Neste trabalho serão apresentados resultados sobre três sistemas proteícos diferentes: Lisozima, Crioglobulina e Proteassomo, analisados a partir, principalmente, da técnica de espalhamento de Raios X a baixos ângulos. Técnicas como microscopia eletrônica de transmissão e espalhamento de luz dinâmico foram utilizadas como técnicas complementares. Os resultados apresentados demonstram o potencial único que a técnica de espalhamento a baixos ângulos possui no estudo de sistemas em solução. Os dados correspondem a um estudo em um grande intervalo de tamanhos para as proteínas estudadas (15kDa to 750 kDa), requerendo diferentes abordagens em cada caso. Como será mostrado, para casos onde se tem um meio monodisperso, diversas metodologias de modelagem podem ser utilizadas. Para o sistema composto de Lisozima, por se tratar de uma proteína amplamente estudada na literatura, é interesante poder comparar os resultados encontrados com os já publicados e observar sua estabilidade em solução. O peso molecular calculado a partir dos dados de espalhamento foi 15kDa, que está em bom acordo com a esperado para esta proteina (14,6 kDa). Além disso, ao variar-se a concentração da proteína em solução, é possível observar um fator de interação entre as partículas para maiores concentrações. Esse fator de interação pode ser considerado próximo ao de esferas rígidas. Para o sistema de Crioglobulinas, houve uma dificuldade na purificação da amostra, mas ainda assim apresentaremos alguns resultados interessantes, em que a técnica de SAXS fornece informações sobre a flexibilidade de proteínas e as análises para as amostras de um pool de imunoglobulinas indicou que com a diminuição da temperatura a dispersão de raios de giro aumenta, indicando a formação de agregados. Para o sistema do Proteassomo, diversas análises se mostraram possível e resultados novos puderam ser obtidos e publicados. Dos estudos utilizando MET,com as micrografias obtidas tem-se a indicação de diferenças na estrutura, quando a molécula está em condições diferentes. Das análises feitas por SAXS, é possível utilizar duas modelagens diferentes, uma simples, outra mais avançada, em que se pode concluir que a redução do Cys-PT glutatiolado induz mudanças conformacionais. Além disso, resultados de SAXS e MET estão em concordância e fornecem informações complementares. / In this work results will be presented on three different protein system: Lysozime, Cryoglobulin and Proteasome, analyzed mainly by Small Angle X-ray scattering technique. Techniques such as transmission electron microscopy and dynamic light scattering were used as complementary techniques. The results show that an unic potential Small Angle X-ray scattering technique around the study of systems in solution. The data correspond to a study of a wide range of sizes for the studied proteins (15kDa to 750 kDa), requiring different approaches in each case. As will be shown for cases where there is a monodisperse system, different modeling methodologies may be used. For the system composed of Lysozyme, because it is a protein widely studied in the literature, it is interesting to compare the results with those already published and observe its stability in solution. The molecular weight calculated from the scattering data was 15kDa, which is in good agreement with the expected for this protein (14.6kDa). Futhermore by varying the concentration of the protein in solution, it is possible to observe a factor of interaction between the particles for higher concentrations. This interaction factor can be considered close to the rigid spheres. For Cryoglobulins system, there was a difficulty in the sample purification, but still present some interesting results, where the SAXS technique provides information on the flexibility of proteins and the analysis for the samples from a pool of immunoglobulin indicated that with decreasing temperature, the dispersion of radius of gyration increases, indicating the formation of aggregates. For the proteasome system, various analyzes have proved possible and new results could be obtained and published. From studies using TEM, with the micrographs we have the indication of differences in the structure, when the molecule is in different conditions. From the analyzes made by SAXS, it is possible to use two different modeling, a simple one, and other more advanced, where it can be concluded that the reduction of the Cys-PT glutathiolated induces conformational changes. Moreover, SAXS and TEM results are in agreement and provide additional information.

Neste trabalho serão apresentados resultados sobre três sistemas proteícos diferentes: Lisozima, Crioglobulina e Proteassomo, analisados a partir, principalmente, da técnica de espalhamento de Raios X a baixos ângulos. Técnicas como microscopia eletrônica de transmissão e espalhamento de luz dinâmico foram utilizadas como técnicas complementares. Os resultados apresentados demonstram o potencial único que a técnica de espalhamento a baixos ângulos possui no estudo de sistemas em solução. Os dados correspondem a um estudo em um grande intervalo de tamanhos para as proteínas estudadas (15kDa to 750 kDa), requerendo diferentes abordagens em cada caso. Como será mostrado, para casos onde se tem um meio monodisperso, diversas metodologias de modelagem podem ser utilizadas. Para o sistema composto de Lisozima, por se tratar de uma proteína amplamente estudada na literatura, é interesante poder comparar os resultados encontrados com os já publicados e observar sua estabilidade em solução. O peso molecular calculado a partir dos dados de espalhamento foi 15kDa, que está em bom acordo com a esperado para esta proteina (14,6 kDa). Além disso, ao variar-se a concentração da proteína em solução, é possível observar um fator de interação entre as partículas para maiores concentrações. Esse fator de interação pode ser considerado próximo ao de esferas rígidas. Para o sistema de Crioglobulinas, houve uma dificuldade na purificação da amostra, mas ainda assim apresentaremos alguns resultados interessantes, em que a técnica de SAXS fornece informações sobre a flexibilidade de proteínas e as análises para as amostras de um pool de imunoglobulinas indicou que com a diminuição da temperatura a dispersão de raios de giro aumenta, indicando a formação de agregados. Para o sistema do Proteassomo, diversas análises se mostraram possível e resultados novos puderam ser obtidos e publicados. Dos estudos utilizando MET,com as micrografias obtidas tem-se a indicação de diferenças na estrutura, quando a molécula está em condições diferentes. Das análises feitas por SAXS, é possível utilizar duas modelagens diferentes, uma simples, outra mais avançada, em que se pode concluir que a redução do Cys-PT glutatiolado induz mudanças conformacionais. Além disso, resultados de SAXS e MET estão em concordância e fornecem informações complementares. / In this work results will be presented on three different protein system: Lysozime, Cryoglobulin and Proteasome, analyzed mainly by Small Angle X-ray scattering technique. Techniques such as transmission electron microscopy and dynamic light scattering were used as complementary techniques. The results show that an unic potential Small Angle X-ray scattering technique around the study of systems in solution. The data correspond to a study of a wide range of sizes for the studied proteins (15kDa to 750 kDa), requiring different approaches in each case. As will be shown for cases where there is a monodisperse system, different modeling methodologies may be used. For the system composed of Lysozyme, because it is a protein widely studied in the literature, it is interesting to compare the results with those already published and observe its stability in solution. The molecular weight calculated from the scattering data was 15kDa, which is in good agreement with the expected for this protein (14.6kDa). Futhermore by varying the concentration of the protein in solution, it is possible to observe a factor of interaction between the particles for higher concentrations. This interaction factor can be considered close to the rigid spheres. For Cryoglobulins system, there was a difficulty in the sample purification, but still present some interesting results, where the SAXS technique provides information on the flexibility of proteins and the analysis for the samples from a pool of immunoglobulin indicated that with decreasing temperature, the dispersion of radius of gyration increases, indicating the formation of aggregates. For the proteasome system, various analyzes have proved possible and new results could be obtained and published. From studies using TEM, with the micrographs we have the indication of differences in the structure, when the molecule is in different conditions. From the analyzes made by SAXS, it is possible to use two different modeling, a simple one, and other more advanced, where it can be concluded that the reduction of the Cys-PT glutathiolated induces conformational changes. Moreover, SAXS and TEM results are in agreement and provide additional information.

Células eucarióticas contêm vários tipos de proteassomo que regulam o processo de degradação de proteína. Proteassomos são proteases multicatalíticas que são responsáveis pela maior parte de degradação não-lisossomal de proteínas em células eucarióticas. As três subunidades catalíticas do proteassomo são &beta;1, &beta;2 e &beta;5. Em condições de stress e resposta imune essas três subunidades são substituídas por &beta;1i, &beta;2i and &beta;5i, respectivamente, para formar o proteassomo imune. Estas três subunidades induzíveis, parecem alterar as especificidades de peptidase do proteassoma imune em células tratadas com IFN-<font face=\"symbol\">g. Nosso objetivo no presente trabalho foi caracterizar um modelo celular para a indução do proteassomo imune, e ainda investigar o repertório peptídeo intracelular produzido por esta forma particular do proteassoma, através da técnica de espectrometria de massas. Em resumo, os nossos dados mostraram um aumento de 3 vezes do peptídeo EL28 derivado da proteína RPT2 em células HeLa tratadas com o IFN-<font face=\"symbol\">g. O peptídeo EL28 pode ser de relevância clínica para o tratamento de distúrbios relacionados com a apresentação de antígenos, visto que ele parece ativar a atividade quimotripsina-like quando incubado com o extrato celular de células HeLa. / Eukaryotic cells contain several types of proteasome regulating the process of protein degradation. The proteasome are responsible for most non - lysosomal protein degradation in eukaryotic cells. The three catalytic subunits of the proteasome are &beta;1, &beta;2 and &beta;5. Under conditions of stress and immune response these three subunits are replaced by &beta;1i, &beta;2i and &beta;5i, respectively, to form the immune proteasome . These three inducible subunits, appear to alter the specificity of the immune proteasome peptidase in cells treated with IFN-<font face=\"symbol\">g. Our aim in this study was to characterize a cellular model for the induction of the immune proteasome, and even investigate the intracellular peptide repertoire produced by this particular form of the proteasome, through the technique of mass spectrometry. In summary, our data showed an increase of 3 times the peptide derived from RPT2 EL28 protein in HeLa cells treated with IFN-<font face=\"symbol\">g. The EL28 peptide may be of clinical relevance for the treatment of disorders related to antigen presentation, since it seems to activate the chymotrypsin-like activity when incubated with the cell extract of HeLa cells.

Células eucarióticas contêm vários tipos de proteassomo que regulam o processo de degradação de proteína. Proteassomos são proteases multicatalíticas que são responsáveis pela maior parte de degradação não-lisossomal de proteínas em células eucarióticas. As três subunidades catalíticas do proteassomo são &beta;1, &beta;2 e &beta;5. Em condições de stress e resposta imune essas três subunidades são substituídas por &beta;1i, &beta;2i and &beta;5i, respectivamente, para formar o proteassomo imune. Estas três subunidades induzíveis, parecem alterar as especificidades de peptidase do proteassoma imune em células tratadas com IFN-<font face=\"symbol\">g. Nosso objetivo no presente trabalho foi caracterizar um modelo celular para a indução do proteassomo imune, e ainda investigar o repertório peptídeo intracelular produzido por esta forma particular do proteassoma, através da técnica de espectrometria de massas. Em resumo, os nossos dados mostraram um aumento de 3 vezes do peptídeo EL28 derivado da proteína RPT2 em células HeLa tratadas com o IFN-<font face=\"symbol\">g. O peptídeo EL28 pode ser de relevância clínica para o tratamento de distúrbios relacionados com a apresentação de antígenos, visto que ele parece ativar a atividade quimotripsina-like quando incubado com o extrato celular de células HeLa. / Eukaryotic cells contain several types of proteasome regulating the process of protein degradation. The proteasome are responsible for most non - lysosomal protein degradation in eukaryotic cells. The three catalytic subunits of the proteasome are &beta;1, &beta;2 and &beta;5. Under conditions of stress and immune response these three subunits are replaced by &beta;1i, &beta;2i and &beta;5i, respectively, to form the immune proteasome . These three inducible subunits, appear to alter the specificity of the immune proteasome peptidase in cells treated with IFN-<font face=\"symbol\">g. Our aim in this study was to characterize a cellular model for the induction of the immune proteasome, and even investigate the intracellular peptide repertoire produced by this particular form of the proteasome, through the technique of mass spectrometry. In summary, our data showed an increase of 3 times the peptide derived from RPT2 EL28 protein in HeLa cells treated with IFN-<font face=\"symbol\">g. The EL28 peptide may be of clinical relevance for the treatment of disorders related to antigen presentation, since it seems to activate the chymotrypsin-like activity when incubated with the cell extract of HeLa cells.

O proteassomo é o componente do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS), responsável pela degradação de proteínas intracelulares marcadas com cauda de ubiquitina. No entanto, a unidade catalítica do proteassomo (20SPT), destituída de unidades regulatórias, é capaz de degradar proteínas de maneira ubiquitina-independente. Diversas modificações pós-traducionais já foram descritas para o 20SPT, incluindo a S-glutatiolação. De acordo com Demasi e col., (2003) o 20SPT da levedura Saccharomyces cerevisiae possui a atividade tipo-quimiotripsina modulada por glutationa e o mecanismo de glutatiolação implica na formação do intermediário ácido sulfênico. No presente trabalho, identificamos por espectrometria de massas (MS/MS) um total de sete resíduos diferentes de cisteína glutatiolados no 20SPT, sendo seis in vitro por incubação com GSH e três in vivo, extraído de células crescidas até atingir fase estacionária tardia em meio rico. Analisando a estrutura 3D do 20SPT, observou-se que os resíduos de cisteína glutatiolados não estão localizados na entrada da câmara catalítica nem próximos aos sítios-ativos, indicando um mecanismo alostérico da modulação da atividade proteassomal. O proteassomo glutatiolado extraído de leveduras é capaz de degradar proteínas oxidadas de maneira mais eficiente que o proteassomo reduzido por DTT, e ainda, esta degradação gera perfis peptídicos diferenciados por utilizar distintamente as atividades sítio-especificas, como visualizado por análises de HPLC e MS/MS. Por microscopia eletrônica verificamos a conformação aberta da câmara catalítica do proteassomo glutatiolado, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Caracterizamos ainda, enzimas reponsáveis pela desglutatiolação do 20SPT, capazes de recuperar as atividades proteassomais que haviam sido diminuídas pela glutatiolação: as oxidoredutases glutarredoxina 2 e as tiorredoxinas citosólicas. O mecanismo ainda inclui a hidrólise dessas oxidorredutases, fenômeno também verificado para diversas proteínas da suprafamília tiorredoxina, provavelmente devido a propriedades estruturais desta família. A glutatiolação do proteassomo apresenta-se como uma nova modificação pós-traducional de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular. Esta modificação promove aumento da atividade proteolítica, sugerindo uma função antioxidante atuante na remoção de proteínas oxidadas durante desafios oxidativos / The proteasome is the protease of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS) responsible for the breakdown of intracellular ubiquitin-tagged proteins. However, the catalytic particle of the proteasome (20SPT) is capable of hydrolyzing some substrates in an ubiquitin-independent fashion. The S-glutathiolation of the 20SPT was described among several post-translational modifications and according to Demasi et. al. (2003), the chymotrypsin-like activity of proteasome from yeast Saccharomyces cerevisiae is regulated by glutathione. The mechanism of S-glutathiolation is dependent on the formation of the sulfenic acid intermediate in the cisteine residues of the 20SPT. In this present work, we identified in vitro and in vivo, a total of seven different S-glutathiolated proteasomal cysteine residues by mass spectrometry studies (MS/MS) and, by analyzing the 3D structure of the 20SPT, the modified cysteine residues are not located either on the entrance of the catalytic core or near to the active sites, indicating an allosteric mechanism of proteasomal modulation. During protein degradation, the natively S-glutathiolated 20SPT produces different patterns of peptide products when compared to the DTT-reduced particle through distinct site-specific cleavage of the protein substrates, as herein demonstrated by HPLC and MS/MS analyses. Furthermore, by electron microscopy, we showed that the entrance of the natively glutathiolated 20SPT is in the open conformation that immediately shifts to the closed conformation in the presence of DTT. We have also characterized the deglutathiolase role of the oxidoreductases Glutaredoxin 2 and Citosolic Thioredoxins 1 and 2 which recover the partially inhibited 20SPT activities. The deglutathiolation mechanism also includes the oxidoreductase degradation dependent on the 20SPT activation. The proteasome Sglutathiolation emerges as a new physiological post-translational modification correlated to the cellular redox state. Moreover, the S-glutathiolation of the 20SPT increases its proteolytic activity suggesting an antioxidant role by removing oxidized proteins generated during oxidative challenges.

A autofagia é o processo de degradação de estruturas celulares através do seu direcionamento ao lisossomo. As proteínas TRIMs reconhecem as -cargas? autofágicas e reúnem o complexo de nucleação do fagóforo, contudo se desconhece a função de cada domínio e a importância da atividade de E3 ligase para a sua atividade. A proteína TRIM49 clonada e expressa em E. coli ou em células humanas HEK293T não apresentou atividade de E3 ubiquitina ligase in vitro e reduziu os níveis totais de ubiquitinação in vivo, indicando que não é um E3 ubiquitina ligase. Células desafiadas com Htt74Q apresentaram menores níveis de citotoxicidade quando co-transfectadas com TRIM49 selvagem, mas não com os mutantes do domínio RING ou SPRY, indicando os dois domínios são necessários para sua atividade celular. A proteína selvagem se colocaliza com o marcador autofágico LC3, após o bloqueio da autofagia com bafilomicina A1. Os resultados indicam que a TRIM49 pode atuar na degradação intracelular de proteínas, por um mecanismo não dependente de atividade de E3 ligase. / Autophagy is the process of degradation of intracellular proteins through their directioning to the lysosome. TRIM proteins can directely recognize autophagic cargo and also act as a hub for the phagophore nucleation complex, however the function of each domain and the role of the E3 ligase activity in this process is unknown. The TRIM49 protein cloned and expressed in E. coli or in human cells HEK23T showed no ubiquitin E3 ligase activity in vitro and cells transfected with the wild type protein showed lower levels of polyubiquitinated proteins, indicating that TRIM49 is not a bona fide E3 ubiquitin ligase. Cells challenged with Htt74Q presented lower cytotoxicity levels when cotransfected with wild type TRIM49, when compared with the RING domain mutant or with the truncated protein lacking the SPRY domain, indicating that both domains are required for its cellular activity. The wild type protein colocalizes with the autophagic marker LC3 after treatment with the autophagy inhibitor bafilomycin A1. Taken together, these results indicate that the TRIM49 protein plays a role in protein degradation independently of a E3 ligase activity.

O proteassomo é uma protease intracelular multimérica e multicatalítica responsável pela degradação de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular, processos de sinalização, apresentação antigênica e no controle de síntese proteica. Ele é constituído por uma unidade catalítica central denominada 20S (20SPT) e por unidades regulatórias (19S) acopladas em uma ou ambas as extremidades para formar o 26S (26SPT). O 26SPT reconhece e direciona os substratos poliubiquitinados para a proteólise por um mecanismo dependente de ATP. Entretanto, o 20SPT também é ativo quando dissociado de unidades regulatórias, degradando proteínas independentemente de poliubiquitinação e consumo de ATP. Proteínas modificadas oxidativamente e outros substratos são degradados desta maneira. O 20SPT é composto por dois anéis heptaméricos centrais (&beta;) onde estão localizados os sítios catalíticos e por dois anéis heptaméricos externos (&alpha;) que são responsáveis pela abertura da câmara catalítica. Anteriormente, foi observado pelo grupo que o 20SPT da levedura S.cerevisiae sofre S-glutatiolação na subunidade &alpha;5 nos resíduos de Cys76 e Cys221. Assim, foram obtidas neste projeto linhagens de levedura S. cerevisiae portando mutações sítio-específicas na subunidade &alpha;5 do 20SPT (&alpha;5-C76S ou &alpha;5-C221S), e posteriormente, ensaios comparativos quanto às consequências estruturais e funcionais dessas mutações foram realizados. Observamos um aumento na capacidade/velocidade de degradação nas atividades peptidásicas e proteolíticas da mutante C221, e também que, a população de proteassomo isolada dessa linhagem apresenta maior proporção da forma aberta da câmara catalítica, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Resultados opostos foram observados na linhagem mutante C76. Identificamos por espectrometria de massas o resíduo C76 do 20SPT glutationilado na mutante C221. Os ensaios fenotípicos mostraram um aumento da longevidade e resistência ao estresse oxidativo da C221, enquanto que a linhagem C76 mostrou uma dificuldade no crescimento. Contudo, a S-glutationilação do 20SPT é uma modificação química pós-traducional reversível de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular, e, o presente trabalho discute a modulação da câmara catalítica do 20SPT através da S-glutationilação de dois resíduos de cisteína localizados na subunidade &alpha;5, e as consequências desta modificação na função proteassomal / The proteasome is a multimeric and multicatalytic intracellular protease responsible for the degradation of proteins involved in cell cycle control, signaling processes, antigen presentation, and control of protein synthesis. It comprises a central catalytic unit called 20S (20SPT) and regulatory units (19S) coupled at one or both ends to form 26S (26SPT). The 26SPT recognizes and directs polyubiquitinylated substrates targeted for proteolysis by an ATP-dependent mechanism. However, 20SPT is also active when dissociated from regulatory units, degrading proteins by a process independent of polyubiquitinylation and ATP consumption. Oxidatively modified proteins and other substrates are degraded in this manner. The 20SPT comprises two central heptamerics rings (&beta;) where are located the catalytic sites and two external heptamerics rings (&alpha;) that are responsible for proteasomal gating. Previously, it was observed by our group that the 20SPT of yeast S. cerevisiae is modified by S-glutathionylation in the residues Cys76 and Cys221 of the &alpha;5 subunit. Thus, were obtained in this project strains of the S. cerevisiae carrying site-specific mutations in the &alpha;5 subunit of the 20SPT (&alpha;5-C76S or &alpha;5-C221S), and comparative assays as the structural and functional consequences of these mutations were performed. We observed an increase in capacity/speed of degradation in peptidase and proteolytic activity in the C221 strain and also that, the isolated population of the proteasome this strain presents the highest frequency of open catalytic chamber conformation, which is immediately closed by the removal of glutathione of the 20SPT in the presence of DTT. Opposite results were observed in the C76 strain. We identified by mass spectrometry the C76 residue of the 20SPT glutathionyilated the C221 mutant. Phenotypic assays show an increased longevity and resistance to oxidative stress of C221, while the C76 strain showed a difficulty in growth. However, the S-glutathionylation of the 20SPT is a reversible post-translational chemical modification of physiological occurrence dependent on the cellular redox state, and this project discusses the modulation of the catalytic chamber of 20SPT via S-glutationylation of the two cysteine residues located the &alpha;5 subunit, and the consequences of this change in proteosomal function

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:25:48Z : No. of bitstreams: 1 Publico-10866.pdf: 1428796 bytes, checksum: 3e8b3b83a47e7f481fd590e1f74949b4 (MD5) / A degradacao de proteinas pelo sistema ubiquitina-proteassoma gera uma grande quantidade de oligopeptideos dentro das celulas. Para investigar possiveis efeitos desses oligopeptideos, alguns deles foram isolados do cerebro de rato, sintetizados acoplados a sequencia peptidica TAT atraves de pontes dissulfeto, sendo entao analisados nas vias de transducao de sinal de receptores acoplados a proteina G. A mistura contendo os quatro peptideos analisados (20-80 ƒÊM) inibiu de forma significativa o aumento da taxa de acidificacao do meio extracelular induzido pela angiotensina II em celulas CHO-S que expressam o receptor AT1 (CHO-S-AT1). Adicionalmente, tanto sozinhos quanto em mistura, estes peptideos aumentaram a transcricao do gene reporter da luciferase induzida pela angiotensina II em celulas CHO-S-AT1, assim como aquela induzida pelo isoproterenol em celulas HEK293. Os peptideos sem TAT, incapazes de atravessar a membrana das celulas, nao alteraram as respostas a estimulacao dos receptores, sugerindo um efeito intracelular dos peptideos nas cascatas de transducao de sinal. Alem disso, todos os peptideos estudados inibiram competitivamente a degradacao de um substrato sintetico da oligopeptidase EP24.15 in vitro. O aumento da expressao da EP24.15 em celulas CHO-S e HEK293 foi suficiente para reduzir a atividade do gene reporter luciferase induzida pela angiotensina II ou pelo isoproterenol. Finalmente, a utilizacao dos peptideos como gisca h em colunas de afinidade revelou que diversas proteinas envolvidas na sinalizacao de receptores acoplados a proteina G interagem com os peptideos, incluindo a adaptina A-alfa e a dinamina-1. Estes resultados sugerem que antes de serem completamente degradados, os peptídeos intracelulares semelhantes àqueles gerados pelo proteassoma podem afetar ativamente a sinalização intracelular, delineando-se como novas moléculas bioativas dentro das células. / TEDE

A autofagia é o processo de degradação de estruturas celulares através do seu direcionamento ao lisossomo. As proteínas TRIMs reconhecem as -cargas? autofágicas e reúnem o complexo de nucleação do fagóforo, contudo se desconhece a função de cada domínio e a importância da atividade de E3 ligase para a sua atividade. A proteína TRIM49 clonada e expressa em E. coli ou em células humanas HEK293T não apresentou atividade de E3 ubiquitina ligase in vitro e reduziu os níveis totais de ubiquitinação in vivo, indicando que não é um E3 ubiquitina ligase. Células desafiadas com Htt74Q apresentaram menores níveis de citotoxicidade quando co-transfectadas com TRIM49 selvagem, mas não com os mutantes do domínio RING ou SPRY, indicando os dois domínios são necessários para sua atividade celular. A proteína selvagem se colocaliza com o marcador autofágico LC3, após o bloqueio da autofagia com bafilomicina A1. Os resultados indicam que a TRIM49 pode atuar na degradação intracelular de proteínas, por um mecanismo não dependente de atividade de E3 ligase. / Autophagy is the process of degradation of intracellular proteins through their directioning to the lysosome. TRIM proteins can directely recognize autophagic cargo and also act as a hub for the phagophore nucleation complex, however the function of each domain and the role of the E3 ligase activity in this process is unknown. The TRIM49 protein cloned and expressed in E. coli or in human cells HEK23T showed no ubiquitin E3 ligase activity in vitro and cells transfected with the wild type protein showed lower levels of polyubiquitinated proteins, indicating that TRIM49 is not a bona fide E3 ubiquitin ligase. Cells challenged with Htt74Q presented lower cytotoxicity levels when cotransfected with wild type TRIM49, when compared with the RING domain mutant or with the truncated protein lacking the SPRY domain, indicating that both domains are required for its cellular activity. The wild type protein colocalizes with the autophagic marker LC3 after treatment with the autophagy inhibitor bafilomycin A1. Taken together, these results indicate that the TRIM49 protein plays a role in protein degradation independently of a E3 ligase activity.

O proteassomo é uma protease intracelular multimérica e multicatalítica responsável pela degradação de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular, processos de sinalização, apresentação antigênica e no controle de síntese proteica. Ele é constituído por uma unidade catalítica central denominada 20S (20SPT) e por unidades regulatórias (19S) acopladas em uma ou ambas as extremidades para formar o 26S (26SPT). O 26SPT reconhece e direciona os substratos poliubiquitinados para a proteólise por um mecanismo dependente de ATP. Entretanto, o 20SPT também é ativo quando dissociado de unidades regulatórias, degradando proteínas independentemente de poliubiquitinação e consumo de ATP. Proteínas modificadas oxidativamente e outros substratos são degradados desta maneira. O 20SPT é composto por dois anéis heptaméricos centrais (&beta;) onde estão localizados os sítios catalíticos e por dois anéis heptaméricos externos (&alpha;) que são responsáveis pela abertura da câmara catalítica. Anteriormente, foi observado pelo grupo que o 20SPT da levedura S.cerevisiae sofre S-glutatiolação na subunidade &alpha;5 nos resíduos de Cys76 e Cys221. Assim, foram obtidas neste projeto linhagens de levedura S. cerevisiae portando mutações sítio-específicas na subunidade &alpha;5 do 20SPT (&alpha;5-C76S ou &alpha;5-C221S), e posteriormente, ensaios comparativos quanto às consequências estruturais e funcionais dessas mutações foram realizados. Observamos um aumento na capacidade/velocidade de degradação nas atividades peptidásicas e proteolíticas da mutante C221, e também que, a população de proteassomo isolada dessa linhagem apresenta maior proporção da forma aberta da câmara catalítica, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Resultados opostos foram observados na linhagem mutante C76. Identificamos por espectrometria de massas o resíduo C76 do 20SPT glutationilado na mutante C221. Os ensaios fenotípicos mostraram um aumento da longevidade e resistência ao estresse oxidativo da C221, enquanto que a linhagem C76 mostrou uma dificuldade no crescimento. Contudo, a S-glutationilação do 20SPT é uma modificação química pós-traducional reversível de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular, e, o presente trabalho discute a modulação da câmara catalítica do 20SPT através da S-glutationilação de dois resíduos de cisteína localizados na subunidade &alpha;5, e as consequências desta modificação na função proteassomal / The proteasome is a multimeric and multicatalytic intracellular protease responsible for the degradation of proteins involved in cell cycle control, signaling processes, antigen presentation, and control of protein synthesis. It comprises a central catalytic unit called 20S (20SPT) and regulatory units (19S) coupled at one or both ends to form 26S (26SPT). The 26SPT recognizes and directs polyubiquitinylated substrates targeted for proteolysis by an ATP-dependent mechanism. However, 20SPT is also active when dissociated from regulatory units, degrading proteins by a process independent of polyubiquitinylation and ATP consumption. Oxidatively modified proteins and other substrates are degraded in this manner. The 20SPT comprises two central heptamerics rings (&beta;) where are located the catalytic sites and two external heptamerics rings (&alpha;) that are responsible for proteasomal gating. Previously, it was observed by our group that the 20SPT of yeast S. cerevisiae is modified by S-glutathionylation in the residues Cys76 and Cys221 of the &alpha;5 subunit. Thus, were obtained in this project strains of the S. cerevisiae carrying site-specific mutations in the &alpha;5 subunit of the 20SPT (&alpha;5-C76S or &alpha;5-C221S), and comparative assays as the structural and functional consequences of these mutations were performed. We observed an increase in capacity/speed of degradation in peptidase and proteolytic activity in the C221 strain and also that, the isolated population of the proteasome this strain presents the highest frequency of open catalytic chamber conformation, which is immediately closed by the removal of glutathione of the 20SPT in the presence of DTT. Opposite results were observed in the C76 strain. We identified by mass spectrometry the C76 residue of the 20SPT glutathionyilated the C221 mutant. Phenotypic assays show an increased longevity and resistance to oxidative stress of C221, while the C76 strain showed a difficulty in growth. However, the S-glutathionylation of the 20SPT is a reversible post-translational chemical modification of physiological occurrence dependent on the cellular redox state, and this project discusses the modulation of the catalytic chamber of 20SPT via S-glutationylation of the two cysteine residues located the &alpha;5 subunit, and the consequences of this change in proteosomal function