Mitochondriopathien sind Multisystemerkrankungen die durch verschiedene Defekte in den Energie (ATP) produzierenden Stoffwechselwegen der Mitochondrien verursacht sind. Will man Mitochondriopathien auf molekularer Ebene diagnostizieren, stößt man auf folgende Schwierigkeiten: (A) Ungefähr 1000 Gene sind an der Biogenese des Mitochondriums beteiligt. Die Dysfunktion jedes einzelnen dieser Gene kann potentiell zur Mitochondriopathie führen. (B) Mitochondriale Proteine werden durch zwei Genome, durch die mitochondriale und durch die nukleäre DNA kodiert. (C) Die klinischen Symptome der Patienten weisen selten auf die molekulare Diagnose, da der Phänotyp oft nur auf einem sekundären Energiemangel beruht. In der Regel besteht keine sichere Genotyp-Phänotyp-Relation. Mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Methoden lassen sich bei nur 20% der Patienten Mutationen finden. Wir wollten daher eine neue Screening-Methode entwickeln, mit deren Hilfe wir hoffen, die Aufspürungsrate für mitochondriale Mutationen zu erhöhen. Die Gesamtheit der Proteine einer Organelle oder einer ganzen Zelle (ihr "Proteom") stellt das Verbindungsglied zwischen Geno- und Phänotyp dar. Aus diesem Grunde wollten wir das mitochondriale Proteom von gesunden Kontrollpersonen und von Patienten mit Mitochondriopathien untersuchen. Protein-Muster, die zwischen diesen beiden Gruppen abweichen, könnten die Aufmerksamkeit auf Gene und Proteine richten, die an der Entstehung des Krankheits-Phänotyps beteiligt sind. Um solch eine vergleichende Studie durchzuführen, muß zunächst eine Referenzkarte des normalen mitochondrialen Proteoms erstellt werden. In meinem Dissertationsprojekt habe ich diese grundlegende Arbeit durchgeführt und zahlreiche Proteine auf der Proteomkarte menschlicher Mitochondrien identifiziert, die aus Epstein-Barr-Virus-transformierten lymphoblastoiden Zellen gewonnen worden waren. Ich wählte diese Zellsorte als Untersuchungsmaterial, da sie nicht nur einfach von Patienten gewonnen werden, sondern auch potentiell permanent wachsen kann. Dies erlaubt die Züchtung einer hohen Zellzahl ohne übermäßigen Aufwand. Ich optimierte ein Protokoll zur Zentrifugation in einem hybriden Gradienten, mit dem genug gereinigte Mitochondrien aus 108 Zellen gewonnen werden konnten. Für die Referenzkarte benutzte ich die lymphoblastoide Zellline einer gesunden Kontrollperson. Die Methode der Wahl zur Proteinidentifikation in Proteom-Projekten ist die zweidimensionale Proteinelektrophorese gekoppelt mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Ich entdeckte mehr als 400 Punkte in meinem silbergefärbten zweidimensionalen Gel und analysierte die 141 stärksten Punkte nach in-gel Trypsin-Verdau und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie in einem Verfahren, das als "Peptide Mass Fingerprinting" (Peptidmassen-Fingerabdruck) bezeichnet wird. Mit Hilfe entsprechender Datenbanken konnte ich schließlich 115 verschiedene Proteinpunkte (entsprechen 95 verschiedenen Proteinen) identifizieren. 90 dieser Punkte (entsprechend 74 verschiedenen Proteinen) waren sicher mitochondrialer Herkunft und sind Komponenten aller wesentlichen im Mitochondrium lokalisierten Stoffwechselwege. 16 der 74 identifizierten mitochondrialen Proteine gehören zur Atmungskette. Obwohl 18 mitochondriale Proteine in der Datenbank SWISS-PROT als "Membran-assoziiert" annotiert sind, identifizierte ich nur vier Proteine mit sicheren Transmembrandomänen. Ich entdeckte keine der 13 durch die mitochondriale DNA kodierten Proteine, die alle stark hydrophobe Membranproteine sind. Andere Forscher sind bei dem Versuch diese Proteine zu identifizieren, auf die gleichen Schwierigkeiten gestoßen. Mit meiner Dissertationsarbeit habe ich unsere eigene Datenbank und Referenzkarte des mitochondrialen Proteoms lyphoblastoider Zellen erstellt. Diese Daten ermöglichen nun die Analyse des mitochondrialen Proteoms von Patienten. Meine weiteren Untersuchungen auf diesem Gebiet werden sich nun auf die genetische Variabilität des Proteoms gesunder Kontrollpersonen und auf das Proteom der Patienten mit Mitochondriopathien beziehen. / Mitochondrial disorders are multisystem diseases that can be caused by any defect in the energy (ATP) generating pathways in the mitochondria. The difficulty in diagnosing mitochondrial diseases on the molecular level arises from several obstacles: (A) About 1000 genes are involved in the biogenesis of mitochondria. The dysfunction of each of them may potentially cause mitochondriopathy. (B) The mitochondrial proteins are encoded by two genomes: the mitochondrial DNA and the nuclear DNA. (C) The clinical symptoms of the patients rarely suggest a molecular diagnosis since in most cases, the phenotype is a secondary phenomenon to energy depletion. Generally there is no genotype-phenotype relation. Based on current diagnostic methods in only 20% of the patients a mutation can be found. We therefore wanted to develop a new screening method by which we hope to increase the identification rate. Since the numerous proteins of an organelle or of a whole cell (its "proteome") connect the genotype with the phenotype, we set out to study the proteome of the mitochondrion in healthy individuals and in patients with mitochondrial diseases. Deviating protein patterns between the two individuals could direct the attention to disease-specific proteins and genes, which might be involved in the expression of a disease-phenotype. In order to perform such a comparison I first had to establish a normal reference map. In my dissertation project I performed this basic task and identified numerous mitochondrial proteins on the proteome-map of human mitochondria, which had been extracted from lymphoblastoid cells. I selected Epstein-Barr-Virus-transformed lymphoblastoid cells as samples not only because they are easily obtained from patients, but also due to their potential permanent growth. This approach allows the cultivation of high cell numbers without excessive expenditure of work and cost. I optimized a protocol for hybrid gradient centrifugation, by which enough mitochondria can be purified from 108 cells. I used a cultured lymphoblastoid cell line from a normal control patient and isolated mitochondria from it by using hybrid gradient centrifugation. In proteomics the combination of the high-resolution two-dimensional electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time-of-flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) is currently the method of choice for protein identification. I detected more than 400 spots in a silver-stained two-dimensional gel. I analyzed the 141 strongest spots of it by trypsin in gel digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry in a process termed "peptide mass fingerprinting". After database search, I finally identified 115 protein spots (corresponding to 95 different proteins), 90 of which (corresponding to 74 different proteins) are of confirmed mitochondrial origin. These identified proteins are components of the main biological pathways located in the mitochondrion. 16 of the 74 identified mitochondrial proteins belong to the respiratory chain. Despite the fact that 18 mitochondrial proteins are annotated in the SWISS-PROT-database as "membrane associated proteins", only four of them have clear transmembrane domains. None of the proteins encoded by the mitochondrial DNA could be detected. All of them are hydrophobic membrane proteins. A similar difficulty in resolving these proteins was encountered by other research groups. With my dissertation I established our own database and reference map of the mitochondrial proteome of lymphoblastoid cells. These data will facilitate the analysis of the mitochondrial proteome in patients. My future research based on this dissertation will mainly focus on the genetic variation of the proteome of healthy individuals and on patients with mitochondrial diseases.

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The avian immune system is a complex system of defence mechanisms that protect bird hosts against threats from ubiquitous pathogens. According to the co-evolutionary models, variability in immune traits of hosts is the key component providing ability to adapt and enhance their defence mechanisms in presence of constant selective pathogen pressure. Domestic chicken (Gallus gallus f. domestica) is used as a model organism in avian biology and also is one of the most important food-producing animals, not only for their meat but also for the egg production. Unfortunately, in research usually only inbred chicken lines are used and modern poultry husbandry is tight with unilateral breeding towards highly productive breeds. Those approaches decrease intra-population polymorphism in chickens. However, especially in case of farm animals, searching and extending the pool of immune variability and enhancing pathogen resistance is crucial for sustaining healthy and biologically secure populations and their products. Morphologically highly distinct traditional chicken breeds, which have evolved for hundreds years under different selective pressures, may represent this desirable immunological variability. In my thesis I described variability in chosen immunological traits, haematological parameters and proteomic...

The avian immune system is a complex system of defence mechanisms that protect bird hosts against threats from ubiquitous pathogens. According to the co-evolutionary models, variability in immune traits of hosts is the key component providing ability to adapt and enhance their defence mechanisms in presence of constant selective pathogen pressure. Domestic chicken (Gallus gallus f. domestica) is used as a model organism in avian biology and also is one of the most important food-producing animals, not only for their meat but also for the egg production. Unfortunately, in research usually only inbred chicken lines are used and modern poultry husbandry is tight with unilateral breeding towards highly productive breeds. Those approaches decrease intra-population polymorphism in chickens. However, especially in case of farm animals, searching and extending the pool of immune variability and enhancing pathogen resistance is crucial for sustaining healthy and biologically secure populations and their products. Morphologically highly distinct traditional chicken breeds, which have evolved for hundreds years under different selective pressures, may represent this desirable immunological variability. In my thesis I described variability in chosen immunological traits, haematological parameters and proteomic...

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Wir fanden konservierte molekulare Signaturen der Regulation durch Δ7-DA und Ascarosid bei Dauer- und infektiösen Larven. Danach wurde die hohe Konservierung durch unsere Analyse in Dauer- und Postdauer-Stadium zwischen den zwei nah verwandten freilebenden Arten C. elegans und C. briggsae identifiziert. Das heißt, dass die relative Veränderung auf mRNA- oder Protein- Ebene zwischen zwei Arten stark korreliert ist. Aber die relative Veränderung innerhalb derselben Art zeigt keine hochgradige Korrelation zwischen mRNA- und Protein-Ebene. Unsere Ergebnisse zeigen in C. elegans Dauerlarven die signifikante Reduzierung der RNA-Mengen in 20 Stoffwechselwegen. Im Gegensatz dazu speicherten Dauerlarven reichlich RNA-Mengen in GO Termen wie Ribosome und Aminoacyl-tRNA biosynthesis. Auf Protein-Ebene sind die Stoffwechselwege von Proteinsynthese und Proteinverarbeitung im endoplasmatischen Retikulum in Dauerlarven herunterreguliert und GO Terme wie Lysosome sind hochreguliert. Durch die Zeitreihenanalyse der Proteom-Remodellierung der molekularen Signaturen beim Austritt aus dem Dauer-Stadium fand wir, dass GO Terme wie metal ion binding signifikant herunterreguliert sind und der Proteinabbau hochreguliert ist. Unsere Ergebnisse vom pSILAC Experiment deuten an, dass die Proteine für Energieerzeugung und Chaperone/Proteinfaltung beim Daueraustritt schnell verbraucht sind und wieder hergestellt werden. Zum Schluss haben wir als Erste den popomR-Assay in C. elegans etabliert und ein Screening der vermeintlichen Proteinbindestellen auf poly-A-RNA durchgeführt, um in der Zukunft die konservierten Mechanismen der post-transkriptionellen Regulation durch RBPs im Dauer-Stadium zu analysieren. / We found the conservation of molecular signatures by regulating with Δ7-DA and Ascarosid in dauer larvae and infective larvae. Then by our comparative analysis, the high degree of conservation between two closely related free-living species C. elegans and C. briggsae was identified in dauer and post-dauer stages. This means that the relative changes are strongly correlated on the mRNA or the protein level between two species. But the relative changes in the same species don’t show any strong correlation between the mRNA and the protein levels. Our results showed a significantly reduced amount of RNA in 20 metabolic pathways in C. elegans dauer larvae. In contrast, dauer larvae stored a large amount of RNA in GO terms such as ribosome and aminoacyl-tRNA biosynthesis. On the protein level, the metabolic pathways of protein synthesis and protein processing in endoplasmic reticulum were downregulated in dauer larvae and the term of lysosome was up-regulated. Due to time course analysis for proteome remodeling of molecular signatures during exit process from dauer stage, we found that GO terms such as metal ion binding were significantly downregulated during dauer exit and at the same time the protein degradation was up-regulated. Our results of pSILAC experiment suggest that the proteins for energy generation and chaperone/protein folding are quickly spent and rebuilded during dauer exit. Finally, we were the first to establish the popomR assay in C. elegans and performed a screening of the putative protein binding sites on poly-A RNA to analyze the conserved mechanisms of post-transcriptional regulation by RBPs in dauer larvae in the future.

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