Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La proteína CK1 es una familia de proteínas quinasa a la que recientemente se la ha relacionado con el desarrollo embrionario. De esta familia se han clonado al menos siete isoformas: CK1α, CK1β, CK1γ1, CK1γ2, CK1γ3, CK1δ y CK1ε. En esta Memoria de Título se realizaron estudios de expresión y función de las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 en el desarrollo embrionario del pez cebra (Danio rerio). Para esto, analizamos los patrones de expresión de estos genes mediante RT-PCR e hibridización in situ. Los resultados indican que estas isoformas se expresan de manera similar en cuanto a su temporalidad, ya que ambas se detectan desde la primera hora post fecundación (h.p.f). CK1δ1 presenta un patrón ubicuo hasta las 8 h.p.f y limitándose después al sistema nervioso central. Por su parte, la expresión de CK1δ2 presenta ubicuidad hasta las 24 h.p.f, restringiéndose posteriormente a la zona cefálica y al primordio de las aletas pectorales. Para analizar la función de ambas isoformas se efectuaron estudios de sobre expresión, mediante la inyección en embriones de pez cebra de los mRNAs codificante para CK1δ1 y CK1δ2, y ensayos de bloqueo de función mediante la inyección en embriones de los mRNA de las formas Dominantes Negativas de cada uno de los genes estudiados. Estos experimentos se realizaron utilizando la técnica de microinyección en embriones en estadío de una célula y posteriormente incubados y observados en distintos estadíos bajo lupa estereoscópica, y clasificados según su fenotipo. Además, se procedió a analizar el patrón de expresión de algunos genes marcadores específicos de desarrollo embrionario, en embriones inyectados con una cantidad conocida de mRNA de CK1δ1 y CK1δ2, con el fin de establecer con mayor precisión los procesos y vías en los que podrían estar involucradas estas isoformas. Los resultados obtenidos con los experimentos anteriores indican que la sobre expresión de ambas isoformas, CK1δ1 y CK1δ2, inducen distintos grados de malformación en cerebro anterior y ojos, siendo el fenotipo principal observado con la inyección de CK1δ1 los embriones sin ojos. El bloqueo de función mediante Dominantes Negativos indujo, en ambas isoformas, embriones dorsalizados y ciclópicos. Se puede concluir, que las isoformas CK1δ1 y CK1δ2 están participando en la formación de los ejes embrionarios en el desarrollo temprano del pez cebra y además en la formación de estructuras del sistema nervioso central, específicamente cerebro anterior y ojos. / FONDECYT N° 1020753 y por Millenium Nucleus in Developmental Biology

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniero Civil en Biotecnología / Durante las últimas décadas, una rama de la investigación biotecnológica se ha enfocado en desarrollar y optimizar procesos de producción de proteínas recombinantes orientadas a aplicaciones terapéuticas. En particular, los péptidos terapéuticos ofrecen actualmente un nuevo potencial comercial para la industria farmacéutica y biotecnológica al generar estrategias efectivas en el tratamiento de diversas patologías como cáncer y alteraciones metabólicas entre otras. Estudios previos han demostrado la capacidad supresora de tumores de péptidos con blanco intracelular como p53p-Ant y PNC-27. Estos corresponden a regiones derivadas de la proteína p53, factor de regulación transcripcional que inhibe la progresión del ciclo celular e induce reparación celular o apoptosis, en caso de estrés genotóxico. Ambos péptidos contienen en su secuencia, un péptido de penetración celular, el cual les entrega la capacidad de atravesar la membrana plasmática. Así, bajo distintos mecanismos, con p53p-Ant y PNC-27 se ha reportado apoptosis o bien necrosis de manera selectiva en ciertos tipos de células tumorales. El presente trabajo tuvo por objetivo expresar en E. coli los péptidos p53p-Ant y PNC-27, y purificarlos mediante el sistema IMPACT. Éste es un mecanismo de expresión y purificación mediado por inteínas que permite purificar a través de una columna de afinidad, proteínas recombinantes con su secuencia nativa sin el uso de proteasas y minimizando pasos cromatográficos. Se logró producir ambos péptidos en forma soluble. La expresión soluble del péptido PNC-27 se consiguió a partir de los dos vectores de expresión proporcionados por el sistema IMPACT (pTXB1 y pTYB11), esta expresión resultó ser fuertemente dependiente de las condiciones de cultivo ya que se requiere de una inducción a baja temperatura (12 °C). Por su parte, la expresión soluble de p53p-Ant depende tanto del sistema de expresión como de las condiciones de cultivo. El diseño de las construcciones genéticas, en particular las que incluyen el vector de expresión pTYB11, permitió una efectiva purificación de los péptidos utilizando un único paso cromatográfico. Más aún, los niveles de rendimiento (0,4 1,2 mg L-1) superan los reportados para péptidos con el mismo sistema y los niveles de pureza obtenidos permitirían desarrollar investigación avanzada con ensayos biológicos in vivo o in vitro.

Objetivo: Determinar la variación de los niveles de proteína C reactiva en pacientes con episodio depresivo mayor luego 4 semanas con inhibidores selectivos de la recaptación de la serotonina, como tratamiento antidepresivo. Metodología: Un total de 19 pacientes con diagnóstico de episodio depresivo mayor, según criterios DSM-IV-TR, culminaron la investigación. Los niveles de proteína C reactiva fueron medidos en 2 oportunidades, antes de iniciar tratamiento antidepresivos, con Fluoxetina, y 4 semanas después. La severidad del episodio depresivo mayor se midió mediante: las Escalas de depresión de Hamilton y Zung. / -- Objetive: Determine the variation of C reactive protein levels in patients with major depressive episode, after 4 weeks antidepressive treatment with Selective serotonin recaptation inhibitors. Metodology: A total of 19 patients with diagnosis of major depressive episode, according to DSM – IV – TR criteria, culminate the investigation. The C reactive protein levels were measure in 2 oportunities, before antidepressive treatment with Fluoxetin and 4 weeks after. The major depressive episode severity was measure with Hamilton and Zung Depression scales.

La nutrición es un fenómeno peculiar y activo de los seres vivientes en su constante proceso de intercambio con el medio ambiente. Objetivo. Se evaluó el efecto histomorfológico en la mandíbula de ratas albinas sometidas a dieta deficiente en proteína con diferentes concentraciones de hierro. Metodología. La muestra fue de 24 ratas albinas Holzman machos; de 21 días de nacidas, agrupadas en 4 grupos experimentales, alimentadas “ad libitum” durante 46 días; grupo A (control) recibió proteína 10g.hierro 29 mg./100g.,grupo B recibió proteína 10g., hierro 46 mg. /100g; grupo C proteína 5g. Hierro 29 mg/100g); grupo D proteína 5g., hierro 46 mg/100mg.Se controló el peso corporal y consumo del alimento. La medición anatómica de la mandíbula (longitudinal vertical, grosor del cuerpo, longitud vertical rama) y primera molar inferior.(longitud coronal y mesiodistal), análisis y conteo celular de los elementos estructurales del complejo dentino-pulpar,del periodonto de inserción y del cóndilo. Resultados. Existen cambios histomorfológicos en el complejo dentino-pulpar, periodonto de inserción y cóndilo, traducidos en disminución de los elementos celulares, capa dentinaria disminuida, zona acelular de weil evidente; presencia de grupos isogénicos nodulares, e hipertróficos en el grupo C, y grupos isogénicos columnares alternando con zonas nodulares hipertróficas en el grupo D del cóndilo. En ratas albinas sometidas a dieta proteína 5g, hierro 26mg /100g.y 46 mg/100g) grupos C y D. Conclusiones. Las dietas deficientes en proteína y diferentes concentraciones de hierro (proteína 5g, hierro 29,46 mg /100g) producen cambios histomorfológicos de la mandíbula, disminuyendo la capa dentinaria, los odontoblastos y fibroblastos pulpares, las fibras colágenas, disminución del número de fibroblastos, cementoblastos, osteoblastos, osteocitos y osteoclastos; disminución del número de condroblastos, condrocitos. Disminución en el peso corporal, longitud y grosor de la de la mandíbula; longitud coronal y diámetro mesiodistal de la primera molar de las ratas. Palabras claves: mandíbula, proteínas, hierro, complejo dentino –pulpar, periodonto de inserción. / --- Nutrition is a phenomenon peculiar and active living beings in their ongoing process of exchange with the environment Objective. Histomorphological effect the jaw albino rats subjected to proteindeficient diet with different iron concentrations assessed. Methodology. The sample consisted of 24 male albino rats Holzman; 21 days old, grouped into 4 experimental groups fed "ad libitum" for 46 days; Group A (control) received 29 mg protein 10g.hierro. / 100 g., group B received 10g protein., 46 mg iron. / 100g; 5g protein C group. Iron 29 mg / 100g); Group D protein 5g., 46 mg iron / 100mg, The anatomical jaw (vertical longitudinal body thickness, vertical branch length) and lower first molar. (coronal and mesiodistal length) cell count analysis and structural elements of the dentin-pulp complex periodontal insertion and the condyle. Result. Existen histomorphological changes in the dentin-pulp, periodontal insertion and condyle translated in decreased cellular elements, earmark layer decreased, acellular obvious area wiel complex; periodontal membrane stage, presence of nodular isogenic groups, and hypertrophic in group C, columnar and nodular isogenic groups alternating with hypertrophic zones in group D condyle. In rats subjected to diet 5g protein, iron /100g.y 26mg 46 mg / 100g) groups C and D. Conclusions. Diets deficient in protein (5g protein, iron 29.46 mg / 100g), and different iron concentration, produces histomorphological effect the jaw rats; reducing dentin layer, pulp odontoblasts and fibroblasts, collagen fibers, reducing the number of fibroblasts, cementoblasts, osteoblasts, osteocytes and osteoclasts; fewer chondroblasts, chondrocytes. Decrease in body weight, length and thickness of the jaw; coronal mesiodistal length and diameter of the first molar of the rats. Keywords: jaw, protein, iron, -pulpar dentin complex

Demuestra la utilidad del nivel de proteína C reactiva en comparación con el recuento leucocitario materno en la predicción de corioamnionitis histológica en gestantes con rotura prematura de membranas pretérmino en el Instituto Nacional Materno Perinatal durante el período comprendido entre enero y junio del 2013. Es un estudio no experimental de tipo validación de prueba diagnóstica aplicado a total de la población de gestantes pretérmino con edad gestacional ≥ 22 semanas y < 37semanas, con ruptura prematura de membranas, fetos únicos y con historia clínica disponible e información requerida completa. Para el análisis estadístico usa el programa IBM SPSS Statistics 19. Obtiene los siguientes resultados: La incidencia de corioamnionitis histológica es 76,3% (71/93). La edad promedio de las gestantes con ruptura prematura de membranas pretérmino es 29,02 +- 6,6 años. La ruptura ocurrió con más frecuencia entre los 25 a 30 años (31,18%); la edad gestacional promedio es 29,28 +- 3,39 semanas y es más frecuente entre las 27- 31 semanas (51,61%); el riesgo social mediano y las nulíparas son más frecuentes. El periodo de latencia promedio es 12,55 +- 10,98 días y con más frecuencia el parto ocurre dentro de los 15 días de la rotura (74%). El nivel de PCR promedio es 29,63 +- 26,97 mg/l con diferencia altamente significativa (p=0,00) para la corioamninitis histológica. Su sensibilidad es 98,59%, especificidad 45,45%, valor predictivo positivo 85,37% y valor predictivo negativo 90,91%. La curva ROC predijo corioamnionitis histológica con un área de 0,861 (IC 95%: 0,77 - 0,95) (p = 0,000); estableciendo en 12,45mg/l el punto de corte por encima del cual se puede predecir el riesgo de corioamnionitis histológica. El recuento leucocitario es 15519,46 +- 4410,457 cel/mm3, sin diferencia significativa (p=0,790). Su sensibilidad es 52,11%, especificidad 63,63%, valor predictivo positivo 82,22% y valor predictivo negativo 29,17%. El área bajo la curva ROC de 0,714. (IC 95% 0,587-0,84) demostró significancia estadística (p= 0,002), teniendo como punto de corte 13490 cel/mm3. Concluye que el nivel de proteína C reactiva fue más confiable que el recuento leucocitario materno en la predicción de corioamnionitis histológica en gestantes con ruptura prematura de membranas pretérmino.

Oito linhagens de soja [Glycine max (L.) Merril], sendo três introduzidas dos Estados Unidos da América (grupo exótico) e cinco selecionadas da coleção de soja do Departamento de Genética da ESALQ/USP (grupo adaptado) foram intercruzadas em esquema dialélico, com a finalidade de avaliar o potencial para utilização em programa de melhoramento genético visando o teor de proteína e a produção de grãos. Para a avaliação experimental dos parentais e progênies F2 utilizou-se um delineamento em blocos ao acaso com sete repetições e parcelas de uma fileira de 3 m de comprimento, com um espaçamento de 1 m entre fileiras e 10 cm entre plantas dentro de fileiras. Avaliaram-se os caracteres teor de proteína (TP), produção de grãos (PG), número de dias para início de florescimento (DF), altura da planta no florescimento (AF), número de dias para a maturidade (DM), altura da planta na maturidade (AM), altura de inserção da primeira vagem (AI), valor agronômico (VA) e acamamento (AC). A análise dialélica baseou-se no método 2 de GRIFFING (1956b), modelo misto B. Os resultados gerais obtidos indicaram: a) existência de diferenças estatísticas entre médias dentro de parentais e progênies F2para todos os caracteres, exceto para VA nos parentais ; b) os cruzamentos foram relativamente diferentes quanto a variância fenotípica para os diferentes caracteres, indicando que os parentais apresentam características complementares; c) a heterose apresentou ampla variação; entretanto, os maiores valores nem sempre estiveram associados as maiores médias e variâncias; d) os quadrados médios para capacidade geral de combinação (CGC) foram significativos para todos os caracteres e, para a maioria deles, quanto à capacidade especifica de combinação (CEC), com exceção de VA; e) a magnitude relativa da capacidade geral de combinação com base em BAKER (1978) foi superior a 85,4% para sete dos nove caracteres. Devido a isso, verificou-se que as médias da geração F2 podem ser preditas com base apenas na capacidade geral de combinação para a maioria dos caracteres, com exceção de TP; f) os efeitos da capacidade geral de combinação (g) apresentaram menor variação para DF, AF, DM, VA, AC, TP, e maior variação para AM, AI e PG; g) a avaliação da capacidade específica combinação inerente de aos parentais (s ) revelou, para a maioria dos caracteres, valores extremos ocorrendo no grupo de parentais exóticos, indicando a maior divergência genética dos mesmos comparada aos parentais adaptados; h) a variabilidade genética e o grau de complementação exibido pelos parentais, para a maioria dos caracteres demonstra que os mesmos são adequados para a formação de uma população de base genética ampla, visando a seleção de genótipos superiores quanto ao teor de proteína e produção de grãos simultaneamente / not available

Foi produzida a proteína recombinante do domínio extracelular da subunidade 2 do receptor do IFN-alfa em forma de proteína de fusão com a glutatione-S-transferase (GST-IFNAR2cEC) em E. coli, com o objetivo de avaliar seu efeito bloqueador sobre a ação do IFN-alfa. A GST-IFNAR2cEC de forma solúvel, com peso molecular 54 kDa, foi obtida quando a proteína recombinante foi expressa a 25 graus C por indução de IPTG e foi lisada por French Press. A avaliação do efeito bloqueador da GST-IFNAR2cEC foi feita utilizando-se 3 métodos: 1) Ensaio antiproliferativo com células Daudi, 2) ensaio antiviral com células Hep 2/c e vírus encefalomiocarditis, e 3) expressão gênica semi-quantitativa do STAT 1 (transdutor de sinal e ativador de transcrição) e da 2',5'-oligoadenilato sintetase (OAS) pela RT-PCR duplex nas células Daudi e Hep 2/c. A GST-IFNAR2cEC, mesmo a 420 nM, não inibiu as atividades antiproliferativa e antiviral de 24,5 pM e 49 pM de rIFN-alfa2 provavelmente devido à sua ineficiência na competição com o IFNAR da superfície celular durante o longo período de incubação nos ensaios realizados. A expressão gênica do STAT 1 não foi inibida pela GST-IFNAR2cEC nas células Daudi e Hep 2/c, porém inibiu-se a da 2’, 5’-OAS. Estes resultados sugerem que a expressão gênica do STAT 1 é independente da ligação do IFN-alfa com a IFNAR 2c, e que a da 2’, 5’-OAS é dependente dessa ligação nessas células

Submitted by Helena Bejio (helena.bejio@unioeste.br) on 2019-03-22T23:10:57Z No. of bitstreams: 2 dissertação PPZ (1).pdf: 798996 bytes, checksum: 316030cb5b9a5f3af1299cc0622d2d8f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2019-03-22T23:10:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertação PPZ (1).pdf: 798996 bytes, checksum: 316030cb5b9a5f3af1299cc0622d2d8f (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-12-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The present research aimed to evaluate the response of productivity in dry matter composition of forage, mycotoxin (s) nutrient levels in dry mass and soil in grassland of Cynodon dactylon cv. Vaquero, subjected to doses increasing nitrogen, applied in the form of pig waste. The work was developed during the period November 2017 to March 2018, in the Experimental unit of the Pontifical Catholic University of Paraná, Toledo campus, located in the Western region of Paraná under latitude 24° 43 ' 13 '' S and longitude 53° 47 ' 01 "W. experimental design was of randomized blocks with six treatments (0, 50, 100, 150, 200, 250 kg ha-1) consisting of increasing doses of nitrogen in the form of pig manure, with five repetitions, totaling 30 plots. The experiment was initiated in November 2017, and the samples were carried out at the end of each of the four periods of cut, which had gaps between cuts of 30 days. Total productivity was studied of dry matter (kg ha-1), plant height (cm), crude protein (CP), dry matter (DM), neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (FDA), neutral detergent insoluble nitrogen (NIDN), acid detergent insoluble nitrogen (NIDA), lignin (LIG), ether extract (EE) and mineral matters (MM). Besides the mineral composition in dry matter and soil (organic matter, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, manganese, zinc, iron). It was found that there was a positive linear effect of the treatments on dry matter productivity of forage, plant height, PB and EE that are increased as the doses of nitrogen rises, reaching the most expressive values at a dose of 250 kg ha-1. On the other hand, the levels of FDA, NIDA, NDF, NIDN and BOND decreased with the increase in levels of nitrogen. With increasing doses of N of pig waste occur increase in levels of nitrogen, phosphorus and potassium. The different nitrogenous doses applied in the form of pig waste in grass pasture vaquero, influence on composition and productivity of bromatological total dry matter, providing an increase in levels of PB, MS, EE, forage produced in four periods. The application of increasing doses of liquid waste pigs promotes increases in levels of nitrogen, phosphorus and potassium (g kg-1) in the dry matter of the aerial part of the shoot to the dose of 250 kg ha-1 of N in the form of pig waste. The application of pig waste as fertilizer reduces the concentration of organic matter, phosphorus, potassium, manganese and iron. MS grass productivity ranged from 3080.57 to 4520.57 Vaquero kg ha-1 in the air, that is, there is an estimated increase of 46.74% on MS productivity of Vaquero, when you go from 0 to 250 kg of waste per hectare. / A presente pesquisa teve por objetivo avaliar a resposta de produtividade na matéria seca, composição bromatológica da forragem, os teores de nutrientes na massa seca e no solo na pastagem do Cynodon dactylon cv. Vaquero, submetida a doses crescentes de nitrogênio, aplicadas na forma de dejeto de suínos. O trabalho foi desenvolvido durante o período de novembro de 2017 a março de 2018, na Unidade Experimental da Pontifícia Universidade Católica do Paraná, campus de Toledo, localizado na região Oeste do Paraná sob latitude 24º 43’ 13’’ S e longitude 53º 47’ 01’’ W. O delineamento experimental adotado foi de blocos ao acaso com seis tratamentos (0, 50, 100, 150, 200, 250 kg ha-1) constituídos por doses crescentes de nitrogênio na forma de dejetos de suínos, com cinco repetições, totalizando 30 parcelas. O experimento foi iniciado em novembro de 2017, e as amostras foram realizadas ao final de cada um dos quatro períodos de corte, que tiveram intervalos entre cortes de 30 dias. Estudou-se a produtividade total de matéria seca (kg ha-1), altura de plantas (cm), proteína bruta (PB), matéria seca (MS), fibra em detergente neutro (FDN), fibra em detergente ácido (FDA), nitrogênio insolúvel em detergente neutro (NIDN), nitrogênio insolúvel em detergente ácido (NIDA), lignina (LIG), extrato etéreo (EE) e matéria mineral (MM). Além da composição mineral na matéria seca e no solo (matéria orgânica, fósforo, potássio, cálcio, magnésio, manganês, zinco, ferro). Verificou-se que houve efeito linear positivo dos tratamentos na produtividade de matéria seca da forragem, altura de plantas, PB e EE que são aumentados à medida que se eleva as doses de nitrogênio, atingindo os valores mais expressivos na dose de 250 kg ha-1. Em contrapartida, os teores de FDA, NIDA, FDN, NIDN e LIG decresceram com o aumento nos teores de nitrogênio. Com o aumento das doses de N do dejeto de suínos ocorrem incremento nos teores de nitrogênio, fósforo e potássio. As diferentes doses nitrogenadas, aplicadas na forma de dejeto de suínos na pastagem de capim vaquero, influência na composição bromatológica e na produtividade total de matéria seca, proporcionando um incremento nos teores de PB, MS, EE, da forragem produzida nos quatro períodos de corte. A aplicação de doses crescentes de dejeto líquido de suínos propicia aumentos nos teores de nitrogênio, fósforo e potássio (g kg-1) na matéria seca da parte aérea da parte aérea até a dose de 250 kg ha-1 de N na forma de dejeto de suínos. A aplicação de dejeto de suínos como adubo reduz a concentração de matéria orgânica, fósforo, potássio, manganês e ferro. A produtividade de MS do capim Vaquero variaram de 3080,57 a 4520,57 kg ha-1 na parte aérea, ou seja, há um aumento estimado de 46,74% na produtividade de MS do Vaquero, quando se passa de 0 para 250 kg de dejeto por hectare.

A síndrome de Li-Fraumeni (SLF) é uma síndrome rara de predisposição a câncer associada a mutações germinativas no gene supressor tumoral TP53. As vias de sinalização da proteína p53 estão envolvidas na regulação da apoptose, das paradas do ciclo celular, da senescência e do reparo de danos no DNA. As mutações em p53 mais comumente encontradas em tumores estão distribuídas ao longo do domínio de ligação ao DNA, incluindo a mutação G245S associada à SLF. No entanto, a mutação mais frequentemente associada à SLF nas regiões Sul e Sudeste do Brasil é a mutação R337H, que afeta o domínio de oligomerização de p53. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar os efeitos em células de p53 mutantes associadas à síndrome de SLF na viabilidade em condições basais e na sobrevivência celular sob estresse genotóxico. Células p53 null da linhagem NCI-H1299 foram transfectadas com vetores para a expressão de p53 wt e das mutantes G245S e R337H, e ensaios celulares foram realizados. A mutante R337H inibiu a formação de colônias e diminuiu a viabilidade celular de forma similar ao observado para células com expressão p53 wt, enquanto G245S demonstrou menor influência sobre a viabilidade e sobre a proliferação das células. Após submetidas a estresse genotóxico induzido por meio de exposições à radiação UVC, células com expressão de R337H mostraram-se mais sensíveis à morte celular mesmo quando expostas à baixa dose de UVC. Já as células com a expressão de G245S apresentaram aumento nas taxas de apoptose tardia somente quando submetidas a altas doses de radiação de UVC, assim como nas células com expressão de p53 wt. Dessa forma, foram observadas atividades funcionais similares entre R337H e p53 wt quanto à influência sobre a viabilidade e sobre a proliferação celular, enquanto células com expressão de G245S apresentaram fenótipo celular mais próximo ao p53-null. Todavia, G245S demonstrou atividade próxima a de p53 wt ao conferir proteção às células contra morte induzida pela radiação UVC, e a mutante R337H gerou maior sensibilidade para morte celular em condições de estresse genotóxico. / Li-Fraumeni syndrome (LFS) is a hereditary cancer predisposition disorder associated with germline mutations in the TP53 tumor suppressor gene. The p53 signaling pathways are involved in the regulation of apoptosis, cell cycle arrest, senescence and DNA repair. The p53 mutations found in tumors are commonly distributed along the DNA binding domain, including the G245S mutation associated with LFS. However, the most frequent p53 mutation associated with LFS in Southeast and Southern Brazil is the R337H mutation, which affects the oligomerization domain of p53. Thus, the aim of this study is to analyze the effects of mutant p53 associated with LFS on cell viability at basal conditions and on cell survival in genotoxic stress. Null-p53 NCI-H1299 cell line were transfected with vectors for the expression of wild-type, G245S and R337H p53, and cell assays were performed. The R337H mutant inhibited the colony formation and decreased the cell viability similar to that observed in cells with wt p53 expression, while G245S demonstrated less influence on cell viability. After undergoing genotoxic stress induced by UVC radiation exposures, cells with R337H expression were more sensitive to cell death when exposed to low UVC dose. Cells with G245S expression showed an increase in late apoptosis rates only when subjected to high doses of UVC radiation, as well as cells with wt p53 expression. Thus, similar and functional activities were observed between R337H and wt p53 concerning influence on cell viability and proliferation, with the expression of G245S presented cellular phenotype closer to p53-null. However, G245S demonstrated to confer protection for cell death as seen for wt p53, whereas R337H generated increased of sensitivity to cell death under conditions of genotoxic stress.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-08Bitstream added on 2014-06-13T19:40:41Z : No. of bitstreams: 1 santos_sat_dr_araiq.pdf: 1210753 bytes, checksum: 2451e920ac425ba2bd7cc04b099878bb (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho refere-se ao desenvolvimento de duas metodologias: imobilização da proteína do core do vírus da Hepatite C (VHC) em matriz híbrida siloxano-poli (propileno óxido) como suporte sólido para ELISA e um imunossensor amperométrico para detecção de anticorpos anti-VHC. Para atingir este objetivo, o RNA-VHC extraído de amostras de soro (genótipo 1b) foi submetido à técnica de RT-PCR e posterior amplificação da seqüência de 408pb do core do VHC. Este produto foi clonado em vetor pET42a. O vetor recombinante foi introduzido em bactérias da linhagem BL21 (DES). Após o cultivo das colônias, a indução foi realizada em concentração final de 0,4mM de IPTG. As bactérias foram lisadas e as frações solúvel e insolúvel, analisadas em gel de poliacrilamida 15%, mostrando uma banda aparente de 44kDa, tamanho esperado da proteína recombinante fusionada a GST. A proteína recombinante do core foi purificada e confirmada por imunodetecção utilizando soro positivo para VHC e apresentou ausência de reatividade cruzada com amostras positivas para outras doenças infecciosas. Na primeira metodologia, a proteína do core foi imobilizada em matriz híbrida siloxano-poli (propileno óxido) preparada por sol-gel como suporte sólido em teste de ELISA para a detecção de anticorpos anti-VHC. As condições adequadas para o estabelecimento desta técnica envolveram 1,25ng da proteína/disco, conjugado com peroxidase na diluição 1:10000 e diluição do soro de 1:40. Este procedimento foi comparado ao ELISA convencional. O desenvolvimento desta matriz híbrida para imunodetecção mostrou bom desempenho, reprodutibilidade e simplicidade durante a síntese, sendo vantajoso para aplicação comercial. / The present work reports the development of two methodologies: hepatitis C vírus core protein immobilization into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process used as solid phase in ELISA and an amperometric immunosensor for detection of antibodies anti-VHC. Toward to achieve this aim, the HCV RNA from serum (genotype 1b) was submitted to RT-PCR techniqueand subsequent amplification of the HCV core 408pb. This product was cloned into pET42a vector. The recombinant plasmid was transformed into BL21 (DES) cell line strain. Cell cultures were grown and induced with final concentration of 0,4mM of IPTG. After induction, the cell were harvest and the soluble and insoluble fractions were analyzed by polyacrilamide gel 15% showing a band with an approximate molecular weight of 44kDa, expected size for this GST-fused recombinant protein. The recombinant protein was purified and confirmed by immunological detection using HCV positive serum and showed absence of cross reactivity with positive samples for others infectious diseases. In the first methodology, the core protein immobilization into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process was used as solid phase in ELISA for detection of antibodies anti-VHC antibody. 1,25ng protein per disc, a peroxidase conjugate diluition of 1:10000 and a serum dilution of 1:40 were adequate for the establishment of the procedure. This procedure performance of the siloxane-polypropyleneglycol discs as a matrix for immnunodetection, showed easy synthesis, good performance and reproducibility for commercial application. The second consisted on the immobilization of core protein into hybrid matrix siloxane-polypropyleneglycol prepared by sol-gel process and deposited on the pencil graphite electrode surface by dip-coating process for development of an amperometric immunosensor.