Tendo em vista a ocorrência de alterações no sistema imune relacionadas ao hipertireoidismo e à participação do sistema complemento (SC) em processos imunológicos, torna-se importante investigar se os hormônios tireoidianos teriam algum efeito sobre o SC. O SC é composto de uma série de proteínas séricas e de membrana que estão envolvidas em processos da resposta imune. Considerando que os hormônios tireoidianos estão envolvidos em uma série de processos biológicos, e que tanto o hipo- quanto hipertireoidismo podem acarretar alterações importantes nestes processos, os objetivos deste trabalho foram estudar o impacto de níveis séricos elevados de hormônios tireoidianos sobre a atividade do sistema complemento e produção de anticorpos. Foram utilizados ratos machos wistar para o modelo experimental de hipertireoidismo, investigando-se a atividade lítica das vias clássica/lectina e alternativa através de ensaios hemolíticos; os níveis séricos de fator B da via alternativa através do emprego de reagente deficiente de fator B; e a produção de anticorpos anti-hemácia de carneiro (SRBC) empregando ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) e ensaios de plaque forming cell (PFC). O hipertireoidismo induzido não resultou em alterações da atividade lítica das vias clássica/lectina. Entretanto, a elevação dos níveis séricos de hormônios tireoidianos provocou uma redução da atividade lítica de via alternativa, de forma significante em doses de 1, 5, 50 e 100g de levotiroxina/200g de peso animal após 14 dias de tratamento, e com dose a partir de 0,15g de triiodotironina/200g de peso animal, após 7 e 12 dias de tratamento. Os níveis séricos funcionais de fator B foram reduzidos nestas condições. Além disso, ocorre redução da resposta de produção de anticorpos em ratos tratados com T3 e imunizados com SRBC. Estes resultados mostram que níveis elevados de hormônio tireoideano reduzem a capacidade funcional da via alternativa do SC , avaliada pelo desencadeamento da lise em decorrência da interação com hemácias de coelho. Esta redução poderia levar a uma menor geração de fragmentos com atividade nos processos de seqüestro e apresentação do antígeno e interação com as células envolvidas na resposta imune, resultando em títulos menores de anticorpos produzidos. Estudos adicionais são necessários para avaliar estas possibilidades. As observações deste estudo podem auxiliar para o melhor entendimento do impacto biológico das disfunções hormonais sobre a atividade do sistema complemento. / Considering the alterations of the immune system that occur in the hyperthyroidism, and the involvement of the complement system (CS) in immune processes, this work aimed to investigate the effect of high levels of thyroid hormones on the CS and on the antibody production. The CS comprehends a group of serum and membrane proteins which activation leads to the generation of protein fragments or complexes with important biologic functions, such as participation in events of the immune response. Wistar adult male rats treated with thyroid hormones were used as experimental model of hyperthyroidism, to evaluate the lytic activity of classical/lectin and alternative pathways of the CS through hemolytic assays; the serum levels of factor B employing serum deficient of this component (RB); and the production of anti-sheep red blood cells (SRBC) antibodies through enzyme linked immunosorbent (ELISA) and plaque forming cell (PFC) assays. Classic and lectin pathways activity was not affected in the hyperthyroidism. However in this condition the alternative pathway activity was significantly reduced at doses of 1; 5; 50 and 100 g of thyroxine (T4) /200g of animal weight/day after 14 days of treatment, or crescent doses starting from 0,15 g of triiodothyronine (T3) for periods of 7 and 12 days of treatment. The serum levels of factor B were also reduced in these conditions. In addition, there was a reduction of the antibody response in rats treated with T3 and immunized with SRBC. These results show that the functional capacity of alternative pathway is decreased in consequence of high levels of thyroid hormones as evaluated by its lytic potency triggered by the rabbit erythrocytes. This could them lead to a reduced generation of complement fragments active in antigen sequestering and presentation, and on the interaction of cells in the immune response decreasing the antibody production. Additional studies are required to evaluate these possibilities.

Tendo em vista a ocorrência de alterações no sistema imune relacionadas ao hipertireoidismo e à participação do sistema complemento (SC) em processos imunológicos, torna-se importante investigar se os hormônios tireoidianos teriam algum efeito sobre o SC. O SC é composto de uma série de proteínas séricas e de membrana que estão envolvidas em processos da resposta imune. Considerando que os hormônios tireoidianos estão envolvidos em uma série de processos biológicos, e que tanto o hipo- quanto hipertireoidismo podem acarretar alterações importantes nestes processos, os objetivos deste trabalho foram estudar o impacto de níveis séricos elevados de hormônios tireoidianos sobre a atividade do sistema complemento e produção de anticorpos. Foram utilizados ratos machos wistar para o modelo experimental de hipertireoidismo, investigando-se a atividade lítica das vias clássica/lectina e alternativa através de ensaios hemolíticos; os níveis séricos de fator B da via alternativa através do emprego de reagente deficiente de fator B; e a produção de anticorpos anti-hemácia de carneiro (SRBC) empregando ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) e ensaios de plaque forming cell (PFC). O hipertireoidismo induzido não resultou em alterações da atividade lítica das vias clássica/lectina. Entretanto, a elevação dos níveis séricos de hormônios tireoidianos provocou uma redução da atividade lítica de via alternativa, de forma significante em doses de 1, 5, 50 e 100g de levotiroxina/200g de peso animal após 14 dias de tratamento, e com dose a partir de 0,15g de triiodotironina/200g de peso animal, após 7 e 12 dias de tratamento. Os níveis séricos funcionais de fator B foram reduzidos nestas condições. Além disso, ocorre redução da resposta de produção de anticorpos em ratos tratados com T3 e imunizados com SRBC. Estes resultados mostram que níveis elevados de hormônio tireoideano reduzem a capacidade funcional da via alternativa do SC , avaliada pelo desencadeamento da lise em decorrência da interação com hemácias de coelho. Esta redução poderia levar a uma menor geração de fragmentos com atividade nos processos de seqüestro e apresentação do antígeno e interação com as células envolvidas na resposta imune, resultando em títulos menores de anticorpos produzidos. Estudos adicionais são necessários para avaliar estas possibilidades. As observações deste estudo podem auxiliar para o melhor entendimento do impacto biológico das disfunções hormonais sobre a atividade do sistema complemento. / Considering the alterations of the immune system that occur in the hyperthyroidism, and the involvement of the complement system (CS) in immune processes, this work aimed to investigate the effect of high levels of thyroid hormones on the CS and on the antibody production. The CS comprehends a group of serum and membrane proteins which activation leads to the generation of protein fragments or complexes with important biologic functions, such as participation in events of the immune response. Wistar adult male rats treated with thyroid hormones were used as experimental model of hyperthyroidism, to evaluate the lytic activity of classical/lectin and alternative pathways of the CS through hemolytic assays; the serum levels of factor B employing serum deficient of this component (RB); and the production of anti-sheep red blood cells (SRBC) antibodies through enzyme linked immunosorbent (ELISA) and plaque forming cell (PFC) assays. Classic and lectin pathways activity was not affected in the hyperthyroidism. However in this condition the alternative pathway activity was significantly reduced at doses of 1; 5; 50 and 100 g of thyroxine (T4) /200g of animal weight/day after 14 days of treatment, or crescent doses starting from 0,15 g of triiodothyronine (T3) for periods of 7 and 12 days of treatment. The serum levels of factor B were also reduced in these conditions. In addition, there was a reduction of the antibody response in rats treated with T3 and immunized with SRBC. These results show that the functional capacity of alternative pathway is decreased in consequence of high levels of thyroid hormones as evaluated by its lytic potency triggered by the rabbit erythrocytes. This could them lead to a reduced generation of complement fragments active in antigen sequestering and presentation, and on the interaction of cells in the immune response decreasing the antibody production. Additional studies are required to evaluate these possibilities.

A pasteurelose é uma das doenças mais comuns do trato respiratório do coelho em criações comerciais e/ou em biotérios de animais destinados à pesquisa biomédica. A bactéria Pasteurella multocida é o patógeno responsável por uma série de manifestações clínicas em coelhos, incluindo rinite crônica, otite média, pneumonia, infecções no trato genital, formação de abscessos pulmonares e cutâneos, conjuntivite e septicemia hemorrágica. Porém, entre 50 e 70 % dos animais podem incubar o organismo de forma assintomática. Os fatores predisponentes para o desencadeamento dos sinais clínicos incluem acúmulo de amônia no ar (má ventilação), prenhez, aparecimento de doenças concomitantes, distúrbios no ambiente de criação ou na manipulação experimental. A doença está presente no Brasil, ocorrendo surtos com relativa freqüência, no entanto, o diagnóstico é feito com base nos sinais clínicos e necropsia. Dessa forma é difícil precisar a extensão dos prejuízos causados pela pasteurelose à cunicultura. Vacinas comerciais específicas contra a pasteurelose em coelhos não estão disponíveis no mercado. A prevenção, ainda que apresente resultados duvidosos, é realizada utilizando-se antibióticos dissolvidos na água, porém este tipo de tratamento normalmente não protege definitivamente os animais. Uma vez que não existem vacinas disponíveis e o tratamento com antibióticos não estabelece proteção contra a pasteurelose, foram desenvolvidos neste trabalho sistemas carreadores das proteínas antigênicas da membrana da P. multocida. Estes sistemas carreadores são formados por lipossomos, já conhecidos pelo seu potencial como imunoadjuvante, e por microesferas lipídicas, responsáveis por apresentar os antígenos às células apresentadoras de antígenos (APC). Inicialmente, foram obtidas colônias puras da bactéria as quais foram cultivadas em meio de crescimento específico (BHI). Os microrganismos foram isolados, rompidos e as proteínas antigênicas foram detectadas por SDS-PAGE e Western Blotting. Estes resultados mostraram que a maioria das bandas protéicas foi reconhecida pelo anticorpo policlonal contra a P. multocida. Visto que tínhamos um pool de proteínas as quais apresentavam antigenicidade, foi realizada uma solubilização incubando frações de membrana da bactéria com SDS 1 %. Este procedimento resultou em um rendimento de solubilização de 85 %. A obtenção dos proteolipossomos foi realizada pelo método da co-solubilização de lipídio, proteína e detergente. Um bom rendimento de incorporação das proteínas em lipossomos parecer estar relacionada com a metodologia utilizada para a remoção do detergente da mistura lipídio:proteína:detergente durante o processo de co-solubilização, e também com a natureza do fosfolipídio utilizado. Os resultados indicaram que a resina Calbiosorb® foi a mais eficiente para a remoção do SDS e, dentre os diversos fosfolipídios testados o que melhor incorporou as proteínas foi o DPPC, com rendimento de incorporação de 93 % e diâmetro médio de 180 nm. Além disso, o SDS-PAGE dos proteolipossomos mostrou que todas as espécies protéicas presentes no extrato bruto solubilizado foram incorporadas nos lipossomos de DPPC. O Western Blotting mostrou que as proteínas incorporadas nos lipossomos continuavam a ser reconhecidas pelo anticorpo policlonal contra a P. multocida. Para os ensaios de imunização foram separados 3 grupos de coelhos: (i) imunizados com lipossomos; (ii) imunizados com extrato bruto solubilizado (EBS); (iii) imunizados com os proteolipossomos. Após 21 dias de imunização com as preparações descritas, os animais foram infectados com 105 ufc de bactéria. Todos os animais vacinados previamente com lipossomos ou EBS foram a óbito enquanto que os animais vacinados com os sistemas de proteolipossomos apresentaram sobrevida de 95 %. Além disso, um grupo controle vacinado com a bactéria atenuada na presença de hidróxido de alumínio como imunoadjuvante apresentou uma sobrevida de apenas 30 %, indicando que a vacina convencional não apresenta uma proteção satisfatória contra a pasteurelose. O soro dos animais vacinados com lipossomo, EBS e proteolipossomos foram coletados semanalmente antes e após a infecção experimental para a detecção da produção de anticorpos IgG, IgM e IgA, utilizando-se a técnica de ELISA. Como esperado, os animais vacinados com lipossomos não apresentaram estimulação de nenhum dos anticorpos específicos para P. multocida analisados. Os animais imunizados com EBS apresentaram um significativo aumento dos níveis de IgG sérico 7 dias após a imunização os quais se mantiveram constantes durante todo o período experimental. Os níveis de IgG no soro de animais imunizados com os proteolipossomos apresentam um aumento 7 dias após a imunização, porém não se mantiveram até o momento da infecção experimental. Após a infecção experimental, os níveis séricos de IgG nos animais imunizados com proteolipossomos apresentam um aumento significativo, enquanto que para os imunizados com EBS houve manutenção dos níveis antes obtidos. A análise de anticorpos IgM específicos para a P. multocida mostram uma produção significativamente maior destes anticorpos para animais imunizados previamente com proteolipossomos que para os animais imunizados com EBS. Além disso, após a infecção experimental, a produção de IgM nos animais imunizados com proteolipossomos continuou sendo estimulada, o que não foi observado para os animais imunizados com EBS. O sistema de proteolipossomos não produz anticorpos IgA sistêmicos específicos para a bactéria, porém após a infecção experimental foi possível observar o aparecimento gradativo deste anticorpo no lavado nasal dos animais, durante as semanas de observação. Os animais previamente imunizados com proteolipossomos sobreviventes da primeira infecção experimental foram observados durante 140 dias e novamente infectados, com nova carga bacteriana. Após a reinfecção a sobrevida destes animais foi de 100 % indicando que o sistema de proteolipossomos foi capaz de gerar uma memória imunológica. A análise conjunta dos resultados obtidos na detecção de anticorpos indica que a proteção proporcionada pelos proteolipossomos contra a pasteurelose é devida a estimulação de anticorpos IgG e, principalmente, de IgM. O outro sistema de delivery de proteínas antigênicas desenvolvido foi o de microesferas lipídicas. Foram experimentados diferentes protocolos, porém o que mais se adequou as nossas condições foi obtido da união e adaptação de duas metodologias descritas na literatura. Estudos de microscopia eletrônica de varredura mostraram que as microesferas lipídicas são formadas quando é utilizado 3 % (p/v) de PVA na formulação. Além disso, marcamos as proteínas com isoticiocianato de fluoresceína e a microscopia revelou a presença de estruturas esféricas fluorescentes, indicando a encapsulação das proteínas na região lipofílica das microesferas. Estudos sistemáticos variando a concentração de óleo, fosfolipídio, proteínas e PVA na formação das microcapsulas permitiram um rendimento de encapsulação de cerca de 99 %. Portanto, no presente trabalho, estabelecemos metodologias de incorporação das proteínas antigênicas em lipossomos constituídos de DPPC e em microesferas lipídicas. Além disso, os sistemas de proteolipossomos apresentaram uma satisfatória propriedade de proteção dos coelhos contra a pasteurelose (frente à infecção experimental com P. multocida) indicando que o sistema aqui proposto pode ser utilizado como vacina, prevenindo a pasteurelose em criações de coelhos comerciais ou destinados à pesquisa biomédica. / Pasteurellosis is a common disease in the respiratory tract of commercial and/or biomedical rearing of research rabbits. The bacterium Pasteurella multocida is the pathogen responsible for a range of clinical syntomes, including chronic rhinitis (snuffles), otitis media, pneumonia, genital infection, pulmonary and cutaneous abscesses, conjunctivitis and hemorrhagic septicemia. However, between 50 and 70 % of the animals can harbour the microorganism asymptomatically. The factors that cause the clinical syntomes include the ammonium accumulation in the air (foul ventilation), pregnancy, another concomitant disease, disorder in the rabbit production environment and experimental manipulation. Outbreaks of this disease occur in Brazil with relative frequency; however diagnosis is generally based on the clinical signals and necropsy. Therefore, it is difficult to estimate the extent of losses caused by pasteurellosis druing cuniculture. However, specific commercial vaccines against pasteurellosis in rabbits are not available and prevention is through the use of antibiotics in drinking water, even though this type of treatment generally does not protect the animals. Initially, pure bacteria colonies were obtained, which were cultivated in specific growing media (BHI). The microorganisms were isolated, lysed and the antigenic proteins were detected by SDS-PAGE and Western Blotting. These results show that most protein bands were recognized by the policlonal antibody against P. multocida. Since this protein pool presented antigenicity, the protein mixture was solubilized by incubating 0,5 mg/ml of the membrane fraction with SDS 1 % (w/v) under constant agitation for 2 hours. This procedure resulted in a 85 % solubilization yield. The proteoliposomes wew formed using a lipid, protein and detergent co-solubilization method. A good yield of protein incorporation in liposomes seems to be related to the methodology used for the removal of the detergent from the lipid:protein:detergent mixture during the co-solubilization process, as well as the nature of the phospholipid used. The results indicated that the Calbiosorb® resin was the most efficient for SDS removal and, among the various phospholipids tested, DPPC best incorporated the proteins, presenting an incorporation yield of 93% and average proteoliposome diameter of 180 nm. In addition, SDS-PAGE of the proteoliposomes has shown that all the proteic species present in the crude solubilized extract were incorporated in the DPPC liposomes. The Western Blotting has shown that the proteins incorporated in the liposomes continue to be recognized by the policlonal antibody against P. multocida. For the immunization assays, three animal groups were separated: (i) rabbits immunized with liposomes; (ii) rabbits immunized with crude solubilized extract (CSE) and (iii) rabbits immunized with the proteoliposomes. After twenty-one days of immunization with the described preparations, the animals were challenged with 105 ufc of bacteria. All animals previously vaccinated with the liposomes or CSE died while the animals vaccinated with the proteoliposomes systems had 95 % survival after the challenge. Moreover, a control group vaccinated with the attenuated bacteria in the presence of aluminum hydroxide as an immunoadjuvant had only 30% survival, indicating that the conventional vaccine does not protect against pasteurellosis. The serum of animals vaccinated with liposome, CSE and proteoliposomes were collected weekly before and after the experimental infection for the detection of IgG, IgM and IgA antibodies production using ELISA. Animals vaccinated with liposomes did not present stimulation of any of the specific antibodies for the P. multocida analyzed. The animals immunized with CSE presented a significant increase in the IgA serum level seven days after the immunization, but these levels were not maintained until the moment of the experimental infection. After the experimental infection, the serum levels of IgG in rabbits immunized with proteoliposomes showed a significant increase, while for those animals immunized with the CSE the levels were maintained. The analysis of IgM antibodies specific for the P. multocida showed a higher production to animals vaccinated with proteoliposomes than for the animals immunized with CSE. Furthermore, after experimental infection, the production of IgM in animals immunized with proteoliposomes continued to be stimulated, which was not observed for those immunized with EBS. The proteoliposome system does not induce IgA systemic antibodies that were specific for the bacterium. However, after the experimental infections it was possible to observe the gradual appearance of IgA in the nasal lavage of the infected animals on the time course of the experiment. Animals previously immunized with the proteoliposomes which survived the first experimental infection were observed during 140 days and re-infected. After the re-infection, the survival of these animals was 100 %, indicating that the proteoliposome system was able to generate a possible immunological memory. The global analysis of the results obtained in the antibody detection indicates that the protection given by the proteoliposome against pasteurellosis is due to the stimulation of antibodies IgG and mainly of IgM. The other delivery system of antigenic proteins developed during this work is of lipidic microspheres. Different protocols were tried, but the one which was more adequate to our experimental conditions was elaborated from joining and adapting two methodologies described in literature. Scanning electron microscopy studies have shown that the lipidic microspheres are formed when 3 % (w/v) of PVA is used in the formulation. Furthermore, we have marked the proteins with fluorescein isothiocyanate and the microscopy revealed the presence of fluorescent spherical structures which indicated the encapsulation of the proteins in the lipophilic region of the microspheres. Systematic studies varying the concentration of oil, phospholipid, proteins and PVA in the microcapsules formulation has given a yield of encapsulation of 99%. We have established methodologies of incorporation of the antigenic proteins in liposomes constituted of DPPC and lipidic microspheres. Moreover, the proteolipossome systems have shown a satisfying property of protection of rabbits against pasteurellosis in face of the experimental challenge with P. multocida indicating that the system proposed here can be used as a vaccine to prevent the pasteurellosis either in commercial or biomedical research rearing of rabbit.

As Hsp são utilizadas nos tratamentos de autoimunidades e tumores, mas seus mecanismos de ação não foram esclarecidos. Para verificar o efeito da Hsp65 no envelhecimento, analisamos leucócitos em ♀ HIII envelhecidas e, utilizando-se camundongos F1, investigou-se a influência genética na susceptibilidade. ♀HIII velhas apresentaram aumento de linfócitos T ativados e B no baço, e de APC no sangue. A sobrevida em ♀F1H injetadas foi menor e semelhante aos dados obtidos em ♀HIII. A produção de IgG aumentou nos ♂F1 tratados, e a de IgM foi maior nos animais inoculados independente do sexo. Nos híbridos, apenas ♀F1 envelhecidas apresentaram maior porcentagem de linfócitos T CD4 e CD8 ativados e de células CD11c. A Hsp65 induz, in vivo, ativação imune em ♀HIII e ♀F1 velhas; a susceptibilidade parece ser ligada a um efeito do sexo feminino e à influência genética da linhagem HIII. / Hsp are used for the development of autoimmunities and tumors treatments, however, the mechanism of action has not been fully enlightened. To verify the effect of Hsp65 in the aging, we analyzed aged ♀HIII leukocytes; using F1 hybrid mice we studied the genetic influence in Hsp65 susceptibility. Aged ♀HIII presented increase of T and B lymphocytes in the spleen and augmented APC in the blood. The survival of aged ♀F1H was reduced, similarly to aged ♀HIII previous results. The anti-Hsp65 IgG production increased in ♂F1 males, and the IgM was greater in all groups regardless of gender. In hybrid mice, only ♀F1 mice presented increased percentage of CD4 and CD8 activated T cells and of CD11c cells. The Hsp65 induces in vivo, activation of the immune system in aged ♀HIII and ♀F1 mice; the susceptibility to the protein can be given by specific gender effects and the genetic influence of the HIII strain.

A pasteurelose é uma das doenças mais comuns do trato respiratório do coelho em criações comerciais e/ou em biotérios de animais destinados à pesquisa biomédica. A bactéria Pasteurella multocida é o patógeno responsável por uma série de manifestações clínicas em coelhos, incluindo rinite crônica, otite média, pneumonia, infecções no trato genital, formação de abscessos pulmonares e cutâneos, conjuntivite e septicemia hemorrágica. Porém, entre 50 e 70 % dos animais podem incubar o organismo de forma assintomática. Os fatores predisponentes para o desencadeamento dos sinais clínicos incluem acúmulo de amônia no ar (má ventilação), prenhez, aparecimento de doenças concomitantes, distúrbios no ambiente de criação ou na manipulação experimental. A doença está presente no Brasil, ocorrendo surtos com relativa freqüência, no entanto, o diagnóstico é feito com base nos sinais clínicos e necropsia. Dessa forma é difícil precisar a extensão dos prejuízos causados pela pasteurelose à cunicultura. Vacinas comerciais específicas contra a pasteurelose em coelhos não estão disponíveis no mercado. A prevenção, ainda que apresente resultados duvidosos, é realizada utilizando-se antibióticos dissolvidos na água, porém este tipo de tratamento normalmente não protege definitivamente os animais. Uma vez que não existem vacinas disponíveis e o tratamento com antibióticos não estabelece proteção contra a pasteurelose, foram desenvolvidos neste trabalho sistemas carreadores das proteínas antigênicas da membrana da P. multocida. Estes sistemas carreadores são formados por lipossomos, já conhecidos pelo seu potencial como imunoadjuvante, e por microesferas lipídicas, responsáveis por apresentar os antígenos às células apresentadoras de antígenos (APC). Inicialmente, foram obtidas colônias puras da bactéria as quais foram cultivadas em meio de crescimento específico (BHI). Os microrganismos foram isolados, rompidos e as proteínas antigênicas foram detectadas por SDS-PAGE e Western Blotting. Estes resultados mostraram que a maioria das bandas protéicas foi reconhecida pelo anticorpo policlonal contra a P. multocida. Visto que tínhamos um pool de proteínas as quais apresentavam antigenicidade, foi realizada uma solubilização incubando frações de membrana da bactéria com SDS 1 %. Este procedimento resultou em um rendimento de solubilização de 85 %. A obtenção dos proteolipossomos foi realizada pelo método da co-solubilização de lipídio, proteína e detergente. Um bom rendimento de incorporação das proteínas em lipossomos parecer estar relacionada com a metodologia utilizada para a remoção do detergente da mistura lipídio:proteína:detergente durante o processo de co-solubilização, e também com a natureza do fosfolipídio utilizado. Os resultados indicaram que a resina Calbiosorb® foi a mais eficiente para a remoção do SDS e, dentre os diversos fosfolipídios testados o que melhor incorporou as proteínas foi o DPPC, com rendimento de incorporação de 93 % e diâmetro médio de 180 nm. Além disso, o SDS-PAGE dos proteolipossomos mostrou que todas as espécies protéicas presentes no extrato bruto solubilizado foram incorporadas nos lipossomos de DPPC. O Western Blotting mostrou que as proteínas incorporadas nos lipossomos continuavam a ser reconhecidas pelo anticorpo policlonal contra a P. multocida. Para os ensaios de imunização foram separados 3 grupos de coelhos: (i) imunizados com lipossomos; (ii) imunizados com extrato bruto solubilizado (EBS); (iii) imunizados com os proteolipossomos. Após 21 dias de imunização com as preparações descritas, os animais foram infectados com 105 ufc de bactéria. Todos os animais vacinados previamente com lipossomos ou EBS foram a óbito enquanto que os animais vacinados com os sistemas de proteolipossomos apresentaram sobrevida de 95 %. Além disso, um grupo controle vacinado com a bactéria atenuada na presença de hidróxido de alumínio como imunoadjuvante apresentou uma sobrevida de apenas 30 %, indicando que a vacina convencional não apresenta uma proteção satisfatória contra a pasteurelose. O soro dos animais vacinados com lipossomo, EBS e proteolipossomos foram coletados semanalmente antes e após a infecção experimental para a detecção da produção de anticorpos IgG, IgM e IgA, utilizando-se a técnica de ELISA. Como esperado, os animais vacinados com lipossomos não apresentaram estimulação de nenhum dos anticorpos específicos para P. multocida analisados. Os animais imunizados com EBS apresentaram um significativo aumento dos níveis de IgG sérico 7 dias após a imunização os quais se mantiveram constantes durante todo o período experimental. Os níveis de IgG no soro de animais imunizados com os proteolipossomos apresentam um aumento 7 dias após a imunização, porém não se mantiveram até o momento da infecção experimental. Após a infecção experimental, os níveis séricos de IgG nos animais imunizados com proteolipossomos apresentam um aumento significativo, enquanto que para os imunizados com EBS houve manutenção dos níveis antes obtidos. A análise de anticorpos IgM específicos para a P. multocida mostram uma produção significativamente maior destes anticorpos para animais imunizados previamente com proteolipossomos que para os animais imunizados com EBS. Além disso, após a infecção experimental, a produção de IgM nos animais imunizados com proteolipossomos continuou sendo estimulada, o que não foi observado para os animais imunizados com EBS. O sistema de proteolipossomos não produz anticorpos IgA sistêmicos específicos para a bactéria, porém após a infecção experimental foi possível observar o aparecimento gradativo deste anticorpo no lavado nasal dos animais, durante as semanas de observação. Os animais previamente imunizados com proteolipossomos sobreviventes da primeira infecção experimental foram observados durante 140 dias e novamente infectados, com nova carga bacteriana. Após a reinfecção a sobrevida destes animais foi de 100 % indicando que o sistema de proteolipossomos foi capaz de gerar uma memória imunológica. A análise conjunta dos resultados obtidos na detecção de anticorpos indica que a proteção proporcionada pelos proteolipossomos contra a pasteurelose é devida a estimulação de anticorpos IgG e, principalmente, de IgM. O outro sistema de delivery de proteínas antigênicas desenvolvido foi o de microesferas lipídicas. Foram experimentados diferentes protocolos, porém o que mais se adequou as nossas condições foi obtido da união e adaptação de duas metodologias descritas na literatura. Estudos de microscopia eletrônica de varredura mostraram que as microesferas lipídicas são formadas quando é utilizado 3 % (p/v) de PVA na formulação. Além disso, marcamos as proteínas com isoticiocianato de fluoresceína e a microscopia revelou a presença de estruturas esféricas fluorescentes, indicando a encapsulação das proteínas na região lipofílica das microesferas. Estudos sistemáticos variando a concentração de óleo, fosfolipídio, proteínas e PVA na formação das microcapsulas permitiram um rendimento de encapsulação de cerca de 99 %. Portanto, no presente trabalho, estabelecemos metodologias de incorporação das proteínas antigênicas em lipossomos constituídos de DPPC e em microesferas lipídicas. Além disso, os sistemas de proteolipossomos apresentaram uma satisfatória propriedade de proteção dos coelhos contra a pasteurelose (frente à infecção experimental com P. multocida) indicando que o sistema aqui proposto pode ser utilizado como vacina, prevenindo a pasteurelose em criações de coelhos comerciais ou destinados à pesquisa biomédica. / Pasteurellosis is a common disease in the respiratory tract of commercial and/or biomedical rearing of research rabbits. The bacterium Pasteurella multocida is the pathogen responsible for a range of clinical syntomes, including chronic rhinitis (snuffles), otitis media, pneumonia, genital infection, pulmonary and cutaneous abscesses, conjunctivitis and hemorrhagic septicemia. However, between 50 and 70 % of the animals can harbour the microorganism asymptomatically. The factors that cause the clinical syntomes include the ammonium accumulation in the air (foul ventilation), pregnancy, another concomitant disease, disorder in the rabbit production environment and experimental manipulation. Outbreaks of this disease occur in Brazil with relative frequency; however diagnosis is generally based on the clinical signals and necropsy. Therefore, it is difficult to estimate the extent of losses caused by pasteurellosis druing cuniculture. However, specific commercial vaccines against pasteurellosis in rabbits are not available and prevention is through the use of antibiotics in drinking water, even though this type of treatment generally does not protect the animals. Initially, pure bacteria colonies were obtained, which were cultivated in specific growing media (BHI). The microorganisms were isolated, lysed and the antigenic proteins were detected by SDS-PAGE and Western Blotting. These results show that most protein bands were recognized by the policlonal antibody against P. multocida. Since this protein pool presented antigenicity, the protein mixture was solubilized by incubating 0,5 mg/ml of the membrane fraction with SDS 1 % (w/v) under constant agitation for 2 hours. This procedure resulted in a 85 % solubilization yield. The proteoliposomes wew formed using a lipid, protein and detergent co-solubilization method. A good yield of protein incorporation in liposomes seems to be related to the methodology used for the removal of the detergent from the lipid:protein:detergent mixture during the co-solubilization process, as well as the nature of the phospholipid used. The results indicated that the Calbiosorb® resin was the most efficient for SDS removal and, among the various phospholipids tested, DPPC best incorporated the proteins, presenting an incorporation yield of 93% and average proteoliposome diameter of 180 nm. In addition, SDS-PAGE of the proteoliposomes has shown that all the proteic species present in the crude solubilized extract were incorporated in the DPPC liposomes. The Western Blotting has shown that the proteins incorporated in the liposomes continue to be recognized by the policlonal antibody against P. multocida. For the immunization assays, three animal groups were separated: (i) rabbits immunized with liposomes; (ii) rabbits immunized with crude solubilized extract (CSE) and (iii) rabbits immunized with the proteoliposomes. After twenty-one days of immunization with the described preparations, the animals were challenged with 105 ufc of bacteria. All animals previously vaccinated with the liposomes or CSE died while the animals vaccinated with the proteoliposomes systems had 95 % survival after the challenge. Moreover, a control group vaccinated with the attenuated bacteria in the presence of aluminum hydroxide as an immunoadjuvant had only 30% survival, indicating that the conventional vaccine does not protect against pasteurellosis. The serum of animals vaccinated with liposome, CSE and proteoliposomes were collected weekly before and after the experimental infection for the detection of IgG, IgM and IgA antibodies production using ELISA. Animals vaccinated with liposomes did not present stimulation of any of the specific antibodies for the P. multocida analyzed. The animals immunized with CSE presented a significant increase in the IgA serum level seven days after the immunization, but these levels were not maintained until the moment of the experimental infection. After the experimental infection, the serum levels of IgG in rabbits immunized with proteoliposomes showed a significant increase, while for those animals immunized with the CSE the levels were maintained. The analysis of IgM antibodies specific for the P. multocida showed a higher production to animals vaccinated with proteoliposomes than for the animals immunized with CSE. Furthermore, after experimental infection, the production of IgM in animals immunized with proteoliposomes continued to be stimulated, which was not observed for those immunized with EBS. The proteoliposome system does not induce IgA systemic antibodies that were specific for the bacterium. However, after the experimental infections it was possible to observe the gradual appearance of IgA in the nasal lavage of the infected animals on the time course of the experiment. Animals previously immunized with the proteoliposomes which survived the first experimental infection were observed during 140 days and re-infected. After the re-infection, the survival of these animals was 100 %, indicating that the proteoliposome system was able to generate a possible immunological memory. The global analysis of the results obtained in the antibody detection indicates that the protection given by the proteoliposome against pasteurellosis is due to the stimulation of antibodies IgG and mainly of IgM. The other delivery system of antigenic proteins developed during this work is of lipidic microspheres. Different protocols were tried, but the one which was more adequate to our experimental conditions was elaborated from joining and adapting two methodologies described in literature. Scanning electron microscopy studies have shown that the lipidic microspheres are formed when 3 % (w/v) of PVA is used in the formulation. Furthermore, we have marked the proteins with fluorescein isothiocyanate and the microscopy revealed the presence of fluorescent spherical structures which indicated the encapsulation of the proteins in the lipophilic region of the microspheres. Systematic studies varying the concentration of oil, phospholipid, proteins and PVA in the microcapsules formulation has given a yield of encapsulation of 99%. We have established methodologies of incorporation of the antigenic proteins in liposomes constituted of DPPC and lipidic microspheres. Moreover, the proteolipossome systems have shown a satisfying property of protection of rabbits against pasteurellosis in face of the experimental challenge with P. multocida indicating that the system proposed here can be used as a vaccine to prevent the pasteurellosis either in commercial or biomedical research rearing of rabbit.

As Hsp são utilizadas nos tratamentos de autoimunidades e tumores, mas seus mecanismos de ação não foram esclarecidos. Para verificar o efeito da Hsp65 no envelhecimento, analisamos leucócitos em ♀ HIII envelhecidas e, utilizando-se camundongos F1, investigou-se a influência genética na susceptibilidade. ♀HIII velhas apresentaram aumento de linfócitos T ativados e B no baço, e de APC no sangue. A sobrevida em ♀F1H injetadas foi menor e semelhante aos dados obtidos em ♀HIII. A produção de IgG aumentou nos ♂F1 tratados, e a de IgM foi maior nos animais inoculados independente do sexo. Nos híbridos, apenas ♀F1 envelhecidas apresentaram maior porcentagem de linfócitos T CD4 e CD8 ativados e de células CD11c. A Hsp65 induz, in vivo, ativação imune em ♀HIII e ♀F1 velhas; a susceptibilidade parece ser ligada a um efeito do sexo feminino e à influência genética da linhagem HIII. / Hsp are used for the development of autoimmunities and tumors treatments, however, the mechanism of action has not been fully enlightened. To verify the effect of Hsp65 in the aging, we analyzed aged ♀HIII leukocytes; using F1 hybrid mice we studied the genetic influence in Hsp65 susceptibility. Aged ♀HIII presented increase of T and B lymphocytes in the spleen and augmented APC in the blood. The survival of aged ♀F1H was reduced, similarly to aged ♀HIII previous results. The anti-Hsp65 IgG production increased in ♂F1 males, and the IgM was greater in all groups regardless of gender. In hybrid mice, only ♀F1 mice presented increased percentage of CD4 and CD8 activated T cells and of CD11c cells. The Hsp65 induces in vivo, activation of the immune system in aged ♀HIII and ♀F1 mice; the susceptibility to the protein can be given by specific gender effects and the genetic influence of the HIII strain.

Introdução: A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) faz parte de um grupo de imunodeficiências primárias na qual os pacientes apresentam defeitos na maturação e diferenciação dos linfócitos B (LB), resultando em distúrbios funcionais além de alterações na distribuição de seus subtipos. Consequentemente, estes pacientes apresentam hipogamaglobulinemia, susceptibilidade a infecções e ausência de produção de anticorpos a antígenos específicos. Na tentativa de reduzir os episódios de infecções recorrentes, alguns trabalhos têm recomendado a vacinação com patógenos mortos ou subunidades e em trabalho anterior demonstramos a eficácia clínica da vacinação de pacientes com ICV, porém, a experiência com a administração de vacinas em imunocomprometidos é limitada. Objetivos: Avaliar a cinética da distribuição das subpopulações de linfócitos B antes e após a vacinação com antígenos proteicos e polissacarídicos em pacientes com ICV acompanhados no Ambulatório de Imunodeficiências Primárias do Hospital das Clínicas, FMUSP, além da produção de anticorpos específicos aos antígenos vacinais. Pacientes e Métodos: Um grupo de 35 pacientes com ICV e 16 controles foram vacinados contra Influenza, H1N1 e S. pneumoniae. Após as coletas nos tempos pré e pós 1, 3 e 6 meses foram realizados a separação de PBMC e cultura de linfócitos com lisado viral e hemaglutinina de Influenza, além da citometria de fluxo para identificação das subpopulações de LB naive, zona marginal (MZB), memória com troca de isotipo (SMB) e plasmoblastos (PBL). Foram dosados os anticorpos específicos e no grupo dos pacientes foi aplicado um score de sintomas antes e após a imunização. Resultados: Apesar da redução significativa na pontuação do score de sintomas, a maioria dos pacientes não produziu anticorpos específicos para Influenza, H1N1 e S. pneumoniae. A análise da cinética das subpopulações de LB revelou que em indivíduos saudáveis, a resposta contra Influenza apresentou duração de 6 meses, observada por meio da redução da subpopulação naive e aumento gradual da frequência de SMB a partir do primeiro mês. Observamos também redução da população de memória por volta do 3º mês, com aumento da população de PBL que permaneceu elevada até o 6º mês. Por outro lado, a despeito de os pacientes apresentarem aumento de SMB no primeiro mês após a vacinação, sua frequência foi inferior ao observado nos controles, decaindo ao terceiro mês. A população de PBL apresentou aumento precoce no primeiro mês após a vacinação, também muito menor do que observado nos controles, não sendo mantido no terceiro mês. Ainda, observamos uma correlação entre o aumento da expressão destas duas subpopulações no primeiro mês. Apenas a população de MZB apresentou aumento significativo no terceiro mês nos pacientes quando comparados aos controles. Ao dividirmos os pacientes de acordo com a expressão de SMB e PBL após 1 mês da administração das vacinas, observamos que os pacientes que apresentaram aumento na expressão de células B de memória foram os que exibiram uma melhora clínica mais expressiva, soroconverteram e desenvolveram soroproteção para H1N1.Conclusões: Apesar de não apresentarem eficaz diferenciação em células de memória e efetoras, resultando na resposta precoce e de curta duração, observamos que os pacientes foram capazes de reconhecer e responder às vacinas. Além disso, a elevada expressão de MZB no terceiro mês após a vacinação pode sugerir a atuação desta subpopulação na apresentação para os LT. Estes achados reforçam a necessidade de uma melhor compreensão da ativação do sistema imune em pacientes com ICV, para uma adequada subdivisão de acordo com o perfil de resposta após a vacinação / Introduction: Common Variable Immunodeficiency (CVID) is a primary antibody deficiency characterized by defects in B lymphocyte maturation, resulting in disturbed differentiation, distribution and functional variations on its subtypes. As a result , CVID patients have hypogammaglobulinemia and poor antibody response to specific antigens with increased susceptibility to infections. In an effort to minimize the recurrent episodes of infections, some studies have recommended immunization with inactivated pathogens or subunits and in a former study we have shown the clinical improvement determined by immunization in CVID patients, but the experience with vaccines\' administration to immunodeficient patients is limited. Objectives: To evaluate the changes in distribution of B cell subtypes before and after vaccination of CVID patients followed at the Division of Clinical Immunology and Allergy of University of São Paulo Medical School with protein and polysaccharide antigens, as well as specific antibody production . Methods: A group of 35 CVID patients and 16 controls were vaccinated against Influenza, H1N1 and S. pneumoniae vaccines. Blood samples were collected before and 1, 3 and 6 months post vaccination. PBMCs were stimulated with Influenza viral lysate and hemagglutinin peptide. Flow cytometry was performed to identify naïve B cells, marginal zone (MZB), switched memory B cells (SMB) and plasmablasts (PBL). Specific antibody production was measured and a symptoms score was applied for clinical evaluation before and after immunization. Results: In spite of the significant reduction in symptoms score after vaccination, most patients didn\'t produce specific antibodies to Influenza, H1N1 and S. pneumoniae. The analyzes of B cell subtypes changes in healthy individuals upon in vitro Influenza stimulation showed that the response endured up to 6 months post immunization. We observed a reduction in naïve B cell frequency while gradual increase in SMB frequency occurred already at 1 month after vaccination. Moreover, as the memory cell population declined, PBL population increased at the third month post vaccination until the sixth month. Although patients had an increase of SMB on the first month after vaccination, it was lower than that observed in controls, decreasing by the third month post vaccination. Plasmablast frequency had an early increase on the first month, also much lower than the observed in controls decreasing by the third month. In addition, we observed a correlation between the increased expression of SMB and PBL on the first month post vaccination. In patients, only MZB subtype presented a significant increase on the third month when compared to controls. We divided the patients according SMB and PBL expression after 1 month post vaccination and we observed that patients who were able to produce memory B cells showed a better clinical improvement, developed H1N1 seroconversion and seroprotection. Conclusion: Despite the defect on differentiation into memory and effector B cells resulting in early response with lowduration, we observed that patients were able to recognize and respond to vaccines. In addition, the over expression of MZB on the third month after vaccination may suggest the role of this subpopulation as an antigen presenting cell for T cells. These findings reinforce the need of a better understanding of immune system activation and response in CVID patients to propose a division according to vaccine (antigen) responders and non responders

Introdução: O vírus da influenza causa doença generalizada e pode ser fatal. A vacinação diminuiu a morbimortalidade. A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) é uma imunodeficiência primária caracterizada por defeitos na maturação e diferenciação dos linfócitos B (LB) resultando em hipogamaglobulinemia, ausência de resposta aos antígenos específicos e infecções de repetição. A maior susceptibilidade a infecções reforça o benefício da vacinação em pacientes com imunodeficiências. O questionamento sobre a vacinação neste grupo de indivíduos se deve a eficácia, uma vez que na ICV as medidas sorológicas não se mostraram úteis como correlatos de proteção. Estudos recentes do nosso grupo observaram a melhora clínica em relação ao número de infecções de vias aéreas em pacientes com ICV após a vacinação contra influenza, porém sem produção de anticorpos específicos em níveis protetores. Objetivos: Diante das observações apontadas, este trabalho tem o objetivo de investigar o envolvimento das subpopulações de linfócitos T naive e de memória, CD4+ e CD8+, na proteção induzida pela vacina influenza em pacientes com ICV. Casuística e Métodos: Foram selecionados 16 pacientes ICV e 16 controles saudáveis. Amostras de sangue foram colhidas antes e após a administração das vacinas contra A H1N1/H3N2 e B (cepas: A/Califórnia/7/2009, A/Victoria/361/2011, B/Brisbane/60/2008). A resposta específica de células T de memória foi avaliada nas condições sem estímulo pré e pós-vacina nos períodos de 1 mês, 3 meses e 6 meses, além da realização de culturas de linfócitos com a hemaglutinina de influenza (HA) e lisado viral, nos mesmos tempos. As subpopulações de linfócitos T naive e de memória foram avaliados a partir da marcação CD3+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e CCR7+ detectados por citometria de fluxo. Esta marcação nos permitiu identificar quatro subtipos de linfócitos: LT naive (CD45+RA+CCR7+); LT de memória efetora (TEM, CD45+RA-CCR7-); LT de memória central (TCM, CD45+RA-CCR7+) e LT de memória terminalmente diferenciado (TEMRA, CD45+RA+CCR7-). A avaliação funcional dos linfócitos T após estímulo foi realizada através da marcação intracelular de IFN-Gama e IL-2. Resultados: Este estudo demonstrou uma redução na frequência de linfócitos T CD4 +, linfócitos CD4 + TCM e CD8 + TCM em pacientes com ICV e controles saudáveis após a vacina contra influenza. Observamos uma frequência aumentada de linfócitos TEM CD4 + e CD8 + em controles saudáveis e aumento da frequência de linfócitos CD8 + TEMRA em pacientes com ICV, bem como em controles saudáveis. A vacina contra influenza foi capaz de induzir a proliferação de subpopulações de linfócitos T que pode ser caracterizada pela hipótese de diferenciação linear de células sugerida por alguns autores (naive - TCM - TEM / TEMRA). Os peptídeos de HA e o lisado viral foram capazes de estimular subpopulações de linfócitos T de memória específica em pacientes com ICV e controles saudáveis, dependendo do período e das condições dos estímulos. Os resultados mostraram que nos linfócitos T CD4+, a vacinação induziu uma resposta predominantemente IL-2+, enquanto no compartimento T CD8+ observamos uma resposta polifuncional com a produção de IL-2+ e IFN-Gama+. Conclusões: Este é o primeiro estudo a avaliar as subpopulações de linfócitos T de memória em pacientes com DCV vacinados contra Influenza A (H3N2) / B e Influenza A H1N1. Nossos resultados mostraram mudanças no padrão de distribuição das subpopulações de linfócitos T naive, TCM, TEM e TEMRA e na produção de IL-2+ e IFN-Gama+ após a vacinação contra influenza, dados que sugerem e possivelmente justificam a resposta clínica e celular protetora observada em pacientes com ICV / Introduction: Influenza viruses infect humans causing widespread, sometimes fatal, disease. Common Variable Immunodeficiency (CVID) is a primary immunodeficiency characterized by defects in B lymphocyte maturation and differentiation resulting in hypogammaglobulinemia, failure to produce specific antigens and recurrent infections. The increased susceptibility to infections reinforces the benefit of vaccination in patients with immunodeficiencies. The major discussion regarding vaccination of CVID patients is the efficacy once these patients do not produce antibodies which are used as correlates of protection. Recent studies from our group showed reduced respiratory infection rates in influenza vaccinated CVID patients demonstrating a clinical response however with no production of specific antibodies in protective levels. Objective: Considering the above observations, this study has the objective of investigating the involvement of naïve and memory T lymphocytes subpopulations, CD4+ and CD8+, in the protection of influenza vaccination CVID in patients. Patients and Methods: Sixteen CVID patients and 16 healthy controls were selected for this study. Blood samples collected before and after administration of the H1N1 / H3N2 and B vaccines (strains: A / California / 7/2009, A / Victoria / 361/2011 B / Brisbane / 60/2008). Specific memory T cell response was evaluated pre and post vaccination with influenza (1 month, 3 months and 6 months). Besides characterization of lymphocyte subpopulations in PBMCs, cell culture with an influenza hemagglutinin (HA) and viral lysate were also realized. T lymphocytes subpopulations characterized by CD3+, CD4+, CD8+, CD45RA+ and CCR7+ were identified by flow cytometry. These antibodies permitted to identify four lymphocyte subtypes: naïve T cells (CD45RA+CCR7+); effective memory T cells (TEM, CD45RA-CCR7-); Central memory (TCM, CD45RACCR7+) and terminally differentiated memory T (TEMRA, CD45RA+CCR7-). Functional evaluation of lymphocytes was performed through intracellular labelling of IFN-Gama and IL-2. Results: This study showed the reductions of naïve CD4+ T cells, CD4+TCM and CD8+TCM cells in CVID patients and healthy controls after influenza vaccine. We observed an increased frequency of CD4+TEM and CD8+TEM lymphocytes in healthy controls, and increased frequency of CD8+TEMRA lymphocytes in CVID patients and healthy controls. Influenza vaccine was able to induce the proliferation of T lymphocyte subpopulations that can characterize the linear cell differentiation suggested by the authors (Naïve - TCM - TEM / TEMRA). Regarding cytokine production, there was an increase in IL-2+ production by CD4+T and CD8+T cells and an increase of IFN-Gama+ by CD8+T cells in CVID and control patients, indicating a polyfunctional cytokine response. Conclusions: To our knowledge, this is the first study that evaluated memory T lymphocyte subpopulations of CVID patients vaccinated against Influenza A (H3N2) / B and Influenza A H1N1. We show changes in the pattern of T lymphocyte subpopulations: naïve, TCM, TEM and TEMRA and IL-2+ and IFN-Gama+ production after influenza vaccination that may suggest and possibly explain the protective cellular and clinical response observed in CVID patients

Introdução: A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) faz parte de um grupo de imunodeficiências primárias na qual os pacientes apresentam defeitos na maturação e diferenciação dos linfócitos B (LB), resultando em distúrbios funcionais além de alterações na distribuição de seus subtipos. Consequentemente, estes pacientes apresentam hipogamaglobulinemia, susceptibilidade a infecções e ausência de produção de anticorpos a antígenos específicos. Na tentativa de reduzir os episódios de infecções recorrentes, alguns trabalhos têm recomendado a vacinação com patógenos mortos ou subunidades e em trabalho anterior demonstramos a eficácia clínica da vacinação de pacientes com ICV, porém, a experiência com a administração de vacinas em imunocomprometidos é limitada. Objetivos: Avaliar a cinética da distribuição das subpopulações de linfócitos B antes e após a vacinação com antígenos proteicos e polissacarídicos em pacientes com ICV acompanhados no Ambulatório de Imunodeficiências Primárias do Hospital das Clínicas, FMUSP, além da produção de anticorpos específicos aos antígenos vacinais. Pacientes e Métodos: Um grupo de 35 pacientes com ICV e 16 controles foram vacinados contra Influenza, H1N1 e S. pneumoniae. Após as coletas nos tempos pré e pós 1, 3 e 6 meses foram realizados a separação de PBMC e cultura de linfócitos com lisado viral e hemaglutinina de Influenza, além da citometria de fluxo para identificação das subpopulações de LB naive, zona marginal (MZB), memória com troca de isotipo (SMB) e plasmoblastos (PBL). Foram dosados os anticorpos específicos e no grupo dos pacientes foi aplicado um score de sintomas antes e após a imunização. Resultados: Apesar da redução significativa na pontuação do score de sintomas, a maioria dos pacientes não produziu anticorpos específicos para Influenza, H1N1 e S. pneumoniae. A análise da cinética das subpopulações de LB revelou que em indivíduos saudáveis, a resposta contra Influenza apresentou duração de 6 meses, observada por meio da redução da subpopulação naive e aumento gradual da frequência de SMB a partir do primeiro mês. Observamos também redução da população de memória por volta do 3º mês, com aumento da população de PBL que permaneceu elevada até o 6º mês. Por outro lado, a despeito de os pacientes apresentarem aumento de SMB no primeiro mês após a vacinação, sua frequência foi inferior ao observado nos controles, decaindo ao terceiro mês. A população de PBL apresentou aumento precoce no primeiro mês após a vacinação, também muito menor do que observado nos controles, não sendo mantido no terceiro mês. Ainda, observamos uma correlação entre o aumento da expressão destas duas subpopulações no primeiro mês. Apenas a população de MZB apresentou aumento significativo no terceiro mês nos pacientes quando comparados aos controles. Ao dividirmos os pacientes de acordo com a expressão de SMB e PBL após 1 mês da administração das vacinas, observamos que os pacientes que apresentaram aumento na expressão de células B de memória foram os que exibiram uma melhora clínica mais expressiva, soroconverteram e desenvolveram soroproteção para H1N1.Conclusões: Apesar de não apresentarem eficaz diferenciação em células de memória e efetoras, resultando na resposta precoce e de curta duração, observamos que os pacientes foram capazes de reconhecer e responder às vacinas. Além disso, a elevada expressão de MZB no terceiro mês após a vacinação pode sugerir a atuação desta subpopulação na apresentação para os LT. Estes achados reforçam a necessidade de uma melhor compreensão da ativação do sistema imune em pacientes com ICV, para uma adequada subdivisão de acordo com o perfil de resposta após a vacinação / Introduction: Common Variable Immunodeficiency (CVID) is a primary antibody deficiency characterized by defects in B lymphocyte maturation, resulting in disturbed differentiation, distribution and functional variations on its subtypes. As a result , CVID patients have hypogammaglobulinemia and poor antibody response to specific antigens with increased susceptibility to infections. In an effort to minimize the recurrent episodes of infections, some studies have recommended immunization with inactivated pathogens or subunits and in a former study we have shown the clinical improvement determined by immunization in CVID patients, but the experience with vaccines\' administration to immunodeficient patients is limited. Objectives: To evaluate the changes in distribution of B cell subtypes before and after vaccination of CVID patients followed at the Division of Clinical Immunology and Allergy of University of São Paulo Medical School with protein and polysaccharide antigens, as well as specific antibody production . Methods: A group of 35 CVID patients and 16 controls were vaccinated against Influenza, H1N1 and S. pneumoniae vaccines. Blood samples were collected before and 1, 3 and 6 months post vaccination. PBMCs were stimulated with Influenza viral lysate and hemagglutinin peptide. Flow cytometry was performed to identify naïve B cells, marginal zone (MZB), switched memory B cells (SMB) and plasmablasts (PBL). Specific antibody production was measured and a symptoms score was applied for clinical evaluation before and after immunization. Results: In spite of the significant reduction in symptoms score after vaccination, most patients didn\'t produce specific antibodies to Influenza, H1N1 and S. pneumoniae. The analyzes of B cell subtypes changes in healthy individuals upon in vitro Influenza stimulation showed that the response endured up to 6 months post immunization. We observed a reduction in naïve B cell frequency while gradual increase in SMB frequency occurred already at 1 month after vaccination. Moreover, as the memory cell population declined, PBL population increased at the third month post vaccination until the sixth month. Although patients had an increase of SMB on the first month after vaccination, it was lower than that observed in controls, decreasing by the third month post vaccination. Plasmablast frequency had an early increase on the first month, also much lower than the observed in controls decreasing by the third month. In addition, we observed a correlation between the increased expression of SMB and PBL on the first month post vaccination. In patients, only MZB subtype presented a significant increase on the third month when compared to controls. We divided the patients according SMB and PBL expression after 1 month post vaccination and we observed that patients who were able to produce memory B cells showed a better clinical improvement, developed H1N1 seroconversion and seroprotection. Conclusion: Despite the defect on differentiation into memory and effector B cells resulting in early response with lowduration, we observed that patients were able to recognize and respond to vaccines. In addition, the over expression of MZB on the third month after vaccination may suggest the role of this subpopulation as an antigen presenting cell for T cells. These findings reinforce the need of a better understanding of immune system activation and response in CVID patients to propose a division according to vaccine (antigen) responders and non responders