Introducció: El carcinoma de pulmó és un dels problemes de salut prioritari de la societat actual, amb una major presència en homes entre els 55 i 65 anys. És una neoplàsia molt agressiva i malgrat els esforços de crear noves teràpies de QT amb diferents combinacions de fàrmacs, o RT i QT conjuntament, s'han millorat poc les taxes de supervivència d'aquesta malaltia. Sabem, per altre banda, que el cicle cel·lular amb les seves diferents fases són objecte d'una regulació bioquímica molt complexa. En aquesta tesi ens vam centrar en l'estudi d'unes quantes proteïnes implicades en el cicle (PCNA, Ki-67, p53, ciclines D1 i E) i veure quin paper tenien. Objectius de la tesi: 1) Determinar mitjançant tècniques de citometria de flux (CMF) l'índex de DNA, la fase S i el percentatge de cèl·lules PCNA positives i també el grau d'heterogeneïtat per a cadascuna en el carcinoma de pulmó de cèl·lula no petita (CPNCP), tant en els tumors primaris com en les seves metàstasis ganglionars. 2) Investigar si existeix un patró o patrons d'índexs de DNA i/o de fase S i/o de percentatge de PCNA relacionables amb el fenomen metastàtic. 3) Determinar l'expressió de l'antígen de proliferació cel·lular PCNA a les diferents fases del cicle cel·lular i avaluar si hi ha alguna relació estadística amb altres paràmetres estudiats. 4) Quantificar per mitja de tècniques d'immunohistoquímica el grau d'expressió de marcadors de proliferació cel·lular (PCNA, Ki-67), els reguladors negatius (p53) i les ciclines (D i E). 5) Avaluar les possibles relacions entre les variables següents: clíniques, anatomopatològiques, variables de CMF i variables immunohistoquímiques. 6) Analitzar estadísticament les variables que puguin ser valorades com a factor pronòstic independent. Material i mètodes: Es varen seleccionar 99 mostres de CPCNP entre 1993-1997, 89 homes i 10 dones. Es van recollir 4 tipus de dades diferents i per separat, per garantir l'objectivitat en l'obtenció de les variables. dades clíniques, anatomopatològiques, immunohistoquímiques i de citometria de flux. Les dades clíniques es van recollir per calcular la supervivència lliure i la global de la malaltia. Les dades anatomopatològiques, immunohistoquímiques i de CMF s'obtingueren de les anàlisis de les recessions quirúrgiques remeses al laboratori durant la intervenció dels malalts. Cada mostra fou dividida en dues parts: una per a CMF per l'estudi del cicle cel·lular i expressió de l'antígen PCNA a les diferents fases del cicle i l'altre per a l'estudi histològic rutinari i per l'anàlisi amb tècniques d'immunohistoquímica. Resultats: Un 70% dels adenocarcinomes es van diagnosticar a l'estadi IIIA. Ki-67, PCNA i ciclina E estaven relacionades amb el tipus histològic de carcinoma indiferenciat de cèl·lula gran (CICG). La ciclina E també estava relacionada amb el CE. La ciclina D1 amb el grau de diferenciació. PCNA i ciclina E també estaven relacionades significativament amb Ki-67. A l'anàlisi univariable en relació amb la supervivència global de la malaltia, l'estadi, CV de l'íDNA i de la fase S assoleixen la significació estadística, com a variables relacionades amb l'evolució de la malaltia. Finalment a l'anàlisi multivariable per la supervivència global de la malaltia, l'estadi i el CV de la fase S assoleixen un valor pronòstic independent. Conclusions: Hi ha una relació directa entre l'estadi i la supervivència global dels malalts. Les variables determinades per immunohistoquímica no tenen implicacions pronostiques. Hi ha una relació entre el CICG i l'expressió augmentada de marcadors de proliferació. La sobreexpressió de ciclina D1 es relaciona directament amb els CPNCP pobrament diferenciats. La fase S es relaciona amb l'expressió augmentada del PCNA per CMF. L'heterogeneïtat en l'expressió del PCNA per CMF es relaciona amb el grau d'heterogeneïtat de l'íDNA i fase S. / Introduction: Lung carcinoma is one of the priority health problems in our society. It shows mainly in men from 55 to 65 years. Is a very aggressive neoplasm and in spite of the efforts done in chemotherapy or combined with radiotherapy, the survival rate has not improved much. On the other hand, we know that the cellular cycle with its different phases is object of a very complex biochemical regulation. In this thesis we pay attention to the study of some cell cycle proteins (PCNA, KI-67, P53, cyclin D1 and E) and to try to see their functions. Objects of thesis: 1) To determine by flow cytometry (FCM) DNA index, S phase, percentage of positive PCNA cells and the heterogeneity degree of every one in non-small-cell-lung carcinomas (NSCLC), in primary tumors and ganglionary metastases. 2) To research the existence of a model or models of DNA index and/or S phase and/or a percentage of PCNA related with metastatic phenomenon. 3) To determine the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) expression during the cell cycle and to evaluate if there are any other statistic relation with other study parameters. 4) To calculate by immunohistochemistry the degree of expression of cellular proliferating markers (PCNA, Ki-67), negative regulators (p53) and cyclins (D and E). 5) To assess the potential relations between the following values: clinics, anatomopathologics, FCM and immunohistochemistry. 6) To analyze statistically the values that might be important as an independent prognostic factor. Material and methods: We colleted 99 samples of NSCLC from 1993 to 1997, 89 men and 10 women. We collected four different types of data, in order to guarantee the objectivity when we obtain the values: clinical data, anatomopathologic, immunohistochemistry and FCM data. The clinical data was obtained to calculate the free survival and global survival of disease. The anatomopathologic, immunohistochemistry and FCM data was obtained by the analysis of surgically resected lung carcinomas that were sent to laboratory. Every sample was divided in two parts: one to study cell cycle and PCNA expression in different phases of cycle by FCM and the other to study the sample by histological study and immunohistochemical techniques. Results: 70% of adenocarcinomas were diagnosed as stage IIIA. Ki-67, PCNA and cyclin E were related with large cell carcinoma histological type, cyclin E was related too with squamous cell carcinoma type. Cyclin D1 was related with the degree of cell differentiation. PCNA and cyclin E were significantly correlated with Ki-67. A univariate analysis of global survival showed that study, variation coeficient of DNA index and variation coeficient of S phase were the most significant prognostic factors as variables related with disease evolution. Finally in a multivariate analysis to global survival disease, study and variability of S phase showed an independent prognostic value. Conclusions: There is a direct relationship between study and global survival of patients. The variables detected immunohistochemically do not have prognostic factors. There is a relationship between large cell carcinoma and high value of proliferative markers. Cyclin D1 over-expression is directly related with poorly differentiated NSCLC. S phase is related with a high PCNA expression by flow cytometry. Heterogeneity in PCNA expression by flow cytometry is related with heterogeneity degree of DNA index and S phase.

Macrophages are key regulators of immune system connecting innate and specific immune responses. Macrophages proliferate in presence of their growth factor, M-CSF. The addition of bacterial lipopolysacharide, LPS, induces macrophage activation and stops their proliferation engaging a pro-inflammatory response. The activation of ERK MAPK is required for both macrophage proliferation and activation. However, different time-course of ERK activation is displayed. Proliferation is a process dependent on early and short ERK activation, whereas LPS addition delays and elongates ERK activation inducing an inflammatory response. Proliferating or activating responses are balanced by the extent and duration of ERK phosphorylation that is regulated by mitogen kinase phosphatase MKP1 (DUSP1). MKP1 is induced by both M-CSF and LPS and its kinetics of induction is correlated with those of inactivation of MAPKs. The induction of MKP-1 by M-CSF or LPS is mediated by PKC-epsilon.Our studies in primary cultures of murine bone marrow derived macrophages, show that MKP-1 expression by both M-CSF and LPS is dependent on activation of Raf-1 kinase, and its interaction with PKC Õ. The time-course of activation of ERK is correlated with that of Raf-1 and MEK-1/2. The use of specific inhibitors and RNA of interference, has shown that ERK activation during proliferation is dependent on Raf-1 activation, whereas in response to inflamatory stimuli such as LPS an alternative pathway to Raf-1 to direct the activation of these kinases. Inhibition of Raf-1 activity causes a growth arrest. The cell cycle blockage at G1 phase correlated with increased expression of cyclin-dependent kinase (Cdks) inhibitors, p21Waf1 and p27Kip1. On the other hand, no effects were observed during macrophage activation as assessed by pro-inflammatory cytokine expression and induction of nitric oxide synthase following LPS stimulation. In addition, the transcriptional induction of MKP-1 phosphatase by both M-CSF and LPS is independent of ERK and p38 activation, but dependent on JNK activation as assessed using inhibitors. In consequence to inactivation of MKP-1, an elongation of other MAPKs activity, ERK and p38, is observed. Macrophages constitutively express JNK1 and JNK2 isoforms, while no JNK3 is detected. JNK1 is the main isoform involved in JNK activity. Using single knock-out mice for jnk1 and jnk2 genes, we have demonstrated that MKP-1 induction is mediated by JNK1 isoform. Moreover, JNK1 is also required for biosynthesis of proinflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-1beta and IL-6) and for induction of nitric oxide synthase. This requirement is independent on JNK1 function as regulator of MKP-1 induction, as shown using knock-out mice for this phosphatase. These data indicate that Raf-1 is critical in ERK MAPK activation during macrophage proliferation whereas its absence does not compromise macrophage activation. Furthermore, Raf-1 is involved in the expression of MKP-1 phosphatase implicated in MAPK deactivation, through interaction with PKC-epsilon isoform. In addition, MKP-1 phosphatase expression is also dependent on JNK activity suggesting a selfregulation of MAPKs through induction of phosphatases. From different JNK isoforms, JNK1 is involved both in the expression of MKP-1 phosphatase and displays a direct role in the LPS-dependent macrophage activation.

El càncer de pàncrees és altament agressiu i representa la cinquena causa de mort al mon occidental. Anteriorment, en el nostre laboratori, vam identificar que el receptor tissular del plasminogen (tPA) hi està sobre-expressat i juga un paper important el la progressió tumoral. En la present tesi hem profunditzat en l'estudi del mecanisme molecular de tPA i seus receptors en aquest càncer. En primer lloc hem caracteritzat en detall la interacció de tPA amb Annexina A2 (principal receptor de tPA en endoteli i altament expressada en pàncrees) demostrant que les dades publicades sobre la seqüència responsable de la interacció no eren correctes. A més a més hem caracteritzat les proteïnes de lisats cel·lulars pancreàtics que interaccionen amb tPA mitjançant un assaig pull down i posterior anàlisi proteòmic. de tot identificant un conjunt de possibles lligands de tPA. D'entre aquests hem seleccionat galectina 1, una lectina que mai s'ha descrit que interaccioni amb tPA, per realitzar la caracterització bioquímica i funcional del seu paper com a nou lligand de tPA en càncer de pàncrees. / Pancreatic cancer is a highly aggressive disease and represents the fifth cause of death in occidental world. Our laboratory has previously reported tissue type plasminogen activator (tPA) over expression in this cancer and its role in tumoral progression. During the present thesis we have studied tPA and its molecular mechanism through its receptors in this tumor.We have first characterized tPA interaction with annexin A2 (its main receptor in endothelium and highly expressed in pancreas). Our results showed that published data about the sequence responsible of this interaction was not correct. We have also identified a set of new putative tPA receptors in pancreatic cell lisates using a pull down assay and proteomic analysis. One of the proteins identified was galectin 1, a lectin with not know relation with tPA. We performed a biochemical and functional characterization of the interaction between these two proteins in pancreatic cancer.