Previously our laboratory had identified a novel component of the Staphylococcus aureus regulatory network, an extracytoplasmic function ó factor, óS, involved in stress response and disease causation. Here we present additional characterization of óS, demonstrating a role for it in protection against DNA damage, cell wall disruption and interaction with components of the innate immune system. Promoter mapping reveals the existence of four unique sigS start sites, one of which appears to be subject to auto-regulation. Transcriptional profiling revealed that sigS expression remains low in a number of S. aureus wild-types, but is upregulated in the highly mutated strain RN4220. Further analysis demonstrates sigS expression is inducible upon exposure to a variety of chemical stressors that elicit DNA damage, including methyl methanesulfonate (MMS) and ciprofloxacin, as well as those that disrupt cell wall stability, such as ampicillin and oxacillin. Ex vivo transcriptional analysis reveals that significant expression of sigS can be induced upon phagocytosis by RAW 264.7 murine macrophage-like cells. Regulation of óS appears to be unique, as the downstream encoded protein, SACOL1828, seemingly acts as a positive activator, rather than as an expected anti-sigma factor. Using a global transposon screen we have elucidated additional genes implicated in the regulation of sigS, including those involved in cell wall stability, cellular detoxification, virulence and DNA base excision repair. Phenotypically, óS mutants display sensitivity to a broad range of DNA damaging agents, such as ultraviolet light, MMS and ethidium bromide. These effects are seemingly mediated via regulation of the purine biosynthesis pathway, as microarray, proteomic and qRT-PCR analysis of óS mutants reveal decreased transcription of all genes involved. Enzymatic profiling of PurA involved in adenine biosynthesis, demonstrates decreased activity in the óS mutant. Finally, we provide further evidence for the role of óS in S. aureus pathogenesis, revealing that sigS mutants display decreased ability to cause localized infections and are impaired in their interactions with components of the human innate immune system. Collectively, our data argues for the important, and perhaps novel, role of óS in the stress and virulence responses of S. aureus.

Previous evidence has shown that the simple sequences microsatellites and poly-purine/poly-pyrimidine tracts (PPTs) could be both a cause, and an effect, of meiotic recombination. The causal link between simple sequences and recombination has not been much explored, however, probably because other evidence has cast doubt on its generality, though this evidence has never been conclusive. Several questions have remained unanswered in the literature, and I have addressed aspects of three of them in my thesis. First, what is the scale and magnitude of the association between simple sequences and recombination? I found that microsatellites and PPTs are strongly associated with meiotic double-strand break (DSB) hotspots in yeast, and that PPTs are generally more common in human recombination hotspots, particularly in close proximity to hotspot central regions, in which recombination events are markedly more frequent. I also showed that these associations can't be explained by coincidental mutual associations between simple sequences, recombination and other factors previously shown to correlate with both. A second question not conclusively answered in the literature is whether simple sequences, or their high levels of polymorphism, are an effect of recombination. I used three methods to address this question. Firstly, I investigated the distributions of two-copy tandem repeats and short PPTs in relation to yeast DSB hotspots in order to look for evidence of an involvement of recombination in simple sequence formation. I found no significant associations. Secondly, I compared the fraction of simple sequences containing polymorphic sites between human recombination hotspots and coldspots. The third method I used was generalized linear model analysis, with which I investigated the correlation between simple sequence variation and recombination rate, and the influence on the correlation of additional factors with potential relevance including GC-content and gene density. Both the direct comparison and correlation methods showed a very weak and inconsistent effect of recombination on simple sequence polymorphism in the human genome.Whether simple sequences are an important cause of recombination events is a third question that has received relatively little previous attention, and I have explored one aspect of it. Simple sequences of the types I studied have previously been shown to form non-B-DNA structures, which can be recombinagenic in model systems. Using a previously described sodium bisulphite modification assay, I tested for the presence of these structures in sequences amplified from the central regions of hotspots and cloned into supercoiled plasmids. I found significantly higher sensitivity to sodium bisulphite in humans in than in chimpanzees in three out of six genomic regions in which there is a hotspot in humans but none in chimpanzees. In the DNA2 hotspot, this correlated with a clear difference in numbers of molecules showing long contiguous strings of converted cytosines, which are present in previously described intramolecular quadruplex and triplex structures. Two out of the five other hotspots tested show evidence for secondary structure comparable to a known intramolecular triplex, though with similar patterns in humans and chimpanzees. In conclusion, my results clearly motivate further investigation of a functional link between simple sequences and meiotic recombination, including the putative role of non-B-DNA structures.

Thesis (Ph.D. in Human Medical Genetics) -- University of Colorado at Denver and Health Sciences Center, 2006. / Typescript. Includes bibliographical references (leaves 127-143). Free to UCDHSC affiliates. Online version available via ProQuest Digital Dissertations;

Thesis (Ph. D.)--University of Canterbury, 2008. / Typescript (photocopy). Includes bibliographical references. Also available via the World Wide Web.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:55:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 876963 bytes, checksum: 2254ce6044753867875b6bfab3b2249e (MD5) Previous issue date: 2014-07-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study aimed evaluating the excretion of purine derivatives and nitrogen compounds in zebu cattle grazing, on different days and times within days. The experiment was conducted in the cattle department of the Federal University of Viçosa / MG, using five Nelore heifers with an average body weight of 300 ± 15 kg and 20 months of age, in 5x5 Latin square design. The experimental treatments were defined to represent those commonly used in the dry season, as follows: control (mineral salt), concentrated with 20.31% crude protein (CP) on dry matter (DM) being offered (OF) level of 0.5 to 1% of body weight fasted (BWF) OF5 and OF10, respectively; and two concentrated self- regulating (SR) consumption, containing 69.38% CP on a DM basis (20% urea and 20% salt) offered ad libitun (SR70) and other concentrate containing 39.73% CP based on MS being offered ad libitum (SR40). The experimental periods was 18 days, with one day to perform 14 hours of fasting for weighing and adjustment of the quantities supplied, 12 days for adaptation to the experimental diets and five for total collection of urine and stool sample at the times of 0h00a.m. to 4h00a.m, 4h00a.m. to 8:00a.m., 8:00a.m. to 12:00p.m., 12:00p.m. to 4:00p.m., 4:00p.m. to 8:00p.m. and 20:00p.m. to 0:00a.m. For total collection of urine was used probe Folley number 26, coupled to polyethylene hose leading to a urine collection bag for urine closed system, which was emptied every two hours in the range of 8:00a.m. to 8:00p.m., and every four hours in the range from 8:00p.m. to 8:00a.m. and subsequently homogenized and cooled. The collected urine sampling was performed every four hours, measuring the volume, and withdrawing one sample were diluted in H 2 SO 4 at 0,036N and another don't diluted. To estimate fecal output, used the titanium dioxide, provided the total daily amount of 15g, between 9 th and 18 th day of each period. To estimate the intake of pasture, used the indigestible neutral detergent fiber (iNDF) as internal indicator. Was performed by collecting pasture technique for determining the square potentially digestible dry matter (PDDM) on the third day of each experimental period, and on days 14 th and 18 th was held grazing simulation to estimate the consumption of constituents of diets. In urine samples the concentrations of creatinine, total nitrogen, urea, uric acid and allantoin. For statistical analysis we used the statistical program SAS Proc Mixed. Dry matter intake 10was higher (P<0.05) for the treatment OF10 compared to SR70, SR40 and control treatments but was not different (P>0.05) treatment OF5. The CP intake increased by supplementation (P<0.05), which caused no effect on DM intake from pasture. Excretions of creatinine did not change treatment, day and sampling period (P>0.05) and had a mean of 23.03 ± 0.30 mg / kgPC. Urinary relations of allantoin (Al) and uric acid (UA) with creatinine were not affected (P>0.05) by treatments, collection days and times of collection. The total nitrogen relations:creatinine and urea nitrogen:creatinine in urine showed interaction (P<0.05) between treatment and sampling period. The relationship between urea nitrogen:total nitrogen was influenced (P<0.05) only at time of collection. The nitrogen balance (NB) in g/day did not differ between treatments OF10, SR70 and SR40, however these had higher retention of N (P<0.05) than treatments OF5 and control, which were not different. The NB, in g/ging, showed differences (P<0.05) between treatments with concentrated, which did not differ (P> 0.05), and control treatment, with the lowest NB. The production of microbial N was not affected (P>0.05) by treatments. The microbial efficiency gPBmic/kgMOD and gPBmic/kgNDT was affected (P<0.05) by supplementation, being higher (P<0.05) for OF5, OF10 and SR70 treatments, which did not differ. The control and OF5, treatments had the lowest values were similar. The lack of effect of day and the collection period on allantoin and uric acid compared with creatinine has wide practical application, enabling use spot urine sample to calculate the excretion of purine derivatives at any time of day or night, and consequently the microbial production. Depending on the variations observed for total nitrogen and urea nitrogen relations with creatinine over 24 hours is not recommended the use of a single spot urine sample for determination of these nitrogen compounds. / O presente trabalho foi desenvolvido com os objetivos de avaliar a excreção dos derivados de purinas e de compostos nitrogenados em zebuínos em pastejo, em diferentes dias e períodos dentro de dias. O experimento foi conduzido no setor de gado de corte da Universidade Federal de Viçosa/MG, utilizando-se cinco novilhas Nelore com peso corporal médio de 300 ± 15kg e 20 meses de idade, distribuídas em quadrado latino 5x5. Os tratamentos experimentais foram definidos para representar aqueles normalmente utilizados na época seca do ano, sendo eles: controle (sal mineral), concentrado com 20,31% de proteína bruta (PB) com base na matéria seca (MS) sendo oferecido (OF) em nível de 0,5 e 1% do peso corporal em jejum (PCJ), OF5 e OF10, respectivamente; e dois concentrados autorreguladores (AR) de consumo, um contendo 69,38% PB com base na MS (20% de ureia e 20% de sal) ofertado ad libitun (AR70) e outro concentrado contendo 39,73% PB com base na MS sendo ofertado ad libitum (AR40). Os períodos experimentais possuíram 18 dias, sendo o dia um para realização de jejum de 14 horas para pesagem e ajuste das quantidades fornecidas, 12 para adaptação dos animais às dietas experimentais e cinco para a coleta total de urina e amostral de fezes, nos horários das 0h00 às 4h00, 4h00 às 8h00, 8h00 às 12h00, 12h00 às 16h00, 16h00 às 20h00 e 20h00 às 24h00. Para a coleta total de urina utilizou-se sonda de Folley no26, acoplada a mangueira de polietileno que conduziu a urina até uma bolsa coletora de urina por sistema fechado, que foi esvaziada a cada duas horas no intervalo das 8h00 às 20h00, e a cada quatro horas no intervalo das 20h00 às 8h00, sendo posteriormente homogeneizadas e resfriadas. A amostragem da urina coletada foi realizada a cada 4 horas, medindo-se o volume e retirando-se duas amostras, uma diluída com solução H2SO4 0,036N e não diluida. Para determinação da excreção fecal, utilizou-se o dioxido de titânio, fornecido na quantidade total diária de 15g, entre os dias 9 e 18 de cada período. Para estimativa do consumo de pasto, utilizou-se a fibra indigestível em detergente neutro (FDNi), como indicador interno. Realizou-se coleta de pasto pela técnica do quadrado para determinação da matéria seca potencialmente digestível (MSpd) no terceiro dia de cada período experimental, e nos dias 14o e 18o realizou-se simulação de pastejo para estimar os consumos dos constituintes das dietas. Nas amostras de urina foram determinadas as concentrações de creatinina, nitrogênio total, ureia, acido úrico e alantoína. Para análise estatística utilizou-se o programa estatístico Proc Mixed do SAS. O consumo de MS foi superior (P<0,05) para o tratamento OF10 em relação aos tratamentos AR70, AR40 e controle, mas não diferiu (P>0,05) do tratamento OF5. O consumo de PB aumentou com a suplementação (P<0,05), que não causou efeito sobre o consumo de MS do pasto. As excreções de creatinina não sofreram efeito de tratamento, dia e período de coleta (P>0,05) e apresentaram média de 23,03 ± 0,30 mg/kgPC. As relações urinárias da alantoína (Al) e do ácido úrico (AU) com a creatinina não foram influenciadas (P>0,05) pelos tratamentos, dias de coleta e horários de coleta. As relações nitrogênio total:creatinina e nitrogênio ureico:creatinina na urina apresentaram interação (P<0,05) entre tratamento e período de coleta. A relação entre nitrogênio ureico:nitrogênio total foi influenciada (P<0,05) apenas pelo horário de coleta. O balanço de compostos nitrogenados (BN), em g/dia, não diferiu entre os tratamentos OF10, AR70 e AR40, contudo esses apresentaram maiores retenções de N (P<0,05) que os tratamentos OF5 e controle, que não foram diferentes. O BN, em g/ging, apresentou diferença (P<0,05) entre os tratamentos com concentrado, que não diferiram entre si (P>0,05), e tratamento controle, que apresentou o menor BN. A produção de compostos nitrogenados microbianos não foi alterada (P>0,05) pelos tratamentos. A eficiência microbiana, em gPBmic/kgMOD e gPBmic/kgNDT foi afetada (P<0,05) pela suplementação, sendo maior (P<0,05) para os tratamentos OF5, OF10 e AR70, que não diferiram entre si. Os tratamentos controle e OF5, apresentaram os menores valores e foram semelhantes entre si. A ausência de efeito de dia e do período de coleta sobre a relação alantoína e ácido úrico com a creatinina tem grande aplicação prática, possibilitando utilizar a amostra spot de urina para calcular a excreção de derivados de purinas em qualquer horário do dia ou da noite, e consequentemente a produção microbiana. Em função das variações observadas para as relações nitrogênio ureico e nitrogênio total com a creatinina ao longo do período de 24 horas não se recomenda o uso de uma única amostra spot de urina para determinação destes compostos nitrogenados.

Orientador: Walter Filgueira de Azevedo Júnior / Banca: Luis Fernando Delboni / Banca: Fernanda Canduri / Resumo: A Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) catalisa a fosforólise de nucleosídeos de purina para suas respectivas bases e açucares (ribose ou desoxirribose) 1-fosfato. A PNP desempenha uma função central no metabolismo das purinas, normalmente operando na via de recuperação do DNA das células. Mais ainda, a PNP cliva ligações glicosídicas com inversão da configuração para produzir a-ribose 1-fosfato. Acredita-se que no organismo do Mycobacterium tuberculosis a PNP desempenha tarefas similares, o que levanta o interesse em desenvolver ciência que dê suporte para o desenvolvimento de drogas baseadas na estrutura desta proteína. A proteína é um homotrímero simétrico com um arranjo triangular das subunidades, similar às PNPs triméricas de mamíferos. Cada monômero consiste de um enovelamento a/ß formado por onze fitas ß circundadas por oito hélices a. O estudo desta PNP visa proporcionar comparações com outras estruturas, na intenção de identificar as bases estruturais de possíveis diferenças ou similaridades funcionais entre esta e outras PNPs, num esforço para desenvolver pesquisa que dê suporte para o desenho de novas drogas mais seletivas e poderosas contra a tuberculose. / Abstract: The Purine nucleoside phosphorylase (PNP) catalyses the phosphorolysis of purine nucleosides to corresponding bases and ribose 1-phosphate. PNP plays a central role in purine metabolism, normally operating in the purine salvage pathway of cells. Moreover, PNP cleaves glycosidic bond with inversion of configuration to produce á-ribose 1-phosphate. It is believed that in the MtPNP is responsible for the same labor in the Mycobacterium tuberculosis organism, which arouses the interest in developing science for giving support to the development of structure based drugs. The protein is a symmetrical homotrimer with triangular arrangement of the subunits, similar to the trimeric mammalian PNPs. Each monomer consist of a á/â folding formed by eleven â sheet surrounded by eight á helices. The study of this PNP aims the possibility of caring out comparisons with other structures, in order to identify the structural basis of possible differences or functional similarities between this and other PNPs, in an effort to develop research which gives support to the design of more selective and powerful new drugs against tuberculosis. / Mestre

Muitas espécies de Leishmania são responsáveis por sérias doenças cutâneas e viscerais, que exibem alta incidência em regiões tropicais e subtropicais. Os medicamentos disponíveis são potencialmente carcinogênicos, requerem múltiplas administrações e a hospitalização do paciente. Um programa efetivo de desenvolvimento de novos fármacos requer a validação genética e bioquímica dos alvos. Neste contexto, uma das diferenças metabólicas mais marcantes entre os protozoários parasitas e o hospedeiro mamífero encontra-se na cadeia de síntese de purino-nucleotídeos. A enzima adenilosuccinato liase (ADSL), no hospedeiro mamífero, atua em duas etapas no metabolismo de purino-nucleotídeos: uma na via de síntese de novo e outra na via de recuperação. Esta característica particular da ADSL nos motivou a investigar como esta enzima poderia nos fornecer evidências sobre a evolução desta via metabólica em Kinetoplastida. Assim, os objetivos do presente trabalho foram validar a ADSL como potencial alvo terapêutico, através da técnica de RNA de interferência (RNAi), usando Trypanosoma brucei como modelo, bem como, caracterizar molecularmente o gene adsl-Lm e caracterizar bioquímica e estruturalmente a enzima recombinante de Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). Os resultados de RNAi demonstraram que a ADSL pode ser considerada um potencial alvo, uma vez que ela se apresentou essencial a viabilidade do parasita. Em relação à caracterização molecular do gene adsl-Lm suas regiões não traduzidas 5\'UTR e 3\'UTR foram definidas por RT-PCR, indicando que o RNA mensageiro maduro possui 2060 nucleotídeos. Análises com enzimas de restrição e eletroforese em campo pulsado (PFGE), seguidas de \"Southern blot\" revelaram que adsl-Lm trata-se de um gene de cópia simples e está localizado no cromossomo 4 deste parasita. O gene adsl-Lm foi clonado em um vetor de expressão e um protocolo de purificação da enzima recombinante foi estabelecido. A forma tetramérica da ADSL-Lm foi confirmada por eletroforese em gel nativo e por espalhamento dinâmico de luz (DLS). ADSL-Lm apresentou um pI experimental de 6,07 e exibiu atividade máxima no pH 8,5. Os parâmetros cinéticos de Km, Vmax , Kcat e eficiência catalítica (Kcat/Vm) foram determinados para o substrato adenilosuccinato. Experimentos de complementação funcional evidenciaram que ADSL-Lm foi capaz de complementar de maneira eficiente o genoma deficiente em ADSL da linhagem de E. coli JK268 (mutação purB58). Entretanto, esta complementação deve ocorrer na via de recuperação, uma vez que ensaios enzimáticos com o SAICAR (substrato da via de novo) mostraram que a enzima não retém atividade sobre este composto. Estes resultados indicam que provavelmente os tripanosomatídeos não representam um caso de perda da via de síntese de novo. Adicionalmente, ADSL-Lm foi cristalizada no grupo espacial tetragonal I4122, com parâmetros de cela unitária a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90°. A estrutura cristalográfica da ADSL-Lm foi resolvida por SIRAS (substituição isomórfica simples com dispersão anômala) usando um cristal nativo (2.2 \'angstron\') e um derivado de Gadolínio. O monômero é composto por três domínios em um enovelamento típico das enzimas da superfamília de -eliminação e é constituído quase exclusivamente por hélices- . Para o sitio ativo, três subunidades são requeridas e os resíduos envolvidos são His 153 (ácido geral), His 231 (base geral), Gln 308, Asn 364 and Glu 369. Entretanto, sem um ligante (substrato ou inibidor) no sítio ativo torna-se difícil estudar detalhadamente as interações entre a enzima e seus dois substratos. Desta forma, experimentos de co-cristalização e modelagem molecular podem auxiliar nesta questão. / Many species of Leishmania are responsible for serious visceral or skin diseases that exhibit high incidence in tropical and subtropical regions. The drugs currently employed in the treatment of parasitic diseases are potentially carcinogenic, often require prolonged treatment and patient hospitalization. An effective program of drug design requires the validation of the potential target. In this context, one of the most striking metabolic discrepancies between Trypanosomatidae and their human hosts is the purine nucleotide biosynthesis pathway. Adenylosuccinate lyase (ADSL) is a bifunctional enzyme that catalyses two non-sequential steps in this cycle (one in the de novo purine pathway and another in the salvage pathway). This particular ADSL feature motivated us to investigate if ADSL could give us information about purine biosynthesis evolution in Kinetoplastida. Hence, the present work is aimed to validate ADSL as a potential target using the RNAi (RNAi) technique, as well as to characterize the adsl gene and the recombinant enzyme from Leishmania major Friedlin (ADSL-Lm). The RNAi results proved that ADSL can be considered a potential target, because it is shown to be essential for parasite viability. Regarding the molecular characterization of the adsl-Lm gene, the mature mRNA transcript containing 2060 nucleotides was defined by 5\' and 3\'RT-PCR. Restriction analysis and Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) followed by Southern Blot hybridizations showed that adsl-Lm is a single copy gene and is located in chromosome 4 of this parasite. The adsl-Lm gene was cloned into an expression vector and a purification protocol of the recombinant enzyme was established. The tetrameric form of the recombinant ADSL-Lm enzyme was confirmed by native gel electrophoresis and Dynamic Light Scattering. ADSL-Lm has an experimental pI of 6.07 and exhibited maximum enzymatic activity at pH 8.5. The kinetic parameters of Km, Vmax , Kcat and kinetic efficiency (Kcat/Vm) were obtained for adenylosuccinate substrate. Functional complementation experiments showed that the adsl-Lm gene can effectively complement the E. coli JK268 purB58 mutation. However, this complementation must be in the salvage pathway, because enzymatic assays were performed using SAICAR (de novo pathway substrate) and ADSL-Lm did not convert this compound into product. This result indicates that probably Trypanosomatidae is not an example of de novo purine nucleotide cycle lost. In addition, ADSL-Lm was crystallized in the tetragonal I4122 space group, with unit cell parameters a= b= 130,023 \'angstron\', c= 316,826 \'angstron\', = = =90° and diffracted beyond 2.2\'angstron\'. ADSL-Lm crystal structure has been determined by SIRAS (Single Isomorphous Replacement with Anomalous Dispersion), using both native and Gadolinium derivative crystals. The ADSL-Lm monomer is composed of three domains arranged in the elongated manner typical of enzymes in the p-elimination superfamily, and is constituted almost exclusively by helices. Three subunits are necessary to form the active site cleft and the residues His 153, His 231 (general bases), Gln 308, Asn 364 and Glu 369 are involved. Without a bound inhibitor or substrate, the specific contacts made by the enzyme to its two substrates cannot be analyzed in detail. Hence, co-crystallization and docking can help in this question.

As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. Causada pelo parasita Schistosoma mansoni a esquistossomose mansônica afeta aproximadamente 259 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. O S. mansoni não possui a via \"de novo\" para a biossíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessas bases, portanto, essa via é um alvo em potencial. Agentes capazes de bloquear a atividade das enzimas participantes desta via atuam de forma inespecífica e são quase sempre tóxicos ao homem e por isso o estudo minucioso das pequenas diferenças encontradas entre as enzimas do hospedeiro e do parasita são de extrema importância. Uma diferença marcante entre a via de salvação de purinas do parasita e do hospedeiro humano é a presença de atividade para adenosina fosforilase, que no parasita é exercida por duas entidades distintas: pela enzima Metiltioadenosina fosforilase de S. mansoni (SmMTAP) e por uma enzima até então desconhecida. A enzima SmMTAP naturalmente converte 5\'-deoxi-5\'-metiltioadenosina (MTA) em adenina livre, mas ao contrário do que é visto no hospedeiro, no parasita essa enzima atua preferencialmente na conversão de adenosina. Substituições encontradas no sítio ativo dessa enzima, podem explicar tamanha preferência pelo substrato alternativo, revelando mecanismos distintos da enzima humana. A enzima Purina nucleosídeo fosforilase de S. mansoni (SmPNP) converte inosina e guanosina à hipoxantina e guanina, respectivamente, mas não possui atividade catalítica para adenosina. No entanto, no genoma de S. mansoni é descrita uma isoforma para a SmPNP (SmPNP2), cuja atividade catalítica é desconhecida e, portanto, essa enzima pode também atuar na conversão de adenosina juntamente com a SmMTAP. Assim, os objetivos deste trabalho foram realizar estudos bioquímicos da ação da enzima SmMTAP e realizar a caracterização estrutural e funcional da enzima SmPNP2. Para isso, foram realizadas mutações no sítio ativo da SmMTAP (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L), as mutantes da SmMTAP juntamente com a enzima SmPNP2 foram clonadas, expressas de forma heteróloga e purificadas. Foram realizados ensaios de cristalização e cinéticos por espectrofotometria utilizando um sistema acoplado. A atividade da SmPNP2 foi ainda avaliada por calorimetria e HPLC. Foram determinadas as constantes catalíticas da forma nativa e para os cinco mutantes da SmMTAP para cinco diferentes substratos. Foi determinada atividade catalítica da SmPNP2 por 3 diferentes substratos: adenosina, inosina e citidina, as constantes catalíticas foram determinadas para os três substratos. Foram obtidos cristais para os mutantes da SmMTAP e da SmPNP2, que foram submetidos à difração de raios X nas linhas I04-1 e I02 do laboratório de radiação síncrotron Diamond Light Source (DLS). Foram resolvidas 9 estruturas dos mutantes da SmMTAP e 4 da proteína SmPNP2. Os dados cinéticos, juntamente com os dados estruturais, permitiram compreender mecanismos catalíticos e de interação das proteínas estudadas, complementando o conhecimento do metabolismo do parasita Schistosoma mansoni e revelando alvos em potencial para o desenvolvimento de fármacos específicos. / The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. The schistosomiasis is caused by Schistosoma mansoni parasite and affects approximately 259 million people worldwide with 6 million only in Brazil. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the \"de novo\" pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathway for its purine requirement, therefore this pathway is a potential target. Compounds able to block the enzymes from this pathway, are not specific and are often toxic to humans, thus the thorough study about the particularity found between enzymes from host and parasite are extremely important. A notable difference between human and parasite metabolism, is the activity existence to Adenosine phosphorylase that in parasite is carried out by two distinct entities: by Methylthioadenosine phosphorylase (SmMTAP) and by a hitherto unknown enzyme. The SmMTAP enzyme, naturally converts 5\'-deoxy-5\'-methylthioadenosine (MTA) to free adenine and in opposition to host, in the parasite this enzyme acts manly in adenosine conversion. Substitutions found in the active site from SmMTAP, can explain the huge preference by alternative substrate and to expose a distinct mechanisms from human enzyme. The Purine nucleoside Phosphorylase from S. mansoni (SmPNP) converts inosine and guanosine to hypoxanthine and guanine, respectively, but it not possess catalytic activity to adenosine conversion. However in the S. mansoni genome there is a isoform to SmPNP, whose activity is unknown, thus is possible that SmPNP2 enzyme also can to convert adenosine. This study aimed to perform biochemical studies to investigate the SmMTAP enzyme action and perform the structural and functional characterization of SmPNP2. For this propose was made site-directed mutagenesis (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L). The SmMTAP mutants and SmPNP2 enzyme were cloned, expressed by heterolog process and purified. Were perform kinetic assays by spectrophotometric method in a coupled system. The SmPNP2 activity was also available by calorimetry and HPLC methods. Were determined the catalytic constants to wild and mutants SmMTAP to five different substrate. Was determinated to SmPNP2 catalictical activity and kinetics parameters to three substrate: adenosine, inosine e cytidine. Were obtained crystals from SmMTAP mutants and SmPNP2 enzyme, those crystals were submitted to X-rays diffractions in the I04-1 and I02 beamlines from Diamond Light Source (DLS). Nine structures were obtained from SmMTAP mutants and four from SmPNP2 enzyme. The kinetics and structural data allowed understanding the catalytic and interaction mechanisms about the protein studied, supplementing the knowledge around Schistosoma mansoni metabolism and reporting potential targets for the specific drugs development.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-21T10:35:01Z No. of bitstreams: 1 fernandagambogibraga.pdf: 553726 bytes, checksum: f15cef0c1ba9bd936e4b249618ff1332 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-25T12:31:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 fernandagambogibraga.pdf: 553726 bytes, checksum: f15cef0c1ba9bd936e4b249618ff1332 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-25T12:31:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 fernandagambogibraga.pdf: 553726 bytes, checksum: f15cef0c1ba9bd936e4b249618ff1332 (MD5) Previous issue date: 2008-02-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por diferentes espécies do gênero Leishmania que afetam mais de 12 milhões de pessoas em todo o mundo. As manifestações clínicas podem variar desde simples lesões cutâneas à leishmaniose visceral que pode ser fatal. A quimioterapia convencional baseia-se em múltiplas injeções parenterais com antimoniais pentavalentes que são consideravelmente tóxicos e propensos a induzir resistência. Medicamentos de segunda linha, como Anfotericina B e suas formulações lipídicas, ou são demasiadamente caros para uso rotineiro nos países em desenvolvimento ou são tóxicos. Considerando que a busca de drogas mais eficazes contra Leishmania tornou-se extremamente necessária, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito in vitro de novos derivados da purina. Essas substâncias foram testadas contra promastigotas de L. amazonensis e L. chagasi e amastigotas de L. amazonensis, através do método colorimétrico do MTT e contagem dos parasitos. Foi também analisada a produção de NO pelas formas promastigotas e amastigotas de Leishmania e pelos macrófagos, medido espectrofotometricamente. Dentre os 13 derivados de purina testados, quatro, 6-(3-cloropropiltio)-9H-purina, ácido 2-(9H-purin-6-tioil)acético, sal de flúor de 7,8-diidro-(1,4)tiazepino(3,2,4-hi)purina e 6-(3'-(tioetilamina)propiltio)purina, inibiram o crescimento das formas promastigotas de L. amazonensis (IC50 de 50, 39, 28 e 50 μM, respectivamente). Somente o sal de 8,9-diidro-7H-(1,4) tiazepino(3,2,4-hi) purinil flúor inibiu o crescimento das formas promastigotas de L. chagasi (IC50 de 28 μM). O ácido 2-(9H-purin-6-tioil)acético apresentou a melhor atividade anti-amastigota e reduziu cerca de 50% do número de amastigotas intracelulares após 48h de tratamento. Os derivados purínicos, em geral, reduziram a produção de NO em promastigotas de Leishmania e em macrófagos, mas no processo de interação parasito/célula hospedeira não houveram alterações significativas na produção de NO. Também foi testada a citotoxicidade contra células mamíferas para todos os compostos que apresentaram efeito leishmanicida, mas nenhuma substância apresentou efeito significativo. Os resultados contribuiram para o avanço na investigação de novas drogas anti-leishmania, e sugerem que ácido 2-(9H-purin-6-tioil)acético tem um potencial leishmanicida promissor. / Leishmaniasis are a group of diseases caused by different species of the protozoan parasite Leishmania, which affect more than 12 million people worldwide. The clinical manifestations may range from single cutaneous lesions to fatal visceral leishmaniasis. Conventional chemotherapy relies on multiple parenteral injections with pentavalent antimonials that are considerably toxic and prone to induce resistance. Second-line drugs, such as amphotericin B and its lipid formulations, are either too toxic or expensive for routine use in developing countries. Considering it, the search for more effective drugs against Leishmania became extremely necessary. In order to find new drugs against leishmaniasis this work checked the in vitro effect of purine derivatives. These substances were assayed against L. amazonensis and L. chagasi promastigotes and amastigotes of L. amazonensis through the colorimetric method of MTT and counting of parasites. It also examined the production of NO the promastigote forms and amastigote forms of Leishmania sp and the macrophages measured spectrophotometrically. Among the 13 derivatives of purine assayed four substances: 6-(3-chloropropylthio)-9H-purine, 2-(9H-purin-6-ylthio)acetic acid, salt of fluor of 7,8-dihydro-[1,4]thiazepino[3,2,4-hi]purine and 6-(3'-(thioethylamine) propylthio)purine, inhibited the growth of promastigote forms of L. amazonensis (IC50 values of 50, 39, 28 and 50 μM, respectively). Only the salt of fluor of the 8,9-dihydro-7H-[1,4]thiazepino[3,2,4-hi]purine, inhibited the growth of promastigotes of L. chagasi (IC50 value of 28μM). The 2-(9H-purin-6-ylthio)acetic acid presented the best anti-amastigotes activity and this substance reduced approximately 50% of the number of intracellular amastigotes after 48h of treatment. In general the derivatives of purine reduced the production of NO in promastigotes of Leishmania and macrophages but in the process of interaction parasite/host cell there were no significant changes in the production of NO. We also had tested citotoxicity against mammalian cells for all the compounds that present leishmanicidal effect but none of the substances were found to have significant toxicity effect. The results contributed for advance in the research for new anti-leishmania drugs and suggest that 2-(9H-purin-6-ylthio)acetic acid has promising antileishmanial potencial.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito dos diferentes níveis de nucleotídeos sobre o desempenho de frangos de corte alimentados com probióticos. Para o trabalho, foi utilizado um delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições dentro de cada tratamento. Foram utilizados 1050 frangos machos da linhagem Ross 308 totalizando trinta e cinco aves por boxe. As aves foram criadas até 42 dias de idade que receberam as rações experimentais a base de milho e farelo de soja contendo seis diferentes níveis de nucleotídeos (0; 100; 200; 300; 400 e 500 gramas por tonelada de ração). Os diferentes níveis de nucleotídeos foram utilizados na fase inicial (1 a 21 dias de idade) e crescimento (22 a 35 dias de idade). Durante a fase final (36 a 42 dias de idade) foi fornecido rações sem nucleotídeo para todos os tratamentos. Os resultados experimentais demonstraram que houve melhora linear no desempenho dos frangos de corte no período de 1 a 21 dias de idade, indicando que, quanto maior o nível de nucleotídeos na dieta de frangos de corte, maior foi o peso corporal das aves. A conversão alimentar também é melhorou linearmente no período de 1 a 21 dias de idade à medida que aumentou o nível de nucleotídeos na ração. O peso no período de 35 dias de idade, também teve um comportamento linear, semelhante ao período de 1 a 21 dias, indicando que, quanto maior o nível de nucleotídeos na dieta de frangos de corte, maior o desempenho das aves. Quanto aos níveis plasmáticos de ácido úrico, pôde-se observar efeito quadrático no período de 1 a 21 dias de idade, indicando o valor de 231,59 gramas de nucleotídeos por tonelada de ração, como o melhor, em níveis mínimos de ácido úrico, por outro lado, no período de 35 dias de idade, estima-se o nível de 208,99 g de nucleotídeos por tonelada de ração; como o melhor em níveis mínimos de ácido úrico no sangue. No período final (35 a 42 dias de idade) e período total (1 a 42 dias de idade) não foi possível o observar efeito dos contrastes testados em nenhum dos parâmetros avaliados. / The objective of this experiment was to evaluate the influence of different nucleotides levels in the rations of broilers containing probiotics on response of the birds and its influence on the performance. Birds were allocated in a randomized experimental design with five replications of each treatment. It was used 1,050 chicks of a day of age, males, distributed in 30 experimental boxes with 35 birds each. The chickens were reared from 1 to 42 days of age and the diets contained corn and soybean meal with one of six different nucleotídes levels (0; 100; 200; 300; 400 and 500 grams for ton of ration). The different nucleotides levels were used in the initial phase (1 to 21 days of age) and growth (22 to 35 days of age). During the final phase (36 to 42 days of age) it was supplied rations without nucleotides for all of the treatments. The experimental results demonstrated that there was improvement on broilers performance in the period from 1 to 21 days of age, demonstrating proportionality between nucleotides level in the diet of broilers and body weight of the birds. Feed conversion at 21 days of age was directly proportional to nucleotides level in the diet. Body weight at 35 days of age, also had a linear behavior, similar to the period from 1 to 21 days, indicating that, as higher the nucleotides level in the diet of broilers, higher the acting of the birds. Acid plasmatic uric levels, demonstrated quadratic effect at 21 days of age, indicating 231,59 grams of nucleotides for ton of ration, and at 35 days of age, it was considered the level of 208,99 g of nucleotides for ton of ration. In the final period (35 to 42 days of age) and total period (1 to 42 days of age) it was not demonstrated effect of the contrasts tested in none of the appraised parameters.