Palliative Therapie inklusive Chemotherapie und andere Behandlungsmethoden wie Hyperthermie ist oftmals die einzig verbleibende Option bei der Behandlung von bestimmten soliden Tumoren wie Magen- und Pankreaskarzinom. Leider ist der Erfolg dieser Therapien limitiert durch geringes Ansprechen der Tumoren auf die Behandlung und die Entwicklung einer Therapieresistenz. In dieser Arbeit wurde die globale Proteinexpression von chemo- und thermoresistenten Varianten der Magenkarzinomzellinie EPG85-257 und der Pankreaskarzinomzellinie EPP85-181 mit Hilfe von Proteomics (Kombination aus zweidimensionaler Elektrophorese, computergestützter Gel-Analyse und Massenspektrometrie) in vitro untersucht, um Kandidatenproteine zu finden, die potentiell mit Thermoresistenz bzw. Chemoresistenz assoziiert sind. In diesem Zusammenhang wurde eine mit Maldi-TOF kompatible Spezialsilberfärbung neu entwickelt. Es zeigte sich eine differentielle Expression einer Vielzahl von Proteinen in den thermoresistenten Zellen, darunter eine Hochregulation von Proteinen mit Chaperonaktivität aus nahezu allen subzellulären Kompartimenten sowie eine Überexpression von Enzymen des Arzneimittelmetabolismus in Zellen mit sowohl chemo- als auch thermoresistentem Phänotyp. Darüber hinaus wurden weitere Proteine identifiziert, welche hinsichtlich ihrer Beteiligung an Resistenzphänomenen im Vorfeld noch gar nicht charakterisiert worden sind (u.a. Aldehyd-Dehydrogenase 1, Transgelin, Phosphoglyceromutase). / Palliative treatment including chemotherapy and other modes of treatment, e.g. hyperthermia, is often the only remaining option in the management of certain solid tumours including gastric and pancreatic carcinoma. Unfortunately, its efficacy is poor due to low tumour sensitivity and the development of therapy resistance. The aim was to study in vitro global protein expression of chemo- and thermoresistant variants of the stomach cancer cell line EPG85-257 and the pancreatic cancer cell line EPP85-181 using proteomics (two-dimensional electrophoresis in combination with computer-assisted image analysis and mass spectrometry) to identify candidate proteins potentially associated with thermoresistance alone or in combination with chemoresistance. In this context, a special silver stain compatible with Maldi-TOF was developed. A large number of proteins was found to be differentially expressed in thermoresistant cells including up-regulation of molecular chaperones at practically every sub-cellular level as well as over-expression of enzymes involved in drug metabolism in both chemo- and thermoresistant cells. Furthermore, other proteins were identified that have not yet been linked to resistance phenomena (e.g. aldehyde dehydrogenase 1, transgelin, phosphoglycerate mutase).

Die Epithelien vielzelliger Organismen bilden eine funktionelle Grenzschicht, die für die Homöostase innerhalb und für den spezifischen Stoffaustausch zwischen den Kompartimenten verantwortlich ist. Der interzelluläre Spalt zwischen Epithelzellen wird durch tight junctions verschlossen, die eine selektive Permeabilitätsbarriere bilden. Da viele Krankheiten auf eine Dysfunktion der Barriere zurückzuführen sind, ist eine genaue Kenntnis der molekularen Zusammensetzung der tight junctions aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse. In dieser Arbeit wurden Anreicherungsstrategien entwickelt, die eine Proteomanalyse der tight junction-Proteine erlauben. Der Fokus wurde dabei auf die Claudine und Tricellulin gelegt, die als transmembranale Proteine das molekulare Rückgrat der tight junctions bilden. Durch Affinitätsreinigung gelang erstmals eine Anreicherung verschiedener Claudine, die durch Massenspektrometrie identifiziert wurden. Die metabolische Markierung der Proteine mit stabilen Isotopen (SILAC) erlaubte die quantitative Diskriminierung von Proteinen, die unspezifisch an das Matrixmaterial banden. Von den potentiellen Interaktionspartnern der Claudine wurden Integrin-a3, SUMO-1 und Sphingosinkinase 2 ausgewählt, um deren Interaktion mit Claudinen weiter zu verifizieren. Es wurden keine Hinweise auf Wechselwirkungen zwischen Claudinen und Integrin-a3 sowie SUMO-1 gefunden, während die Interaktion von Claudinen mit Sphingosinkinase 2 weder bestätigt noch ausgeschlossen werden konnte. Ferner wurde eine Affinitätsreinigung durchgeführt, um Interaktionspartner von Tricellulin anzureichern. Durch die quantitative massenspektrometrische Analyse wurde ausschließlich Claudin-4 nicht aber Claudin-3 und 7 als potentieller, spezifischer Interaktionspartner von Tricellulin identifiziert. Es wurde aber gezeigt, dass die Kombination aus Affinitätsreinigung und quantitativer Massenspektrometrie einen wertvollen Beitrag zur Entschlüsselung von Protein-Komplexen leisten kann. / Epithelia function as specialized barriers that separate different compartments within multicellular organisms and regulate the specific exchange of substances between them. The intercellular space between adjacent epithelial cells is sealed by tight junctions forming a permeability barrier. Dysregulation of the barrier occurs in a variety of diseases. Hence, a deeper knowledge is required of the molecular composition of tight junctions, in particular with respect to pharmacological applications. In the present study, new enrichment strategies have been established that allow the proteomic analysis of tight junction proteins. Special emphasis was placed on claudins and tricellulin as these transmembrane proteins constitute the molecular backbone of the tight junctions. For the first time, using an affinity purification, the enrichment of several claudins was accomplished that were identified by mass spectrometry. The metabolic labeling of proteins with stable isotopes (SILAC) allowed the quantitative discrimination of proteins that bound unspecifically to the matrix. Integrin-a3, SUMO 1 and sphingosin kinase 2 were chosen for further verifications from the proteins considered to potentially interact with claudins. While there was no evidence for an association of claudins with integrin-a3 and SUMO-1, an interaction of claudins with sphingosin kinase 2 could be neither confirmed nor disproved. Furthermore, an affinity purification was performed in order to enrich interaction partners of tricellulin. Claudin-4 was identified as a specific, potential interaction partner of tricellulin by quantitative mass spectrometric analysis whereas claudin 3 and -7 were determined to be enriched unspecifically. The present study demonstrates that a combination of affinity purification and quantitative mass spectrometry can substantially contribute to the elucidation of protein complexes.

Im Zentrum der vorliegenden Arbeit steht die Proteomanalyse des APP23-Mausmodells für die Alzheimer-Krankheit (AK). Es wurden die Gehirnregionen Hippocampus und Cortex der Altersstadien Embryonaltag 16 sowie 1, 2, 7 und 15 Monate untersucht und somit erstmals eine Art „Proteom-Lebensprofil“ eines Mausmodells erstellt. Bei dem Vergleich der APP23-Mäuse mit Wildtypmäusen konnte innnerhalb aller untersuchten Altersstadien und Gehirnregionen eine große Anzahl quantitativer Proteinexpressionsunterschiede festgestellt werden. Interessanterweise bestand jedoch im Hippocampus adoleszenter, zwei Monate alter Mäuse, ein herausragend großer Unterschied. Ein Vergleich der Proteomzusammensetzung zwischen den verschiedenen Altersstadien zeigte, dass spezifisch im Hippocampus der adoleszenten APP23-Mäuse viele entwicklungsbedingte Proteomveränderungen ausgeblieben waren. Zusammen mit der Beobachtung, dass in diesem Altersstadium viele synaptische Proteine in den APP23-Mäusen herunterreguliert waren, weisen die gewonnenen Daten darauf hin, dass ein natürlicher Peak in der hippocampalen Plastizität während der Adoleszenzphase in den APP23-Mäusen ausgeblieben war. Es ist weiterhin bekannt, dass APP als auch eine wichtige Rolle in der embryonalen Neurogenese spielt. Da über diese Prozesse noch wenig bekannt ist, wurde im Rahmen der vorliegenden Studie weiterhin eine grundlegende Untersuchung der murinen embryonalen Gehirnentwicklung durchgeführt. Dabei wurde beobachtet, dass innerhalb eines Zeitraums von zwei Entwicklungstagen die Anzahl an quantitativ veränderten Proteinen konstant ist. Dies könnte die maximal mögliche Veränderungsrate wiederspiegeln, die wiederum einen begrenzenden Faktor für die Geschwindigkeit der Embryonalentwicklung darstellt. Weiterhin stieg im Zuge der Neurogenese die Konzentration zelltypspezifischer Proteine an während im Gegenzug die Konzentration unspezifischer Proteine abnahm. / The work presented here focuses on the analysis of the APP23 mouse model for alzheimer´s disease (AK). Using a proteomics approach; the two brain regions cortex and hippocampus, were analyzed at the ages 1,2,7 and 15 months and at embryonic day 16. Thus, for the first time, a lifetime profile of brain proteome alterations caused by mutant APP expression was created. Protein expression alterations between APP23 and control mice were numerous at all age stages but unexpectedly, the hippocampus of two-month old (adolescent) mice, showed a dramatic peak in the number of altered proteins. When comparing proteome patterns longitudinally between age-stages, protein alterations were largely absent in the hippocampus of adolescent APP23-mice but not in other stages compared. Apparently, the large difference in hippocampal protein pattern changes between two-month old APP23- and wildtype-mice was caused by an absence of distinct developmental changes in APP23-mice. In summary, the absence of longitudinal developmental proteome alterations during adolescence, a developmental stage where neuronal plasticity is prominent and horizontal (disease/control) down-regulation of many proteins related to plasticity suggests the disruption of a normally occurring peak of hippocampal plasticity during adolescence of APP23-mice. APP was also suggested to play an important role in embryonic neurogenesis. Since information about the molecular mechanisms of neurogenesis is scarce, a basic analysis of protein changes during normal embryonic neurogenesis was conducted. Interestingly, the rate of protein concentration change within two days of development was constant. This might represent the maximal rate limiting the speed of embryonic development. During neurogenesis, cell-type specific proteins were up- and unspecific proteins down-regulated. In summary, this study shows that it is of utmost importance to investigate AK even at an early age prior to the occurrence of disease symptoms.

Ligninolytic fungi are well known for their ability to degrade a wide range of xenobiotics contaminating the environment, including synthetic industrial dyes. In this work Pleurotus ostreatus was used for decolorization of a synthetic textile dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR). To set up a model fungal "fixed-bed" bioreactor the fungus was immobilized on a polyurethane foam and artificially contaminated with a model bacterium Rhodococcus erythropolis. The development of bacterial contamination can be expected during a real application of fungal bio filters in wastewater treatment. The main aim of the work was to study interspecies interactions in the model bioreactors during the dye decolorization. Ligninolytic enzyme activities were followed in the bioreactor cultures as markers of fungal biodegradation ability. In contrast to the controls, no bacterial growth was observed in the P. ostreatus bioreactor culture liquid. The results showed that fungal laccase, pH of the culture liquid, and glucose consumption by the fungus had no effect on the bacterial growth. However, 4*105 - 1,3*106 CFU/ml of R. erythropolis was detected to be associated with the fungal solid support. The presence of these bacteria had no effect on the decolorization performance of the bioreactors. Dye decolorization efficiency...

1 Abstract It has been estimated that the mammalian mitochondrial proteome consists of ~1500 distinct proteins and approximately one quarter of them is still not fully characterized. One of these proteins is TMEM70, protein involved in the biogenesis of the eukaryotic F1Fo-ATP synthase. TMEM70 mutations cause isolated deficiency of ATP synthase often resulting in a fatal neonatal mitochondrial encephalocardiomyopathies in patients. To understand the molecular mechanism of TMEM70 action, we generated constitutive Tmem70 knockout mice, which led to embryonic lethal phenotype with disturbed ATP synthase biogenesis. Subsequently generated inducible Tmem70 mouse knockout was lethal by the week 8 post induction. It exhibited primarily impaired liver function, which contrasts with the predominantly cardiologic phenotype at disease onset in humans. Liver mitochondria revealed formation of labile ATP synthase subcomplexes lacking subunit c. Thus, in case of TMEM70 deficiency c-oligomer was not incorporated into ATP synthase, which led to critical impairment of mitochondrial energy provision, analogous to TMEM70 dysfunction in humans. In TMEM70 deficient models, the ATP synthase deficiency reached the 'threshold' for its pathologic presentation, which we quantified at 30 %. We observed compensatory increases in the...

Biofilms represent universal strategy for bacterial survival. Living in form of biofilms, bacteria acquire wide range of advantages over planktonically growing cultures. It can be assumed that nearly 99% of world bacterial population is living in form of biofilms. There are benefits and drawbacks associated with bacterial biofilms for mankind. Life in biofilms makes pathogens more effective and persistent through higher antibiotic resistance and helps them to hide before immune system of the host. Mycobacteria, which are capable of forming biofilms on variety of surfaces, differ from most of other bacteria by unique composition of their cell wall. It provides them with high resistance against physical or chemical damage. This is one of the reasons for considering Mycobacterium tuberculosis as a highly potent pathogen. The studies of mycobacterial biofilms are motivated by effort to improve or find new therapeutic methods. This work is aimed at morphological and proteomic comparative analyses of biofilms obtained from Mycobacterium smegmatis grown on surface of glass and silica/zirconium beads, on liquid medium surface or grown submerged in shaken planktonic culture. We have developed technique for preparation of "floating" biofilm sample to be observed in SEM. We have shown that the growth of...

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung genetischer Faktoren, die das Plasmaproteom regulieren. Die Untersuchungen wurden im Modellsystem einer F2-Kreuzung zweier Inzucht-Mausstämme (FVB.LDLR-/-, C57BL/6.LDLR-/-) durchgeführt, die sich in ihrer Atheroskleroseausprägung unterscheiden. Von jedem der 453 Tiere der F2-Generation wurden Plasmaproteomprofile mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF) generiert. Diese Spektren wurden in zwei unabhängigen Datenanalysen ausgewertet und eine Kopplungsanalyse (QTL-Analyse, quantitative trait loci) der Phänotypen mit jeweils 192 genetischen Markern in jedem der F2-Tiere durchgeführt. So wurden die Datensätze von Proteom und Genom miteinander kombiniert, um Genorte, die mit unterschiedlich regulierten Proteinen in Verbindung stehen, zu identifizieren. Dieser Ansatz ist bisher in der Literatur nicht beschrieben worden. In der vorliegenden Arbeit wird sowohl die Methodik der statistischen Auswertung als auch die weitere Analyse der generierten Daten beschrieben. Es wurden zahlreiche hochsignifikante Kopplungssignale gefunden, von denen zwei durch die Identifizierung von Proteinen verifiziert werden konnten. Es handelt sich hierbei um das Apo-A2 des HDL auf Chromosom 1 und Hämoglobin subunit alpha auf Chromosom 11. Eine Kolokalisation der gefundenen Proteine mit Loci der Atherosklerosedisposition konnte nicht identifiziert werden. Dieser Ansatz zeigt erstmals, dass eine hypothesenfreie Verbindung proteomischer und genomischer Daten möglich ist und zur Identifizierung genetisch regulierter Plasmaproteine beitragen kann.

This PhD thesis showed the applicability of a gel-based proteomic separation tool, 2-D electrophoresis in three independent projects. Supplemented with results obtained using different techniques the proteomic studies enabled a global imaging of proteoms in the studied biological systems. Comparing total proteoms of E. coli 61 protein changes were identified and connected with the development of the bacterial population in the presence of an antibiotic compound, erythromycin. This classic proteomic approach included sample extraction, optimization of its 2D separation followed by 2D gel analysis and protein identification by MS methods. A disadvantage of this work was an enourmously large amount of data to be analyzed by computer analysis. For the study of membrane proteom of B. subtilis during a pH induced stress, on the other hand, a modification of isolation techniques for membrane and membrane associated proteins was required first to improve the subsequent protein separation by 2-D electrophoresis. The optimalization of protein extraction included changes in detergents used for protein solubilization and a prolongation of time periods in the protein solubilization protocol. 5 relevant protein changes were then described that play a role in the bacterial response to pH stress. The proteins were...

Chlamydia trachomatis ist ein obligat intrazelluläres Humanpathogen, welches sich, nach der Einnistung in seiner Wirtszelle, innerhalb einer membranumhüllten Vakuole, der sogenannten Inklusion, befindet. Die Inklusionsmembran stellt dabei die primäre Kontaktfläche für Pathogen–Wirtszell-Interaktionen dar und definiert dadurch die Nische, in welcher sich die Bakterien vermehren können. Zum ersten Mal beschreiben wir in dieser Arbeit die Isolation und biochemische Charakterisierung der Inklusion von C. trachomatis, mittels herkömmlicher Organellaufreiniungsverfahren und massenspektrometrischer Proteomanalyse an einem zentralen Zeitpunkt der Infektion. Die relative Quantifizierung von Proteinen mittels stabiler isotopenmarkierter Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) und die zusätzliche markierungsfreie Quantifizierung erlaubten uns die Darstellung dieses subzellulären Proteoms mit hohem Konfidenzniveau. Mithilfe dieser Methoden haben wir über dreihundert Wirtszellproteine identifiziert und quantifiziert, welche noch nicht als inklusionslokalisiert bekannt waren. Die globale Analyse dieser Daten bestätigte die Rekrutierung vieler Proteine, welche in verschiedenen Membrantransportwegen involviert sind. Zudem fanden sich viele Proteine des retrograden Transportweges, welcher bislang nicht im Zusammenhang mit Chlamydien-Infektionen untersucht wurde. Die detaillierte Analyse dieser Proteine zeigte, dass Sorting Nexine sehr spezifisch zur Inklusion rekrutiert werden. Zudem haben wir mithilfe des unlängst beschriebenen Inhibitors Retro-2 gezeigt, dass retrograder Transport essenziell für die effiziente intrazelluläre Replikation von C. trachomatis ist. Zusammengefasst haben wir eine große Anzahl zuvor unbekannter inklusionsassoziierter Proteine identifiziert und quantifiziert, und auf Basis unserer Daten schlagen wir den retrograden Transportweg als neues Potenzielles Angriffsziel von Therapeutika zur Behandlung von C. trachomatis Infektionen vor. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen which, after invasion of its host cell, resides within a membrane bounded vacuole called the inclusion. The inclusion membrane represents the main host-pathogen interface of Chlamydiae and thereby defines the environment in which the bacteria thrive. Here we describe for the first time the isolation and biochemical characterization of the mid-infection inclusion of C. trachomatis using mass spectrometry based proteomics in combination with traditional organelle purification techniques. Relative quantification by Stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) and additional label free quantification allowed the generation of a high confidence subcellular proteome. Using this approach, we were able to identify and quantify over three hundred host cell proteins that were not reported previously to be inclusion localized. By analyzing the obtained data on a global scale, we were able to confirm previous reports on the recruitment of proteins implied in several membrane trafficking pathways. Detailed analysis of proteins identified to be involved in retrograde trafficking, a pathway that has not been described previously in the context of chlamydial infections, showed that sorting nexins are specifically recruited to the inclusion. We furthermore identified retrograde trafficking to be essential for the efficient intracellular replication of C. trachomatis using the recently described inhibitor Retro-2, which drastically reduced bacterial progeny formation upon treatment. Taken together, we identified and quantified a large number of previously unknown inclusion associated proteins, and we propose retrograde trafficking as a novel potential drug target for the treatment of infections with C. trachomatis.

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit Nachweismöglichkeiten von Helicobacter pylori und deren Vergleich. Hierfür ist eine genaue Kenntnis der Helicobacter-Proteine notwendig. Zu diesem Zweck wurde die humorale Immunantwort gegenüber Helicobacter pylori unter Anwendung der Methodik des zweidimensionalen Immunoblots analysiert. Zunächst wurden Proteine des autologen Helicobacter pylori-Stammes über zweidimensionale Gelelektrophorese aufgetrennt, auf Nitrocellulose-Membranen geblottet und sodann mit Antikörpern aus autologem Plasma sowie Antikörpern aus dem Überstand von in vitro kultiviertem autologem Biopsiematerial detektiert. Zur Bestimmung einer Helicobacter-Infektion wurden andere invasive und nicht invasive Tests genutzt. In einer prospektiven Untersuchung wurden über 200 konsekutive Patienten mit gastrointestinalen Beschwerden und unbekanntem H. pylori-Status, die für eine Gastroskopie vorgesehen waren, routinemäßig untersucht. Bei jeder Gastroskopie wurden zwei Antrum- und zwei Korpusbiopsien zur Gastritis-Diagnostik und zur Bestimmung des H. pylori-Status entnommen. Es wurden Assoziationen zwischen einer Infektion mit Helicobacter pylori und Erkrankungen wie akute und chronische Gastritis, gastraler und duodenaler Ulkus, Magenkarzinom und Folgeerkrankungen der Gastritis überprüft. Dabei wurden auch die eindeutig Helicobacter pylori-negativen Seren mit den positiven Seren verglichen. Trotz ungleichmäßiger Verteilung der Patientenzahlen über die einzelnen Krankheitsgruppen (Gastritis, Ulkus, Karzinom) wurden bestimmte Proteine nur bei einer der Erkrankungen erkannt. Einige Proteinspots kamen deutlich intensiver bei einer einzigen Krankheitsgruppe vor. Anzustreben sind Studien mit größeren Patientenzahlen innerhalb der einzelnen Krankheitsgruppen, um mögliche weitere Assoziationen bestimmter Helicobacter-Antigene mit Folgeerkrankungen zu analysieren und zu verifizieren. Ferner wurde das Vorliegen einer Assoziation des zweidimensionalen Immunoblots mit anderen invasiven und nicht invasiven Nachweisverfahren der H. pylori-Infektion analysiert. Dabei wurde das Antigenprofil des H. pylori, sowohl qualitativ als auch quantitativ, berücksichtigt. Durch die Charakterisierung und Identifizierung einer bedeutenden Anzahl von Helicobacter-Proteinen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit für ein zukünftig beschleunigtes Screening in Richtung protektiver Vakzine-Kandidaten. / The present study is concerned with practicable methods of detecting Helicobacter pylori and comparing them. As a precondition, a precise knowledge of the proteins of Helicobacter is necessary. To this end the humoral immune response of Helicobacter pylori was analysed by using the method of two-dimensional immuno blots. First, the proteins of each autologous Helicobacter pylori strain were separated by two-dimensional electrophoresis, then blotted onto nitrocellulose membranes and eventually detected by using antibodies from autologous plasma and antibodies taken from the overflow of in vitro cultivated autologous biopsy material. For determining a Helicobacter infection various invasive and non-invasive tests were carried out. In a prospective study on more than 200 patients with gastrointestianal disorders but unknown H. pylori status were consecutively tested. At each gastroscopy two bioptic specimen each were taken from the antrum and from the corpus region in order to determine the H. pylori status. Associations were assessed between Helicobacter pylori infections and manifestations such as acute or chronic gastritis, gastric or duodenal ulcers, gastric carcinoma and gastritis induced disorders. In the process, clearly Helicobacter pylori negative sera were also compared with positive sera. Inspite of the unequal distribution of numbers of patients over different groups of disorders (gastritis, ulcers, carcinoma) certain proteins were only detected in connection with one group of disorder. Several of the protein spots only occurred in a single group of disorders. More studies will be necessary using greater numbers of patients within each group of diseases in order to analyse and verify associations between Helicobacter antigenes and other disorders. Further, evidences of an association between two-dimensional immunoblots and other invasive and non-invasive methods of assessing H. pylori were analysed with regard to respective antigene profiles, qualitatively as well as quantitatively. Based upon the presented characterizations and identifications of an unusually great number of Helicobacter proteins the probability is thus increased considerably with regard to improved screening methods towards protective vaccine candidates.