anchored proteins (GPI-APs) is well characterized. GPI-APs that are sorted in the Trans Golgi Network follow a direct route from the Golgi apparatus to the apical plasma membrane. The exception to direct apical sorting of native GPI-APs in MDCK cells is represented by the Prion Protein. Of interest, PrP localization in polarized MDCK cells is highly controversial and its mechanism of trafficking is not clear. We found that full-length PrP and its cleavage fragments are segregated in different domains of the plasma membrane in polarized cells in both 2D and 3D cultures and that the C1/PrP full-length ratio increases upon MDCK polarization. We revealed that differently from other GPI-APs, PrP undergoes basolateral-to-apical transcytosis in fully polarized MDCK cells and is α-cleaved during its transport to the apical surface. This study not only reconciles and explains the different findings in the previous literature but also provides a better picture of PrP trafficking and processing, which has been shown to have major implications for its role in prion disease.

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Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) or prion diseases are a class of fatal brain disorders better known as Creutzfeldt-Jacob Disease (CJD) in humans, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle, scrapie in sheep, and chronic wasting disease (CWD) in deer and elk. The infectious agent responsible for these diseases is a misfolded prion protein capable of catalyzing a conformational change in normal cellular prion proteins (PrPC) into aberrant disease-causing structural isoforms (PrPSc). Although the etiological agent for TSEs has clearly been defined as PrPSc, there are important gaps in our understanding of how these proteins target and invade brain tissue. It remains to be established how ingested PrPSc ultimately reach the brain and also to understand why these tissues are particularly targeted, notwithstanding that several other tissues highly express prion proteins. Certain viruses, retroviruses in particular, efficiently hijack host proteins and can carry these proteins with them when they are released from a cell. Several lines of evidence have shown that prions and retroviruses can interact and associate at various stages of the retroviral replication cycle. Of special interest is that most retroviruses can cross the blood-brain barrier and could therefore deliver host-derived proteins to neuronal cells. In view of these observations, this thesis investigates whether retroviruses can act as vectors to capture prions from an infected cell and deliver them to a susceptible target cell. In this work, I have cloned human and mouse prion cDNAs from PBMCs and the murine cell line NIH 3T3. Either a FLAG epitope tag or the eGFP reporter protein cDNA was inserted into a region of the prion cDNA that is predicted to be amenable to such genetic insertions without affecting protein folding or expression. I then confirmed using both fluorescent and confocal microscopy and that the recombinant proteins had a similar cell distribution to the endogenous prion protein. Using Western blot analysis, I then showed that endogenous and overexpressed prion proteins can be detected in co-transfected cells producing HIV and murine leukemia virus (MLV) retroviral particles. Finally, I went on to show that prions are also present at high levels in HIV and MLV retroviral particles released from these cells. This work constitutes the first step in determining whether retroviruses can act as vectors for prion dissemination. Establishing a strong and clear association between retroviruses, pathogenic prions and prion disease would provide the rationale for preventive measures to be taken directly against retroviruses in order to protect humans and animals that have been newly exposed to PrPSc-infected products or those who are genetically predisposed to develop prion diseases. Anti-retroviral drugs could also be potentially used to delay disease progression and reduce prion transmission in human and animal tissues. The availability of such a treatment would constitute a significant advancement because there is currently no cure or treatment for prion diseases.

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