pH studies are used to gain insight into chemical mechanisms of enzyme catalysed reactions. However, perhaps the most important practical point that is often overlooked in pH studies is control of the ionic strength of reaction mixtures at the various pH values. For example, cathepsins Band L were suspected to be involved in cancer invasion but pH vs activity profiles indicated that they were not active at the extracellular pH (pH 7.2). When these profiles were re-evaluated in buffers of constant ionic strength, as opposed to buffers of constant molarity, it was shown that the enzymes were indeed active at pH 7.2. Other enzymes have also been reported to be sensitive to ionic strength. These include neutrophil elastase, class sigma glutathione S-transferase and penicillin G-acylase amongst others. The effects of increasing ionic strength on the activity of six enzymes were investigated. a-Glucosidase (from bakers ' yeast), elastase (human leukocyte) and trypsin (bovine pancreatic), cathepsin L (sheep liver), cathepsin B (rabbit liver), fruit bromelain (pineapple fruit) were subjected to different ionic strength buffers and their activities and Km and Vmax were determined as a function of ionic strength. The influence of ionic strength on Ki values has not been previously reported and was also studied, using the interaction between chicken egg-white cystatin C and cathepsin L as a model. a-Glucosidase was found to have an ionic strength optimum and elastase showed increasing activity with an increase in ionic strength. Trypsin activity decreased with increasing ionic strength with a substrate containing a positively charged side chain in the P1 position, and an increase in activity with a substrate containing a hydrophobic group at the P1 position. Cathepsin B activity increased when acting on the substrate Z-Phe-ArgNHMec and decreased when acting on Z-Arg-Arg-NHMec, with increasing ionic strength. Bromelain showed an increase in activity with increasing ionic strength. Cathepsin L activity decreased at increasing ionic strength and the Ki values for the cathepsin L-cystatin C interaction increased with increasing ionic strength. The results obtained can be attributed to the nature of the specificity pockets involved in binding the substrate, effects on the catalytic mechanism of the enzyme or structural changes due to increasing ionic strength. These results show that the ionic strength is a significant variable and should be kept constant or at in vivo levels when assaying enzymes. / Thesis (M.Sc.)-University of KwaZulu-Natal, Pietermaritzburg, 2005.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:30:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 584816 bytes, checksum: f4330ebbc024b36a1ab766369b97b738 (MD5) Previous issue date: 2008-07-07 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Plants previously attacked by herbivores may have their defense system activated. The defense forms may occur by different routes. Some of the unleashed routes take place right after the herbivory, when the plant starts responding in an indirect way through the production of volatile substances attractive to natural enemies of the infesting phytophagous. Another route would be the direct response from the plant through the synthesis of proteinase inhibitors produced post-injury, which can affect the development and growth of the infesting phytophagous. The plants can present specificity in the induced responses, that is, the defenses may intimidate a subsequent herbivory; however, in some cases the re- infesting species do not have their performance affected. Recent studies have shown resistance mechanisms in plants of commercial interest against the attack of pests. Strawberry plants which are cultivated in large scale in Brazil have suffered serious damage by the two spotted mite Tetranychus urticae, which is a primary pest for the culture. Therefore, the present study had as an aim to study induced direct resistance in strawberry plants (Fragaria x ananassa Duch.) upon the population dynamics of the two-spotted mite T. urticae. In the experimental studies clean strawberry plants (control), plants that were mechanically injured as well as plants pre-infected with the two-spotted mite T. urticae were used. In order to determine the proteinase inhibitors, samples of each treatment were used. Based on these methods, in test 1 the hypothesis that the pre-infestation of T. urticae would induce the production of proteinase inhibitors reducing the population growth of their co-specifics was tested. In test 2, the specificity of the defensive compounds was studied, testing then the hypothesis that the pre- infestation of T. urticae would induce the production of proteinase inhibitors which would affect the development of red mite Tetranychus mexicanus, a species of spider mite that also occur in strawberry plants. In test 3, the hypothesis that the infestation by T. urticae in the mother strawberry plants would induce the production of proteinase inhibitors and these would be translocated through stolons unt il the strawberry runners injuring the development of T. urticae in these daughter plants was tested. According to the results a smaller number of individuals of T. urticae were found in plants previously infected with the co-specific. The spider mite T. mexicanus did not have its development affected by the induced response due to the pre-infestation of T. urticae. The plant response had contrasting effect to T. mexicanus, apparently the induced defenses in strawberry plants do not act in reinfestations of hetero-specifics, ate least for T. mexicanus. The population growth of T. urticae was also smaller in the strawberry runners of strawberry plants. The induced defense by T. urticae in mother strawberry plants presented systemic defense signals through the stolon, affecting the performance of the phytophagous of the strawberry runners. In the results of the concentrations of proteinase inhibitors, one could verify that they varied among the treatments in the experiments, but were not correlated to phytophagous performance. Possibly, other phytochemicals compounds produced by the plants might be involved in the induced responses by T. urticae. These results support the hypothesis that the plants that present direct defense can reduce the performance of co-specific phytophagous in the following generation. / Plantas previamente atacadas por herbívoros podem ter o seu sistema de defesa ativado. As formas de defesa podem ocorrer por diferentes rotas. Algumas das rotas desencadeadas ocorrem logo após a herbivoria, quando a planta passa a responder de forma indireta através da produção de substâncias voláteis atrativas aos inimigos naturais dos fitófagos infestantes. Uma outra rota seria a resposta direta da planta através da síntese de inibidores de proteases produzidos após a injúria, o que pode afetar o desenvolvimento e crescimento de fitófagos infestantes. As plantas, por sua vez, podem apresentar especifidade nas respostas induzidas, ou seja, as defesas podem intimidar a herbivoria posterior, porém em alguns casos as espécies re- infestantes não tem o desempenho afetado. Estudos recentes têm demonstrado mecanismos de resistência em plantas de interesse comercial contra o ataque de pragas. Plantas de morangueiro que são cultivadas em larga escala no Brasil têm sofrido sérios danos pelo ácaro-rajado Tetranychus urticae, que é praga primária para a cultura. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo estudar a resistência induzida direta em plantas de morangueiro (Fragaria x ananassa Duch.) sobre populações de T. urticae. Nos estudos experimentais foram utlizadas plantas de morangueiro limpas (controle), plantas injuriadas mecanicamente e plantas pré-infestadas por T. urticae. Para determinação dos inibidores de proteases foram utilizadas amostras de folhas limpas de cada tratamento. Baseado nestes métodos, testou-se no ensaio 1 a hipótese de que a pré-infestação de T. urticae induziria a produção de inibidores de proteases reduzindo o crescimento populacional de seus coespecíficos. No ensaio 2, estudou-se a especificidade dos compostos defensivos, testando a hipótese de que a pré-infestação de T. urticae induziria a produção de inibidores de proteases que afetariam o desenvolvimento do ácaro-vermelho Tetranychus mexicanus, uma espécie de ácaro que também ocorre em morangueiro. No ensaio 3, foi testada a hipótese de que a infestação por T. urticae nas plantas matrizes de morangueiro induziria a produção de inibidores de proteases e estes seriam translocados através dos estolões até as plantas-filhas prejudicando o desenvolvimento de T. urticae nestes propágulos. De acordo com os resultados, menor número de indíviduos de T. urticae foram encontrados em plantas previamente infestadas com o coespecífico. O ácaro T. mexicanus não teve seu desenvolvimento afetado pela resposta induzida decorrente da pré-infestação de T. urticae. A resposta da planta teve efeito contrastante a T. mexicanus , aparentemente as defesas induzidas em morangueiro não atuam em re-infestações de heteroespecíficos, pelo menos para T. mexicanus. O crescimento populacional de T. urticae também foi menor nos propágulos de morangueiro. A defesa induzida por T. urticae em plantas matrizes de morangueiro apresentou sistemicidade, através do estolão, afetando o desempenho dos fitófagos nos propágulos. Nos resultados das concentrações de inibidores de proteases, verificou-se em geral, que as mesmas variaram entre os tratamentos nos experimentos, mas não foram correlacionados ao desempenho dos fitófagos. Possivelmente, outros compostos fitoquímicos produzidos pelas plantas estejam envolvidos nas respostas induzidas por T. urticae. Estes resultados suportam a hipótese de que as plantas que apresentam defesa direta podem reduzir o desempenho de fitófagos coespecíficos na geração seguinte.

Essa tese teve como objetivo avaliar todos os casos de candidose sistêmica por Candida albicans identificadas através de kit comercial ID 32C® (bioMérieux), diagnosticados no Laboratório de Micologia da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre/RS, durante o período de 1999 a 2009, buscando identificar a prevalência de C. dubliniensis, bem como avaliar os fatores de virulência e diferença de perfil de suscetibilidade antifúngica entre os isolados clínicos. Foi realizado um levantamento clínico-epidemiológico dos casos incluídos no estudo, avaliando sexo, idade, manifestações clínicas, evolução, região proveniente do paciente, doença de base, condições predisponentes, utilização de corticóides e antibióticos e resposta ao tratamento recebido. Para a diferenciação das duas espécies utilizou-se testes fenotípicos (arranjo dos clamidosporos, teste de termotolerância, formação do tubo germinativo, crescimento em meio hipertônico e niger), molecular (espectrometria de massa) e genotípico (reação em cadeia da polimerase - PCR). Em adição, foi avaliada a eficácia do método de conservação das leveduras estocadas a -20ºC e comparamos quatro substratos (soro fresco, soro congelado, ágar e caldo Mueller-Hinton) para a prova do tubo germinativo. Determinou-se a produção da fosfolipase e proteinase em isolados incluídos no estudo. A atividade in vitro dos antifúngicos fluconazol, anfotericina B e anidulafungina frente aos isolados estudados foi determinada através da concentração inibitória mínima (CIM), a concentração fungicida mínima (CFM) e ponto de corte epidemiológico (ECV). Os casos de candidemia por C. albicans diagnosticados durante 10 anos ocorreram com maior frequência em pacientes adultos com presença de cateteres. Observamos que houve maior chance de ocorrência desta em pacientes oncológicos. O percentual de alta nos pacientes foi baixo. O método utilizado para a conservação de leveduras nesse estudo apresentou taxa de 70% de viabilidade. O ágar e o caldo Mueller-Hinton demonstraram sensibilidade de 90% e especificidade de 100%. Os isolados de C. albicans provenientes de hemocultivos apresentaram produção de fosfolipase em 78% e proteinase em 97% dos isolados. A espécie C. dubliniensis não foi identificada em isolados de hemocultivos, sendo todos os casos de candidemia por C. albicans. Os testes microcultivo em ágar fubá, espectrometria de massa, caldo niger e caldo hipertônico concordaram com o teste genotípico. Os isolados de C. albicans apresentaram maior suscetibilidade a anidulafungina, entretanto, os menores valores obtidos em 90% dos isolados (CIM90) foi pela anfotericina B. E através do ECV, os isolados poderiam ser resistentes ao fluconazol, demonstrando a importância da associação desses dois parâmetros. / The aim this tesis was to evaluate systemic candidiasis cases by Candida albicans through ID 32C® (bioMérieux), at Mycology Laboratory of the Santa Casa de Porto Alegre/RS, during 1999 to 2009, seeking to identify the C. dubliniensis prevalence, as well as evaluating the virulence factors and antifungal susceptibility profile difference of among isolates. The clinical and epidemiological survey was made through gender, age, clinical manifestations, evolution, patient's region, underlying disease, predisposing conditions, steroids and antibiotics use, and response to treatment. The phenotypic tests (tthermotolerance, germ tube, hypertonic and Niger medium), molecular (mass spectrometry) and genotypic (polymerase chain reaction – PCR) was used for two species identification. We also assessed if the mantainance of C. albicans stored at - 20ºC in a freezer with sterile distilled water was usefull.The four substrate (fresh and frozen serum, agar and broth Mueller-Hinton®) were used for germ tube formation and the phospholipase and proteinase activity were evaluated. The in vitro activity of fluconazole, amphotericin B and anidulafungin were compared through the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum fungicidal concentration (MFC) and epidemiological cutoff value (ECV). The candidemia cases by C. albicans for ten years occurred more frequently in adult and catheters use. We observed the more chance this occurrence in cancer patients. The survival percentage was low. The used method in the study for yeast stored had 70% of viability. The agar and broth Mueller-Hinton were 90% sensitivity and 100% specificity. The boodstream isolates of C. albicans produce virulence factors, such the germ tube production and hydrolytic enzymes (78% of phospholipase and 97% of protease) production. The C. dubliniensis was not identified in bloodstream isolates, thus all candidemia cases were by C. albicans. The mass spectrometry, cornmeal agar, Niger and hypertonic broth agreed with genotypic test. The isolates exhibited more susceptibility to anidulafungin, and 90% of them (MIC90) exhibited the lowest values against amphotericin B. Based on ECV and Pfaller classification, isolates could be resistant to fluconazole, demonstrating the importance of the combination of these parameters.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Aranhas do gênero Loxosceles, são responsáveis por acidentes em todo o mundo, com grande importância clínica no Sul do Brasil. Os venenos destas aranhas são compostos por diversas toxinas, entre elas proteínas, responsáveis pelo quadro conhecido como loxoscelismo. No intuito de descrever o perfil transcricional da glândula produtora de veneno da aranha Loxosceles intermedia geramos uma biblioteca de cDNA bastante ampla e seus transcritos foram funcionalmente caracterizados. Após o processamento inicial das sequências, 1.843 ESTs (Expressed Sequence Tags) apresentavam qualidade suficiente para as análises posteriores. Estas sequências foram montadas em 538 clusters, sendo que 281 eram singletons. Após análises de similaridade, mais de 50% das ESTs demonstraram algum grau de semelhança com proteínas conhecidas. As análises de similaridade também demonstraram que os transcritos que codificavam para toxinas, perfaziam 43% de todas as sequências e abrangem uma parte significativa das ESTs. As toxinas mais frequentes foram anotadas como pertencentes à família LiTx de toxinas inseticidas. As fosfolipases-D e as metaloproteases semelhantes à astacinas perfazem, cada uma, cerca de 9% do total de transcritos. Componentes tóxicos tais como inibidores de serino-proteases, hialuronidase e proteínas alergênicas foram também identificadas, porém com menor representação. Quase 10% das ESTs codificam para proteínas envolvidas em processos celulares. O presente trabalho descreve também as etapas para clonagem, expressão heteróloga e purificação de um transcrito semelhante a um inibidor de serino-protease, identificado na biblioteca de cDNA. É sabido que proteínas desta família apresentam um grande potencial de aplicação como drogas antitrombóticas, atuando como agentes terapêuticos que influenciam a atividade de fatores de coagulação. Esses dados fornecem uma visão global do perfil de expressão da glândula de veneno de L. intermedia, revelam diferenças significantes entre venenos de aranhas do gênero Loxosceles e descrevem a produção de uma nova toxina recombinante. / Loxosceles genus spiders are responsible for accidents all over the world and have clinical importance in the South of Brazil. The venom of these spiders is made up of several toxins, including proteins, which are responsible for the clinical pattern called loxoscelism. To describe the transcriptional profile of the L. intermedia venom gland, we generated a wide cDNA library, and its transcripts were functionally and structurally analyzed. After initial analyses, 1,843 ESTs produced readable sequences that were grouped into 538 clusters, 281 of which were singletons. Nine hundred eighty-five reads (53% of total ESTs) matched to known proteins. Similarity searches showed that toxinencoding transcripts totalize 43% of the total library and comprise a great number of ESTs. The most frequent toxins were from the LiTx family, which are known for their insecticidal activity. Both phospholipase-D and astacin-like metalloproteases toxins account for approximately 9% of total transcripts. Toxins components such as serine proteases, hyaluronidases and venom allergens were also found but with minor representation. Almost 10% of the ESTs encode for proteins involved in cellular processes. This work also describes the stages for cloning, heterologous expression and purification of a cDNA similar to a protease inhibitor identified in the cDNA library. It is known that proteins belonging to this family have an application potential as antithrombotic drugs, acting as therapeutic agents that influences the activity of coagulation factors. These data provide an important overview of the L. intermedia venom gland expression scenario, revealed significant differences from profiles of other spiders from the Loxosceles genus and describe the production of a novel recombinant toxin. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:34:59Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-29Bitstream added on 2014-06-13T19:24:02Z : No. of bitstreams: 1 frangioni_dss_dr_botfca.pdf: 2302780 bytes, checksum: a3bab8cdfaa8a760d70900c13de09d8d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O gênero Potyvirus é um dos maiores dentre os vírus de planta com genoma composto por RNA. O genoma dos potyvirus codifica um único polipeptídeo que é processado por três proteinases virais que originam todas as proteínas necessárias para complementar o ciclo da infecção. A proteína HC-Pro (Helper Component proteinase) é uma dessas proteínas multifuncionais que está envolvida na amplificação do genoma, transmissão por afídeo, movimento sistêmico e local, supressão do silenciamento gênico e proteólise. Nesse trabalho, foi realizada a substituição funcional de parte da região codificadora da HC-Pro do Lettuce mosaic virus (LMV) com a porção correspondente à HC-Pro do Potato virus Y (PVY), com o objetivo de melhor compreender os papéis dessa proteína no ciclo de infecção dos potyvirus. O LMV e o PVY diferem tanto em patogenicidade quanto em círculo de hospedeiros. O LMV infecta, principalmente, espécies da família Asteraceae (alface) enquanto o PVY infecta Solanaceae. Para avaliar o efeito de tal substituição na infectividade, dois vírus quiméricos foram construídos: um clone infeccioso de LMV contendo a HC-Pro selvagem do PVY (estendendo-se dos aminoácidos 1 a 352) e um segundo clone contendo a HC-Pro de PVY com mutação no motivo conservado IGN (mutado para RPN). Os vírus recombinantes e o LMV selvagem foram inoculados via biobalística em folhas de plântulas de alface cv. Trocadero (suscetível ao LMV). A presença e a natureza das progênies virais... / The genus Potyvirus is one of the largest genera of plant RNA viruses. The potyvirus genome encodes a single polypeptide that is processed by three viral proteinases to yield all viral proteins needed for the infection cycle. One of these proteins is the multifunctional helper component proteinase (HC-Pro), which is involved in genome amplification, aphid transmission, local and systemic movement, suppression of gene silencing and proteolysis. To gain further understanding of the roles of this protein in the Potyvirus life cycle, the functional replacement of the HC-Pro coding region of Lettuce mosaic virus (LMV) with its corresponding counterpart of Potato virus Y (PVY) was performed. These viruses differ both in pathogenicity and in host range. LMV infects mainly Asteraceae while PVY infects Solanaceae. To assess the functional requirement of a homologous HC-Pro in infectivity, two different chimeric viruses were constructed i. e: a full-length LMV containing a wild type PVY HC-Pro (1aa to 352aa) and a full-length LMV containing a PVY HC-Pro with a mutation in the IGN motif (exchanged to RNP). The chimeras, and wild type LMV, were inoculated by biolistic in young lettuce plants. The presence and nature of viral progenies were checked by RT-PCR amplification followed by sequencing. All recombinant viruses were infectious and displayed systemic infection although the symptoms were weak when compared to the wild type LMV. The viruses accumulation were evaluated by differential cycles in the RT-PCR. The LMV wild type was amplified by 30 cycles while the chimerics viruses needed 40 cycles. Therefore this result indicating that the chimeric viruses titer were lower than LMV wild type. The results 4 described here demonstrated that the main biological functions of HC-Pro can be accomplished by heterologous protein.

In this work a new metalloproteinase (BthMP) was purified from the snake venom of Bothrops moojeni. This enzyme was homogeneous by native and SDSPAGE it showed polypeptide chain of 23,5 kDa, pI = 7,1 and N-terminal blocked. BthMP is comprised of high proteolytic activity on casein, fibrin and bovine fibrinogen, but no coagulating, esterase, phospholipase A2 activities, and lightly hemorrhagic; it was inhibited by EDTA, EGTA and 1,10-phenanthroline and maintained its activity on pH of 7,0 at 9,0 and temperature of 5 to 40°C. Assays with metal ions showed that Ca++ is an activator, whereas Zn++ and Hg++ inhibited about 50 and 80%, respectively. The edema evidenced the important role of the toxin in the inflamatory activity of the venom. BthMP also caused uncloting, and provoked histological alterations in gastrocnemius muscle of mice inducing hemorrhage, necrosis and leucocytic infiltrate. The molecular mass and the inhibition assays suggest that the metalloproteinase BthMP belongs to class P-I SVMPs. / Neste trabalho uma nova metaloproteinase (BthMP) foi purificada do veneno da serpente Bothrops moojeni. A protease é homogênea em PAGE-SDS e nativa, apresentou uma única cadeia polipeptídica de 23,5 kDa, pI = 7,1 e Nterminal bloqueado. BthMP é provida de alta atividade proteolítica sobre a caseína, fibrina e fibrinogênio bovino; foi inibida por EDTA, EGTA e 1,10- fenantrolina e manteve sua atividade em pH de 7,0 a 9,0 e temperatura de 5 a 40°C. Ensaios com íons metálicos mostraram que Ca++ é ativador, enquanto Zn++ e Hg++ inibiram cerca de 50 e 80%, respectivamente. BthMP é desprovida de atividades coagulante, esterásica, fosfolipásica e fracamente hemorrágica quando comparada ao veneno bruto. O edema induzido pela metaloprotease evidenciou o importante papel da toxina na atividade inflamatória do veneno. BthMP também causou incoagulabilidade sanguínea, e provocou alterações histológicas em músculo gastrocnêmio de camundongos induzindo hemorragia, necrose e infiltrado leucocitário. A massa molecular e os ensaios de inibição com EDTA e 1,10-fenantrolina sugerem que a metaloproteinase BthMP pertence à classe P-I das SVMPs. / Mestre em Genética e Bioquímica

Essa tese teve como objetivo avaliar todos os casos de candidose sistêmica por Candida albicans identificadas através de kit comercial ID 32C® (bioMérieux), diagnosticados no Laboratório de Micologia da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre/RS, durante o período de 1999 a 2009, buscando identificar a prevalência de C. dubliniensis, bem como avaliar os fatores de virulência e diferença de perfil de suscetibilidade antifúngica entre os isolados clínicos. Foi realizado um levantamento clínico-epidemiológico dos casos incluídos no estudo, avaliando sexo, idade, manifestações clínicas, evolução, região proveniente do paciente, doença de base, condições predisponentes, utilização de corticóides e antibióticos e resposta ao tratamento recebido. Para a diferenciação das duas espécies utilizou-se testes fenotípicos (arranjo dos clamidosporos, teste de termotolerância, formação do tubo germinativo, crescimento em meio hipertônico e niger), molecular (espectrometria de massa) e genotípico (reação em cadeia da polimerase - PCR). Em adição, foi avaliada a eficácia do método de conservação das leveduras estocadas a -20ºC e comparamos quatro substratos (soro fresco, soro congelado, ágar e caldo Mueller-Hinton) para a prova do tubo germinativo. Determinou-se a produção da fosfolipase e proteinase em isolados incluídos no estudo. A atividade in vitro dos antifúngicos fluconazol, anfotericina B e anidulafungina frente aos isolados estudados foi determinada através da concentração inibitória mínima (CIM), a concentração fungicida mínima (CFM) e ponto de corte epidemiológico (ECV). Os casos de candidemia por C. albicans diagnosticados durante 10 anos ocorreram com maior frequência em pacientes adultos com presença de cateteres. Observamos que houve maior chance de ocorrência desta em pacientes oncológicos. O percentual de alta nos pacientes foi baixo. O método utilizado para a conservação de leveduras nesse estudo apresentou taxa de 70% de viabilidade. O ágar e o caldo Mueller-Hinton demonstraram sensibilidade de 90% e especificidade de 100%. Os isolados de C. albicans provenientes de hemocultivos apresentaram produção de fosfolipase em 78% e proteinase em 97% dos isolados. A espécie C. dubliniensis não foi identificada em isolados de hemocultivos, sendo todos os casos de candidemia por C. albicans. Os testes microcultivo em ágar fubá, espectrometria de massa, caldo niger e caldo hipertônico concordaram com o teste genotípico. Os isolados de C. albicans apresentaram maior suscetibilidade a anidulafungina, entretanto, os menores valores obtidos em 90% dos isolados (CIM90) foi pela anfotericina B. E através do ECV, os isolados poderiam ser resistentes ao fluconazol, demonstrando a importância da associação desses dois parâmetros. / The aim this tesis was to evaluate systemic candidiasis cases by Candida albicans through ID 32C® (bioMérieux), at Mycology Laboratory of the Santa Casa de Porto Alegre/RS, during 1999 to 2009, seeking to identify the C. dubliniensis prevalence, as well as evaluating the virulence factors and antifungal susceptibility profile difference of among isolates. The clinical and epidemiological survey was made through gender, age, clinical manifestations, evolution, patient's region, underlying disease, predisposing conditions, steroids and antibiotics use, and response to treatment. The phenotypic tests (tthermotolerance, germ tube, hypertonic and Niger medium), molecular (mass spectrometry) and genotypic (polymerase chain reaction – PCR) was used for two species identification. We also assessed if the mantainance of C. albicans stored at - 20ºC in a freezer with sterile distilled water was usefull.The four substrate (fresh and frozen serum, agar and broth Mueller-Hinton®) were used for germ tube formation and the phospholipase and proteinase activity were evaluated. The in vitro activity of fluconazole, amphotericin B and anidulafungin were compared through the minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum fungicidal concentration (MFC) and epidemiological cutoff value (ECV). The candidemia cases by C. albicans for ten years occurred more frequently in adult and catheters use. We observed the more chance this occurrence in cancer patients. The survival percentage was low. The used method in the study for yeast stored had 70% of viability. The agar and broth Mueller-Hinton were 90% sensitivity and 100% specificity. The boodstream isolates of C. albicans produce virulence factors, such the germ tube production and hydrolytic enzymes (78% of phospholipase and 97% of protease) production. The C. dubliniensis was not identified in bloodstream isolates, thus all candidemia cases were by C. albicans. The mass spectrometry, cornmeal agar, Niger and hypertonic broth agreed with genotypic test. The isolates exhibited more susceptibility to anidulafungin, and 90% of them (MIC90) exhibited the lowest values against amphotericin B. Based on ECV and Pfaller classification, isolates could be resistant to fluconazole, demonstrating the importance of the combination of these parameters.

Dentre as substâncias químicas secretadas pelas plantas, contra os insetos herbívoros, os inibidores de peptidases são de grande interesse. A atenção dada a esses inibidores deve-se ao fato, de eles serem uma boa alternativa no controle de insetos praga, uma vez que não causam danos ao meio ambiente. Contudo, muitas espécies de insetos são capazes de escapar dos efeitos negativos dos inibidores de peptidases das plantas, via diferentes mecanismos adaptativos. Devido a esse fato, é importante compreender os mecanismos desenvolvidos pelos insetos para burlar os efeitos dos inibidores de peptidases das plantas. Diante desse panorama, este trabalho teve como objetivo estudar o mecanismo adaptativo das serina endopeptidases de Spodoptera frugiperda aos inibidores de endopeptidases de soja. Foram realizadas análises do transcriptoma dos intestinos das lagartas mantidas em exposição crônica ao inibidor. Para averiguar os efeitos causados devido à exposição crônica ao inibidor, foram realizadas comparações da expressão relativa, dos genes de tripsinas e quimotripsinas, de intestinos de lagartas de sexto instar. Contudo, para entender o efeito da exposição aguda ao inibidor, lagartas de S. frugiperda foram criadas em dieta artificial controle até o primeiro dia do sexto instar, após esse período elas foram transferidas para dieta artificial acrescida com 0,5 % dos inibidores de endopeptidases de soja, durante 48 horas. Para verificar a ocorrência de um possível controle epigenético na expressão dos genes, as lagartas foram conduzidas até a fase adulta e os adultos, de cada tratamento, foram acasalados entre si, constituindo uma segunda geração. Dados de expressão relativa foram obtidos, de indivíduos da primeira e segunda geração, e foram então comparados. Foram identificados 14 possíveis genes de quimotripsinas e nove possíveis genes de tripsinas. Os genes de tripsina foram divididos em dois grupos distintos em relação a sua sensibilidade aos inibidores de endopepetidases de soja e expressão relativa. Houve uma resposta diferenciada na ativação dos genes de serina endopeptidases de S. frugiperda, a qual dividiu os genes em dois grupos, os responsivos e os não responsivos ao inibidor. A exposição aguda ao inibidor ativou um pequeno grupo de genes, enquanto que a exposição crônica promoveu uma maior amplitude de expressão gênica, sugerindo mecanismos temporalmente regulados. Por último, evidências indicam, pela primeira vez, a possível ocorrência de um mecanismo epigenético, na resposta das enzimas digestivas aos inibidores de serina endopeptidases de soja. / Among the chemicals secreted by plants against insect herbivores, peptidase inhibitors (PIs) are of great interest. The attention given to PIs is due to the fact that they are a good alternative to control insect pests since they do not cause damage to human health and the environment. However, many species of insects are able to escape the negative effects of PIs plants via different adaptive mechanisms. Because of this, it is important to understand the mechanisms developed by insects to circumvent the effects of PIs plants. Against this background, this research aimed to study the adaptive mechanism of serine endopeptidases Spodoptera frugiperda to soybean endopeptidase inhibitors. For this purpose, larvae of S. frugiperda were reared on artificial diet and control artificial diet plus 0.5% of endopeptidase inhibitors of soybean. We conducted a transcriptome midgut of worms maintained in chronic ingestion of the inhibitor. The relative expression of the genes, trypsin and chymotrypsin, was also compared the midgut of sixth instar larvae kept in these diets. In another experiment, the larvae were conducted to moth, then the treatments were mated forming a second generation. Relative expression data were obtained for individuals of the first and second generation, and then compared. Identified 14 genes with potential of chymotrypsin and 9 trypsin like genes. The trypsin gene were divided into two groups for both their sensitivity to PI soybean endopeptidase, and for their relative expression pattern. There was a differentiated response on the genes activation of S. frugiperda serina endopeptidases. The genes were clustered in 2 groups, the responsive ones and the non responsive to the inhibitor. The acute exposition to the inhibitor activated a small group of genes and the chronic exposition affected several genes, indicating the existence of temporal regulated mechanism. Besides, there is a possible occurance of an epigenetic mechanism, which is related to the digestive serina endopeptidases inhibitors of soybean.

Neste estudo foram avaliados os efeitos das serinoproteinases PA-BJ e giroxina, isoladas dos venenos das serpentes Bothrops jararaca e Crotalus durissus terríficus, respectivamente, sobre células endoteliais (CEs) em cultura. Os resultados obtidos demonstraram que essas toxinas, nas concentrações utilizadas, não afetaram a viabilidade e a integridade das CEs. Por outro lado, induziram a liberação de PGI2, que foi significativamente reduzida por inibidores não seletivos e seletivos das ciclooxigenases -1 e -2 (COX-1 e -2), mas não afetaram a expressão protéica constitutiva das mesmas. Adicionalmente, foi demonstrado que o antagonista de receptores PAR-1, o SCH 79797, não alterou a liberação de PGI2, induzida pelas toxinas. Em conclusão, essas toxinas, em concentrações não citotóxicas, induziram a liberação de PGI2 a partir de CEs, de modo dependente da ativação das COX-1 e -2. Por outro lado, o receptor PAR-1 não parece ser importante para este efeito, nessas células. / In this study, the effects of PA-BJ and gyroxin, isolated from Bothrops jararaca and Crotalus durissus terrificus snake venoms, respectively, on endothelial cells in culture were investigated. Results showed that neither PA-BJ nor gyroxin affected the integrity of monolayers nor modified ECs viability in the periods of incubation tested. In contrast, these serine proteinases increased the release of prostacyclin from ECs. This effect was inhibited by both non-selective and selective COX-1 and COX-2 inhibitors, but these toxins did not affect the protein expression of COX-1 and -2. Inhibition of the catalytic activity of PA-BJ and gyroxin or pre-incubation of ECs with PAR-1 antagonist did not abrogate the ability of these toxins to induce PGI2 release. These findings demonstrate that these serine proteinases are able to stimulate production of prostacyclin by ECs by a mechanism dependent on stimulation of COX-1 and COX-2 enzyme activity. Moreover, neither enzyme activity of both serine proteinases nor the receptor PAR-1 contribute for this effect on endothelium.

Gingipaine sind Cysteinproteinasen des wohl in Ätiologie und Pathogenese der chronischen Erwachsenenparodontitis bedeutsamsten bakteriellen Erregers und zugleich die wichtigsten Virulenzfaktoren der Spezies Porphyromonas gingivalis. Die für diese extrazellulären Produkte kodierenden Gene sind rgpA, rgpB und kgp. Deren Produkte sind entsprechend HRgpA, RgpB und Kgp. HRgpA und RgpB verursachen eine Steigerung der Gefäßpermeabilität durch die Aktivierung des Kallikrein/Kinin-Systems und aktivieren die Blutgerinnung, welche potentiell mit der Synthese der Sulkusflüssigkeit und dem Fortschreiten der Entzündung bis hin zum Verlust des alveolären Knochens assoziiert sind. Offenbar wird dieses durch die Aktivierung von Matrixmetalloproteinasen begünstigt. Kgp ist von den dreien die potenteste fibrinogen-und fibrinabbauende Proteinase und bei der Blutungsneigung der erkrankten Stellen involviert. HRgpA aktiviert besonders Blutgerinnungsfaktoren. Gingipaine stören das Komplementsystem und manipulieren den Zytokinhaushalt der Entzündungskaskaden. Die Gingipaine unterstützen die Kolonisierung von P. gingivalis durch die Bindung zu anderen Bakterien des subgingivalen Biofilms und der Bindung zu epithelialen Zellen. Sie vermögen an Laminin, Fibrinogen, Fibronektin, Hämoglobin und an manchen Typen von Kollagen zu binden. Alle können den Rezeptor CD14 auf Makrophagen abbauen und so die Leukozytenaktivierung hemmen. Sie regulieren die Infektionsintensität, den Bakterienhaushalt, die Aminosäurenaufnahme aus Wirtsproteinen und die Fimbrienreifung. Die Genetik, die Chemie und die virulenzverursachenden Eigenschaften der Gingipaine stehen seit Mitte der 90iger Jahre des letzten Jahrhunderts im Blickpunkt des wissenschaftlichen Interesses. Aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Pathogenese der Parodontitis und der mikrobiellen Infektion sind die Gingipaine Ziele für die mögliche Entwicklung von Hemmstoffen respektive für Immunisierungsstrategien gegen die chronische Parodontitis.:Erklärungen I Genehmigungsvermerk II Inhaltsverzeichnis III 1. Einleitung und Fragestellung 4 1.1 Parodontitis 4 1.1.1 Epidemiologie 4 1.1.2 Klassifikation 4 1.1.3 Ätiologie und Pathogenese 5 1.1.4 Mikrobiologie 7 1.1.5 Biofilm 8 1.2 Porphyromonas gingivalis 10 1.3 Verwandtschaftsverhältnisse von P. gingivalis 12 1.4 Mit P. gingivalis assoziierte Proteinasen 15 1.5 Fragestellung 16 2. Material und Methoden 17 3. Ergebnisse und Diskussion 18 3.1 Einführung – Gingipaine als Enzyme von P. gingivalis 18 3.1.1 Definition der Gingipaine 18 3.1.2 RgpA- und RgpB-Gen-Gingipaine 19 3.1.3 Kgp-Gen-Gingipain 20 3.2 Bedeutung der Gingipaine für die Pathogenität von P. gingivalis 21 3.2.1 Gingipaine und fimbrienvermittelte Adhäsion, intrazelluläre Invasion und parazellulärer Pfad von P. gingivalis 21 3.2.2 Effekte auf die Integrität des Bindegewebes 24 3.2.3 Aktivierung des Kallikrein-Kinin-Systems 25 3.2.4 Aktivierende Einflüsse auf das Gerinnungssystem 27 3.2.5 Hemmende Einflüsse auf das Fibrinogen-Fibrin-System 28 3.2.6 Beeinträchtigung der Immunabwehr des Wirts 28 3.3 Gingipaine im biochemischen Regulationsmechanismus von P. gingivalis 35 3.3.1 Die Rolle des proteolytischen Systems von P. gingivalis beim Nährstofferwerb 35 3.3.2 Gingipainreifung und die Steuerung des intrazellulären Haushalts von P. gingivalis 39 3.3.3 Regulation der Proteinaseexpression von P. gingivalis 40 3.3.4 Gingipaine als bakterielle Hämagglutinine, Adhäsine und hämoglobinbindende Proteine 42 3.3.5 Proteinasegenmutationen bei P. gingivalis und ihre enzymatische Aktivität 42 3.4 Gingipaine und systemische Effekte 44 3.5 Synergismen mit anderen Spezies und quorum sensing 45 3.6 Hemmstoffe der Gingipaine 46 3.7 Immunisierung gegen Gingipaine 48 4. Zusammenfassung / Summary 52 5. Literaturverzeichnis 53 Anhang 87 Abbildungsverzeichnis 87 Tabellenverzeichnis 87 Danksagung 88 Lebenslauf 89 / Gingipains are cysteine proteases of the probably most important bacterial pathogen of the adult periodontitis in the field of etiology as well as pathology. At the time, they are the most important virulence factors of the species Porphyromonas gingivalis. The encoding genes of this extracellular products are rgpA, rgpB and kgp. Their products are corresponding HRgpA, RgpB and Kgp. HRgpA and RgpB induce vascular permeability enhancement through activation of the kallikrein/kinin system and activate the blood coagulation, processes potentially associated with gingival crevicular fluid synthesis and progression of inflammation which ultimately can lead to alveolar bone loss. Obviously, this will be favoured by matrix metalloproteinases. Kgp is the most potent fibrinogen/fibrin degrading enzyme of the three gingipains involved in the bleeding tendency at the diseased sites. HRgpA especially activates coagulation factors. Gingipains disturb the complement system and manipulate the cytokine network of the inflammation cascades. Gingipains support colonizing of P. gingivalis due to their connection to other bacteria of the subgingival biofilm and to epithelial cells. They are able to bind to laminin, fibrinogen, fibronectin, hemoglobin and some types of collagen. All of them are able to degrade macrophage CD14 receptor, thus preventing activation of the leukocytes. They regulate the intensity of infection and the bacterial housekeeping, including amino acid uptake from host proteins and fimbriae maturation. Genetics, chemistry and the virulence inducing properties of gingipains are the focus of scientific attention since the middle of the nineties of the last century. Due to their key role in pathogenesis of periodontitis and microbial infection the gingipains are targets for the possible development of inhibitory substances, respectively for immunization strategies against chronic periodontitis.:Erklärungen I Genehmigungsvermerk II Inhaltsverzeichnis III 1. Einleitung und Fragestellung 4 1.1 Parodontitis 4 1.1.1 Epidemiologie 4 1.1.2 Klassifikation 4 1.1.3 Ätiologie und Pathogenese 5 1.1.4 Mikrobiologie 7 1.1.5 Biofilm 8 1.2 Porphyromonas gingivalis 10 1.3 Verwandtschaftsverhältnisse von P. gingivalis 12 1.4 Mit P. gingivalis assoziierte Proteinasen 15 1.5 Fragestellung 16 2. Material und Methoden 17 3. Ergebnisse und Diskussion 18 3.1 Einführung – Gingipaine als Enzyme von P. gingivalis 18 3.1.1 Definition der Gingipaine 18 3.1.2 RgpA- und RgpB-Gen-Gingipaine 19 3.1.3 Kgp-Gen-Gingipain 20 3.2 Bedeutung der Gingipaine für die Pathogenität von P. gingivalis 21 3.2.1 Gingipaine und fimbrienvermittelte Adhäsion, intrazelluläre Invasion und parazellulärer Pfad von P. gingivalis 21 3.2.2 Effekte auf die Integrität des Bindegewebes 24 3.2.3 Aktivierung des Kallikrein-Kinin-Systems 25 3.2.4 Aktivierende Einflüsse auf das Gerinnungssystem 27 3.2.5 Hemmende Einflüsse auf das Fibrinogen-Fibrin-System 28 3.2.6 Beeinträchtigung der Immunabwehr des Wirts 28 3.3 Gingipaine im biochemischen Regulationsmechanismus von P. gingivalis 35 3.3.1 Die Rolle des proteolytischen Systems von P. gingivalis beim Nährstofferwerb 35 3.3.2 Gingipainreifung und die Steuerung des intrazellulären Haushalts von P. gingivalis 39 3.3.3 Regulation der Proteinaseexpression von P. gingivalis 40 3.3.4 Gingipaine als bakterielle Hämagglutinine, Adhäsine und hämoglobinbindende Proteine 42 3.3.5 Proteinasegenmutationen bei P. gingivalis und ihre enzymatische Aktivität 42 3.4 Gingipaine und systemische Effekte 44 3.5 Synergismen mit anderen Spezies und quorum sensing 45 3.6 Hemmstoffe der Gingipaine 46 3.7 Immunisierung gegen Gingipaine 48 4. Zusammenfassung / Summary 52 5. Literaturverzeichnis 53 Anhang 87 Abbildungsverzeichnis 87 Tabellenverzeichnis 87 Danksagung 88 Lebenslauf 89