L’adénovirus possède plusieurs caractéristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les études de génomique fonctionnelle. Dans la majorité de ces applications, on a recours à un vecteur adénoviral de première génération délété de sa région E1. L’utilisation de vecteurs adénoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subséquente de ce dernier. Le développement de méthodes alternatives est donc nécessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation étendue de ces vecteurs. Ce développement va s’articuler sur deux axes : l’ingénierie du vecteur de transfert pour la construction de l’adénovirus recombinant et l’ingénierie d’une lignée cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adénoviral co-exprimant, à partir d’un promoteur régulable à la tétracycline, la protéase de l’adénovirus et une protéine de fluorescence verte (GFP) par l’intermédiaire d’un site d’entrée ribosomal interne (IRES), notre groupe a établi que la sélection positive, via l’expression ectopique de la protéase, est un processus efficace pour la création de librairie d’adénovirus recombinants. Par contre, la diversité atteinte dans ce premier système est relativement faible, environ 1 adénovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectué dans le cadre de cette thèse vise à construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel l’expression de la protéase sera indépendante de celle du transgène permettant ainsi d’optimiser l’expression de la protéase. Ce travail d’optimisation a permis de réduire le phénomène de transcomplémentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversité à 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce système a été mis à l’épreuve en générerant une librairie adénovirale antisens dirigée contre la GFP. La diversité de cette librairie a été suffisante pour sélectionner un antisens réduisant de 75% l’expression de la GFP. L’amplification de ce vecteur adénoviral de première génération doit se faire dans une lignée cellulaire exprimant la région E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adénovirus de première génération se répliquant dans les cellules 293 peut échanger, par recombinaison homologue, son transgène avec la région E1 de la cellule créant ainsi un adénovirus recombinant réplicatif (RCA), compromettant ainsi la pureté des stocks. Notre groupe a déjà breveté une lignée cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la région E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgène du virus. Par contre, le niveau de réplication de l’adénovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, à peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence qu’une expression insuffisante d’E1B-55K était responsable de la mauvaise réplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones à partir de la lignée parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirmé que certains clones exprimaient une plus grande quantité d’E1B-55K et que ces clones amplifiaient de manière plus efficace un vecteur adénoviral de première génération. Ce clone a par la suite été adapté à la culture en suspension sans sérum. / The adenovirus has numerous interesting characteristics making this particular virus an ideal candidate for the construction of vector for conducting studies in functional genomics. The vast majority of those applications rely on a so-called “first-generation vector” in which the E1 region is replaced by a transgene. Despite all their advantages, there are 2 weak links associated with first-generation vector: the efficient construction of the actual vector and its production. Therefore, the development of alternative methods for construction and production is necessary to ensure their usefulness. The development will involve 2 axes: the reengineering of the transfer vector for the construction of recombinant adenovirus and the reengineering of the cell line capable of producing the vector. Using a transfer vector co-expressing the adenoviral protease (PS) gene and GFP by using an IRES under the control of a tetracycline-regulated promoter, our laboratory previously established the proof of concept that positive selection of recombinant adenovirus through ectopic expression of the PS gene was an efficient approach to generate adenoviral libraries. However, the diversity achieved was quite low, around 1 recombinant adenovirus per 1,000 cells. The goal of this thesis was to design a new transfer vector in which the PS expression was independent from the expression of the transgene in order to be able to optimize its expression independently. We also improved library diversity by lowering the amount of PS in order to reduce the the trans-complementation from the transfer vector. Using this method, at least 1 recombinant adenovirus per 75 cells was generated with 100% of the plaques being recombinant. This system was successfully used to generate an antisense library targeting GFP. The diversity of the library was high enough to allow the selection of an antisense that inhibited 75% of GFP expression. Amplification of those first-generation recombinant adenoviruses must take place in an E1-expressing cell such as 293 cells. However, when replicating in 293 cells, the recombinant adenovirus can exchange their transgene with the E1 region of the cell by homologous recombination, which results in the generation of a fully replicative adenovirus (RCA), a situation that compromises the purity of the viral preparation. Our laboratory has previously patented an A549 cell line expressing the E1 region and producing RCA-free recombinant adenovirus (BMAdE1). However, the replication of E1-deleted adenovirus in BMAdE1 cells was sub-optimal, in the range of 15-30% the level obtained in 293 cells. The work done in this thesis establishes that the low level of E1B-55K could be responsible for the lower productivity of BMAdE1 cells. Thus, we have derived new clones following lentiviral transduction in order to increase E1B-55K expression. Western blot confirmed that some clones expressed more E1B-55K than BMAdE1, and this correlated with a more robust replication of a recombinant adenovirus in those clones. This newly optimized BMAdE1 cell line was adapted to serum-free suspension culture.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le veau nouveau-né possède un rumen peu développé et non fonctionnel. Au cours des premiers mois, les fonctions digestives s’établissent, avec l’implantation du microbiote composé majoritairement de bactéries, archées et protozoaires. Les objectifs de ce travail étaient doubles : i) caractériser et comprendre la séquence d’implantation taxonomique des microorganismes du rumen chez le veau par des techniques de biologie moléculaire et de dénombrement, ainsi que la séquence de mise en place des paramètres fermentaires (AGV et ammoniac) et des activités principales enzymatiques chez le veau en périodes pré- et post-sevrage, ii) étudier l’effet de l’addition de levures vivantes sur la mise en place de cet écosystème ruminal en périodes pré- et post-sevrage. D’une part, nos travaux ont permis de confirmer qu’à la naissance, le rumen chez le veau, est dépourvu de micro-organismes, d’AGV, d’activité xylanasique et amylasique, avec un pH proche de la neutralité et un Eh fortement positif. La colonisation du rumen se fait dès la naissance, pendant les 15 premiers jours de la vie de l’animal par un microbiote complexe prédominé par les bactéries (phyla Proteobacteria et Bacteroidetes) et comprenant aussi des archées (majoritairement Methanobrevibacter). En même temps, le Eh devient fortement négatif. Ces communautés entraînent la production de produits fermentaires grâce à leurs activités enzymatiques. Entre 15 jours et le sevrage, avec l’ingestion d’aliments solides, la composition du microbiote du rumen évolue pour se rapprocher de celle de ruminants adultes, sans atteindre pour autant la maturité en termes de densités et abondances relatives. A cette période, le phylum Bacteroidetes est majoritaire, avec le genre Prevotella. Après le sevrage de légers changements apparaissent sur certains paramètres fermentaires comme les AGV sans doute en raison d’une évolution du microbiote qui devient moins diversifié et plus adapté à la dégradation d’aliments solides. L’apparition, à partir de 90 jours, des protozoaires ciliés dans le rumen semble conditionnée par la présence d’animaux adultes à proximité. A 4 mois d’âge, l’écosystème ruminal tend à devenir proche de celui observé chez les animaux adultes en matière de paramètres fermentaires, activités enzymatiques et composition taxonomique du microbiote. D’autre part, nos travaux ont permis de conclure que, avant sevrage, une supplémentation en levures vivantes (Saccharomyces cerevisiae) diminue l’ingestion de concentrés, conduit à une apparition plus précoce de la communauté des protozoaires et une plus grande densité d’archées, mais a peu d'effets sur la densité et la diversité de la communauté bactérienne, à l'exception de variations d’abondances de quelques taxa mineurs. L’apport de levures entraîne une diminution de la protéolyse, une augmentation de la proportion d'acétate ruminal et une diminution de la proportion de propionate. Au cours de la période post-sevrage, les veaux supplémentés en levures consomment plus de foin et la densité en archées est plus importante alors qu’une réduction de la diversité et de la densité de la communauté bactérienne est observée, mais accompagnée d’une augmentation de l’abondance relative des bactéries dégradant l’amidon, les pectines, les protéines et majoritairement les parois cellulaires en fonction des substrats présents dans le rumen. Ces changements sont probablement à relier aux augmentations de l'activité xylanasique et de la proportion d'acétate. L’ensemble des résultats acquis dans ce travail de thèse a permis d’apporter un certain nombre de connaissances et une meilleure compréhension de la mise en place de l’écosystème ruminal chez le veau de race laitière en périodes pré- et post-sevrage, ainsi que quelques pistes pour orienter ou améliorer cette implantation pour une meilleure maîtrise de l’élevage des veaux d’élevage. / The newborn calf has a little and non-fonctional rumen. During the first months of life, digestive functions establish, in relationship with the colonization by a microbiota mainly composed of bacteria, archaea and protozoa. This study had two objectves: i) characterize and understand the sequence of establishment of ruminal microbiota in calves by molecular biology and counting techniques abd describe the appearance of fermentation parameters (VFA and ammonia) and enzyme activities during the pre- and post-weaning periods, ii) define the effect of yeast supplementation on the establishment of the ruminal ecosystem in pre-and post-weaning periods. On the one hand, our work confirmed that at birth, calf rumen is devoid of micro-organisms, AGV, xylanase and amylase activities, with a pH close to neutrality and a strongly positive Eh. From 2 to 15 days of age, the rumen is colonized by a complex microbiota dominated by bacteria (Proteobacteria and Bacteroidetes phyla) and also containing archaea (with mainly the Methanobrevibacter genus), and Eh becomes strongly negative. These communities result in the production of fermentation products due to their enzymatic activities. Between 15 days and weaning, with the ingestion of solid food, the composition of rumen microbiota changes to become closer to that of adult ruminants without reaching maturity in term of densities and relative abundances. At this time, the phylum Bacteroidetes is predominant with the Prevotella genus. After weaning, slight differences occurs on some fermentative parameters such as VFA, probably related to a change in the microbiota that becomes less diversified and more adapted to the degradation of solid food. From 90 days, the establishment of ciliated protozoa in the calf rumen seems conditioned by the proximity with adult animals. From 4 months of age, considering fermentation, enzymatic and taxonomic composition of the microbiota, the ruminal ecosystem tends to be similar to that observed in adult animals. On the other hand, our work showed that during the pre-weaning period, the supplementation with live yeast (Saccharomyces cerevisiae) results in a lower concentrate intake, an earlier establishment of ciliated protozoa and a higher archaeal community density, but poorly affects the density and diversity of the bacterial community, with the exception of changes in abundances of some minors taxa. Yeast supplementation reduces proteolysis, increases the proportion of acetate and decreases that of propionate. During the post-weaning period, yeast supplemented calves consumed more hay, had a higher archaeal density, but a lower diversity and density of the bacterial community with an increased relative abundance of fiber, protein, starch, pectine degrading bacteria compared to control according to the substrates present in the rumen. These changes are probably related to increases of the xylanolytic activity and the proportion of acetate. Taken together, results obtained in his thesis have improved knowledge and understanding of the establishment of the ruminal ecosystem in the dairy calf in pre- and post-weaning periods, and carried some possibilities to orientate or improve the ruminal establishment for better control of calves rearing.

La maladie de Crohn (MC) est une affection inflammatoire chronique du tube digestif dont l’étiologie est multifactorielle. Les lésions intestinales des patients atteints de MC sont anormalement colonisées par des souches pathogènes d’Escherichia coli appartenant au pathovar AIEC pour «Adherent-Invasive Escherichia coli ». Ces souches sont capables d’adhérer et d’envahir les cellules épithéliales intestinales, et ont la capacité de survivre et de se multiplier en macrophages en induisant une synthèse intense de cytokines pro-inflammatoires. Les AIEC pourraient ainsi être impliquées dans l’induction et/ou l’entretien de l’état inflammatoire de la muqueuse intestinale.L’objectif de ce travail est d’identifier les déterminants bactériens des AIEC qui vont intervenir dans les étapes précoces de l’implantation des AIEC au niveau intestinal et de définir quel est le rôle des facteurs micro-environnementaux de l’hôte dans cette implantation.Nous montrons que l’AIEC LF82 possède une activité mucinolytique qui est portée par le gène vat-AIEC et qui favorise la traversée du mucus et la colonisation intestinale. Nous avons retrouvé ce gène chez 42% des souches AIEC isolées de patients atteints de MC, et chez 97% des souches AIEC appartenant au phylogroupe B2. Par ailleurs, nous avons montré que les sels biliaires augmentent l’expression de cette mucinase.Nous avons ensuite étudié l’influence des sels biliaires sur l’expression globale des gènes de la souche LF82. Les sels biliaires modifient profondément le métabolisme de la souche, induisant une diminution globale des voies de biosynthèse (protéines, lipides) et une augmentation des voies de dégradation (alcools, acides carboxyliques, polyamines, …). L’étude du catabolisme de l’éthanolamine et du propanediol indique que les AIEC pourraient se servir de ces substrats pour s’implanter au sein de la flore iléale. De plus, les analyses transcriptomiques révèlent que les sels biliaires augmentent l’expression de gènes codant des facteurs de virulence comme l’invasine IbeA, les systèmes de sécrétion de type VI et la yersiniabactine. Nous montrons également qu’ils favorisent la formation de biofilm chez les souches AIEC.Ces données indiquent que les sels biliaires constituent un signal permettant à la souche AIEC LF82 de mettre en place différentes voies métaboliques et déterminants bactériens nécessaires à son implantation au niveau intestinal.Mots-clé : Escherichia coli, maladie de Crohn, mucines, serine protéase, mucinase, AIEC, / The etiology of Crohn's disease (CD) involves disorders in host genetic factors and intestinal microbiota. Ileal mucosa of CD patients is often abnormally colonized by adherent-invasive Escherichia coli (AIEC). These strains isolated from the intestinal mucosa of CD patients are able to adhere to intestinal epithelial cells (IECs). This adhesion to IECs promotes the invasion of cells by the bacteria. Furthermore, the invasive ability of AIEC strains allows bacteria to translocate across the human intestinal epithelium, move into the deep tissues and activate immune cells continuously upon arrival. Thus AIEC could be involved in the inflammatory state of the intestinal mucous membrane. The aim of this study was to identify components of AIEC virulence, which might favor their implantation in the gut of CD patients and to define the role of several chemical factors from the ileal environment. Here, we reported a protease called Vat-AIEC from AIEC which favors the penetration of AIEC through the mucus layer and enhances gut colonization. The screening of E. coli strains isolated from CD patients revealed a preferential vat-AIEC association with AIEC strains belonging to the B2 phylogroup. Besides, Vat-AIEC transcription was increased with bile salts from the ileum environment. Then a global RNA sequencing (RNA-seq) of E. coli LF82 has been used to observe the impact of bile salts on the expression of bacterial genes. The results demonstrate the explosive effect of bile salts with a dysregulation of about 40% of the genome, with a global upregulation of genes involved in degradation and downregulation of those implicated in several biosynthesis. Our results show that LF82 use ethanolamine as a nitrogen source and propane diol as a carbon source, which can favor their colonization in the gut compared to the other bacteria. We also studied virulence genes expression in the presence of bile salts. They increase the expression of several virulence factors like the IbeA invasion, the type 6 secretion systems and the yersiniabactin. Furthermore, we noticed an increased expression of genes implicated in biofilm formation. These results improve the understanding of the global regulatory network in the presence of bile salts and thus of AIEC implantation in the human gut of CD patients.

L’étude du retentissement d’un xénobiotique en général ou d’un médicament en particulier sur la gestation humaine est difficile à appréhender. Elle doit prendre en compte des considérations éthiques, indispensables lors de toute recherche chez la femme enceinte, mais aussi pour le cas de l’induction de la parturition, de la complexité des mécanismes physiologiques impliqués. S’il existe un relatif consensus expérimental à partir de modèles animaux pour évaluer leur retentissement sur la fertilité et l’embryogenèse, il n’y a pas à ce jour d’attitude pour évaluer un risque induit d’un accouchement prématuré. Hors la naissance prématurée est la première cause de mortalité du nouveau-né et concerne quinze millions de naissances par an au niveau mondial. Les étiologies sont multiples : infectieuses dont VIH,grossesses multiples, addictions. La littérature récente fait part aussi de cette problématique pour certains médicaments indispensables comme les inhibiteurs de protéase chez les femmes enceintes infectées par le VIH. Nous avons réalisé trois études spécifiquement chez la femme enceinte : modulation du passage placentaire des inhibiteurs de protéase du VIH, modulation des hormones stéroïdiennes placentaires et materno-foetales par la mifépristone, variation des protéines sériques maternelles dans les jours précédents la parturition. C’est à l’issue de ces travaux que nous émettons plusieurs hypothèses sur l’incidence d’un médicament lors de la parturition humaine et les moyens envisagés pour l’étudier de manière la moins invasive possible. / Effects of a xenobiotic or drug on human gestation are difficult to approach. This is due tonecessary ethical considerations with regards to research on pregnant women as well as thecomplexity of physiological processes involved in the case of induced parturition. While thereis a relative experimental consensus with animal models to assess their impact on fertility andembryogenesis, there is currently no method to assess the risk of induced preterm labor.Preterm labor is the leading cause of newborn deaths at the rate fifteen million births per yearglobally. The etiologies are multiple: infectious including HIV, multiple pregnancies,addictions. Recent publications also discuss this issue in the context of necessary drugs suchas protease inhibitors for HIV infected pregnant women. We realised three studies specificallyin pregnant women: modulation of the placental transfer of protease inhibitors of the HIV,modulation of the feto-maternal and placental steroid hormones by mifepristone, and a studyabout variation of the maternal serum proteins in the previous days of the parturition. Also,regarding our studies and the literature, we make several hypotheses on possible interferencesbetween drugs and human parturition, disturb its signal, and methods proposed for its study ina minimally invasive manner.

Le système immunitaire inné repose sur la détection de motifs microbiens et l'activation de réponses adaptées, parmi lesquelles les voies de signalisation dépendantes des facteurs NF-κB jouent un rôle primordial. Ces voies sont finement régulées afin d'éviter une réponse immunitaire excessive et soutenue dans le temps qui peut causer de nombreuses pathologies, comme les maladies auto-immunes et pro-inflammatoires. Au cours de ma thèse, j'ai élucidé certains mécanismes de régulation des voies de signalisation NF-κB, Toll et IMD, chez la drosophile, qui reposent sur l'ubiquitination de protéines et leur dégradation par la voie endocytaire ou le protéasome. L'ubiquitination réversible des protéines est une modification post-traductionnelle qui permet de réguler leur activité, leur stabilité et leur localisation subcellulaire. En particulier, l'ubiquitination des récepteurs membranaires peut servir de signal d'endocytose et de dégradation lysosomale. Chez la drosophile, le récepteur PGRP-LC reconnaît spécifiquement le peptidoglycane (PGN) bactérien de type acide diaminopimélique et induit la voie de signalisation IMD. J'ai montré que PGRP-LC est ubiquitiné, internalisé et dégradé par la voie endocytaire. Dans ce processus, j'ai identifié le rôle majeur de la déubiquitinase USP8 qui contrôle la dégradation de PGRP-LC ubiquitiné. J'ai aussi mis en évidence que la stimulation de la voie IMD par les PGN augmente l'internalisation et la dégradation de PGRP-LC, assurant l'élimination des récepteurs après que la voie IMD ait été activée. En outre, j'ai participé à des études visant à comprendre le rôle des déubiquitinases USP2, USP34 et USP36, préalablement sélectionnées par l'équipe comme des régulateurs négatifs des voies IMD et/ou Toll. Mes résultats ont notamment contribué à montrer que USP2 agit principalement au niveau de la protéine adaptatrice Imd, en permettant l'hydrolyse de ses chaînes d'ubiquitine K48 et sa dégradation par le protéasome. Finalement, j'ai observé que USP2 interagit également avec PGRP-LC et favorise l'hydrolyse des chaînes K48 associées à ce récepteur, bien que dans ce cas, la dégradation des formes poly-ubiquitinées K48 de PGRP-LC ne dépende pas du protéasome, mais des protéines de la voie endocytaire Hrs, Rab5 et de la déubiquitinase USP8. / The innate immune system relies on the recognition of “non-self” and on the activation of adapted responses, among which NF-κB signaling pathways play a crucial role. These pathways are tightly regulated, in order to prevent an excessive and sustained immune response, responsible for several pathologies, such as autoimmune and pro-inflammatory diseases. During my PhD thesis, I elucidated some Drosophila regulatory mechanisms of NF-κB pathways, Toll and IMD, which rely on protein ubiquitination and their subsequent degradation by the endocytic pathway or proteasome. Reversible ubiquitination of proteins is a post-translational modification, regulating their activity, their stability and the subcellular localization. In particular, ubiquitination of membrane receptors could trigger their internalization and their subsequent lysosomal degradation. In Drosophila, the PGRP-LC receptor specifically recognizes diaminopimelic acid containing peptidoglycan (PGN) and induces the IMD signaling pathway. I proved that PGRP-LC receptor is ubiquitinated, internalized and degraded by the endocytic pathway. In this process, I identified the major role of the USP8 deubiquitinating enzyme, which controls the degradation of ubiquitinated PGRP-LC. Besides, I showed that the IMD stimulation by PGN enhances the PGRP-LC internalization and its degradation, ensuring receptors elimination once the IMD pathway has been activated. Moreover, I took part to studies, aiming to understand the role of USP2, USP34 and USP36, previously selected by the team as negative regulators of the IMD and/or Toll pathways. In particular, my results showed that USP2 principally acts at the Imd level, allowing for the hydrolysis of its K48 poly-ubiquitin chains and its proteasomal degradation. Finally, I observed that USP2 also interacts with PGRP-LC and favors the hydrolysis of PGRP-LC associated K48 chains, whereas the degradation of K48 poly-ubiquitinated PGRP-LC is independent from the proteasome, but rather depends on the Hrs and Rab5 endocytic proteins and on the USP8 deubiquitinating enzyme.

Ixodes ricinus est l’espèce de tique la plus abondante et ayant la plus vaste répartition géographique en Europe. Elle est le vecteur de nombreux agents pathogènes d’importance en santé publique et vétérinaire. Le remplacement des acaricides générant pollution environnementale et apparition croissante de résistances requiert le développement urgent de nouvelles stratégies de lutte efficaces contre les tiques et les agents pathogènes qu’elles transmettent. La découverte de telles stratégies passe nécessairement par une meilleure connaissance des interactions entre les tiques, leurs hôtes et les agents pathogènes transmis. La salive de tique, à l’interface de ces interactions, est un fluide essentiel pour ces arthropodes et possède notamment des propriétés protéolytiques, anticoagulantes, immunomodulatrices, analgésique, et anti-inflammatoires qui permettent à la tique de réaliser ses repas sanguins extrêmement longs. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la transmission des agents pathogènes et pour identifier de possibles candidats vaccinaux contre I. ricinus, une étude transcriptomique comparative entre des glandes salivaires infectées et non infectées par la bactérie Bartonella henselae a été antérieurement réalisée. Le transcrit le plus surexprimé suite à cette infection était IrSPI, un inhibiteur de sérine protéase de la famille des Kunitz. Les analyses fonctionnelles par ARN interférence ont montré l’implication de ce gène dans le gorgement et de l’infection des glandes salivaires par B. henselae. Ainsi, les travaux de thèse présentés ici ont concerné l’analyse structurelle, biochimique et fonctionnelle de IrSPI en tant que molécule impliquée dans les interactions tick-hôte-pathogène. Le premier objectif était de définir la structure et la séquence du gène IrSPI mais, malheureusement, bien que nos résultats aient permit des avancés sur cette question, nous n'avons pu obtenir la totalité de sa séquence. Dans un second temps, la dynamique d’expression d’IrSPI a été évaluée au cours du gorgement et de l’infection des tiques par différents agents pathogènes, montrant que son expression est induite par le repas sanguin, par des agents transmis par la tique mais pas par Escherichia coli, bactérie non transmise. De plus, nos résultats ont montré l’expression de IrSPI dans plusieurs organes de la tique, suggérant son implication dans diverses fonctions au sein de ce vecteur. Parmi elles, la mise en évidence d'une injection, par la salive, de la protéine à l'hôte vertébré nous a permis d'envisager un rôle sur les réponses de l'hôte à la piqûre de tique. Nos résultats n’ont montré aucune implication dans la voie extrinsèque de la coagulation ni dans la fibrinolyse, ni dans l’angiogenèse. En revanche, ils ont démontré que IrSPI inhibe la prolifération des lymphocytes TCD4+ sous stimulation monogénique quand chez des lymphocytes B non stimulés IRSPI, il induit une hausse de la prolifération. De plus IrSPI a montré une action négative significative sur la production de la majorité des cytokines et chimiokines pro-inflammatoires produites par les macrophages et les splénocytes. Ainsi, IrSPI, correspond à un des composants salivaires d’I. ricinus lui permettant de moduler la réponse immune de l’hôte pour lui permettre de prélever son repas sanguin tout en favorisant la transmission des agents pathogènes. Enfin, des résultats préliminaires dans l'identification des interactants de IrSPI à la fois chez la tique et l’hôte vertébré ouvre de nombreuses voies de recherche quant à la compréhension de ses fonctions. / Ixodes ricinus tick species, the most abundant and widespread tick in Europe, is an important vector of pathogens affecting both animal and human health. To replace the use of acaricides that generate environmental contamination and resistances, new environmentally sustainable approaches providing broad protection against ticks and tick-borne pathogens (TBP) are urgently needed. Such development requires improved understanding of the biology of ticks and more particularly of their interactions with vertebrate hosts and TBP. Tick saliva is an essential biofluid for ticks, as its proteolytic, anticoagulant, immunomodulatory, analgesic and anti-inflammatory activities allow ticks to acquire their blood meal under optimal conditions. Moreover, injection of saliva during blood feeding represents the principal route by which TBP are transmitted to the host. To understand the molecular mechanisms involved in TBP transmission, as well as to identify putative vaccine candidates against I. ricinus, salivary glands from bacteria infected and uninfected ticks were previously compared by high throughput transcriptomics. The most up-regulated transcript following infection was IrSPI, which belongs to the Kunitz/BPTI inhibitor family. Functional analyses via RNAi knockdown experiments revealed that IrSPI enhances both blood feeding and bacterial burden in the salivary glands. This present PhD work concerns then the structural, biochemical and functional characterization of IrSPI as a molecule involved in tick-host-pathogen interactions. Our aim was first to define the structure of IrSPI gene but, unfortunately, while our results have led to progress on this issue, we have not been able to get the full sequence. Then, the dynamic of IrSPI expression was evaluated during both tick feeding and colonization of ticks by pathogens, showing that its expression is induced by blood feeding and TBP but not by Escherichia coli that is not transmitted by I. ricinus. In addition, our results shown the expression of IrSPI in several tick organs, suggesting its implication in several functions in tick physiology. Among them, the discovery of the injection of IrSPI, through the saliva, to the vertebrate host allowed us to consider a role in host responses to tick bite. Evaluation of IrSPI effect on host showed no impact on coagulation through extrinsic pathway, as determined by analysis of thrombin generation time and by fibrinolysis, or in angiogenesis. However, it inhibited the proliferation of mitogen-stimulated CD4+ lymphocytes and increased unstimulated-B cell proliferation. In addition, IrSPI also modulated cytokine production from macrophages and splenocytes, repressing significantly most of proinflammatory cytokines and chemokines. Thus, we demonstrated that IrSPI plays a role in modulating the host immune response during blood feeding. Finally, preliminary results in the identification of the protein’s interactants open many research perspectives for understanding how IrSPI acts in tick physiology and counteracts host responses to tick injury and pathogen transmission.

L’adénovirus possède plusieurs caractéristiques faisant de ce virus un candidat de choix pour la construction de vecteurs utiles dans les études de génomique fonctionnelle. Dans la majorité de ces applications, on a recours à un vecteur adénoviral de première génération délété de sa région E1. L’utilisation de vecteurs adénoviraux comprend deux maillons faibles : la construction du vecteur et la production subséquente de ce dernier. Le développement de méthodes alternatives est donc nécessaire pour renforcer ces deux maillons, permettant ainsi une utilisation étendue de ces vecteurs. Ce développement va s’articuler sur deux axes : l’ingénierie du vecteur de transfert pour la construction de l’adénovirus recombinant et l’ingénierie d’une lignée cellulaire pour la production du vecteur. En utilisant un vecteur de transfert adénoviral co-exprimant, à partir d’un promoteur régulable à la tétracycline, la protéase de l’adénovirus et une protéine de fluorescence verte (GFP) par l’intermédiaire d’un site d’entrée ribosomal interne (IRES), notre groupe a établi que la sélection positive, via l’expression ectopique de la protéase, est un processus efficace pour la création de librairie d’adénovirus recombinants. Par contre, la diversité atteinte dans ce premier système est relativement faible, environ 1 adénovirus recombinant par 1 000 cellules. Le travail effectué dans le cadre de cette thèse vise à construire un nouveau transfert de vecteur dans lequel l’expression de la protéase sera indépendante de celle du transgène permettant ainsi d’optimiser l’expression de la protéase. Ce travail d’optimisation a permis de réduire le phénomène de transcomplémentation du virus parental ce qui a fait grimper la diversité à 1 virus recombinant par 75 cellules. Ce système a été mis à l’épreuve en générerant une librairie adénovirale antisens dirigée contre la GFP. La diversité de cette librairie a été suffisante pour sélectionner un antisens réduisant de 75% l’expression de la GFP. L’amplification de ce vecteur adénoviral de première génération doit se faire dans une lignée cellulaire exprimant la région E1 telle que les cellules 293. Par contre, un adénovirus de première génération se répliquant dans les cellules 293 peut échanger, par recombinaison homologue, son transgène avec la région E1 de la cellule créant ainsi un adénovirus recombinant réplicatif (RCA), compromettant ainsi la pureté des stocks. Notre groupe a déjà breveté une lignée cellulaire A549 (BMAdE1) exprimant la région E1, mais qui ne peut pas recombiner avec le transgène du virus. Par contre, le niveau de réplication de l’adénovirus dans les BMAdE1 est sous-optimal, à peine 15-30% du niveau obtenu dans les cellules 293. Le travail fait dans le cadre de cette thèse a permis de mettre en évidence qu’une expression insuffisante d’E1B-55K était responsable de la mauvaise réplication du virus dans les BMAdE1. Nous avons produit de nouveaux clones à partir de la lignée parentale via une transduction avec un vecteur lentiviral exprimant E1B-55K. Nous avons confirmé que certains clones exprimaient une plus grande quantité d’E1B-55K et que ces clones amplifiaient de manière plus efficace un vecteur adénoviral de première génération. Ce clone a par la suite été adapté à la culture en suspension sans sérum. / The adenovirus has numerous interesting characteristics making this particular virus an ideal candidate for the construction of vector for conducting studies in functional genomics. The vast majority of those applications rely on a so-called “first-generation vector” in which the E1 region is replaced by a transgene. Despite all their advantages, there are 2 weak links associated with first-generation vector: the efficient construction of the actual vector and its production. Therefore, the development of alternative methods for construction and production is necessary to ensure their usefulness. The development will involve 2 axes: the reengineering of the transfer vector for the construction of recombinant adenovirus and the reengineering of the cell line capable of producing the vector. Using a transfer vector co-expressing the adenoviral protease (PS) gene and GFP by using an IRES under the control of a tetracycline-regulated promoter, our laboratory previously established the proof of concept that positive selection of recombinant adenovirus through ectopic expression of the PS gene was an efficient approach to generate adenoviral libraries. However, the diversity achieved was quite low, around 1 recombinant adenovirus per 1,000 cells. The goal of this thesis was to design a new transfer vector in which the PS expression was independent from the expression of the transgene in order to be able to optimize its expression independently. We also improved library diversity by lowering the amount of PS in order to reduce the the trans-complementation from the transfer vector. Using this method, at least 1 recombinant adenovirus per 75 cells was generated with 100% of the plaques being recombinant. This system was successfully used to generate an antisense library targeting GFP. The diversity of the library was high enough to allow the selection of an antisense that inhibited 75% of GFP expression. Amplification of those first-generation recombinant adenoviruses must take place in an E1-expressing cell such as 293 cells. However, when replicating in 293 cells, the recombinant adenovirus can exchange their transgene with the E1 region of the cell by homologous recombination, which results in the generation of a fully replicative adenovirus (RCA), a situation that compromises the purity of the viral preparation. Our laboratory has previously patented an A549 cell line expressing the E1 region and producing RCA-free recombinant adenovirus (BMAdE1). However, the replication of E1-deleted adenovirus in BMAdE1 cells was sub-optimal, in the range of 15-30% the level obtained in 293 cells. The work done in this thesis establishes that the low level of E1B-55K could be responsible for the lower productivity of BMAdE1 cells. Thus, we have derived new clones following lentiviral transduction in order to increase E1B-55K expression. Western blot confirmed that some clones expressed more E1B-55K than BMAdE1, and this correlated with a more robust replication of a recombinant adenovirus in those clones. This newly optimized BMAdE1 cell line was adapted to serum-free suspension culture.

La bronchopneumopathie chronique obstructive ou BPCO est une atteinte des voies respiratoires causée par le tabagisme. Cette maladie pulmonaire chronique et non réversible pour laquelle il n’y pas de traitement curatif se caractérise par une inflammation permanente du tractus respiratoire. Celle-ci est due à l’afflux massif de cellules de l’inflammation, principalement des neutrophiles et macrophages, qui libèrent après activation, de nombreuses protéases actives. Ces protéases vont alors dégrader les protéines de structure comme l’élastine, ce qui va entraîner la dégradation progressive des alvéoles pulmonaires et au final une altération de plus en plus marquée de la fonction respiratoire. Parmi les différentes protéases présentes dans le poumon, la MMP-12 de macrophage, joue un rôle clé dans la physiopathologie de la maladie. / Chronic obstructive pulmonary disease or COPD is a lung disease caused by tobacco smoking. This is a chronic and non reversible disease for which no curative treatment is available yet. Permanent inflammation of the airways is a hallmark of COPD because immune cells such as neutrophils and macrophages are continuously recruited. Once activated, these cells release numerous active proteases which participate to the degradation of structural proteins of the lungs such as elastin, leading to lung emphysema as a consequence of lung alveoli degradation. Among the different proteases found in the lungs, macrophage MMP-12 has been reported to play a key pathogenic role in COPD development.

Les systèmes moléculaires décrits chez les Archaea mettent en évidence un caractère primitif et une simplicité, comparativement à leurs homologues eucaryotes. Par ailleurs, leur caractère extrêmophile a pour conséquence une hyper-robustesse qui rend leur manipulation in vitro et les études structurales beaucoup plus aisées. Ainsi les Archaea représentent de bons modèles pour comprendre les fonctions cellulaires complexes, particulièrement celles qui mettent en jeu de grandes machineries moléculaires, comme celles impliquées dans la protéolyse. Mon travail de thèse a consisté à comprendre les mécanismes de résistance et l'importance des systèmes de protéolyse dans l'adaptation des Archaea halophiles aux stress environnementaux. Les Archaea halophiles accumulent des concentrations multi-molaires de KCl/NaCl dans leur cytosol (3.4M KCl / 1.1M NaCl chez Halobacterium salinarum). Ainsi, les protéines de ces organismes sont elles-mêmes halophiles et ne sont solubles et repliées que dans des conditions de salinité extrêmes (de 2 à 5M).Nous avons étudié la réponse de l'Archaea halophile stricte H. salinarum à des stress, dont les stress à basse salinité, en se focalisant en particulier sur les modifications de la dynamique moléculaire du protéome in vivo (diffusion neutronique). Au cours de ce travail, il a été mis en évidence un phénomène de survie à la basse salinité associé à des modifications morphologiques.Un autre objectif de ma thèse a été de contribuer à la compréhension du rôle dans la protéolyse intracellulaire du complexe aminopeptidasique TET, dans les conditions de stress mises en place dans les études précédentes. / Molecular systems described for Archaea show primitive and simple characteristics, compared to their homologous eukaryotes. In addition, extremophilic characteristic results in an hyper-robust which makes in vitro manipulation and structural studies much easier. Thus, Archaea represent good models for understanding complex cellular functions, particularly those that involve large molecular machines, such as those involved in proteolysis. My thesis consisted in understanding the resistance mechanisms and the importance of proteolytic systems in the adaptation of halophilic Archaea to environmental stresses. Halophilic Archaea accumulate multi-molar concentrations of KCl / NaCl in their cytosol (3.4M KCl / NaCl 1.1M for Halobacterium Salinarum). This requires a very special biochemistry that allows operation in solvents where free water is scarce. Thus, the proteins of these organisms are themselves halophilic and are soluble and folded only in extreme salinity conditions (2 to 5 M). This particular biochemistry partly explain the extraordinary ability of halophilic Archaea to resist physical and chemical stress (temperature, radiation, dehydration). We study the response of the halophilic Archaea strict H. salinarum at low-salinity stress. Indeed, beyond the osmotic shock, the fall of the environment salt concentration causes a decrease in the intracellular KCl concentration, which should have a direct effect on the folding state of intracellular protein, as in case of heat stress. In the first part of this thesis, a study was conduct to determine viability limits and cytosolic modifications, associated with a salinity decrease. These studies involve intracellular salt dosages, viability studies (microscopic counts, color live / dead), induction of chaperone proteins linked to stress response and biophysical neutron experiments, to evaluate the effect of stress on proteins folding. In this work, a phenomenon of survival at low salinity linked to morphological changes was revealed. To describe this phenomenon, this second study involves confocal microscopy experiences, fluorescence microscopy, viability tests, counting on box, scanning electron microscopy, electron microscopy by negative staining, salt intracellular dosages and proteins separation experiments, to study the overall proteome composition during low salinity stress. In this study, a fall of the intracellular K $^+$ concentration and the proteome clarification during stress was revealed. Low salt concentrations causes halophiles proteins denaturation, the accumulation of misfolded proteins in the cytoplasm involves chaperones systems and intracellular proteolysis machinery. In this context, another objective of my thesis was to contribute to the understanding of the intracellular proteolysis role in the PAN-proteasome system and in the aminopeptidase TET complex, in stress conditions established in previous studies. This part of the thesis involves experiments of endopeptidase activity assay, aminopeptidase activity assay, quantification of mRNA genic expression by Northern blot, immunoprecipitation, proteins separation by sucrose gradient and proteasome chemical inhibition (drug). We show the role of the PAN-proteasome system in stress response and we deepen our understanding of the aminopeptidase TET role in vivo. This protease appears to have an independent role of the proteasome complex. The protease TET seems to participate at the amino acids treatment in cells to maintain the metabolic activities in nutritional deficiencies.