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Estudo comparativo do mecanismo de ação e dos efeitos farmacológicos do tenoxicam, indometacina, dexametasona e metotrexato no processo inflamatório agudo e crônico / Comparative study of the action mechanism and pharmacologic effects of Tenoxican, Indomethacin, Dexamethasone and Methotrexate in the acute and chronic inflammatory processSchütz, Antonio Beltrão 27 September 1996 (has links)
Aprofundamos o estudo dos efeitos farmacológicos da dexametasona, indometacina e tenoxicam e de uma droga citostática (metotrexato), assim como a análise dos mecanismos envolvidos na estimulação flogógena causada por agentes de intensidades fraca, média e forte. Para isso. empregamos o teste edemogênico, que demonstrou ser os fármacos antiinflamatórios não esteróides (tenoxicam e indometacina), os de maior potência na inibição da exsudação plasmática induzida pela paracoccidioidina. Todavia, com agentes flogógenos de intensidade média (carragenina), o metotrexato foi o medicamento mais potente; enquanto que com a placa microbiana dental (agente forte), a dexametasona e a indometacina foram os de maior potência antiinflamatória. Por meio da análise histomorfométrica relativa dos granulomas induzidos por esse último agente, verificamos, até 14 dias, a maior potência antiinflamatória apresentada pelo tenoxicam, comparativamente à da indometacina - em relação à inibição da região central de necrose supurativa-, demonstrando efeito semelhante ao da dexametasona; não obstante, nesse período experimental, em relação à inibição da densidade do volume do tecido granulomatoso, os fármacos mais potentes terem sido a indometacina e a dexametasona. Após 14 dias, foi constatada diferença não significativa (p>0.05) entre o efeito apresentado pelo tenoxicam e o da indometacina. O acentuado efeito apresentado pelos NSAIDs em relação à inibição da densidade de volume dos macrófagos, semelhante ao do metotrexato, sugeriu que os NSAIDs inibiram a proliferação das células progenitoras mielóides dos monócitos/macrófagos. Também agiram tanto aumentando (21 dias) como inibindo (28 dias) a densidade de volume ocupada pelas fibras colágenas; enquanto que a dexametasona apresentou efeito contrário. Tais resultados indicaram que no processo inflamatório induzido por agentes flogógenos de intensidade forte (PMD), estimulores da acentuada produção de LTs e PGs, o emprego de antiinflamatórios esteróides e não esteróides foi vantajosa em relação ao fármaco citostátco. / Was studied comparatively the mechanisms of action and the antiinflammatory effect presented by dexamethasone, tenoxican, indomethacin and methotrexate in acute and chronic inflammation induced by agent flogogenous of minim, media and elevated intensity. With the employ of edemogenic test was verified that the effect presented by nonsteroid antiinflammatory (tenoxican and indomethacin), in relation to inhibition of the plasmatic exsudation induced by paracoccidioidin, was more potent than other medicaments tested. Meanwhile, in the inhibition of the acute inflammation caused by carrageenan and dental microbian plaque, methotrexate, dexamethasone and indomethacin were the most potent pharmacs, respectively. The injection of the dental microbian plaque in the air pouch model induced two experimental granulomas susceptive to the antiinflammatory effects presented for the pharmacs tested, which were utilized in the determination of the weights and of the volume density occupied by structures presents in the periods experimental of 7, 14, 21 and 28 days. With relation the inhibition of the differential mid and dry weights, methotrexate and dexamethasone followed by indomethacin and tenoxican were the most effective pharmacs in decrescent order of potency. The histomorphometric studies of the volume density of the granulomatous tissue revealed that indomethacin reduced this structure comparatively to the tenoxican at 14 days. After this experimental period tenoxican presented the most potent anti-inflammatory effect; however, without significant statistical difference to indomethacin. Tenoxican too presented elevated inhibitory effect of the volume density of the region of supurative necrose (similar to dexamethasone) particularly along to first week. NSAIDs also showed in relation the inhibition of volume density of the collagen effect stimulator (21 days) and inhibitor (28 days), while that dexamethasone revealed contrary effect. The accentuate inhibitory effect of the volume density of macrophages presented by NSAIDs was similar to methotrexate, indicating that these medicaments possibly presented anti-mitotic effect to the progenitors myeloid cells of monocytes/macrophages. These results indicated that in the inflammatory process induced by flogogenous of strong intensity, stimulators of increased production of LTS and PGs, the administration of steroids and non-steroids anti-inflammatory was advantageous in relation to methotrexate.
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Avaliação comportamental, perfil oxidativo e atividade de ATPases e colinesterases em ratos expostos ao cádmio e tratados com quercetina / Behavioral assessment, oxidative profile and ATPases cholinesterase activities in cadmium exposed rats and treated with quercetinAbdalla, Fátima Husein 29 September 2014 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cadmium (Cd) is considered one of the most toxic heavy metals for its ability to affect different tissues, including the brain and the immune system. The molecular mechanisms of toxicity of Cd are not well established, however, it is known that one of the consequences of Cd exposure is the generation of oxidative stress. Conversely, the quercetin, one flavonoid present in various foods performs various therapeutic functions in the body, such as antioxidant activity, anti-inflammatory and neuroprotective action. Thus, the aim of this study was to investigate the effects of quercetin on the behavioral tests, the activity of the enzymes acetylcholinesterase (AChE), Na+, K+-ATPase and the δ-dehydratase aminolevulinic acid (δ-ALA-D), as well as parameters of oxidative stress in the central nervous system of adult male wistar rats exposed to CdCl2. The activities of enzymes AChE, NTPDase and adenosine deaminase (ADA) of peripheral lymphocytes, butyrylcholinesterase (BuChE) in the serum and myeloperoxidase (MPO) in plasma were also measured in the peripheral system of these animals. The rats were exposed to CdCl2 (2.5 mg / kg) and quercetin (5, 25 or 50 mg / kg) by gavage (1 ml/kg) for 45 days. Hence, the animals were divided into eight groups (n = 10-14): saline/control, saline/Querc 5 mg/kg, saline/Querc 25 mg/kg, saline/Querc 50 mg/kg, Cd/ethanol, Cd/Querc 5 mg/kg, Cd/Querc 25 mg/kg and Cd/Querc 50 mg/kg. The groups treated with Cd and quercetin, received the antioxidant quercetin solution after 30 minutes of the administration of Cd solution. At the end of 45 days of the treatment the animals were submitted to training and behavioral tests. After, they were anesthetized by halothane inhalation, and blood collection was performed to set serum, plasma and peripheral lymphocytes apart. Then the animals were euthanized, with part of the brain being removed for analysis of the enzyme δ-ALA-D activity, while the other part of brain was dissected into, cerebral cortex, striatum, cerebellum, hippocampus and hypothalamus, for future enzymatic assays. The results showed that Cd is able to cross the blood brain barrier, therefore, although the amount of Cd accumulated in the different brain structures studied was low, it was significantly higher than in control. Simultaneous treatment of quercetin in Cd exposed animals was ineffective to decrease these levels of Cd. The Cd exposure caused impairment on learning and memory, besides causing an increase in the anxiogenic behavior type. Nevertheless, the treatment with quercetin prevented the undesirable effects caused by exposure to the metal in the anxiety and memory. In relation to enzymatic activities in the brain, it was observed that Cd exposure reduced AChE activity in cerebral cortex and hippocampus, while as activation of the enzyme was observed in hypothalamus. Furthermore, a decrease in the Na+, K+-ATPase enzyme activity in cerebral cortex, hippocampus and hypothalamus was observed, as well as a decrease in the δ-ALA-D activity in total brain of Cd exposed animals. Interestingly, the quercetin co-administration in the Cd exposed animals prevented the changes in the activity of the enzymes AChE and Na+, K+-ATPase in different brain structures, though has not restored the δ-ALA-D enzyme activity. It was also observed an increase in ROS production, in lipid peroxidation, in protein oxidation, the levels of double stranded DNA and changes in the antioxidant system, such as, reduction in the glutathione reductase (GR) activity, levels of total thiols (T-SH) and reduced glutathione (GSH), and an increase in the glutathione S-transferase (GST) enzyme activity in cerebral cortex, hypothalamus and hippocampus of Cd exposed animals. Co-administration of quercetin in Cd exposed rats was able to prevent totally or partially the changes caused by metal exposure in oxidative stress parameters. It is suggested that quercetin is able to reduce the oxidative damage caused by exposure to these metal and subsequently restore the AChE and Na+, K+-ATPase activities, modulating cholinergic neurotransmission and improving cognitive processes. In relation to the peripheral system, there was an increase in the NTPDase, ADA, AChE, BuChE and MPO activities in Cd exposed rats. Based on these results it is possible to infer that the increase in NTPDase activity is a compensatory effect due to the increase in ATP levels in circulation. It is suggested that decreased levels of ACh are available in the circulation due to increase in the peripheral cholinesterase activity. When rats were treated with the quercetin, flavonoid was able to modulate the activities of these enzymes probably due to the anti-inflammatory property of the compound. Accordingly, it is suggested that quercetin prevents or eases the toxicity caused by exposure to metal due to its antioxidant and anti-inflammatory activities. Therefore, it is believed that the flavonoid may be a promising drug in alternative therapies against toxicity induced by the metal in the central nervous system and peripheral system. / O cádmio (Cd) é considerado um dos metais pesados de maior toxicidade devido a sua capacidade de afetar diferentes tecidos, incluindo o encéfalo, bem como o sistema imunológico. Os mecanismos moleculares de toxicidade do Cd ainda não estão bem estabelecidos, contudo, sabe-se que uma das consequências da exposição ao Cd é a geração de estresse oxidativo. Por outro lado, a quercetina, um flavonoide presente em vários alimentos, exerce diversas funções terapêuticas no organismo, como atividade antioxidante, anti-inflamatória e ação neuroprotetora. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos da quercetina sobre os testes comportamentais, a atividade das enzimas acetilcolinesterase (AChE), a Na+,K+-ATPase e a δ-desidratase aminolevulinato (δ-ALA-D), bem como os parâmetros de estresse oxidativo no sistema nervoso central de ratos machos wistar adultos expostos ao CdCl2. Também foi avaliada, no sistema periférico destes animais, a atividade das enzimas AChE, NTPDases e adenosina desaminase (ADA) de linfócitos periféricos, butirilcolinesterase (BuChE) do soro e a mieloperoxidase (MPO) do plasma. Os ratos foram expostos ao CdCl2 (2,5 mg/kg) e quercetina (5, 25 ou 50 mg/kg) por gavagem (1ml/kg) durante 45 dias. Para isso, os animais foram distribuídos em oito grupos (n=10-14): salina/controle, salina/Querc 5mg/kg, salina/Querc 25 mg/kg, salina/Querc 50 mg/kg, Cd/etanol, Cd/ Querc 5mg/kg, Cd/Querc 25mg/kg e Cd/Querc 50 mg/kg. Os grupos tratados com Cd e quercetina receberam a solução antioxidante após 30 minutos da administração da solução de Cd. No final do período de 45 dias de tratamento os animais foram submetidos aos treinos e aos testes comportamentais. Posteriormente, foram anestesiados, através da inalação de halotano, e foi realizada a coleta de sangue e separação de soro, plasma e linfócitos periféricos. Em seguida os animais foram submetidos à eutanásia, com parte do encéfalo sendo retirada para a análise da atividade da enzima δ-ALA-D, enquanto que outra parte foi dissecada em córtex cerebral, estriado, cerebelo, hipocampo e hipotálamo, para posteriores ensaios enzimáticos. Os resultados obtidos mostraram que o Cd é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica, pois, embora a quantidade de Cd acumulada nas diferentes estruturas encefálicas estudadas tenha sido baixa, ainda assim, foi significativamente maior que o controle. O tratamento concomitante da quercetina nos animais expostos ao Cd foi ineficiente em diminuir estes níveis de Cd. A exposição ao Cd causou prejuízos na aprendizagem e memória, além de causar um aumento no comportamento do tipo ansiogênico. Por outro lado, o tratamento com a quercetina preveniu os efeitos indesejáveis causados pela exposição ao metal na ansiedade
e memória. Em relação às atividades enzimáticas no encéfalo, verificou-se que a exposição ao Cd reduziu a atividade da enzima AChE no córtex cerebral e no hipocampo, enquanto que uma ativação da enzima foi observada no hipotálamo. Além disso, observou-se uma diminuição na atividade da enzima Na+, K+-ATPase no córtex cerebral, hipocampo e hipotálamo, bem como uma diminuição na atividade da δ-ALA-D no encéfalo total de animais expostos ao Cd. Interessantemente, a co-administração com a quercetina em animais expostos ao Cd impediu as alterações na atividade das enzimas AChE e Na+, K+-ATPase em diferentes estruturas encefálicas, embora não tenha restaurado a a atividade da enzima δ-ALA-D. Verificou-se, também, um aumento na produção de ROS, na lipoperoxidação, na oxidação de proteínas, nos níveis de DNA dupla fita e alterações no sistema antioxidante, como a diminuição na atividade da enzima glutationa redutase (GR), nos níveis de tióis totais (T-SH) e glutationa reduzida (GSH), e um aumento na atividade da enzima glutationa S-transferase (GST) no córtex cerebral, hipocampo e hipotálamo dos animais expostos ao Cd. A co-administração da quercetina nos ratos expostos ao Cd foi capaz de impedir totalmente ou parcialmente as alterações causadas pela exposição ao metal nos parâmetros do estresse oxidativo. Sugere-se que a quercetina é capaz de diminuir o dano oxidativo causado pela exposição ao metal e, subsequentemente, restaurar a atividade da AChE e Na+, K+-ATPase, modulando, assim, a neurotransmissão colinérgica e melhorando os processos cognitivos. Em relação ao sistema periférico, verificou-se um aumento na atividade das enzimas NTPDase, ADA, AChE, BuChE e MPO nos ratos expostos ao Cd. A partir desse resultado pode-se inferir que o aumento na atividade da NTPDase seja um efeito compensatório devido ao aumento dos níveis de ATP na circulação. Sugere-se que níveis diminuídos de ACh estão disponíveis na circulação devido ao aumento na atividade das colinesterases periféricas. Quando os ratos foram tratados com quercetina o flavonoide foi capaz de modular a atividade dessas enzimas provavelmente devido à propriedade anti-inflamatória do composto. Deste modo, propõe-se que a quercetina previne ou ameniza a toxicidade causada pela exposição ao metal devido a sua atividade antioxidante e anti-inflamatória. Logo, acredita-se que este flavonoide possa ser um fármaco promissor em terapias alternativas contra a toxicidade induzida pelo metal no sistema nervoso central e periférico.
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Estudo comparativo do mecanismo de ação e dos efeitos farmacológicos do tenoxicam, indometacina, dexametasona e metotrexato no processo inflamatório agudo e crônico / Comparative study of the action mechanism and pharmacologic effects of Tenoxican, Indomethacin, Dexamethasone and Methotrexate in the acute and chronic inflammatory processAntonio Beltrão Schütz 27 September 1996 (has links)
Aprofundamos o estudo dos efeitos farmacológicos da dexametasona, indometacina e tenoxicam e de uma droga citostática (metotrexato), assim como a análise dos mecanismos envolvidos na estimulação flogógena causada por agentes de intensidades fraca, média e forte. Para isso. empregamos o teste edemogênico, que demonstrou ser os fármacos antiinflamatórios não esteróides (tenoxicam e indometacina), os de maior potência na inibição da exsudação plasmática induzida pela paracoccidioidina. Todavia, com agentes flogógenos de intensidade média (carragenina), o metotrexato foi o medicamento mais potente; enquanto que com a placa microbiana dental (agente forte), a dexametasona e a indometacina foram os de maior potência antiinflamatória. Por meio da análise histomorfométrica relativa dos granulomas induzidos por esse último agente, verificamos, até 14 dias, a maior potência antiinflamatória apresentada pelo tenoxicam, comparativamente à da indometacina - em relação à inibição da região central de necrose supurativa-, demonstrando efeito semelhante ao da dexametasona; não obstante, nesse período experimental, em relação à inibição da densidade do volume do tecido granulomatoso, os fármacos mais potentes terem sido a indometacina e a dexametasona. Após 14 dias, foi constatada diferença não significativa (p>0.05) entre o efeito apresentado pelo tenoxicam e o da indometacina. O acentuado efeito apresentado pelos NSAIDs em relação à inibição da densidade de volume dos macrófagos, semelhante ao do metotrexato, sugeriu que os NSAIDs inibiram a proliferação das células progenitoras mielóides dos monócitos/macrófagos. Também agiram tanto aumentando (21 dias) como inibindo (28 dias) a densidade de volume ocupada pelas fibras colágenas; enquanto que a dexametasona apresentou efeito contrário. Tais resultados indicaram que no processo inflamatório induzido por agentes flogógenos de intensidade forte (PMD), estimulores da acentuada produção de LTs e PGs, o emprego de antiinflamatórios esteróides e não esteróides foi vantajosa em relação ao fármaco citostátco. / Was studied comparatively the mechanisms of action and the antiinflammatory effect presented by dexamethasone, tenoxican, indomethacin and methotrexate in acute and chronic inflammation induced by agent flogogenous of minim, media and elevated intensity. With the employ of edemogenic test was verified that the effect presented by nonsteroid antiinflammatory (tenoxican and indomethacin), in relation to inhibition of the plasmatic exsudation induced by paracoccidioidin, was more potent than other medicaments tested. Meanwhile, in the inhibition of the acute inflammation caused by carrageenan and dental microbian plaque, methotrexate, dexamethasone and indomethacin were the most potent pharmacs, respectively. The injection of the dental microbian plaque in the air pouch model induced two experimental granulomas susceptive to the antiinflammatory effects presented for the pharmacs tested, which were utilized in the determination of the weights and of the volume density occupied by structures presents in the periods experimental of 7, 14, 21 and 28 days. With relation the inhibition of the differential mid and dry weights, methotrexate and dexamethasone followed by indomethacin and tenoxican were the most effective pharmacs in decrescent order of potency. The histomorphometric studies of the volume density of the granulomatous tissue revealed that indomethacin reduced this structure comparatively to the tenoxican at 14 days. After this experimental period tenoxican presented the most potent anti-inflammatory effect; however, without significant statistical difference to indomethacin. Tenoxican too presented elevated inhibitory effect of the volume density of the region of supurative necrose (similar to dexamethasone) particularly along to first week. NSAIDs also showed in relation the inhibition of volume density of the collagen effect stimulator (21 days) and inhibitor (28 days), while that dexamethasone revealed contrary effect. The accentuate inhibitory effect of the volume density of macrophages presented by NSAIDs was similar to methotrexate, indicating that these medicaments possibly presented anti-mitotic effect to the progenitors myeloid cells of monocytes/macrophages. These results indicated that in the inflammatory process induced by flogogenous of strong intensity, stimulators of increased production of LTS and PGs, the administration of steroids and non-steroids anti-inflammatory was advantageous in relation to methotrexate.
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Avaliação do envolvimento da Galatrox, uma lectina ligante de lactodr isolada da peçonha de Bothrops atrox, no processo inflamatório / Evaluation on the involvement of Galatrox, a lactose binding lectin isolated from Bothrops atrox venom, on the inflammatory processSartim, Marco Aurélio 26 March 2010 (has links)
Lectinas consistem de um vasto grupo de proteínas de origem não-imunológica e de caráter não enzimático, que reconhecem carboidratos de modo específico e não-covalente. Além disso, essas proteínas participam de vários eventos fisiológicos e patológicos, com embriogenese, resposta imunológica, apoptose, diferenciação celular e câncer. Recentemente, foi purificada da peçonha da serpente Bothrops atrox uma lectina do tipo-C, ligante de lactose, com propriedades bioquímicas e funcionais semelhantes à de outras lectinas de serpentes do gênero, denominada Galatrox. O presente projeto teve como objetivos a investigação do envolvimento da Galatrox no processo inflamatório agudo através de experimentos in vivo e in vitro e a produção de anticorpos policlonais anti-Galatrox. A lectina isolada foi obtida através de dois processos cromatográficos, apresentando um valor final de recuperação protéica de 0,3% (mg) em relação ao conteúdo protéico da peçonha bruta. De modo interessante, a Galatrox conjugada ao fluorocromo FITC (8µg/mL) foi capaz de ligar-se a superfície de neutrófilos (91,47%±0,5650). Além disso, está proteína reconheceu a laminina imobilizada, e não a fibronectina, uma glicoproteína da matriz extracelular que contém sequencias de poli-N-acetillactosamina. Avaliando seu potencial inflamatório, Galatrox mostrou-se capaz de induzir a migração de neutrófilos humanos in vitro de forma dose-dependente, tendo máxima atividade quimiotática na concentração de 32µg/mL (41,57±3,42 neutrófilos por campo). Apesar da Galatrox induzir um discreto nível de burst oxidativo em neutrófilos humanos não primados, ela apresentou um efeito três vezes maior quando essas células foram primadas com fMLP. Esta lectina quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos Balb/C provocou migração leucocitária, sendo que na dose (50g/cavidade) e no tempo (4 horas) ótimos ocorreu um influxo celular de 2,05x106±0,101 leucócitos/mL. Ainda, esse infiltrado celular mostrou-se, basicamentre, composto por neutrófilos. Avaliando o perfil de mediadores da resposta inflamatória nesse ensaio in vivo, nos lavados peritoneais foi indicada a liberação máxima de IL-1 e IL-6 após 4 horas de tratamento, mas não foram detectadas a presença de TNF- e óxido nitrico em qualquer tempo de resposta. Células de baços murinos tratados com Galatrox produziram as citocinas pró-inflamatórias TNF- e IFN- e não produziram IL-10 ou NO. A produção de anticorpos policlonais foi realizada por imunização de camundongos e purificação cromatografia de afinidade em colunas com Galatrox imobilizada. A monitoração por ELISA e Western blot comprovaram a produção de anticorpos da classe IgG anti-Galatrox reconhecedores da lectina em sua forma nativa e desnaturada além de suas formas monoméricas e diméricas. Em todos os ensaios biológicos que a Galatrox foi testada na presença da lactose (carboidrato ligante da Galatrox, 20 mM) ocorreram inibições significativas das atividades dessa lectina, indicando que o seu domínio de reconhecimento de carboidrato participa das funções dessa molécula. Com base nos resultados obtidos é possível sugerir que a Galatrox participe da resposta imune inata por mediar eventos biológicos da resposta inflamatória aguda. No entanto, a lectina mostrou-se como um moderado agente pró-inflamatória, quando relacionada à peçonha bruta tendo em vista a fisiopatologia inflamatória do envenenamento. O anticorpo anti-Galatrox poderá ser usado como uma importante ferramenta estudos moleculares e funcionais dessa lectina de serpente. / Lectins are proteins with no enzymatic activity and are able to bind specifically and non-covalently (reversible manner) to carbohydrates. In addition, these proteins are involved in several physiological and pathological events, as embryogenesis, immune response, cancer, and others. Galatrox, a lactose-binding protein, was purified from Bothrops atrox snake venom and partially characterized concerning its biochemical and functional properties. The present work aimed to investigate the involvement of Galatrox in the inflammatory process. In addition, was carry out the production of a polyclonal antibody against Galatrox. This lectin was purified by one chromatographic step with yield around 0.3% (w/w) of total protein from Bothrops atrox crude venom. Interestingly, Galatrox-FITC (8g/mL) binds on human neutrophil surface (91.47% ± 0.5650). Also, this lectin recognized laminin, but not fibronectin, a glycoprotein of the extracellular matrix that contains poly-N-acetyllactosamine sequences. Galatrox was able to induce human neutrophils migration in vitro in a dose-dependent manner, with maximum chemotactic activity at 32g/mL (41.57 ± 3.42 neutrophils per well). Galatrox is more efficient to induce oxidative burst on fMLP primed neutrophils rather than non-primed neutrophils. When injected into mouse peritoneal cavity, Galatrox induced dose and time-dependent leukocyte migration, with optimal effect at 50g/animal after 4 hours of the injection (2.05x106±0.101 leukocytes/mL). Galatrox also induced release of IL-1 and IL-6 up to 12 hours after injection in the peritoneal cavity. However, TNF- and NO were not detected. The treatment of splenocytes with Galatrox in vitro promotes the production of INF- and TNF-. The biological activities of Galatrox were inhibited by lactose (specific sugar, 20 mM), indicating that its recognition carbohydrate domain participates of its functions. The production of polyclonal antibody anti-Galatrox was performed by immunization of mice and purified by affinity chromatography using immobilized Galatrox resin. Gamma-globulins against Galatrox were able to recognize this lectin under native and reduced conditions, using ELISA and Western-blot, respectively. The antibody anti-Galatrox can be use as important tool to further molecular and functional characterization of this snake venom lectin. These results suggest that Galatrox is immunogenic and may participate in the acute inflammatory process, acting as a pro-inflammatory agent through its lectin property.
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Espectroscopia Raman aplicada ao estudo da resposta bioquímica de tecidos a compostos lamelares / Raman spectrocopy applied to the study of biochemical responses of tissues to lamellar compoundsGil, Otávio Mendes 14 August 2015 (has links)
Nesta Dissertação de Mestrado foram estudadas as respostas inflamatórias e de reparo de tecido muscular de ratos a implantes de hidróxidos duplos lamelares (HDL) contendo íon cloreto e sulindaco (fármaco anti-inflamatório não-esteroidal - FAINE) em seu espaço interlamelar. As técnicas empregadas nesta investigação foram as espectroscopias Raman e de absorção no infravermelho (FTIR), a difratometria de raios X (XRD) e a análise histomorfológica dos tecidos corados pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE) (Michalany, 1990)(Michalany, 1990)(Michalany, 1990) e Picrosirius Red (Picro). Simulações do espectro vibracional foram feitas por DFT usando o pacote computacional Gaussian 09 e as análises estatísticas foram feitas usando o pacote Unscrambler X.10.1. Os experimentos in vivo foram realizados fazendo-se a implantação das pastilhas de HDL por microcirurgia entre as camadas do músculo externo oblíquo de ratos (Wistar) e como experimento controle foi feita a separação de tais camadas simulando um implante. Os tecidos foram coletados após 7, 21, 28 e 35 dias de pós operatório, divididos em duas porções (uma para análise histomorfológica e outra para análise por espectroscopia Raman). Inicialmente foram feitos os cálculos teóricos e a caracterização espectroscópica do sulindaco, que possibilitou melhorar sua atribuição vibracional encontrada na literatura. O mesmo ocorreu com as matrizes de HDL, de Zn(II) e de Mg(II), intercaladas com íons cloreto, o que também resultou em um aprimoramento da atribuição que é encontrada na literatura. Os dois HDLs intercalados com sulindaco também foram caracterizados espectroscopicamente e os espectros Raman mostraram grande semelhança com a espécie do fármaco desprotonado. O difratograma obtido dos intercalatos mostra expansão do espaçamento basal (de 7 Å para 26 Å) compatível com a intercalação do sulindaco inclinado em relação ao plano das lamelas. Os espectros Raman do tecido controle mostram alterações mais significativas nas banda amida I e amida III com o tempo de pós-operatório e por PCA foi possivel observar a nítida separação do grupo que apresenta um processo inflamatório agudo (7 dias). Os tecidos expostos à pastilha de HDL intercalada com íons cloreto, mostraram resposta inflamatória reduzida em relação ao tecido controle e as alterações espectrais observadas evidenciam a presença de colágenos, o que indica uma aceitação da pastilha por parte do organismo (biocompatibilidade). As pastilhas também foram analisadas espectroscopicamente e mostraram que houve incorporação de íons CO32- no espaço interlamelar, indicado pela presença da banda Raman em 1060 cm-1 (estiramento simétrico C-O nesse íon), mas não foi possivel determinar se eventuais variações no pH local exerceram efeitos na resposta inflamatória. No caso dos tecidos expostos à pastilha de HDL com sulindaco, a análise por microscopia Raman mostrou que o processo inflamatório foi significativamente reduzido, evidenciando uma ação local do fármaco, além do crescimento de colágenos do tipo III. A pastilha de HDL com sulindaco implantado foi analisada por FT-Raman e a liberação do fármaco foi confirmada. Os resultados de espectroscopia Raman de tecidos foram confirmados pela análise histomorfológica, que mostrou haver de fato um acúmulo de colágeno do tipo III nas regiões próximas às pastilhas implantadas, assim como a formação de invaginações e neovascularização. / In this Master\'s Thesis the inflammatory responses and tissue repair of rat muscles caused by implants of Lamellar Double Hydroxides (LDH) containing chloride ion and sulindac (anti-inflammatory non-steroidal drug - NSAID) in its interlayer space was studied. The techniques used in this research were the Raman spectroscopy and infrared absorption spectroscopy (FTIR), the X-ray diffraction (XRD) and the histomorphological analysis of tissues stained by techniques of Hematoxylin and Eosin (HE) and Picrosirius Red (Picro). Simulations of vibrational spectrum were made by DFT using the computational package Gaussian 09 and the statistical analyzes were performed using the Unscrambler X.10.1 package. In vivo experiments were performed by making the implantation of HDL tablets by microsurgery between the layers of the external oblique muscle of rats (Wistar) and as a control experiment the separation of the layers to simulate an implant was conducted. The tissues were collected after 7, 21, 28 and 35 days postoperatively, divided into two parts (one for histomorphological analysis and the other for analysis by Raman spectroscopy). Initially, theoretical calculations and spectroscopic characterization of sulindac where made, which enabled improving its vibrational assignment in the literature. The same happened for the LDH matrices, Zn(II) and Mg(II), both with chloride ions in the interlamelar space, which also resulted in an improving of it vibrational assignment found in the literature. Both LDH intercalated with sulindac were also characterized spectroscopically and their Raman spectra showed great agreement to the deprotonated species of thedrug. The diffraction pattern obtained from intercalated compounds shows an expansion of the basal spacing (7 Å to 26 Å) compatible with the hypothesis of the sulindac inclined relative to the lamelar plane. The Raman spectra control tissues show the most significant changes in the band amide I and amide III after diferente surgery times and through PCA was possible to observe the clear separation of the group that presenting an acute inflammatory process (at 7 days). Tissues exposed to LDH pellet intercalated with chloride ions showed a reduced inflammatory response relative to control tissue and the spectral changes demonstrate the presence of collagen, which indicates an acceptance of the insert by the body (biocompatibility). The pellets were also analyzed spectroscopically and showed that there was incorporation of CO32- ions in the interlayer space, indicated by the presence of the Raman band at 1060 cm-1 (symmetric stretch C-O of this ion), but it was not possible to determine if changes in local pH affect the inflammatory response. In the case of tissues exposed to LDH tablet with sulindac, analysis by Raman microscopy showed that inflammation was significantly reduced, indicating a local action of the drug, in addition, the collagen type III growth has been observed. The implanted LDH pellet with sulindac was analyzed by FT-Raman and the drug release was confirmed. The results of Raman spectroscopy of tissues were confirmed by histomorphological analysis, which showed that there is indeed an accumulation of collagen type III in the tissue regions near to the implanted pellets, as well as the formation of invagination and neovacularization.
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Perfil sérico de melatonina, citocinas e cortisol em gestantes com pré-eclâmpsia / Serum profile of melatonin, cytokines and cortisol in pregnant women with preeclampsiaSalustiano, Eugenia Maria Assunção 02 July 2014 (has links)
A pré-eclâmpsia (PE) é a maior causa de mortalidade e morbidade materna e perinatal. Sua etiologia permanece desconhecida, o que torna impossível a realização de prevenção primária dessa doença. O entendimento do perfil de substâncias que estão alteradas na PE é de relevância para poder atuar preventivamente. Considerando que vários hormônios envolvidos na resposta imunológica participam da fisiopatologia da PE e que, como demonstrado recentemente, a melatonina tem papel relevante na fisiopatologia da inflamação aguda, nossa hipótese seria que este hormônio poderia também atuar fisiopatologia da PE. OBJETIVOS: avaliar o perfil de citocinas e hormônios no soro de pacientes com PE para estabelecer se o eixo imune-pineal estaria ativado nesta doença. MÉTODOS: Realizamos estudo prospectivo caso-controle, no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, no período de Outubro de 2010 a Outubro de 2013. O grupo experimental foi formado por pacientes com PE pura no momento do diagnóstico (sem medicação anti-hipertensiva inicial por 24h). Gestantes saudáveis e normotensas, pareadas por idade materna, idade gestacional e paridade, foram selecionadas como controles. Citocinas (TNF, IL-8, IL-6, IL-1beta, IL-4, IFN-y , VEGF , IL-10, IL-12p40, IL-17 e IL-2), cortisol, níveis séricos de melatonina pela manhã (08h-11h) e à noite (23h- 01h), assim como os níveis de 6-sulfatoximelatonina (6-SMT) nos diferentes períodos do dia (bl1:12h-18h, bl2:18h-24h,bl3:24h-06h,bl4:06-12h) foram avaliados por MULTIPLEX e ELISA. A diferença entre os grupos foi avaliada por Two-way ANOVA seguido de pós teste de Bonferroni. Foi considerada significativamente diferente quando a probabilidade da hipótese nula foi rejeitada (p < 0,05). A correlação entre parâmetros foi avaliada por regressão linear simples e teste de Pearson. RESULTADOS: De um total de 31 pacientes inicialmente avaliadas, 14 gestantes com PE e 12 controles foram incluídas. As características das pacientes (idade materna, paridade e idade gestacional) foram semelhantes em ambos os grupos (p > 0.05). A concentração plasmática de TNF e IL-8 foi significativamente maior em pacientes com PE do que em controles, e não foi detectada a presença de IL-6, IL-1beta, VEGF, IL-10, IL-17, IL-12p40 em ambos os grupos. A concentração de IL-4 foi similar em ambos os grupos. Níveis séricos de IFNy tenderam a ser maiores em pacientes com PE. A análise dos dados mostrou uma correlação significativamente positiva entre as concentrações plasmáticas de melatonina e TNF; melatonina e IL-8; e TNF e IL-8 no grupo PE durante período diurno. Os níveis diurnos de cortisol foram mais altos em ambos os grupos quando comparados com os noturnos; entretanto pacientes com PE apresentam níveis significativamente reduzidos de cortisol pela manhã quando comparados com o grupo controle. Níveis séricos de melatonina na pré-eclâmpsia quando comparados com controles foram maiores pela manhã, mas não à noite. O grupo controle apresentou um padrão esperado do ritmo dia/noite de melatonina, enquanto a pré-eclâmpsia não apresentou diferença significativa entre dia e noite. O ritmo circadiano de 6-SMT foi constatado em ambos os grupos, porém o valor excretado durante o dia foi maior no grupo PE que no controle. CONCLUSÃO: Nossos resultados sugerem que a PE altera negativamente o eixo hipotálamohipófise- adrenal, induzindo um aumento no TNF, que sinaliza uma resposta inflamatória aguda. Além disso, acredita-se que os altos níveis de IL-8 e TNF possam configurar um sistema de retroalimentação que contribui para o desenvolvimento do quadro e ativação do eixo-imune pineal. Portanto, este efeito pode estar associado com o aumento da melatonina diurna na PE, induzida por TNF em células imunocompetentes ativadas. Diante disso, nossos dados sugerem que o aumento tanto de melatonina como de 6-SMT nas pacientes com PE possa ser de origem extra-pineal / Preeclampsia (PE) is a major cause of maternal and perinatal mortality and morbidity. Since its etiology remains unknown, it is impossible to have a primary prevention of the disease. The understanding of the substance profiles that are altered in PE is important to prevent the disease. Considering that many hormones involved in immune response are involved in the physiopathology of PE and that melatonin has a relevant role in the acute inflammatory process, our hypothesis is that this hormone would also be involved in the physiopathology of PE. OBJECTIVES: To analyze the serum profile of cytokines and hormones in pregnant women with PE in order to evaluate if the immune-pineal axis is activated in this disease. METHODS: A prospective case-control study was conducted at the Clinical Hospital USP between October 2010 and October 2013. Only patients with pure PE at the moment of diagnosis (without anti-hypertensive medication for the initial 24h after diagnosis) were included. Normotensive healthy pregnant women that were matched by maternal age, gestational age and parity were included as controls. Cytokines (IL-6, IL-1b, IL-8, TNF and IFNy), cortisol and serum melatonin levels in the morning (08h-11h) and at night (23h-01h), as well as 6-sulfatoximelatonin (6-SMT) levels in different periods of the day (bl1:12h- 18h, bl2:18h-24h, bl3:24h-06h, bl4:06-12h) were measured by MULTIPLEX and ELISA. Differences between groups were analyzed using two-way ANOVA followed by Bonferronis\'s test. Statistical difference was considered when the null hypothesis was rejected (p < 0.05). Correlations between parameters were analyzed using linear regression and Pearson test. RESULTS: From a total of 31 patients initially evaluated, 14 patients with PE and 12 controls were included. Demographics such as maternal age, parity, gestational age at the dosages, body-mass index were similar in both groups (p > 0.05). TNF and IL-8 levels were higher in the preeclampsia group than controls, while IL-6, IL-1beta, VEGF, IL-10, IL-17 and IL-12p40 were not detected in both groups. IL-4 levels were similar in both groups. There was a tendency of higher levels of IFNy, in patients with PE when compared to controls. Our analysis revealed a positive correlation between melatonin and TNF, melatonin and IL-8, TNF and IL-8 in PE group. Daytime cortisol levels were higher in both groups when compared to nighttime; however, patients with preeclampsia had reduced morning levels of cortisol when compared to the control group. Melatonin serum level was higher at daytime, but not at nighttime, in patients with PE when compared to controls. Controls had the expected day/nighttime rhythm of the melatonin levels, while patients with PE did not have it. In contrast, 6-SMT rhythm was observed in both groups, but with higher daytime levels in patients with PE when compared to controls. CONCLUSION: Our results suggest that PE alters negatively the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, but induces an increase in TNF, which signalizes an acute inflammatory response. Furthermore, it is believed that high levels of IL-8 and TNF can configure a feedback system that contributes to the development of the disease and immune pineal axis activation. Therefore, this effect may be associated with increased daytime melatonin levels in PE, induced by TNF in immunocompetent cells. Thus, our data suggest that the increased melatonin and 6-SMT in patients with PE may be originated from an extra-pineal axis
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Perfil sérico de melatonina, citocinas e cortisol em gestantes com pré-eclâmpsia / Serum profile of melatonin, cytokines and cortisol in pregnant women with preeclampsiaEugenia Maria Assunção Salustiano 02 July 2014 (has links)
A pré-eclâmpsia (PE) é a maior causa de mortalidade e morbidade materna e perinatal. Sua etiologia permanece desconhecida, o que torna impossível a realização de prevenção primária dessa doença. O entendimento do perfil de substâncias que estão alteradas na PE é de relevância para poder atuar preventivamente. Considerando que vários hormônios envolvidos na resposta imunológica participam da fisiopatologia da PE e que, como demonstrado recentemente, a melatonina tem papel relevante na fisiopatologia da inflamação aguda, nossa hipótese seria que este hormônio poderia também atuar fisiopatologia da PE. OBJETIVOS: avaliar o perfil de citocinas e hormônios no soro de pacientes com PE para estabelecer se o eixo imune-pineal estaria ativado nesta doença. MÉTODOS: Realizamos estudo prospectivo caso-controle, no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, no período de Outubro de 2010 a Outubro de 2013. O grupo experimental foi formado por pacientes com PE pura no momento do diagnóstico (sem medicação anti-hipertensiva inicial por 24h). Gestantes saudáveis e normotensas, pareadas por idade materna, idade gestacional e paridade, foram selecionadas como controles. Citocinas (TNF, IL-8, IL-6, IL-1beta, IL-4, IFN-y , VEGF , IL-10, IL-12p40, IL-17 e IL-2), cortisol, níveis séricos de melatonina pela manhã (08h-11h) e à noite (23h- 01h), assim como os níveis de 6-sulfatoximelatonina (6-SMT) nos diferentes períodos do dia (bl1:12h-18h, bl2:18h-24h,bl3:24h-06h,bl4:06-12h) foram avaliados por MULTIPLEX e ELISA. A diferença entre os grupos foi avaliada por Two-way ANOVA seguido de pós teste de Bonferroni. Foi considerada significativamente diferente quando a probabilidade da hipótese nula foi rejeitada (p < 0,05). A correlação entre parâmetros foi avaliada por regressão linear simples e teste de Pearson. RESULTADOS: De um total de 31 pacientes inicialmente avaliadas, 14 gestantes com PE e 12 controles foram incluídas. As características das pacientes (idade materna, paridade e idade gestacional) foram semelhantes em ambos os grupos (p > 0.05). A concentração plasmática de TNF e IL-8 foi significativamente maior em pacientes com PE do que em controles, e não foi detectada a presença de IL-6, IL-1beta, VEGF, IL-10, IL-17, IL-12p40 em ambos os grupos. A concentração de IL-4 foi similar em ambos os grupos. Níveis séricos de IFNy tenderam a ser maiores em pacientes com PE. A análise dos dados mostrou uma correlação significativamente positiva entre as concentrações plasmáticas de melatonina e TNF; melatonina e IL-8; e TNF e IL-8 no grupo PE durante período diurno. Os níveis diurnos de cortisol foram mais altos em ambos os grupos quando comparados com os noturnos; entretanto pacientes com PE apresentam níveis significativamente reduzidos de cortisol pela manhã quando comparados com o grupo controle. Níveis séricos de melatonina na pré-eclâmpsia quando comparados com controles foram maiores pela manhã, mas não à noite. O grupo controle apresentou um padrão esperado do ritmo dia/noite de melatonina, enquanto a pré-eclâmpsia não apresentou diferença significativa entre dia e noite. O ritmo circadiano de 6-SMT foi constatado em ambos os grupos, porém o valor excretado durante o dia foi maior no grupo PE que no controle. CONCLUSÃO: Nossos resultados sugerem que a PE altera negativamente o eixo hipotálamohipófise- adrenal, induzindo um aumento no TNF, que sinaliza uma resposta inflamatória aguda. Além disso, acredita-se que os altos níveis de IL-8 e TNF possam configurar um sistema de retroalimentação que contribui para o desenvolvimento do quadro e ativação do eixo-imune pineal. Portanto, este efeito pode estar associado com o aumento da melatonina diurna na PE, induzida por TNF em células imunocompetentes ativadas. Diante disso, nossos dados sugerem que o aumento tanto de melatonina como de 6-SMT nas pacientes com PE possa ser de origem extra-pineal / Preeclampsia (PE) is a major cause of maternal and perinatal mortality and morbidity. Since its etiology remains unknown, it is impossible to have a primary prevention of the disease. The understanding of the substance profiles that are altered in PE is important to prevent the disease. Considering that many hormones involved in immune response are involved in the physiopathology of PE and that melatonin has a relevant role in the acute inflammatory process, our hypothesis is that this hormone would also be involved in the physiopathology of PE. OBJECTIVES: To analyze the serum profile of cytokines and hormones in pregnant women with PE in order to evaluate if the immune-pineal axis is activated in this disease. METHODS: A prospective case-control study was conducted at the Clinical Hospital USP between October 2010 and October 2013. Only patients with pure PE at the moment of diagnosis (without anti-hypertensive medication for the initial 24h after diagnosis) were included. Normotensive healthy pregnant women that were matched by maternal age, gestational age and parity were included as controls. Cytokines (IL-6, IL-1b, IL-8, TNF and IFNy), cortisol and serum melatonin levels in the morning (08h-11h) and at night (23h-01h), as well as 6-sulfatoximelatonin (6-SMT) levels in different periods of the day (bl1:12h- 18h, bl2:18h-24h, bl3:24h-06h, bl4:06-12h) were measured by MULTIPLEX and ELISA. Differences between groups were analyzed using two-way ANOVA followed by Bonferronis\'s test. Statistical difference was considered when the null hypothesis was rejected (p < 0.05). Correlations between parameters were analyzed using linear regression and Pearson test. RESULTS: From a total of 31 patients initially evaluated, 14 patients with PE and 12 controls were included. Demographics such as maternal age, parity, gestational age at the dosages, body-mass index were similar in both groups (p > 0.05). TNF and IL-8 levels were higher in the preeclampsia group than controls, while IL-6, IL-1beta, VEGF, IL-10, IL-17 and IL-12p40 were not detected in both groups. IL-4 levels were similar in both groups. There was a tendency of higher levels of IFNy, in patients with PE when compared to controls. Our analysis revealed a positive correlation between melatonin and TNF, melatonin and IL-8, TNF and IL-8 in PE group. Daytime cortisol levels were higher in both groups when compared to nighttime; however, patients with preeclampsia had reduced morning levels of cortisol when compared to the control group. Melatonin serum level was higher at daytime, but not at nighttime, in patients with PE when compared to controls. Controls had the expected day/nighttime rhythm of the melatonin levels, while patients with PE did not have it. In contrast, 6-SMT rhythm was observed in both groups, but with higher daytime levels in patients with PE when compared to controls. CONCLUSION: Our results suggest that PE alters negatively the hypothalamic-pituitary-adrenal axis, but induces an increase in TNF, which signalizes an acute inflammatory response. Furthermore, it is believed that high levels of IL-8 and TNF can configure a feedback system that contributes to the development of the disease and immune pineal axis activation. Therefore, this effect may be associated with increased daytime melatonin levels in PE, induced by TNF in immunocompetent cells. Thus, our data suggest that the increased melatonin and 6-SMT in patients with PE may be originated from an extra-pineal axis
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Espectroscopia Raman aplicada ao estudo da resposta bioquímica de tecidos a compostos lamelares / Raman spectrocopy applied to the study of biochemical responses of tissues to lamellar compoundsOtávio Mendes Gil 14 August 2015 (has links)
Nesta Dissertação de Mestrado foram estudadas as respostas inflamatórias e de reparo de tecido muscular de ratos a implantes de hidróxidos duplos lamelares (HDL) contendo íon cloreto e sulindaco (fármaco anti-inflamatório não-esteroidal - FAINE) em seu espaço interlamelar. As técnicas empregadas nesta investigação foram as espectroscopias Raman e de absorção no infravermelho (FTIR), a difratometria de raios X (XRD) e a análise histomorfológica dos tecidos corados pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE) (Michalany, 1990)(Michalany, 1990)(Michalany, 1990) e Picrosirius Red (Picro). Simulações do espectro vibracional foram feitas por DFT usando o pacote computacional Gaussian 09 e as análises estatísticas foram feitas usando o pacote Unscrambler X.10.1. Os experimentos in vivo foram realizados fazendo-se a implantação das pastilhas de HDL por microcirurgia entre as camadas do músculo externo oblíquo de ratos (Wistar) e como experimento controle foi feita a separação de tais camadas simulando um implante. Os tecidos foram coletados após 7, 21, 28 e 35 dias de pós operatório, divididos em duas porções (uma para análise histomorfológica e outra para análise por espectroscopia Raman). Inicialmente foram feitos os cálculos teóricos e a caracterização espectroscópica do sulindaco, que possibilitou melhorar sua atribuição vibracional encontrada na literatura. O mesmo ocorreu com as matrizes de HDL, de Zn(II) e de Mg(II), intercaladas com íons cloreto, o que também resultou em um aprimoramento da atribuição que é encontrada na literatura. Os dois HDLs intercalados com sulindaco também foram caracterizados espectroscopicamente e os espectros Raman mostraram grande semelhança com a espécie do fármaco desprotonado. O difratograma obtido dos intercalatos mostra expansão do espaçamento basal (de 7 Å para 26 Å) compatível com a intercalação do sulindaco inclinado em relação ao plano das lamelas. Os espectros Raman do tecido controle mostram alterações mais significativas nas banda amida I e amida III com o tempo de pós-operatório e por PCA foi possivel observar a nítida separação do grupo que apresenta um processo inflamatório agudo (7 dias). Os tecidos expostos à pastilha de HDL intercalada com íons cloreto, mostraram resposta inflamatória reduzida em relação ao tecido controle e as alterações espectrais observadas evidenciam a presença de colágenos, o que indica uma aceitação da pastilha por parte do organismo (biocompatibilidade). As pastilhas também foram analisadas espectroscopicamente e mostraram que houve incorporação de íons CO32- no espaço interlamelar, indicado pela presença da banda Raman em 1060 cm-1 (estiramento simétrico C-O nesse íon), mas não foi possivel determinar se eventuais variações no pH local exerceram efeitos na resposta inflamatória. No caso dos tecidos expostos à pastilha de HDL com sulindaco, a análise por microscopia Raman mostrou que o processo inflamatório foi significativamente reduzido, evidenciando uma ação local do fármaco, além do crescimento de colágenos do tipo III. A pastilha de HDL com sulindaco implantado foi analisada por FT-Raman e a liberação do fármaco foi confirmada. Os resultados de espectroscopia Raman de tecidos foram confirmados pela análise histomorfológica, que mostrou haver de fato um acúmulo de colágeno do tipo III nas regiões próximas às pastilhas implantadas, assim como a formação de invaginações e neovascularização. / In this Master\'s Thesis the inflammatory responses and tissue repair of rat muscles caused by implants of Lamellar Double Hydroxides (LDH) containing chloride ion and sulindac (anti-inflammatory non-steroidal drug - NSAID) in its interlayer space was studied. The techniques used in this research were the Raman spectroscopy and infrared absorption spectroscopy (FTIR), the X-ray diffraction (XRD) and the histomorphological analysis of tissues stained by techniques of Hematoxylin and Eosin (HE) and Picrosirius Red (Picro). Simulations of vibrational spectrum were made by DFT using the computational package Gaussian 09 and the statistical analyzes were performed using the Unscrambler X.10.1 package. In vivo experiments were performed by making the implantation of HDL tablets by microsurgery between the layers of the external oblique muscle of rats (Wistar) and as a control experiment the separation of the layers to simulate an implant was conducted. The tissues were collected after 7, 21, 28 and 35 days postoperatively, divided into two parts (one for histomorphological analysis and the other for analysis by Raman spectroscopy). Initially, theoretical calculations and spectroscopic characterization of sulindac where made, which enabled improving its vibrational assignment in the literature. The same happened for the LDH matrices, Zn(II) and Mg(II), both with chloride ions in the interlamelar space, which also resulted in an improving of it vibrational assignment found in the literature. Both LDH intercalated with sulindac were also characterized spectroscopically and their Raman spectra showed great agreement to the deprotonated species of thedrug. The diffraction pattern obtained from intercalated compounds shows an expansion of the basal spacing (7 Å to 26 Å) compatible with the hypothesis of the sulindac inclined relative to the lamelar plane. The Raman spectra control tissues show the most significant changes in the band amide I and amide III after diferente surgery times and through PCA was possible to observe the clear separation of the group that presenting an acute inflammatory process (at 7 days). Tissues exposed to LDH pellet intercalated with chloride ions showed a reduced inflammatory response relative to control tissue and the spectral changes demonstrate the presence of collagen, which indicates an acceptance of the insert by the body (biocompatibility). The pellets were also analyzed spectroscopically and showed that there was incorporation of CO32- ions in the interlayer space, indicated by the presence of the Raman band at 1060 cm-1 (symmetric stretch C-O of this ion), but it was not possible to determine if changes in local pH affect the inflammatory response. In the case of tissues exposed to LDH tablet with sulindac, analysis by Raman microscopy showed that inflammation was significantly reduced, indicating a local action of the drug, in addition, the collagen type III growth has been observed. The implanted LDH pellet with sulindac was analyzed by FT-Raman and the drug release was confirmed. The results of Raman spectroscopy of tissues were confirmed by histomorphological analysis, which showed that there is indeed an accumulation of collagen type III in the tissue regions near to the implanted pellets, as well as the formation of invagination and neovacularization.
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Avaliação do envolvimento da Galatrox, uma lectina ligante de lactodr isolada da peçonha de Bothrops atrox, no processo inflamatório / Evaluation on the involvement of Galatrox, a lactose binding lectin isolated from Bothrops atrox venom, on the inflammatory processMarco Aurélio Sartim 26 March 2010 (has links)
Lectinas consistem de um vasto grupo de proteínas de origem não-imunológica e de caráter não enzimático, que reconhecem carboidratos de modo específico e não-covalente. Além disso, essas proteínas participam de vários eventos fisiológicos e patológicos, com embriogenese, resposta imunológica, apoptose, diferenciação celular e câncer. Recentemente, foi purificada da peçonha da serpente Bothrops atrox uma lectina do tipo-C, ligante de lactose, com propriedades bioquímicas e funcionais semelhantes à de outras lectinas de serpentes do gênero, denominada Galatrox. O presente projeto teve como objetivos a investigação do envolvimento da Galatrox no processo inflamatório agudo através de experimentos in vivo e in vitro e a produção de anticorpos policlonais anti-Galatrox. A lectina isolada foi obtida através de dois processos cromatográficos, apresentando um valor final de recuperação protéica de 0,3% (mg) em relação ao conteúdo protéico da peçonha bruta. De modo interessante, a Galatrox conjugada ao fluorocromo FITC (8µg/mL) foi capaz de ligar-se a superfície de neutrófilos (91,47%±0,5650). Além disso, está proteína reconheceu a laminina imobilizada, e não a fibronectina, uma glicoproteína da matriz extracelular que contém sequencias de poli-N-acetillactosamina. Avaliando seu potencial inflamatório, Galatrox mostrou-se capaz de induzir a migração de neutrófilos humanos in vitro de forma dose-dependente, tendo máxima atividade quimiotática na concentração de 32µg/mL (41,57±3,42 neutrófilos por campo). Apesar da Galatrox induzir um discreto nível de burst oxidativo em neutrófilos humanos não primados, ela apresentou um efeito três vezes maior quando essas células foram primadas com fMLP. Esta lectina quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos Balb/C provocou migração leucocitária, sendo que na dose (50g/cavidade) e no tempo (4 horas) ótimos ocorreu um influxo celular de 2,05x106±0,101 leucócitos/mL. Ainda, esse infiltrado celular mostrou-se, basicamentre, composto por neutrófilos. Avaliando o perfil de mediadores da resposta inflamatória nesse ensaio in vivo, nos lavados peritoneais foi indicada a liberação máxima de IL-1 e IL-6 após 4 horas de tratamento, mas não foram detectadas a presença de TNF- e óxido nitrico em qualquer tempo de resposta. Células de baços murinos tratados com Galatrox produziram as citocinas pró-inflamatórias TNF- e IFN- e não produziram IL-10 ou NO. A produção de anticorpos policlonais foi realizada por imunização de camundongos e purificação cromatografia de afinidade em colunas com Galatrox imobilizada. A monitoração por ELISA e Western blot comprovaram a produção de anticorpos da classe IgG anti-Galatrox reconhecedores da lectina em sua forma nativa e desnaturada além de suas formas monoméricas e diméricas. Em todos os ensaios biológicos que a Galatrox foi testada na presença da lactose (carboidrato ligante da Galatrox, 20 mM) ocorreram inibições significativas das atividades dessa lectina, indicando que o seu domínio de reconhecimento de carboidrato participa das funções dessa molécula. Com base nos resultados obtidos é possível sugerir que a Galatrox participe da resposta imune inata por mediar eventos biológicos da resposta inflamatória aguda. No entanto, a lectina mostrou-se como um moderado agente pró-inflamatória, quando relacionada à peçonha bruta tendo em vista a fisiopatologia inflamatória do envenenamento. O anticorpo anti-Galatrox poderá ser usado como uma importante ferramenta estudos moleculares e funcionais dessa lectina de serpente. / Lectins are proteins with no enzymatic activity and are able to bind specifically and non-covalently (reversible manner) to carbohydrates. In addition, these proteins are involved in several physiological and pathological events, as embryogenesis, immune response, cancer, and others. Galatrox, a lactose-binding protein, was purified from Bothrops atrox snake venom and partially characterized concerning its biochemical and functional properties. The present work aimed to investigate the involvement of Galatrox in the inflammatory process. In addition, was carry out the production of a polyclonal antibody against Galatrox. This lectin was purified by one chromatographic step with yield around 0.3% (w/w) of total protein from Bothrops atrox crude venom. Interestingly, Galatrox-FITC (8g/mL) binds on human neutrophil surface (91.47% ± 0.5650). Also, this lectin recognized laminin, but not fibronectin, a glycoprotein of the extracellular matrix that contains poly-N-acetyllactosamine sequences. Galatrox was able to induce human neutrophils migration in vitro in a dose-dependent manner, with maximum chemotactic activity at 32g/mL (41.57 ± 3.42 neutrophils per well). Galatrox is more efficient to induce oxidative burst on fMLP primed neutrophils rather than non-primed neutrophils. When injected into mouse peritoneal cavity, Galatrox induced dose and time-dependent leukocyte migration, with optimal effect at 50g/animal after 4 hours of the injection (2.05x106±0.101 leukocytes/mL). Galatrox also induced release of IL-1 and IL-6 up to 12 hours after injection in the peritoneal cavity. However, TNF- and NO were not detected. The treatment of splenocytes with Galatrox in vitro promotes the production of INF- and TNF-. The biological activities of Galatrox were inhibited by lactose (specific sugar, 20 mM), indicating that its recognition carbohydrate domain participates of its functions. The production of polyclonal antibody anti-Galatrox was performed by immunization of mice and purified by affinity chromatography using immobilized Galatrox resin. Gamma-globulins against Galatrox were able to recognize this lectin under native and reduced conditions, using ELISA and Western-blot, respectively. The antibody anti-Galatrox can be use as important tool to further molecular and functional characterization of this snake venom lectin. These results suggest that Galatrox is immunogenic and may participate in the acute inflammatory process, acting as a pro-inflammatory agent through its lectin property.
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Isolamento, caracterização bioquímica e funcional in vitro e in vivo de uma metaloprotease isolada da peçonha de Bothrops moojeni envolvida no processo de ativação de fatores da cascata de coagulação / Purification, biochemical and functional characterization in vitro and in vivo of a metalloprotease isolated from Bothrops moojeni snake venom involved in the activation of coagulation factorsSartim, Marco Aurélio 18 August 2014 (has links)
Distúrbios de hemostasia são uma das principais manifestações clínicas observadas nos acidentes por serpentes do gênero Bothrops. Tendo em vista a importância da ativação de fatores da cascata de coagulação no desenvolvimento da patologia no envenenamento, o presente trabalho descreve o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de uma metaloprotease capaz de induzir a ativação de fatores de coagulação, a partir da peçonha de Bothrops moojeni. A metaloprotease foi isolada por três etapas cromatográficas utilizando colunas de exclusão molecular (Sephacryl S-200), interação hidrofóbica (Phenyl Sepharose) e troca aniônica (ES 502N). A protease isolada, denominada moojenactivase, é uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 89 kDa e ponto isoelétrico de 4,92, sendo composta por três cadeias com massas de 66; 17 e 14 kDa, ligadas por pontes dissulfeto. A determinação da sequência de aminoácidos por espectrometria de massas evidenciou grande identidade sequencial com outras metaloproteases, indicando a presença dos domínios metaloprotease, desintegrina-like e lectinas-like e classificando-a como uma protease da classe PIIId. Funcionalmente, a moojenactivase foi capaz de induzir a cogulação de plasma humano pela ativação dos fatores II (protrombina) e X da cascata de coagulação, gerando -trombina e fator X ativado, respectivamente. A protease apresentou atividade fibrinogenolítica, especialmente sobre a cadeia da molécula de fibrinogênio, porém não foi capaz de induzir a formação do coágulo de fibrina pela ativação deste. A moojenactivase foi parcialmente inibida quando incubada em condições de pH entre 3,5 e 5,0 e em pH 9,0, além de temperaturas acima de 60ºC, bem como na presença de ions Cu2+, além dos inibidores EDTA, SDS, DTT e soro anti-ofídico crotalico/botrópico. A protease induziu agregação plaquetária e não apresentou atividades fibrinolítica e hemorrágica. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) tratadas com a protease foram capazes de produzir TNF- assim como expressar fator tecidual (Fator III da coagulação) na forma ativa, fazendo com que essas células apresentassem caráter procoagulante. Com o objetivo avaliar os efeitos nos parâmetros hematológicos in vivo, a moojenactivase foi administrada em ratos (3g/Kg) onde foi observado que a protease foi capaz de prolongar o tempo de sangramento dos animais e induzir a diminuição do número de plaquetas sanguíneas, caracterizando um quadro de trombocitopenia. Ainda, o plasma dos animais administrados com a moojenactivase apresentaram valores elevados do tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcialmente ativada, assim como redução na concentração de fibrinogênio. Na análise dos parâmetros da série branca, foi observado aumento leucocitário na circulação, com predominância de neutrófilos até 3h após a administração, indicando a instalação de um quadro inflamatório. Com relação à análise da série vermelha, a moojenactivase não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros estudados. Os resultados obtidos no presente trabalho mostram, pela primeira vez, o isolamento de uma metaloprotease da classe P-IIId da peçonha de Bothrops moojeni capaz de atuar sobre diferentes ii eventos do processo hemostático, sendo essa ação prócoagulante responsável pelo quadro de incoagulabilidade sanguínea em animais. Os dados gerados podem auxiliar no entendimento dos distúrbios de coagulação em pacientes envolvidos em acidentes por serpentes da espécie Bothrops moojeni, levando ao melhor direcionamento na terapia anti-ofídica. Ainda, a função da moojenactivase sobre componentes biológicos credencia a molécula para uma possível aplicação biotecnológica em processos que envolvem o sistema hemostático. / Haemostasis disorders are a major clinical manifestation induced by Bothrops snake envenomations. Considering the relevance of the activation of coagulation factors during the envenomation pathophysiology, the present work describes, for the first time, the isolation and functional and biochemical characterization of a coagulation factor activator metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom. The protease was purified by three chromatographic procedures using size exclusion (Sephacryl S-200), hydrophobic interaction (Phenyl Sepharose) and anion exchange (ES 502N) chromatographies. The isolated protease, named moojenactivase, is a glycoprotein with molecular mass of approximately 89 kDa by SDS-PAGE, and composed of 66 kDa, 17 kDa and 14 kDa disulfide linked chains, with pI of 4,92. The amino acid sequence determination of tryptic peptides from moojenactivase by mass spectrometry presented fragments with high identity to snake venom metalloproteases, confirming the presence of the metalloprotease, disintegrin-like and lectin-like domains, which allowed its classification as a PIIId class snake venom metalloprotease. Regarding its functional properties, the protease was capable to induce human plasma coagulation by inducing activation of coagulation factors II and X, forming-thrombin and factor X activated, respectively. Also, moojenactivase presented fibrinogenolitic activity, by cleaving preferentially -chain of fibrinogen, however was not capable to induce the formation of fibrin clot from fibrinogen. The enzyme stability was assessed and showed that moojenactivase presented a reduced functional activity when preincubated in pH values ranging from 3,5 to 5,0 and at pH 9,0, and in temperature conditions over 60ºC. Cu2+ ions and inhibitors such as EDTA, SDS, DTT and crotalic/bothropic antiophidian serum reduced the protease activity. Moojenactivase induced platelet aggregation, but no fibrinolytic and haemorrhage activities. In order to evaluate the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), cells were treated with the protease and we observed the release of proinflammatory cytokine TNF- and expression of active Tissue Factor (coagulant factor III), inducing a procoagulant state on PBMC. In order to evaluate in vivo haematological effects, the protease (3 g/Kg) was administered in rat (i.v.) and was observed that moojenactivase induced a prolonged bleeding time and reduced platelet counting (indicating a thrombocytopenia state). Moreover, the evaluation of the hemostasis parameters was assessed by the the prothrombin time and activated partial thromboplastin time assays and showed a prolonged clot time on both tests, and also a decrease in fibrinogen plasma levels. The leukogram analysis showed an increase in the circulating leukocyte number up to 3 hours after moojenactivase administration, composed predominantly of neutrophils. However, parameters envolving red cells shows that the protease do not affect. The results obtained in the present work show, for the first time, the isolation of a PIIId class metalloprotease from Bothrops moojeni snake venom involved on the activation of several hemostatic events, inducing a pro coagulant activity and leading to blood unclottable state in experimental animals. These data can assit in understanding coagulation disturbs in iv patients involved in Bothrops moojeni envenomation and leading to a better anti ophidic therapy guidance. Moreover, moojenactivase functional activities accredits this protease as a possible molecular instrument applied on biotechnological prospect related to the hemostasis.
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