L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est caractérisée par l’obstruction des artères pulmonaires, principalement due au phénotype pro-prolifératif/anti-apoptotique des cellules musculaires lisses de la paroi des artères pulmonaires (CMLAP). L’augmentation progressive des résistances vasculaires pulmonaires aboutit à une élévation de la pression pulmonaire qui va induire rapidement une insuffisance cardiaque droite et conduire au décès des patients à moyen terme. Plusieurs études ont démontré l’implication du facteur de transcription NFAT (nuclear factor of activated T cell) dans le maintien du phénotype pro-prolifératif/anti-apoptotique des CMLAP-HTAP. Cependant les voies de signalisation responsables de l’activation constitutive d’NFAT restent peu connues. Durant mon doctorat, j’ai étudié les mécanismes responsables de l’activation d’NFAT dans l’HTAP. Nous nous sommes intéressés au rôle des microARN et notamment à miR-204. Ainsi, les facteurs circulants augmentés dans HTAP, diminue l’expression de miR-204 via l’activation du facteur de transcription STAT3. Par un mécanisme de rétro-action positive, la diminution de miR-204 induit une suractivation de STAT3 aboutissant au phénotype pathologique. Ainsi, l’augmentation exogène de miR-204 permettrait de soigner l’HTAP in vitro et in vivo. Nous avons montré que miR-204 va également moduler l’expression de Runx2, facteur de transcription connu pour être impliqué dans la calcification. Dans les CMLAP-HTAP, la diminution de miR-204 est associée à une augmentation de l’expression de Runx2, connu comme un régulateur positif de l’activation du facteur de transcription HIF-1 impliqué dans l’HTAP. Ainsi la modulation de miR-204 affecte la prolifération et l’apoptose des CMLAP-HTAP par plusieurs axes de signalisation. Enfin, nous avons démontré l’implication du facteur de transcription Krüppel Like Factor 5 (KLF5) dans l’HTAP. La surexpression de KLF5 dans l’HTAP est secondaire à l’activation de STAT3, tandis que son inhibition diminue la prolifération et favorise l’apoptose des CMLAP-HTAP. In vivo, l’administration de siKLF5 renverse l’HTAP en diminuant les pressions pulmonaires, l’hypertrophie ventriculaire droite, la prolifération et augmentant l’apoptose des CMLAP des artères pulmonaires distales. Finalement, j’ai étudié différents aspects du développement de l’HTAP et notamment de l’activation de l’axe STAT3/NFAT. Nous avons pu mettre en évidence que cibler cette voie de signalisation par différents moyens (mimic miR-204, siRunx2, siSTAT3, siKLF5) semble une bonne stratégie pour traiter l’HTAP. Mots clés : l’hypertension artérielle pulmonaire, thérapeutique, prolifération, apoptose, microARN, facteur de transcription, réparation à l’ADN. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is characterized by the obstruction of the pulmonary arteries, mainly due to the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype of the pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC). The progressive increase of pulmonary vascular resistance first leads to an increase of pulmonary pressure and then leads to a right heart failure, which generates patient’s death within few years. Many studies demonstrated the implication of the transcription factor NFAT (nuclear factor of activated T cell), which maintains the pro-proliferative and anti-apoptotic phenotype in PAH-PASMC. However, pathways that lead to the constitutive NFAT activation remain unclear. During my doctorate, I studied mechanisms responsible for the activiation of NFAT in HTAP. We study the role of the microRNA and more exactly to miR-204. Thus, the circulating factors, which are increased in PAH and which decreased miR-204 expression in PAH, via the transcription factor STAT3 activation. Through a positive regulation loop mechanism, the decrease of miR-204 induces an overactivation sustain of STAT3 leading to the pathologique phenotype. Thus, the exogenous increase of miR-204 could treat PAH in vitro as well as in vivo. We demonstrated that miR-204 is able to modulate the expression of the transcription factor Runx2 known to be implicated in calcification. In PAH-PASMC, the decrease of miR-204 is associated to an increase of Runx2 expression, known as positive regulator of the HIF-1 activation implicated in PAH. Thus miR-204 modulations affected the proliferation and apoptosis of PAH-PASMC through many molecular axes. Finaly we reveal the implication of the transcription factor Kruppel Like Factor 5 (KLF5) in PAH. The KLF5 overexpressed in PAH is associated to the STAT3 activation, wherease its inhibition decreased the proliferation and promoted apoptosis in PAH-PASMC. In vivo, si KLF5 reversed PAH by decreasing pulmonary pressures, right ventricular hypertrophy, proliferation and increasing apoptosis in PASMC from distal PA. Finally, I studied many aspects implicated in PAH development and especially the STAT3/NFAT axis activation. We showed that targeting this pathway using many technics (mimic miR-204, siRunx2, siSTAT3, siKLF5) seem to be an interesting strategy to treat PAH. Key words: Pulmonary arterial hypertension, therapeutic, proliferation, apoptosis, microRNA, and transcription factor.

Chez l'humain et la souris, les androgènes retardent la montée de la production de surfactant pulmonaire chez le mâle. L'objectif de ce projet mené chez la souris est de déterminer les moments gestationnels exacts où la production de surfactant augmente chez le mâle et chez la femelle. Pour ce faire, nous avons adapté une technique permettant de quantifier le surfactant pulmonaire à différents moments gestationnels par la mesure des phosphatidylcholines disaturées (DSPC) dans les poumons foetaux. Brièvement, la quantité de DSPC augmente significativement selon l'âge gestationnel chez les deux sexes. Aucune différence sexuelle significative dans la quantité de surfactant n'a pu être détectée. Cela peut être expliqué par une approche de normalisation des résultats non optimale, une puissance statistique insuffisante, une contamination des échantillons par les DSPC membranaires et sanguins ou parce que la différence sexuelle est transitoire et a lieu pendant une courte période précise non étudiée.

L’hypertension pulmonaire (HTP) est caractérisée par une élévation de la pression pulmonaire (> 25mmHg). Cette hypertension peut être primaire (HTAP, hypertension artérielle pulmonaire) ou secondaire à une autre pathologie, par exemple à une cardiopathie gauche (PH-LHD, pulmonary hypertension due to left heart disease). En HTAP, les cellules musculaires lisses des artères pulmonaires (CMLAP) ont un phénotype hyperprolifératif et anti-apoptotique, causant un remodelage des artères pulmonaires. Dernièrement, le lecteur épigénétique Bromodomain-containing protein 4 (BRD4) a été montré comme soutenant la prolifération des cellules cancéreuses. Puisque BRD4 est une cible prédite de miR-204 et que celui-ci est diminué en HTAP, nous avons émis l’hypothèse que la diminution de miR-204 favorise une surexpression de BRD4 en HTAP. Comme dans le cancer, cette surexpression de BRD4 participerait au phénotype hyperprolifératif des CMLAP. Au chapitre 2, nous avons montré que la surexpression de BRD4, effectivement régulé par miR-204, soutient la dérégulation des CMLAP en modulant l’expression des oncoprotéines NFATc2, Bcl-2 et la Survivine. Finalement, nous avons montré que l’inhibition de BRD4 in vivo renverse le remodelage vasculaire et l’HTAP. Malgré que l’HTAP soit la forme d’HTP la plus sévère, la PH-LHD est de loin la plus fréquente. Malheureusement, il existe peu de modèles animaux pour son étude. Afin d’étendre nos connaissances des mécanismes étiologiques du remodelage vasculaire pulmonaire à ce groupe, nous avons, dans le chapitre 3, développé et caractérisé 2 modèles de PH-LHD par la constriction de l’aorte transverse (TAC, transverse aortic constriction) et supracoronaire (SAB, supracoronary aortic banding) chez le rat. Tel qu’attendu, les rats TAC et SAB ont développé une hypertrophie et une dysfonction diastolique ventriculaire gauche. De plus, nous avons observé le développement d’une HTP avec présence de remodelage vasculaire pulmonaire similaire à l’histopathologie pulmonaire rapportée chez certains patients PH-LHD. Ces observations nous permettent de confirmer la validité de ces modèles pour l’étude du remodelage vasculaire chez ce groupe d’HTP. / Pulmonary hypertension (PH) is characterized by an elevation of pulmonary arterial pressure (> 25mmHg). This hypertension may be primary (PAH, pulmonary arterial hypertension) or secondary to another disease, for example, due to left heart disease (PH-LHD, pulmonary hypertension due to left heart disease). In PAH, pulmonary arterial smooth muscle cells (PASMC) are hyperproliferative and apoptosis resistant, causing vascular remodeling and PH. Recently, the epigenetic reader bromodomain-containing protein 4 (BRD4) was showed to sustain proliferation in cancer cells. Since BRD4 is a predictive target of miR-204, a micro-RNA downregulated in PAH, we hypothesized that BRD4 overexpression, caused by miR-204 downregulation, is involved in PAH-PASMC hyperproliferative and anti-apoptotic phenotype. In chapter 2, we showed that BRD4 overexpression was indeed regulated by miR-204 and sustains PASMC deregulation by modulating the oncoproteins NFATc2, Bcl-2 and Survivin. Finally, we showed that in vivo pharmacological and molecular BRD4 inhibition reversed vascular remodeling and PAH. Although PAH is the most severe form of PH, PH-LHD is by far the most common. Unfortunately, there are few models for its study. To expand our knowledge of the etiological mechanisms of pulmonary vascular remodeling to this group, we developed and characterised, in chapter 3, 2 PH-LHD models by the transverse aortic constriction (TAC) and the supracoronary banding (SAB) in rats. As expected, TAC ad SAB rats developed left ventricular hypertrophy and diastolic dysfunction. Furthermore, we observed in these animals the development of PH with pulmonary remodeling similar to the pulmonary histopathology reported in some PH-LHD patients, allowing us to confirm the validity of these two models for the study of vascular remodeling in this PH group.

La sarcoïdose est une maladie inflammatoire multisystémique s'attaquant aux poumons dont l'étiologie demeure inconnue. Elle est caractérisée par l'accumulation de granulomes noncaséeux dans les organes touchés. L'appareil pulmonaire est fréquemment atteint par la sarcoïdose et d'importants changements de population cellulaire sont observés dans le fluide récolté lors de lavages bronchoalvéolaires (LBA). Une étude précédente a démontré la possibilité d'utiliser un modèle animal de rat pour l'étude de cette maladie. Cette étude a démontré que l'adjuvant complet de Freund (CFA) administré par voie intraveineuse (IV) à deux reprises induit l'apparition de granulomes qui furent, par la suite, analysés par tomographie axiale. Le projet de recherche décrit dans ce mémoire a visé à développer, à partir du modèle déjà connu, un modèle mieux toléré par les animaux et à analyser les caractéristiques cellulaires, histologiques et immunologiques de celui-ci. De plus, certains agonistes des récepteurs nicotiniques, molécules ayant des propriétés anti-inflammatoires, seront testés sur le modèle comme traitement potentiel. Il fut démontré lors de cette étude qu'une seule injection de CFA cause l'apparition de granulomes dans les poumons des animaux et que cette injection est bien tolérée par les animaux. Les analyses cellulaires des LBA des animaux malades ont permis de noter une forte similarité avec la sarcoïdose pulmonaire humaine. De plus, le profil immunologique des animaux était très près de la pathologie humaine. Finalement, l'utilisation des agonistes nicotiniques n'a pas permis d'atténuer l'inflammation reliée à cette pathologie granulomateuse.

Le système endothéline (ET) est activé en condition d’hypertension pulmonaire (HTP). L’efficacité des antagonistes des récepteurs à l’ET a clairement été démontrée et a menée à l’approbation clinique de tels antagonistes dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Toutefois, il existe présentement un important débat opposant l’utilisation d’un antagoniste sélectif des récepteur ETA à l’utilisation d’un antagoniste double ETA/ETB dans le traitement de cette pathologie. Bien que nous sachions que le système ET est activé et contribue à l’HTAP, les modifications locales de ce système induites par la pathologie, particulièrement au niveau des artères de résistance pulmonaires, demeurent inconnues. De plus, l’impact de ces modifications sur la réponse pharmacologique aux divers antagonistes des récepteurs à l’ET (sélectifs versus double) est d’une importance capitale. Ainsi, le but de la première étude de cette thèse était d’évaluer les modifications potentielles de la pharmacologie du système ET au niveau des artères de résistance pulmonaires induites par l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’en condition contrôle l’antagoniste sélectif ETA et l’antagoniste double n’ont eu aucun effet sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1. Toutefois, en condition d’HTAP, les antagonistes sélectif et double ont tous deux été en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire induite par l’ET-1. Une diminution importante de l’expression génique du récepteur ETB pourrait être à l’origine de cette modification du profil pharmacologique des antagonistes. Une meilleure compréhension des rôles joués par les récepteurs ETA et ETB au niveau des artères de résistance pulmonaires pourrait permettre l’optimisation des traitements de l’HTAP. Ainsi, le but de la deuxième étude était d’évaluer les effets d’un traitement antisens ex vivo dirigé contre l’ARNm des récepteurs ETA et ETB dans la vasoconstriction des artères de résistance pulmonaires induite par l’ET-1. Dans cette étude, nous avons démontré dans un premier temps que les récepteurs ETA et ETB pouvaient former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression protéique du R-ETA entraînait une potentialisation de la vasoconstriction ETB dépendante suggérant ainsi qu’en condition contrôle, le récepteur ETA aurait un effet inhibiteur sur la vasoconstriction pulmonaire induite par la stimulation du récepteur ETB. Les effets délétères de l’ET-1 sur la circulation pulmonaire sont bien connus, toutefois seules quelques études ont porté leur attention sur l’implication de l’ET-3 dans l’HTAP. Ainsi, le but de la troisième étude était d’évaluer l’implication potentielle de l’ET-3 dans l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’il était nécessaire en condition contrôle de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin de réduire la réponse vasoconstrictrice pulmonaire à l’ET-3. En condition d’HTAP, nous avons observé une augmentation non-significative des concentrations plasmatiques d’ET-3 ainsi qu’une modification du profil pharmacologique des antagonistes des récepteurs à l’ET. En effet, l’utilisation de l’antagoniste sélectif ETA ou de l’antagoniste double était dans les deux cas en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire à l’ET-3. Les résultats de ces trois études suggèrent qu’il est préférable d’utiliser un antagoniste double dans le traitement de l’HTAP. En effet, (1) en condition d’HTAP, l’utilisation d’un antagoniste double est aussi efficace que l’utilisation d’un antagoniste sélectif ETA; (2) les récepteurs ETA et ETB peuvent former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires et (3) le récepteur ETB joue un rôle prédominant dans la vasoconstriction pulmonaire, il semble donc essentiel de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin d’inhiber la réponse vasoconstrictrice induite par l’ET. Mots-clés: endothéline-1, endothéline-3, artère de résistance pulmonaire, récepteur vasculaire, antagoniste des récepteurs à l’ET, dimérisation, phosphorothioate, hypertension artérielle pulmonaire / The endothelin (ET) system is activated in pulmonary arterial hypertension (PAH); indeed, increased plasma levels of ET-1 were detected in patients with various forms of PAH and in various experimental models. The therapeutic value of pharmacological blockade of ET receptors has been demonstrated in various animal models and led to the current approval and continued development of these drugs for the therapy of human PAH. Whether the net effect of either selective ETA receptor blockade or combined ETA/ETB receptor blockade provides greater therapeutic benefit remains a subject of debate. Although the ET system contributes to PAH, we currently incompletely comprehend which local modifications of this system occur as a consequence of PAH, particularly in small resistance arteries, and how this could affect the pharmacological response to ET receptor antagonists. The purpose of the first study was therefore to evaluate potential modifications of the pharmacology of the ET system in rat pulmonary resistance arteries from monocrotaline-induced PAH. Our results reveal striking changes in pulmonary vasculature sensitivity to ET receptor antagonism in PAH that may be related to a reduction in ETB receptor expression. A better understanding of the exact role played by both ETA and ETB receptors on pulmonary resistance arteries might contribute to optimization of PAH treatments. Therefore the aim of the second study was to clarify the role played by both ETA and ETB receptors in ET-1 induced pulmonary vasoconstriction using an antisense (AS) oligonucleotide ex vivo treatment. In this study we have demonstrated that ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries. Furthermore, suppression of ETA receptors potentiated the response to ET-1 suggesting that in control condition the ETA receptor has an inhibitory action on the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction induced by the stimulation of the ETB receptor. Although the deleterious effects of ET-1 on the pulmonary circulation are well established, only a few studies have focused on ET-3 in PAH. Therefore, the purpose of the last study was to evaluate the potential implication of ET-3 in MCT-induced PAH and evaluate the roles of ETA and ETB receptors on ET-3-induced pulmonary vascular reactivity. In control condition, the use of a combination of both ETA and ETB receptor antagonists is necessary to reduce the ET-3 induced pulmonary vasoconstriction. In PAH, we found an increased ET-3 plasma levels and a modification of the pharmacological profile of ET receptor antagonists. Indeed, the use of either the ETA receptor antagonist or the dual antagonist was able to reduce the ET-3 response. The results from these three studies suggest that it is preferable to use a dual antagonist in the treatment of PAH. Indeed, (1) in PAH the use of a dual antagonist is as effective as the use of a selective ETA receptor antagonist (2) ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries and (3) ETB receptor plays an important role in the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction, suggesting that it is necessary to block both receptors to reduce the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction. Keywords: endothelin-1, endothelin-3, pulmonary resistance artery, receptor, endothelin receptor antagonist, dimerisation, phosphorothioate pulmonary arterial hypertension

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) est caractérisé par des lésions alvéolairesdiffuses qui résultent d’une lésion de la membrane alvéolo-capillaire entrainant entre autresune réaction inflammatoire intense et une perte massive et hétérogène du volume pulmonaireaéré. La tomographie par émission de positons (TEP) et la tomographie par impédanceélectrique (TIE) sont deux techniques d’imagerie fonctionnelle permettant l’étude noninvasive, quantitative et régionale du poumon.Ce travail présente le résultat d’études expérimentales conduites dans le SDRA. Tout d’abord,nous avons comparé positivement la TIE à la TEP pour la mesure de la ventilation pulmonaireet du volume aéré. Nous avons ensuite décrit et validé une technique robuste d’obtention duvolume aéré et de la ventilation spécifique en TEP sans prélèvement invasif. Enfin, nousavons étudié en TEP l’influence de la pression expiratoire positive (PEP) et du décubitusventral (DV) sur la répartition de la ventilation, de la perfusion et de l’inflammationpulmonaires. Les poumons agressés par l’acide chlorhydrique inhalé ont une inflammationsignificativement plus élevée que le groupe contrôle. Aucune différence significatived’inflammation n’a été trouvée entre les groupes expérimentaux malgré des modificationsimportantes de la répartition de la ventilation et de la perfusion régionales lors de la mise enDV. Ces études donc ont permis le développement d’un modèle porcin stable d’agressionpulmonaire aiguë et la validation de techniques d’imagerie permettant l’étude non invasive deparamètres physiologiques importants pouvant aider au réglage de la ventilation mécanique aucours du SDRA. / Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is characterized by diffuse alveolar damage andresulting from an increased permeability of the alveolar-capillary membrane. Of notice, thereis an intense lung inflammation. Positron emission tomography (PET) and electricalimpedance tomography (EIT) allow noninvasive assessment of pulmonary ventilation,perfusion and inflammation. We use these techniques to decipher the impairments ofventilation and inflammation throughout the lungs in an experimental model of acute lunginjury by hydrochloric acid inhalation in pigs.In a first study, we compared EIT to PET in quantifying pulmonary aerated volume andventilation, using PET as a gold standard. We found that lung ventilation and volume wereaccurately measured with EIT over a wide range of lung volume and minute ventilation. Wehave then described and validated a new model to obtain lung aerated volume and ventilationwith PET, without the requirement of gas sampling in the respiratory circuit. Finally, weconducted a controlled study with PET to evaluate the effects of positive end-expiratorypressure and body position on regional lung inflammation, ventilation and perfusion.Inflammation was significantly higher in injured groups than in control. However, there wasno significant change in inflammation across ALI groups despite significant differencebetween ventilation and perfusion repartition.We have developed in this work a stable experimental model of acute lung injury andvalidated noninvasive imaging tools allowing studying of important physiologic parametersthat could help setting up mechanical ventilation.

Le système endothéline (ET) est activé en condition d’hypertension pulmonaire (HTP). L’efficacité des antagonistes des récepteurs à l’ET a clairement été démontrée et a menée à l’approbation clinique de tels antagonistes dans le traitement de l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Toutefois, il existe présentement un important débat opposant l’utilisation d’un antagoniste sélectif des récepteur ETA à l’utilisation d’un antagoniste double ETA/ETB dans le traitement de cette pathologie. Bien que nous sachions que le système ET est activé et contribue à l’HTAP, les modifications locales de ce système induites par la pathologie, particulièrement au niveau des artères de résistance pulmonaires, demeurent inconnues. De plus, l’impact de ces modifications sur la réponse pharmacologique aux divers antagonistes des récepteurs à l’ET (sélectifs versus double) est d’une importance capitale. Ainsi, le but de la première étude de cette thèse était d’évaluer les modifications potentielles de la pharmacologie du système ET au niveau des artères de résistance pulmonaires induites par l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’en condition contrôle l’antagoniste sélectif ETA et l’antagoniste double n’ont eu aucun effet sur la réponse vasoconstrictrice à l’ET-1. Toutefois, en condition d’HTAP, les antagonistes sélectif et double ont tous deux été en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire induite par l’ET-1. Une diminution importante de l’expression génique du récepteur ETB pourrait être à l’origine de cette modification du profil pharmacologique des antagonistes. Une meilleure compréhension des rôles joués par les récepteurs ETA et ETB au niveau des artères de résistance pulmonaires pourrait permettre l’optimisation des traitements de l’HTAP. Ainsi, le but de la deuxième étude était d’évaluer les effets d’un traitement antisens ex vivo dirigé contre l’ARNm des récepteurs ETA et ETB dans la vasoconstriction des artères de résistance pulmonaires induite par l’ET-1. Dans cette étude, nous avons démontré dans un premier temps que les récepteurs ETA et ETB pouvaient former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires. De plus, nous avons observé qu’une réduction de l’expression protéique du R-ETA entraînait une potentialisation de la vasoconstriction ETB dépendante suggérant ainsi qu’en condition contrôle, le récepteur ETA aurait un effet inhibiteur sur la vasoconstriction pulmonaire induite par la stimulation du récepteur ETB. Les effets délétères de l’ET-1 sur la circulation pulmonaire sont bien connus, toutefois seules quelques études ont porté leur attention sur l’implication de l’ET-3 dans l’HTAP. Ainsi, le but de la troisième étude était d’évaluer l’implication potentielle de l’ET-3 dans l’HTAP. Dans cette étude, nous avons démontré qu’il était nécessaire en condition contrôle de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin de réduire la réponse vasoconstrictrice pulmonaire à l’ET-3. En condition d’HTAP, nous avons observé une augmentation non-significative des concentrations plasmatiques d’ET-3 ainsi qu’une modification du profil pharmacologique des antagonistes des récepteurs à l’ET. En effet, l’utilisation de l’antagoniste sélectif ETA ou de l’antagoniste double était dans les deux cas en mesure de réduire la vasoconstriction pulmonaire à l’ET-3. Les résultats de ces trois études suggèrent qu’il est préférable d’utiliser un antagoniste double dans le traitement de l’HTAP. En effet, (1) en condition d’HTAP, l’utilisation d’un antagoniste double est aussi efficace que l’utilisation d’un antagoniste sélectif ETA; (2) les récepteurs ETA et ETB peuvent former des dimères au niveau des artères de résistance pulmonaires et (3) le récepteur ETB joue un rôle prédominant dans la vasoconstriction pulmonaire, il semble donc essentiel de bloquer simultanément les récepteurs ETA et ETB afin d’inhiber la réponse vasoconstrictrice induite par l’ET. Mots-clés: endothéline-1, endothéline-3, artère de résistance pulmonaire, récepteur vasculaire, antagoniste des récepteurs à l’ET, dimérisation, phosphorothioate, hypertension artérielle pulmonaire / The endothelin (ET) system is activated in pulmonary arterial hypertension (PAH); indeed, increased plasma levels of ET-1 were detected in patients with various forms of PAH and in various experimental models. The therapeutic value of pharmacological blockade of ET receptors has been demonstrated in various animal models and led to the current approval and continued development of these drugs for the therapy of human PAH. Whether the net effect of either selective ETA receptor blockade or combined ETA/ETB receptor blockade provides greater therapeutic benefit remains a subject of debate. Although the ET system contributes to PAH, we currently incompletely comprehend which local modifications of this system occur as a consequence of PAH, particularly in small resistance arteries, and how this could affect the pharmacological response to ET receptor antagonists. The purpose of the first study was therefore to evaluate potential modifications of the pharmacology of the ET system in rat pulmonary resistance arteries from monocrotaline-induced PAH. Our results reveal striking changes in pulmonary vasculature sensitivity to ET receptor antagonism in PAH that may be related to a reduction in ETB receptor expression. A better understanding of the exact role played by both ETA and ETB receptors on pulmonary resistance arteries might contribute to optimization of PAH treatments. Therefore the aim of the second study was to clarify the role played by both ETA and ETB receptors in ET-1 induced pulmonary vasoconstriction using an antisense (AS) oligonucleotide ex vivo treatment. In this study we have demonstrated that ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries. Furthermore, suppression of ETA receptors potentiated the response to ET-1 suggesting that in control condition the ETA receptor has an inhibitory action on the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction induced by the stimulation of the ETB receptor. Although the deleterious effects of ET-1 on the pulmonary circulation are well established, only a few studies have focused on ET-3 in PAH. Therefore, the purpose of the last study was to evaluate the potential implication of ET-3 in MCT-induced PAH and evaluate the roles of ETA and ETB receptors on ET-3-induced pulmonary vascular reactivity. In control condition, the use of a combination of both ETA and ETB receptor antagonists is necessary to reduce the ET-3 induced pulmonary vasoconstriction. In PAH, we found an increased ET-3 plasma levels and a modification of the pharmacological profile of ET receptor antagonists. Indeed, the use of either the ETA receptor antagonist or the dual antagonist was able to reduce the ET-3 response. The results from these three studies suggest that it is preferable to use a dual antagonist in the treatment of PAH. Indeed, (1) in PAH the use of a dual antagonist is as effective as the use of a selective ETA receptor antagonist (2) ETA and ETB receptors can form heterodimers in pulmonary resistance arteries and (3) ETB receptor plays an important role in the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction, suggesting that it is necessary to block both receptors to reduce the ET-1 induced pulmonary vasoconstriction. Keywords: endothelin-1, endothelin-3, pulmonary resistance artery, receptor, endothelin receptor antagonist, dimerisation, phosphorothioate pulmonary arterial hypertension

La voie pulmonaire suscite un intérêt grandissant pour l'administration systémique des peptides et protéines thérapeutiques, aujourd'hui encore administrés essentiellement par voie parentérale. Un microsystème a été conçu pour permettre de faciliter et accélérer les études in vitro de criblage de différentes biomolécules actives et de sélectionner les formulations les plus adaptées à leur pénétration à travers l'épithélium pulmonaire, en vue de sélectionner les meilleurs candidats à une administration par voie pulmonaire. Organisé en deux configurations distinctes, ce microsystème permet dans un premier temps d'obtenir des barrières épithéliales pulmonaires polarisées et jointives (cellules Calu-3) en seulement 7 jours dans des micropuits de 1mm², sans avoir à renouveler le milieu nutritif ni avoir recours à un appareillage externe associé au microsystème. Grâce à la mise au point d'une technique simple de fabrication, des plateformes de culture contenant jusqu'à 12 micropuits en parallèle sont aujourd'hui fabriquées de manière standardisée. L'évaluation du passage de molécules est ensuite réalisée sous une deuxième configuration dédiée à la mesure de la perméabilité des barrières épithéliales cultivées en micropuits. La capacité de différents candidats (nanoparticules et biomolécules) à traverser l'épithélium pulmonaire a été étudiée. Le passage de nanoparticules de PLGA revêtues de chitosane ainsi que le passage de l'insuline ont été démontrés avec succès. Enfin, l'électrophorèse capillaire couplée à une détection par fluorescence induite par laser (EC-LIF), compatible avec les faibles volumes manipulés dans ce microsystème, a été exploitée pour la détection et la quantification de l'insuline après passage des barrières pulmonaires miniaturisées. A cette fin, l'insuline a soit été marquée par le FITC, soit complexée à un anticorps ou a un aptamère fluorescents. A l'heure actuelle, seule la méthode développée pour le marquage de l'insuline par le FITC est utilisable à des fins de quantification, mais le recours à un aptamère a montré des premiers résultats encourageants.

The original work presented in this thesis investigates some of the mechanisms that may be responsible for the aetiology of altitude-related cough. Particular attention is paid to its relationship to the long recognised, but poorly understood, changes in lung volumes that occur on ascent to altitude. The literature relevant to this thesis is reviewed in Chapter 1.<p><p>Widespread reports have long existed of a debilitating cough affecting visitors to high altitude that can incapacitate the sufferer and, on occasions, be severe enough to cause rib fractures (22, 34, 35). The prevalence of cough at altitude has been estimated to be between 22 and 42% at between 4200 and 4900 m in the Everest region of Nepal (10, 29). Traditionally the cough was attributed to the inspiration of the cold, dry air characteristic of the high altitude environment (37) but no attempts were made to confirm this aetiology. In the first formal study of cough at high altitude, nocturnal cough frequency was found to increase with increasing altitude during a trek to Everest Base Camp (5300 m) and massively so in 3 climbers on whom recordings were made up to 7000 m on Everest (8). After 9 days at 5300 m the citric acid cough threshold, a measure of the sensitivity of the cough reflex arc, was significantly reduced compared with both sea level and arrival at 5300 m.<p><p>During Operation Everest II, a simulated climb of Mount Everest in a hypobaric chamber, the majority of the subjects were troubled above 7000 m by pain and dryness in the throat and an irritating cough despite the chamber being maintained at a relative humidity of between 72 and 82% and a temperature of 23ºC (18). This argued against the widely held view that altitude-related cough was due to the inspiration of cold, dry air. <p><p>In the next major hypobaric chamber study, Operation Everest III, nocturnal cough frequency and citric acid cough threshold were measured on the 8 subjects in the study. The chamber temperature was maintained between 18 and 24ºC and relative humidity between 30 and 60% (24). This work is presented in Chapter 2 and, demonstrated an increase in nocturnal cough frequency with increasing altitude which immediately returned to control values on descent to sea level. Citric acid cough threshold was reduced at 8000 m compared to both sea level and 5000 m values. Changes in citric acid cough threshold at lower altitudes may not have been detected because of the constraints on subject numbers in the chamber. The study still however demonstrated an increase in clinical cough and a reduction in the citric acid cough threshold at extreme altitude, despite controlled environmental conditions, and thus refuted the long held belief that altitude-related cough is solely due to the inspiration of cold, dry air. <p><p>If altitude-related cough is not simply due to the inspiration of cold, dry air, other possible aetiologies are:<p>•\ / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie orpheline, progressive, incurable, caractérisée par un remodelage intense de la paroi des artérioles pulmonaires résistives conduisant à l’augmentation des résistances vasculaires pulmonaires. Des anomalies génétiques associées à des mutations du gène codant pour le récepteur de type 2 de morphogenèse osseuse (BMPR2) ont été mises en évidence chez près de 70% des formes héréditaires d’HTAP. Dans le présent travail et ce à l’aide de cultures cellulaires primaires réalisées à partir de biopsies pulmonaires collectées chez des patients souffrant d’HTAP idiopathique et des sujets contrôles, nous nous sommes intéressés aux mécanismes responsables de l’hyperplasie des cellules musculaires lisses présente dans l’HTAP, plus particulièrement à l’implication de la voie angiopoîétine (Ang)/Tie2 dans la communication intercellulaire existant entre cellules endothéliales (CE) et cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires (CML-AP), ainsi qu’à la voie des BMP/BMPR2 chez des patients HTAP porteurs de mutations BMPR2. <p>Contrairement aux expressions inchangées des Ang1 et Ang2, l’expression du récepteur endothélial Tie2 est augmentée tant au niveau pulmonaire que cellulaire dans l’HTAP. Les CML-AP isolées à partir de patients souffrant d’HTAP présentent in vitro un phénotype prolifératif accru et ce d’autant plus en présence de surnageants de culture collectés à partir de CE pulmonaires (CE-P). Cet effet prolifératif est d’autant plus intense que les CE-P proviennent de patients HTAP et qu’elles ont été préalablement stimulées par l’Ang1. La fluoxétine, un inhibiteur du transporteur de la sérotonine (5-HT) inhibe ces effets prolifératifs, alors que le bosentan, un antagoniste non sélectif des récepteurs A et B à l’endothéline (ET) n’a pas d’effet. De plus, l’activation du récepteur Tie2 induit la synthèse et la libération de 5-HT et d’ET1 par les CE-P isolées à partir de patients souffrant d’HTAP. La voie angiopoïétine/Tie2 joue donc un rôle central dans le dialogue croisé existant entre l’endothélium et le muscle lisse vasculaire pulmonaire et son activation contribue à la prolifération accrue des CML-AP responsable du remodelage vasculaire pulmonaire chez les patients souffrant d’HTAP idiopathique. <p>L’expression du BMPR2 est diminuée tant au niveau pulmonaire, que cellulaire chez les patients souffrant d’HTAP et porteurs de mutations BMPR2. Dans ces CML-AP mutées, le BMP4 ne freine pas la prolifération et n’induit pas l’apoptose, normalement induites dans les cellules isolées à partir de contrôles et de patients souffrant d’HTAP non porteurs de mutations BMPR2. Ces particularités fonctionnelles sont associées à une activation de la voie p38MAPK et un défaut d’activation de la voie Smad. Parmi les 9 mutations BMPR2 étudiées, seule la mutation par délétion de 22 paires de bases dans le domaine transmembranaire ne présente pas ces particularités fonctionnelles. Des anomalies génétiques, telles les mutations BMPR2 concourent donc à une perte du contrôle de la prolifération cellulaire associé à l’activation de la voie p38MAPK, présentant les mutations BMPR2 étudiées, comme des facteurs de risque supplémentaires au développement de l’hyperplasie médiale dans l’HTAP. <p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished