A dor constitui uma experiência complexa, mediada por distintos sistemas de transmissão sendo integrados por diversos mecanismos neurais. Um dos modelos mais empregados para o estudo da dor neuropática é a secção nervosa periférica, a qual resulta em alterações neuroquímicas e neuroanatômicas em neurônios sensoriais primários e em seus territórios de projeção. Após a secção do nervo ciático, os mamíferos apresentam um aumento na expressão de genes precocemente expressos, como o c-Fos e o c-Jun, no corno dorsal da medula espinal. Animais não mamíferos, como os anfíbios, também vem sendo utilizados como modelos para os estudos dos mecanismos acerca da nocicepção. No presente estudo foi analisado o padrão de imunorreatividade à proteína c-Fos na medula espinal lombossacral e no gânglio da raiz dorsal (GRD) de rãs Rana catesbeiana em condições basais, bem como de rãs submetidas à manipulação e à secção do nervo ciático. Para isso foram utilizados animais adultos, de ambos os sexos, sendo que os mesmos foram sacrificados 3 dias após o procedimento cirúrgico. A técnica imunoistoquímica utilizada foi a do anticorpo não marcado de Sternberger (1979), sendo utilizado anticorpo primário do tipo policlonal, na concentração de 1:700. As alterações no padrão de imunorreatividade a esta proteína no GRD dos três grupos experimentais foram quantificadas através das técnicas de densitometria óptica e contagem neuronal. Para a quantificação da proteína c-Fos na medula espinal lombossacral dos 3 grupos experimentais, utilizou-se a técnica de western blot. Em GRD, a imunorreatividade foi mais pronunciada no citoplasma de neurônios de pequeno (10-20μm), médio (25-35μm), e grande 40-50μm) diâmetro dos 3 grupos experimentais. A manipulação e a secção do nervo ciático provocou aumento no número de núcleos imunorreativos de células de pequeno diâmetro. A densitometria óptica foi significativamente maior no citoplasma das células dos GRDs localizados ipsilateralmente quando comparada com aquela das células pertencentes aos GRDs localizados contralateralmente à lesão. Todavia, não houve diferenças estatisticamente significativa entre a imunorreatividade nuclear nos GRDs entre os 3 grupos experimentais. O número de células imunorreativas nestes gânglios não mostrou mudanças significativas nos 3 grupos experimentais. Na medula espinal, a imunorreatividade à proteína c-Fos ocorreu predominantemente em núcleos localizados nos campos terminais dorsal e ventral, na banda mediolateral, na região ventral medial do corno ventral e nos funículos lateral e ventral medial. Os neurônios motores sempre foram imunorreativos. A manipulação e a secção do nervo ciático resultaram em um acréscimo no número de núcleos imunorreativos localizados nos campos terminais dorsal e ventral, e banda mediolateral, sendo este aumento maior na região do campo terminal dorsal. As demais regiões não mostraram modificações significantes no padrão de imunorreatividade da proteína c-Fos. A expressão desta proteína não modificou significativamente nos 3 grupos experimentais. Estes resultados mostram que, em rãs, similar ao que ocorre em mamíferos, a ativação de fibras aferentes primárias ativam a proteína c-Fos. No entanto, diferente de mamíferos, esta proteína ocorre no citoplasma de células sensoriais. Assim, apesar das rãs constituírem excelentes modelos para o estudo do papel do c-Fos nos mecanismos da transmissão nociceptiva, os estudos futuros abordando esta questão deverão considerar esta particularidade das rãs.

HMGB1é a proteína não-histona mais abundante no núcleo celular e foi inicialmente descrita como reguladora da transcrição gênica por ligar-se ao DNA promovendo alterações conformacionais na fita dupla e assim permitindo a ação de outros fatores nucleares. Em 1999, a HMGB1 foi detectada no soro de pacientes com sepse em estágios tardios, e sua concentração plasmática foi inversamente proporcional à sobrevivência. Desde então a busca para elucidar o papel sinalizador da proteína nuclear HMGB1, tem gerado resultados paradoxais. HMGB1 é secretada por macrófagos, células dendríticas, tumores, células endoteliais e também é liberada com o processo de necrose. Duas classes de receptores já foram descritos estarem relacionados com a sinalização da HMGB1: RAGE e TLRs. As vias de transdução do sinal interno ativado por HMGB1 envolvem quinases da família das MAPK que convergem para a translocação nuclear de NF-κB. Suas primeiras ações caracterizadas relacionam-se ao processo pró-inflamatório, mas recentes pesquisas mostram a participação da HMGB1 na promoção da recuperação celular. Supõe-se que o fator limitante no direcionamento do sinal da proteína nuclear sejam suas concentrações e a especificidade celular. Com o intuito de relacionar a sinalização de HMGB1 e sua possível ação sobre agentes redox-sensíveis, utilizamos culturas de macrófagos peritoneais de ratos submetidas a 2 doses de HMGB1 e analisamos os níveis de nitritos no meio de cultivo celular; dosamos a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase; e avaliamos a translocação de fatores de transcrição para o núcleo. As duas concentrações de HMGB1 ativaram NF-κB, mas apenas a menor dose foi capaz de induzir um aumento na atividade enzimática da catalase. Ambas as doses não alteraram a atividade da superóxido dismutase e também não promoveram um acúmulo de nitritos. Nossos resultados comprovam que os efeitos da HMGB1 são dose-dependentes. Mais investigações ajudarão a elucidar se a HMGB1 em leves doses pode agir como um fator pré-condicionador. / HMGB1 is the non-histone protein most abundant in the cell nucleus. This protein was initially described as a DNA-binding agent that promotes transcription regulation by bending the double-helix, thus allowing the action of nuclear factors. In 1999, serum HMGB1 was detected in sepsis patients with time delay. HMGB1 concentrations and survival were inversely proportional. Then, the search for HMGB1 actions has generated inverse results. HMGB1 is secreted by macrophages, dendritic cells, endothelial cells and tumors cells; however, during the process of necrosis, HMGB1 is released to extracellular environment. Two receptor families were described: RAGE and TLRs. The HMGB1 transduction signals involve MAPK kinases that converge to NF-κB translocation. HMGB1 actions were related with pro-inflammatory process, but recent research showed HMGB1 beneficial effects. Protein concentrations could cause different tissue-specific responses. Our purpose was to analyze macrophages responses to low doses of HMGB1. Rat peritoneal macrophage cultures were treated with two HMGB1 concentrations. Supernatant nitrites, superoxide dismutase activity and catalase activity were determined. Plus, transcriptional factor translocation was evaluated. Both HMGB1 concentrations activated NF-κB, but only the low HMGB1 concentration induced an increase in the catalase enzymatic activity. Both HMGB1 concentrations did not alter the superoxide dismutase activity and also they did not change nitrite amount. Our results showed biological HMGB1 effect. More studies will help elucidate the HMGB1 role primed-like agent.

A utilização de proteína texturizada de soja (PTS) como ingrediente em alimentos visa substituir ou complementar outros tipos de proteínas de maior custo, melhorar as características do produto final, aumentar o valor nutricional e reduzir custos de produção. Embora a sua utilização seja cada vez mais comum, poucos trabalhos a respeito de PTS foram realizados. Dessa forma, torna-se importante a realização de estudos que apresentem informações que sejam relevantes para o armazenamento e processamento desse produto. O presente trabalho objetiva: (i) estudar os efeitos da variação de parâmetros de secagem (temperatura e velocidade do ar e altura de produto) no comportamento de duas PTS; (ii) determinar as isotermas de sorção e, a partir das equações de sorção obtidas, calcular as principais propriedades termodinâmicas do produto; (iii) determinar a temperatura de transição vítrea do produto. Foram estudados dois tipos de PTS, que diferem quanto à forma e tamanho, tendo a PTS I forma de flake e PTS II forma de chunks. Foram determinadas as isotermas de sorção estáticas nas temperaturas de 10, 20, 30 e 40ºC, utilizando valores de atividade de água entre 0,10 e 0,85. Quatorze modelos foram ajustados aos dados experimentais. Houve aumento da umidade de equilíbrio com o decréscimo da temperatura para os dois produtos. Os modelos de GAB e Peleg apresentaram os melhores resultados no ajuste dos dados de sorção de PTS I e PTS II, respectivamente. As isotermas dinâmicas foram estudadas nas umidades relativas (UR) de 43, 70 e 97% a 20 e 30ºC, através do monitoramento da umidade ao longo do tempo. Observou-se que a adsorção de água por parte do produto ocorre principalmente nos primeiros dez dias para os dois produtos. Foram calculadas as propriedades termodinâmicas: entalpia diferencial, entropia diferencial e energia livre de Gibbs, a partir dos modelos de isoterma de sorção estática. A entalpia e entropia diferenciais aumentaram exponencialmente com o decréscimo da umidade de PTS I e PTS II, satisfazendo, inclusive, a teoria compensatória. A energia livre de Gibbs apontou que a sorção de água é um processo favorável para PTS I e não espontâneo para PTS II. Na secagem, foram avaliadas as curvas de secagem em diferentes condições de temperatura (90 a 130ºC) e velocidade (70 a 150 cm/s) do ar de secagem e altura da camada de produto (4 a 8 cm para PTS I e 3 a 9 para PTS II) no interior do secador. Foi observado que apenas a velocidade do ar não influencia o tempo total de secagem de PTS II, sendo que todos os fatores têm influência sobre o comportamento de secagem de PTS I. Três modelos de secagem foram ajustados, sendo o modelo de Page o que melhor ajustou os dados experimentais dos dois produtos. A análise de transição vítrea foi realizada para PTS I pelo método DSC (Differencial Scanning Calorimetry), mas não foi possível determinar a curva de transição vítrea da PTS. Os resultados obtidos servem como um ensaio preliminar para futuros trabalhos na área. CAPES e The Solae Company apóiam este trabalho. / Textured soy protein (TSP) is used as food ingredient in order to substitute or complement high cost proteins, improving final product characteristics, increasing nutritional value and reducing production costs. Although TSP has been used ordinarily, few papers about it are available in the literature and it is important to carry out studies that show relevant information about storaging and processing of this product. The aim of this work is (i) to study the variation effects of drying process parameters (temperature and velocity of the drying air and height of product) on the behavior of two different types of TSP; (ii) to obtain the sorption isotherm and calculate some thermodynamic properties of the product; (iii) to obtain the glass transition temperature of the product. Two commercial types of TSP have been studied, which difference is the shape and size of the particle. TSP I is a flake and TSP II is a chunk. Static soprtion isotherms was determined on 10, 20, 30 and 40ºC, within a range of 0,10 to 0,85 water activity. Fourteen well-known isotherm sorption’s models were applied to identify the one which fits experimental dada better. Generally, the moisture content of both products are higher at higher RH and lower temperature. GAB e Peleg model was considered the best for fitting PTS I and PTS II data respectively. Dynamic EMC were determined at 20 and 30ºC and 43, 70 and 97% of relative humidity (RH). Generally, moisture adsorption take place in the fisrt ten days of study for both products. Thermodynamic properties, such as differential enthalpy, differential entropy and Gibbs free energy, were evaluated from static sorption isotherm’s best model. Differential enthalpy and entropy raised exponentially as moisture content decreased, for PTS I and PTS II, satisfying compensation theory. Gibbs free energy states that sorption is a spontaneous process for TSP I and non-spontaneous for TSP II. Drying experiment evaluate different conditions of drying air temperature (90 to 130ºC) and velocity (70 to 150 cm/s) and height of product (4 to 8 cm for TSP I and 3 to 9 cm for TSP II) on the dryer cabinet. It was observed that only air velocity didn’t show influence on TSP II drying total time, but other factors influence drying behavior of TSP II. Three drying models were fitted, but Page’s model had the best result. Glass transition analyses were done for PTS I by DSC, but it wasn’t possibly to determine glass temperature. Results can be used as a preliminary study to another project. CAPES and The Solae Company support this project.

O efluente gerado na produção de isolados protéicos a base de soja é um efluente de altíssima carga orgânica, composto, basicamente, por proteínas e carboidratos solúveis em meio aquoso; exige, portanto, um sistema de tratamento bastante qualificado, o qual requer um espaço físico elevado e a adição de grandes volumes de reagentes químicos. O objetivo deste trabalho consiste em avaliar a aplicação de dois processos alternativos para o pré-tratamento deste efluente bruto e o comportamento do sistema primário de tratamento existente atualmente (composto por dois reatores anaeróbios acidogênicos, um reator tubular e um sedimentador circular) ao receber os efluentes gerados nestes processos de pré-tratamento. Um sistema de membranas de ultrafiltração (três membranas cerâmicas tubulares de 5, 20 e 50 kDa) e um novo agente químico a base de sílica que atua na etapa de coagulação/floculação foram os processos de pré-tratamento estudados a fim de reduzir a carga orgânica do efluente bruto. A membrana de 20 kDa apresentou o menor fluxo permeado em função dos fenômenos de compactação, polarização por concentração e fouling; a membrana de 50 kDa proporcionou os menores percentuais de retenção. A membrana de 5 kDa obteve os melhores resultados (menor diminuição do fluxo permeado em função do tempo, menor percentual de fouling e maiores percentuais de retenção. O prétratamento com o agente químico a base de sílica não gerou resultados satisfatórios em relação à remoção da DQO do efluente e à estabilidade dos flocos formados durante o processo e foi, portanto, considerado inviável. Resultados muito satisfatórios foram obtidos a partir do desenvolvimento de um sistema primário de bancada (comportamento semelhante ao sistema primário industrial, com remoções de 24% de DQO, 49% de proteína e 76% de SST); quando este sistema tratou o permeado da membrana de UF, remoções inferiores foram obtidas (4% de ST, 41% de SST, 12% de DQO e 21% de proteína). Os resultados comprovaram, que a implementação do pré-tratamento com membranas de UF seria de grande valia para o sistema de tratamento de efluentes atual. Em função da elevada remoção de sólidos e nutrientes obtida durante os processos conjuntos de pré-tratamento e posterior tratamento primário do permeado, sugere-se a manutenção do sistema primário atual. / The isolated soy protein (ISP) production generates a very high organic load wastewater, composed by soluble proteins and carbohydrates; very efficient wastewater treatment systems are required, which demand a significant physical space. The objective of this study is the evaluation of two alternative processes application on the ISP production effluent pre-treatment and of the current primary system behavior (involving an anaerobic acidogenic reactor, a tubular reactor and a sedimentation tank) when treating the “new” effluents obtained with the studied pretreatment. The introduction of an ultrafiltration membrane system (three tubular ceramic membranes with 5, 20 e 50 kDa) and the use of a new chemical agent which acts at the coagulation/flocculation steps were studied to reduce the raw wastewater organic load. The 20 kDa membrane showed the smaller permeate flux as a consequence of the compactness, concentration polarization and fouling phenomena; with the 50 kDa membrane the lowest retention were obtained. The 5 kDa membrane presented the best results: an elevated retention (34% of COD, 52% of protein, 21% of TS and 86% of TSS) and the less fouling tendency. The pre-treatment with the new chemical agent did not generate satisfactory results relating to wastewater COD removal and to the stability of the formed flocks. This process was, therefore, rejected. A bench scale primary treatment system was developed; very satisfactory results were obtained when treating the raw wastewater (it presented a behavior very similar to the industrial primary system, with removal of 24% COD, 49% protein and 76% TSS). When treating the membrane system permeate, however, this system removed only 4% TS, 41% TSS, 12% COD and 21% protein. The results confirmed that the membrane pre-treatment implementation would be very useful to the current wastewater treatment system. Due to the great solids and nutrient removal during the membrane pre-treatment followed by the primary treatment of the permeat, it is suggested the maintenance of the current primary treatment system, even if the membrane pre-treatment is used.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-11T12:22:59Z No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-11T12:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Entamoeba histolytica, o agente etiológico da amebíase, constitui a segunda maior causa de morte por protozooses, sendo considerado um grave problema de saúde pública, particularmente em países em desenvolvimento. A morte celular induzida por este parasito entérico é dependente de contato e mediada por proteínas específicas, as quais modulam diversos eventos fisiológicos no hospedeiro. Dentre os mecanismos reguladores de tais respostas está a desfosforilação de grupos fosfotirosil de proteínas, através da atuação de proteína tirosina fosfatases (PTPases), tanto expressas na superfície celular como secretados pelo trofozoíto. Alguns estudos demonstram uma rápida diminuição nos níveis de fosforilação de resíduos tirosina em proteínas de células-alvo após o contato com E. histolytica. Estas PTPases têm sido descritas como tendo importante papel na patogênese da amebíase. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil de atividade fosfatásica em diferentes cepas de E. histolytica, assim como caracterizar a sua sensibilidade a conhecidos inibidores de proteína tirosina fosfatases, e os efeitos destes moduladores em mecanismos envolvidos na patogênese, a exemplo de fagocitose e efeito citopático. Inicialmente, a sensibilidade aos moduladores da via de sinalização celular em trofozoítos de E. histolytica (cepas ICB – 452, ICB – CSP e HM1:IMSS) foi caracterizada através de avaliação da proliferação celular, onde inóculos de parasitos foram incubados em presença ou ausência de inibidores de PTPases. Dentre os moduladores testados, o derivado de vanádio bisperoxo (1, 10 - fenantrolina) oxovanadato de potássio (bpVphen) e o óxido de fenilarsina (PAO) demonstraram efetiva capacidade antiproliferativa. Estas células apresentaram uma maior sensibilidade ao PAO em comparação ao bpV(phen), com valores de IC50 para a cepa HM1:IMSS de 0,9 μM e 38,4 μM, respectivamente. A análise bioquímica revelou que há uma maior atividade secretória e ectofosfatásica na linhagem HM1:IMSS (24,48 nM p-NP/40 min./3 x 106 células e 297 nM p-NP/40 min./2 x 105 células, respectivamente), e uma redução desta atividade foi detectada na presença dos derivados de vanádio na superfície do parasito (31,3 nM p-NP/40 min./2 x 105 células). O mesmo não foi observado após a adição de PAO. A análise da eritrofagocitose e da destruição da monocamada de células epiteliais da linhagem MDCK, importantes marcadores de virulência neste patógeno, demonstrou significativa redução destes processos em trofozoítos tratados com os inibidores ortovanadato de sódio (OVS) e o bpV(phen), indicando a participação de PTPases nos mesmos. Estas mesmas alterações foram observadas após o tratamento do parasito com PAO, porém dados ultraestruturais de citoquímica enzimática não indicam a redução da atividade fosfatásica por este composto. Estes dados foram confirmados após a avaliação da atividade das frações purificadas de homogenatos solubilizados de trofozoítos de E. histolytica, onde detectou-se a redução dos níveis de atividade enzimática após a adição de vanadato e seus derivados à reação, o que não pôde ser observado após o acréscimo de PAO. Os resultados obtidos indicam que PTPases estão diretamente envolvidas em importantes funções celulares exercidas por trofozoítos de Entamoeba histolytica. Ademais, novos estudos que visem à elucidação dos possíveis modos de ação do composto PAO neste patógeno poderiam contribuir, consideravelmente, com o entendimento da biologia do parasito e, consequentemente, dos mecanismos patogênicos da amebíase. / The microaerophilic protozoan Giardia lamblia inhabits the upper small intestine mucosa of vertebrate hosts, where it is exposed to different concentrations of oxygen. Despite the fermentative metabolism, Giardia trophozoites consume O2 and produce oxygen free radicals and therefore mechanism for detoxification are required. Devoid of glutathione, Giardia express high concentrations of cystein-rich proteins (CRP, also known as variable surface protein or VSP), as an antioxidant defense. This mechanism involves redox cycling for maintenance of a reduced intracellular environment and protection from oxidative stress. In this regard, substances that interfere in the antioxidant response of this protozoan could comprise a powerful chemotherapeutic strategy for Giardia lamblia infection. Here, we analyzed the effects of DETC, a superoxide dismutase (SOD) inhibitor, on parasite proliferation, thiol expression, lipid peroxidation, free radicals detection and cell architecture. DETC inhibited parasite proliferation at levels similar to metronidazole and induced peroxidation of membrane, possibly by the increase of reactive species.Ultrastructural alteration were also observed. Since this protozoan is devoid of SOD, here present data indicate SOD-independ DETC effects. Thiol groups detection with the fluorescent probe o-phthaldialdehyde (OPA). Cells treated with DETC displayed washed out cytoplasm and structures indicative of autophagy. The peripheral vesicles also had an increased volume, presumably caused by homophilic fusion. Taken together these data indicate that DETC enhance the oxidative stress in Giardia trophozoites by reacting with thiol groups.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-02-17T17:49:04Z No. of bitstreams: 1 Cintia Figueiredo de Araújo Investigação sobre uma atividade...2013.pdf: 1673861 bytes, checksum: b9ab47b2dff7a275b8deca0557230323 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-17T17:49:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cintia Figueiredo de Araújo Investigação sobre uma atividade...2013.pdf: 1673861 bytes, checksum: b9ab47b2dff7a275b8deca0557230323 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / Os protozoários do gênero Leishmania são parasitos intracelulares que causam um conjunto de doenças, as leishmanioses, em milhões de pessoas no mundo. As leishmanias secretam moléculas que modulam o sistema imune do hospedeiro, contribuindo para o estabelecimento da infecção por interferirem na atividade microbicida do macrófago. Os objetivos desse trabalho foram identificar proteínas de Leishmania com atividade imunomoduladora e caracterizar essa imunomodulação. No trabalho foram avaliados os efeitos potenciadores de polipeptídeos da cinesina recombinante de Leishmania infantum, do extrato de Leishmania braziliensis (ELb) e de frações purificadas do extrato de Leishmania amazonensis (ELa), tratados ou não com inibidores de serina ou cisteína proteases, sobre a infecção por L. braziliensis, em camundongos BALB/c. Os animais foram acompanhados semanalmente, durante 6 semanas pós infecção, para a mensuração dos tamanhos das lesões. Após a eutanásia foi realizada a diluição limitante das lesões, a quantificação das concentrações de IL-4 e IL-10 da cultura em leucócitos estimulados com anti-CD3 e a semiquantificação de IgG1 e IgG2a do soro. Frações do ELa foram processadas por técnicas de espectrometria de massas para identificação de proteínas. Foi observado que frações de pesos moleculares aparentes de 28, 36, 45, 68 kDa do ELa foram capazes de potenciar a infecção por L. braziliensis, assim como um polipeptídeo da cinesina recombinante de L. infantum com motivos repetitivos e ELb contendo 5 μg de proteína. Quando as frações de 28 e 68 kDa foram tratadas com os inibidores de serina proteases, elas perderam a capacidade de potenciar a infecção por L. braziliensis, apesar de não terem sido identificadas serina proteases nessas frações por espectrometria de massas. / Leishmania are intracellular parasites that cause a group of diseases, the leishmaniases. Millions of people worldwide are infected with those protozoa. They secrete molecules that modulate the host immune system, allowing the establishment of the infection by interfering in the microbicidal activity of macrophages. The aims of this study were to identify proteins of Leishmania with immunomodulatory activity and characterize this immunomodulation. In this study the infection-enhancing effects of recombinant kinesin polypeptides of Leishmania infantum, Leishmania braziliensis extract (LbE) and purified fractions of the Leishmania amazonensis extract (LaE), treated or not with inhibitors of serine or cysteine proteases, on BALB/c mice infected with L. braziliensis. Animals were monitored weekly for 6 weeks post-infection for measuring the size of the lesion and after euthanasia were carried out at limiting dilution of the lesion, dose of IL-4 and IL-10 from culture supernatant of cells in draining lymph nodes lesion and determination of IgG1 and IgG2a serum. Fractions were processed by techniques of mass spectrometry for protein identification. Iit was seen that fractions of LaE with apparent molecular weights of 28, 36, 45, and 68 kDa were able to excarcebate the cutaneous disease caused by L. braziliensis, as were a recombinant kinesin polypeptide of L. infantum with repetitive motifs and LbE at a dose of 5 μg. However, when the fractions of 28 and 68 kDa were treated with inhibitors of serine proteases, they lost their ability to potentiate the infection by L. braziliensis, despite the fact that peptides of serine proteases were not identified in those fractions by mass spectrometry.

GUIMARÃES, Wellinson Gadêlha. FixL Híbrida da Bactéria Rhizobium etli: Estudos Conformacionais e de Estabilidade. 2016. 74 f. Dissertação (Mestrado em Química)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Weslayne Nunes de Sales (weslaynesales@ufc.br) on 2017-03-27T11:47:49Z No. of bitstreams: 1 2016_wgguimaraes.pdf: 2399264 bytes, checksum: 6b01ad2806daa748fbbbddeee1ed0c0d (MD5) / Approved for entry into archive by Jairo Viana (jairo@ufc.br) on 2017-03-27T22:56:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_wgguimaraes.pdf: 2399264 bytes, checksum: 6b01ad2806daa748fbbbddeee1ed0c0d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T22:56:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_wgguimaraes.pdf: 2399264 bytes, checksum: 6b01ad2806daa748fbbbddeee1ed0c0d (MD5) Previous issue date: 2016 / Heme-based sensors are a class of hemeproteins that studies are relatively recent. Heme-based sensor are capable to reversibly bind to molecules such as O2, CO and NO ligands through iron atom, leading to conformational changes that govern adptative responses, make them actives or inactives to a response. FixL is a histidine kinase found in several bacteria Rhyzobium, being involved in microaerobic respiration and nitrogen metabolism processes. This protein has been extensively studied and is considered a model system to heme-based sensors that are histidine kinases. Its mechanisthic elucidation may help to understand many similar systems. In this work protein FixL from Rhyzobium etli, until now one only of genre that was studied, was produced and purified aiming to investigate conformational and stability aspects. Therefore, it was used Circular Dichroism (CD) to estimate the kind of secondary structure in FixL in a active state. It was revealed that it is majority organized on α-helices. After, it was investigated the possible conformational changes that FixL protein may have when its activity is changed due to be bounded to a signalizing ligand. Interesting results obtained suggest the potential use of CD technique and electronic spectroscopy to assess structural changes from an active state to inactive one that apparently occur by changing the tertiary structures. The results suggest that the heme interactions with nearby protein side chains are involved in loss of activity from FixL to bind O2 or CN-. Finally, stability studies by thermal and chemical denaturation showed that FixL is less stable than many other heme proteins, and that there are significant differences in stability between the active state and the inactive state, particularly with regard to chemical denaturation, although not had significant differences in the thermal stability. These differences in stability were explained in the light of a model in which the protein becomes more compact when it is enzymatically active by interaction inter / intra domains. / Heme proteínas sensoras (HPS) são uma classe de heme proteínas cujos estudos são relativamente recentes. As HPS são capazes de se ligar reversivelmente a moléculas como O2, CO e NO por meio do ferro do seu grupo heme, o que leva a alterações estruturais que governam as respostas adaptativas, tornando-as ativas ou inativas para uma resposta. A FixL é uma histidina quinase encontrada em várias bactérias do gênero Rhizobium, estando envolvida nos processos de respiração microaeróbica e no metabolismo do nitrogênio. Esta proteína tem sido bastante estudada, sendo considerada um sistema modelo para hemeproteínas sensoras que desempenham função histidina quinase, e cuja elucidação mecanística pode ajudar a entender diversos sistemas semelhantes. Neste trabalho foi produzida e purificada a proteína FixL da bactéria Rhyzobium etli, única do gênero estudada até agora, tendo como finalidade investigar aspectos conformacionais e de estabilidade. Desta forma, empregou-se espectroscopia de dicroísmo circular (CD) para estimar os tipos de estrutura secundária desta proteína em seu estado nativo, sendo revelado que sua estrutura se encontra majoritariamente na forma de α-hélices. Posteriormente, foram investigadas as possíveis alterações conformacionais que a proteína sofre por ocasião da mudança na sua atividade enzimática provocada por ligantes sinalizadores. Os interessantes resultados obtidos ilustram a potencialidade da técnica de CD e espectroscopia eletrônica em avaliar alterações estruturais de um estado ativo para inativo que ocorrem aparentemente através da mudança das estruturas terciárias. Os resultados sugerem que as interações do grupo heme com as cadeias protéicas laterais próximas estão envolvidas na perda de atividade da FixL ao se ligar ao O2 ou ao CN-. Por fim, os estudos de estabilidade por desnaturação térmica e química mostraram que a FixL é menos estável que diversas outras heme proteínas, e que existem diferenças significativas de estabilidade entre o estado ativo e o estado inativo, particularmente quanto à desnaturação química, apesar de não haverem diferenças significativas em relação à estabilidade térmica. Essas diferenças na estabilidade foram explicadas à luz de um modelo em que a proteína se torna mais compacta quanto está enzimaticamente ativa através de interações inter/intra domínios.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-05T10:47:04Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697109 bytes, checksum: b09f59fa66f67bef03e4ec1048cf1eea (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-05T10:47:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697109 bytes, checksum: b09f59fa66f67bef03e4ec1048cf1eea (MD5) Previous issue date: 2001-12-28 / O chaperone molecular residente do retículo endoplasmático (RE), denominado BiP “Binding Protein”, é membro da classe Hsp70 de proteína de estresse, sendo regulado em resposta a condições de estresse do RE, como acúmulo de proteínas desdobradas e desequilíbrio na homeostase de cálcio. Em condições normais, BiP de mamíferos sofre fosforilação e oligomerização. As modificações de BiP de mamíferos são restritas à forma oligomérica, sendo que a forma monomérica inalterada representa a espécie ativa. Recentemente, foi demonstrado que BiP de soja existe como formas fosforiladas e desfosforiladas interconversíveis, e o equilíbrio pode ser deslocado em qualquer direção em respostas a diferentes estímulos. Em contraste com o tratamento com tunicamicina, o estresse osmótico estimula a fosforilação das espécies de BiP em cultura de células de soja. Nesta investigação foi demonstrado que, independentemente do seu estado de oligomerização, as isoformas de BiP de folhas, sob déficit hídrico, exibem atividade de ligação a proteínas, indicando que a regulação de BiP de plantas pode diferir de outros eucariotos. Foi também caracterizado o estado de oligomerização das isoformas de BiP de soja induzidas por estresse osmótico e tunicamicina. Assim como em células de mamíferos, tanto a forma oligomérica como a monomérica foram detectadas em células de soja não-estressadas. A desfosforilação de BiP mediada por tunicamicina é acompanhada pela conversão da forma oligomérica para a monomérica. Entretanto, a forma fosforilada de BiP induzida por estresse osmótico existe predominantemente como espécie monomérica. Esses resultados indicam que a fosforilação de BiP induzida por estresse osmótico não media a oligomerização da proteína, e pode ter uma função regulatória distinta. A função protetora de BiP em planta foi examinada em condições de estresse hídrico. Plantas transgênicas de Nicotiana tabacum expressando constitutivamente níveis elevados de BiP ou seu cDNA anti-senso foram sujeitas à condição de déficit hídrico progressivo. Elevados níveis de BiP nas linhagens senso conferiram tolerância ao déficit hídrico durante o crescimento das plantas. Sob seca progressiva, os níveis de BiP foliar correlacionaram com a manutenção da turgescência celular e com o conteúdo de água da parte aérea. O efeito protetor da superexpressão de BiP contra estresse hídrico foi anulado pela repressão anti-senso. Embora a superexpressão de BiP previna a desidratação celular, a condutância estomática e a taxa transpiratória em folhas senso estressadas foram superiores em relação às folhas controles e anti-senso. Em plantas anti-senso, a indução do sistema de defesa antioxidativo foi maior do que nas plantas controle, enquanto que em folhas senso estressadas a indução da atividade da superóxido dismutase não foi observada. Coletivamente, esses resultados evidenciam que a superexpressão de BiP em plantas pode conferir tolerância à seca, prevenindo o estresse oxidativo endógeno. / The endoplasmic reticulum molecular chaperone BiP is a member of the Hsp70 family of stress-related protein, that is up-regulated in response to ER-stress condition, such as accumulation of unfolded protein and disruption of the cellular Ca 2+ homeostasis. The mammalian BiP undergoes phosphorylation and oligomerization under normal conditions. Modification of mammalian BiP is restricted to the oligomeric form and the monomeric unmodified form represents the active species. In fact, the glycosylation inhibitor tunicamycin induces dephosphorylation of mammalian BiP, which is accompanied by conversion of the oligomeric BiP pool to the monomeric form. Recently, we have shown that the soybean BiP exists in interconvertible phosphorylated and unphosphorylated forms and the equilibrium can be shifted to either direction in response to different stimuli. In contrast to tunicamycin treatment, osmotic stress stimulates phosphorylation of BiP species in soybean cultured cells. Here we demonstrated that despite their phosphorylation state, the BiP isoforms from water-stressed leaves exhibited protein-binding activity, suggesting that plant BiP functional regulation may differ from other eukaryotic BiPs. We have further characterized modifications of the tunicamycin and osmotic stress-induced soybean BiP forms. Like in mammalian cells, both monomeric and oligomeric soybean BiP species were detected in untreated soybean cells. Tunicamycin-mediated dephosphorylation of BiP is accompanied by the conversion of the oligomeric form to its monomeric form. Likewise, the hyperphosphorylated osmotic stress-induced soybean BiP exists predominantly as monomeric species. These results suggest that osmotic stress- induced phosphorylation of soybean BiP does not mediate oligomerization of the protein and may serve as a distinct regulatory function. We have also examined the protective function of BiP against water stress at the whole plant level. Transgenic Nicotiana tabacum plants constitutively expresssing elevated levels of BiP or its antisense cDNA were subjected to progressive drought. Elevated levels of BiP in transgenic sense lines conferred tolerance to water deficit during plant growth. Under progressive drought, the leaf BiP levels correlated with the maintenance of the shoot cellular turgor and water content. The protective effect of BiP overexpression against water stress was disrupted by expression of an antisense BiP cDNA construct. Although overexpression of BiP prevented cellular dehydration, the stomatal conductance and transpiration rate in droughted sense leaves were higher than in control and antisense leaves. In antisense plants, the water-stress stimulation of the antioxidative defeses was higher than in control plants, whereas in droughted sense leaves an induction of superoxide dismutase activity was not observed. Collectively, these results demonstrate that overexpression of BiP in plants may confer tolerance to drought by preventing endogenous oxidative stress. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T16:51:24Z No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 16597 bytes, checksum: c188d7e42b6952425efca3c5a93ee706 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T16:51:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 resumo.pdf: 16597 bytes, checksum: c188d7e42b6952425efca3c5a93ee706 (MD5) Previous issue date: 2003-08-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Leveduras presentes na microbiota do ambiente da indústria de queijo possuem propriedades potenciais de interesses biotecnológicos. O banco de leveduras do Laboratório de Fisiologia de Microrganismos (Bioagro – UFV) contém centenas de leveduras obtidas de cinco diferentes laticínios da Zona da Mata de Minas Gerais, das quais 94 foram testadas neste trabalho, sendo a levedura com maior atividade proteolítica extracelular selecionada. Determinaram-se as condições fisiológicas de cultivo dessa levedura que propiciaram atividade proteolítica máxima, bem como caracterizaram-se propriedades química e cinética das proteases extracelulares. Um total de 74 leveduras foram positivas para proteases extracelulares em ágar caseinato de sódio. As leveduras codificadas como 5-BV-ed 4 e 5-BXII- 1 foram isoladas da superfície de queijo tipo Edam e da mesa de manipulação, respectivamente. A levedura 5-BXII- 1 , a qual obteve a maior atividade proteolítica, foi submetida a cultivo em diferentes fontes de nitrogênio, sob diferentes concentrações. Em sulfato de amônio, a constante de afinidade (K S ) foi de 0,012 g.L -1 e a velocidade máxima de crescimento (μ max ), de 0,36 h -1 . Em casaminoácidos, K S foi de 0,20 g.L -1 e μ max , de 0,39 h -1 . Já, em caseína, K S foi de 0,34 g.L -1 e μ max , de 0,54 h -1 . Baixas concentrações de sulfato de amônio induziram maior atividade proteolítica por massa de células em culturas conduzidas sob regime de batelada. Maior atividade proteolítica esteve associada ao crescimento exponencial de leveduras cultivadas em batelada, tendo casaminoácidos como fonte de nitrogênio. Em cultura contínua sob condições limitantes de casaminoácidos, observaram-se resultados antagônicos, isto é, altas vazões específicas de alimentação (correspondentes a altas velocidades específicas de crescimento) resultaram em menor atividade proteolítica, enquanto baixas vazões específicas de alimentação (correspondentes a menores velocidades de crescimento) estiveram associadas às atividades proteolíticas máximas. Atividade proteolítica máxima foi observada na faixa de pH de 7,0 a 8,5 e temperatura de 35 °C. Embora 50% da atividade máxima tenha sido detectada de 45 a 70 °C, a atividade proteolítica em função da concentração do substrato azocaseína seguiu o modelo cinético de Michaelis e Menten. A atividade proteolítica no extrato enzimático foi inibida por EDTA, PMSF e pepstatina e pelos íons metálicos divalentes Co +2 , Mg +2 e Zn +2 e ativada pelo Mn +2 . Esses resultados indicam a presença de proteases da classe das aspartil proteases, metaloproteases e serino proteases no extrato enzimático extracelular da levedura 5-BXII- 1 . / Yeast growing in cheese manufacturing environments possess properties of potential biotechnological interest. The yeast collection at the Microbial Physiology Laboratory (Bioagro-UFV) includes hundreds of yeast collected at five different dairies in the Zona da Mata of Minas Gerais State, ninety-four of which were tested to select that with the highest extracellular proteolytic activity. Growth conditions were optimized for maximum proteolytic activity by the selected yeast and the chemical and kinetic properties of its extracellular proteases were characterized. A total of 74 yeast tested positive for extracellular proteases in sodium caseinate agar. Yeasts 5-BV-ed4 and 5-BXII- 1 were isolated from the surface of Edam cheese and a cheese dairy countertop, respectively. Yeast 5-BXII- 1 presented the highest proteolytic activity and was thus grown on varying concentrations of different nitrogen sources. Nitrogen source half- saturation constants (K s ) and the maximum specific growth rates (μ max ) were xv0.012g.L -1 and 0.36 h -1 for ammonium sulfate, 0.20 g.L -1 and 0.39h -1 for casaminoacids and 0.34 g.L -1 and 0.54 h -1 for casein. Lower ammonium sulfate concentrations induced higher specific proteolytic activity in batch cultures. Higher proteolytic activity was found during exponential growth of batch cultures when casaminoacids were the nitrogen source. Antagonistic results were observed for continuous cultures under casoaminoacid limiting conditions. Higher specific substrate flowrates (corresponding to high specific growth rates) resulted in lower proteolytic activity while low specific substrate flowrates (corresponding to lower growth rates) were associated with maximum proteolytic activities. Maximum proteolytic activity was observed in a pH range of 7,0 to 8.5 and at a temperature of 35 o C, although 50% of the maximum activity was detected at 45 and 70 o C. Proteolytic activity followed Michaelis-Menten kinetics when azocasein was used as substrate. Enzyme extract proteolytic activity was inhibited by EDTA, PMSF, pepstatin and the divalent metal ions Co 2+ , Mg 2+ and Zn 2+ , while it was activated by Mn 2+ . These results indicate the presence of aspartyl, serine and metalo proteases in the extracellular enzyme extract of yeast 5-BXII- 1 .

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-07-11T11:27:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 904628 bytes, checksum: 5d0accfed4bf3ffa5b534f9e166eeacc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-11T11:27:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 904628 bytes, checksum: 5d0accfed4bf3ffa5b534f9e166eeacc (MD5) Previous issue date: 2001-08-09 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A proteína BiP (Binding Protein) está envolvida no dobramento correto de proteínas secretórias e retenção no RE de proteínas dobradas ou montadas incorretamente. BiP também atua auxiliando na solubilização de agregados protéicos durante períodos de estresses. Dois clones de BiP de soja, denominados gsBiP6 e gsBiP9, foram isolados a partir das bibliotecas genômicas provenientes dos fagos λEMBL3 e λZAP II, respectivamente. Os promotores de gsBiP6 e gsBiP9 possuem cis-elementos gerais, característicos de promotores de genes de plantas, como as seqüências de transcrição CAAT e TATA, e cis-elementos que respondem a estresses do retículo endoplasmático (ERSE), além de elementos G-box. Os promotores de BiP foram fusionados ao gene repórter gus e usados para transformar Nicotiana tabacum via A. tumefaciens. Análises histoquímicas de plantas transformadas com as construções -358pbip6-gus ou -2200pbip9-gus revelaram que os promotores de BiP produziram um padrão uniforme de expressão de GUS em folhas, caules e raízes. Intensa atividade histoquímica de GUS foi observada nos feixes vasculares de folhas, caule e raízes e em regiões de traço foliar, assim como, no meristema apical, local onde ocorre intensa divisão celular. Este padrão de distribuição espacial da atividade de GUS sugere estar correlacionado com uma expressão desses genes em tecidos que apresentam alta atividade celular secretória e alta proporção de células em um processo ativo de divisão celular. Coerente com esta observação, a atividade histoquímica de GUS é muito menos intensa no parênquima xilemático. Deleções do promotor de gsBiP6 foram conduzidas na orientação 5’-3’ (- 138pbip6-gus) e no interior do clone Δ(-226/-82)pbip6-gus. Análise dessas deleções em plantas transformadas, identificaram 2 domínios regulatórios cis-atuantes, denominados CRD1 (-358 a -226) e CRD2 (-226 a -82). A região CRD1 exibe atividade de enhancer, já que foi capaz de restaurar altos níveis de expressão basal do gene repórter gus, quando ligada à extremidade 5’ na posição -82 do promotor de BiP6. A região CRD2 contém tanto cis -elementos regulatórios positivos quanto cis -elementos negativos que contribuem para o padrão tecido-específico de expressão controlado pelo promotor de gsBiP6. A expressão do gene repórter na região do procâmbio em raízes, no meristema apical e no floema de caule foi absolutamente dependente da região CRD2. Em contraste, deleção de CRD2 resultou em acúmulo acentuado de atividade de GUS no parênquima xilemático. A ativação dos promotores BiP6 e BiP9 em resposta ao acúmulo de proteínas anormais no retículo endoplasmático (UPR) e em respostas a estresse osmótico foi avaliada em discos foliares transgênicos. Tratamento dos discos foliares com tunicamicina, ativador da via UPR, e com PEG, indutor de um estresse osmótico, induziu a expressão de GUS, sob o controle do pro motor BiP6 e do promotor BiP9. A deleção da região CRD2 (-226 a -82) no promotor BiP6 causou a perda da inducibilidade da expressão gênica em resposta a tunicamicina e PEG, indicando que CRD2 contém elementos cis-atuantes de resposta a estresse. De fato, dois cis-elementos conservados atuantes na via UPR (UPRE) foram identificados na região CRD2. Coletivamente, estes resultados sugerem que o controle da expressão de BiP em plantas depende de uma complexa integração de múltiplos cis-elementos regulatórios no promotor. / The binding protein BiP is involved in the correct folding of secretory proteins and retention in the RE of unfolded proteins. BiP also prevents nonproductive intermolecular interactions of folding intermediates and subsequent misaggregation of proteins during stress conditions. We have isolated two genomic clones named gsBiP6 and gsBiP9 from λEMBL3 and λZAP II genomic libraries, respectively. The gsBiP6 and gsBiP9 promoters have general motifs founded in plant gene promoters, such as CAAT and TATA sequence, and specific motifs, such as endoplasmatic reticulum stress response element (ERSE) and G-box elements. The BiP promoters were fused to the reporter gene β-glucuronidase (GUS) and introduced into tobacco plants via Agrobacterium tumefaciens transformation. Histochemical analysis of transformed plants with the constructions -358pbip6-gus or -2200pbip9-gus revealed that the BiP promoters produced a uniform pattern of the GUS expression in leaves, stems, and roots. Intense GUS histochemical activity was observed in the vascular region of leaves,stems and roots, and in the leaf trace region as well as in the apical meristem, place where intense cellular division happens. This pattern of space distribution of the GUS activity suggests to be correlated with an expression of those genes in places that have high cellular secretory activity and high proportion of cells in an active process of cellular division. Coherent with this observation, the histochemical activity of GUS is much less intense in the xylem parenchyma. The gsBiP6 promoter deletions were driven in the 5'-3' orientation (-138pbip6-gus) and intern region Δ(-226/- 82)pbip6-gus. Analysis of those deletions in transformed plants identified two regulatory domains cis-acting, denominated CRD1 (-358 to -226) and CRD2 (- 226 to -82). The CRD1 exhibits enhancer activity, since it was capable to recuperate high levels of basal expression of the gus reporte r gene when linked to the extremity 5' in the position -82 of the BiP6 promoter. The CRD2 contains positive regulatory cis -elements, as negative regulatory cis -elements that contribute to the specific pattern of expression controlled by the gsBiP6 promoter. The reporter gene expression in the root procambium region, in the apical meristem and in the phloem stem, was absolutely dependent on the CRD2. In contrast, CRD2 deleted resulted in accentuated accumulation of GUS activity in the xylem parenchyma. The activation of the BiP6 and BiP9 promoters, in response to the unfolded proteins response in the endoplasmatic reticulum (UPR) and osmotic stress condition, were evaluated in transgenic leaf disks. Leaf disks incubated with tunicamycin, activator of the UPR, and with PEG, inductor of an osmotic stress, induced the expression of GUS, under the BiP6 and BiP9 promoters control. The CRD2 (-226 to -82) deleted in the BiP6 promoter caused the loss of the induction of the expression in response to tunicamycin and PEG, indicating that CRD2 contains responsive cis-acting elements under stress conditions. In fact, two conserved cis-acting elements in the UPR (UPRE) were identified in the CRD2. Collectively, these results suggest that the control of the expression of BiP in plants depends on a complex integration of multiple regulatory cis-elements in the promoter.