Synthèse et utilisation de mimes de quadruplexes contraints pour l'évaluation de ligands II est maintenant bien connu que l'ADN simple brin peut s'associer sous différentes conformations telles que la double hélice, les triplexes, les i-motifs ou bien encore les G-quadruplexes. Ces dernières années les structures de type quadruplexes (G-quadruplexes et i-motif) ont suscité un certain intérêt notamment pour leur implications au niveau cellulaire (maintenance des télomères, activation de gènes…). C'est pourquoi de nombreuses équipes travaillent sur le développement de ligands affins pour ces structures qui pourraient agir en tant qu'anticancéreux. Cependant, le fait que les quadruplexes présentent un polymorphisme important(variabilité du nombre de brins dans la structure, des différents types de boucles et de l'orientation des brins) rend la compréhension des interactions entre un ligand et le quadruplexe plus difficile. Dans ce contexte, l'équipe développe un nouveau concept, « Template Assisted Synthesis of Quadruplexes » (TASQ) dont le but est d'obtenir un quadruplexe ne présentant qu'une topologie de façon contrôlée afin de permettre des études plus précises sur la façon dont un ligand pourrait interagir avec les quadruplexes. La première partie de ce manuscrit reporte l'évaluation par résonnance plasmonique de surface de complexes métalliques en tant que ligands de G-quadruplexe. Ces études reposent sur l'utilisation d'un premier mime de G-quadruplexe parallèle sur lequel deux séries de complexes sont testées : des métalloporphyrines et des ligands de type salphen. La seconde partie du manuscrit décrit la synthèse de mimes de G-quadruplexes antiparallèle. Elle repose sur l'utilisation du gabarit peptidique qui relié aux séquences spécifiques d'oligonucléotides de façon adéquat contraint la structure. Pour se faire, deux réactions chimiosélectives ont été utilisées : la cycloaddition 1,3 dipolaire de Huisgen et la ligation oxime. Les travaux reportés concernent trois types de structure mimant un i-motifs, des G-quadruplexes tétramoléculaires ou bimoléculaires. / Synthesis and use of constrained quadruplexe mimic for the ligand evaluation It has now been shown that single stranded DNA can fold into hairpin, triplex, i-motif and G-quadruplexe structures containing non canonical base pairing. In particular quadruplex structures (G-quadruplexes and i-motif) have generated interest because the formation is considered to have important consequences at the cellular level (telomere maintenance, oncogene activation…). Therefore, the design of small molecules (ligands) targeting quadruplexes is under development, in particular to obtain anticancerous molecules. Nevertheless G-quadruplexes exhibit a wide structural polymorphism (different kind of loop, strand orientation, number of strands) making investigation of ligand tricky. In this context, we have developed a new concept called 'Template Assisted Synthesis of Quadruplex' (TASQ) with aim to constrain the G-quadruplex in a single conformation which enables the study of the interactions of ligand more specifically for a single topology. In the first part of this manuscript, we describe studies by using surface plasmon resonance (SPR) of metal complexes as G-quadruplex ligands. The investigation was performed using a first parallel G-quadruplex as model to interact with two kinds of metal complexes: metalloporphyrins and salphen. The second part of the manuscript reports the work concerning the synthesis of antiparallel quadruplexes. The strategy is based on the use of a peptide scaffold in which the suitable oligonucleotide sequences are anchored with specific orientation. For this purpose two compatible chemistries are used (1,3 dipolar Huisgen cycloaddition and oxime ligation). Three kinds of antiparallel quadruplexe mimics have been investigated: i-motif, tetramolecular G-quadruplexes and loop-constrained G-quadruplexes.

Le glioblastome multiforme (GBM) est une tumeur cérébrale extrêmement agressive associée à un mauvais pronostic. C'est pourquoi, il apparaît nécessaire d'identifier les mécanismes moléculaires participant au développement des GBM ainsi qu'à leurs résistances aux traitements afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Récemment, il a été montré que les régulations traductionnelles jouent un rôle fondamental dans les propriétés agressives du GBM. Les protéines de liaison à l'ARN (RBP) sont des acteurs majeurs de ces régulations dont l'expression/activité est altérée dans les GBM. Les RBP hnRNP HF (HF) font partie des RBP les plus surexprimées dans les GBM et leur contribution dans la régulation traductionnelle des GBM n'a encore jamais été investiguée. Nous avons émis l'hypothèse que hnRNP H et hnRNP F soient au centre d'un réseau de régulations post-transcriptionnelles impactant la machinerie traductionnelle qui contrôle le développement tumoral et la résistance aux traitements des GBM. Nos résultats montrent qu'HF régulent la prolifération et la réponse aux traitements car leur perte d'expression (i) diminue la prolifération des GBM (modèle cellulaire, sphéroïde et xénogreffes in vivo), (ii) active les voies de réponse aux dommages à l'ADN et (iii) sensibilise les cellules de GBM aux irradiations. De plus, nous avons identifié un nouveau rôle pour HF en tant que régulateurs de la traduction. En effet, nos données montrent que les hnRNP HF contrôlent la traduction d'un ensemble d'ARNm en régulant l'expression et l'activité de facteurs d'initiation ainsi qu'en collaborant avec des ARN hélicases partenaires en ciblant des ARNm impliqués dans des processus reliés au développement tumoral et la résistance aux traitements possédant des structures secondaires G-quadruplexe dans leurs 5'UTR. Les données que nous avons générées suggèrent que hnRNP H et hnRNP F sont des régulateurs traductionnels essentiels au développement tumoral et à la résistance aux traitements des GBM. / Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most aggressive brain tumors with poor prognosis. Understanding the molecular mechanisms involved in the development and resistance to treatments of gliomas could improve treatment efficiency. Recently, it has been demonstrated that translational regulations play a key role in the GBM aggressivity. RNA binding proteins (RBP) are major regulators of these processes and have altered expression / activity in GBM. The RBP hnRNP H and hnRNP F (HF) are among the most overexpressed RBP in GBM and their role in GBM translational regulation has never been investigated yet. We hypothesize that HF are at the core of a post-transcriptional regulation network which impacts the translational machinery that controls GBM tumor development and resistance to treatment. We have demonstrated that hnRNP H and hnRNP F regulate proliferation and response to treatment because their depletion (i) decreases the GBM proliferation (cell line model, spheroid and in vivo xenografts), (ii) activates the DNA damage response pathways and (iii) sensitizes the GBM cells to irradiation. We have identified HF as new regulators of GBM translation. Indeed, our data show that hnRNP H and hnRNP F control mRNA translation by regulating expression/activity of initiation factors and in collaboration with RNA helicases by targeting mRNA involved in oncogenic processes and containing secondary structures called G-quadruplex in their 5'UTR. The data that we have generated suggest that HF are essential translational regulators involved in tumor development and resistance to treatment in GBM.

Les G-quadruplexes sont des structures à quatre brins formées spontanément par certains acides nucléiques riches en guanines dans des conditions physiologiques in vitro et qui présentent une grande variété de conformations. Ma thèse a consisté à montrer qu'ils se formaient in vivo et à étudier les conséquences pathologiques de leur persistance. Le système expérimental utilisé au cours de ma thèse repose sur la mesure de la stabilité de séquences répétées en tandem humaines de type minisatellite chez S. cerevisiae en croissance mitotique. Le motif unitaire du minisatellite CEB1 forme un G-quadruplexe, efficacement déroulé par l'hélicase Pif1 in vitro. Dans un mutant déficient pour l'hélicase Pif1, CEB1 est fréquemment réarrangé (expansion ou contraction). J'ai dans un premier temps participé à montrer que cette instabilité de CEB1 dépendait de ses motifs G-quadruplexes, par mutagénèse dirigée. J'ai confirmé ce résultat par une seconde approche, en traitant des cellules sauvages avec un ligand spécifique des G-quadruplexes. Ce ligand induit spécifiquement l'instabilité du minisatellite CEB1, mais n'a pas d'effet sur le minisatellite CEB1 muté. Ces outils expérimentaux m'ont ensuite permis, en collaboration avec J. Lopes, de montrer que l'instabilité du minisatellite survient durant la réplication, lorsque les G-quadruplexes sont formés sur la matrice du brin à synthèse continue. Cette capacité à former des G-quadruplexes, entre autres propriétés des minisatellites riches en GC, induit la formation de grands réarrangements chromosomiques. Le dernier volet de ma thèse a consisté en l'étude de la relation structure-fonction des G-quadruplexes à l'instabilité génomique

Le marquage fluorescent de biomolécules est devenu un outil incontournable en biologie. Dans ce contexte, nous avons conçu de nouvelles sondes fluorescentes pour l'ADN.<br />Le marquage non-covalent d'ADN quadruplexe (ADN-G4) par reconnaissance structurale a été étudié. Les propriétés mitigées des composés obtenus en conjuguant un ligand d'ADN-G4 à des sondes fluorescentes nous ont conduit à étudier le Thiazole Orange (TO), dont la fluorescence est exaltée par l'ADN. Le TO a une forte affinité pour l'ADN-G4, qui exalte fortement sa fluorescence. L'affinité d'un ligand d'ADN-G4 peut donc être évaluée par déplacement compétitif de cette sonde. De plus, l'ADN-G4 constitue une matrice favorisant le transfert d'énergie entre un ligand de G4 et le TO.<br />Des sondes de taille réduite, avec une forte absorption biphotonique et permettant le marquage covalent d'ADN ont ensuite été développées. Certaines de ces sondes présentent une exaltation de fluorescence en présence d'ADN.

Avec la récente découverte que plus de 90% du génome humain est transcrit activement, il est raisonnable d'assumer que les mécanismes de régulation post-transcriptionnelle sont les moyens primaires contrôlant le transfert de l'information de l'ARN messager à la protéine. Ces mécanismes de régulation nécessitent généralement plusieurs éléments et motifs d'ARN en cis retrouvés à l'intérieur des ARN messagers. La structure G-quadruplexe sort de l'ordinaire en terme de motif d'ARN. L'empilement des G-quartets, formés de quatre guanines coplanaires interagissant entre elles via des paires de bases Hogsteen, la présence d'un contre-ion et la structure en tétrahélice procurent à la structure G-quadruplexe une stabilité remarquable. Cette stabilité amalgamée à ces caractéristiques structurales uniques, font de ce motif un élément de régulation post-transcriptionnelle en cis très prometteur. Cette thèse présente une étude des capacités de la structure G-quadruplexe à agir comme un élément de régulation de l'ARN. Tout d'abord, j'ai exploré l'habilité d'une structure G-quadruplexe à moduler l'activité catalytique d'un ribozyme en développant et caractérisant une nouvelle classe de ribozyme, le G-quartzyme. Le G-quartzyme résulte de la fusion d’un motif G-quadruplexe au ribozyme VHD antigénomique. Une activité catalytique dépendante de la présence de potassium en solution a été observée pour ce nouveau ribozyme. La caractérisation de cette chimère G-quadruplexe-ribozyme a permis d'apprécier la flexibilité et la capacité du G-quadruplexe à moduler l'activité catalytique d'un ribozyme. Par la suite, j'ai étudié les G-quadruplexes présents dans les 5-UTR des ARNm en utilisant une approche robuste composée de trois étapes, in silico, in vitro et in cellulo. Cette méthodologie a permis d'avoir une vue d'ensemble du phénomène. L'analyse de neuf candidats de front a été la clé afin d'apprécier l'ampleur des G-quadruplexes dans les 5'-UTR agissant comme répresseurs traductionnels. Les résultats obtenus ont permis d'identifier des nouvelles règles régissant la formation de structure G-quadruplexe d'ARN in vitro et in cellulo. Ce travail suggère que ces répresseurs de la traduction sont vastement distribués à travers le transcriptome. Finalement, cette même approche a été utilisée afin d'explorer les G-quadruplexes présents dans les 3’-UTR des ARNm. Cette analyse m'a permis de discerner un nouveau rôle pour cette structure, celui de stimuler la polyadénylation alternative d'un messager. L'étude plus en détail d'un candidat, FXR1, démontre que la présence d'un G-quadruplexe dans son 3'-UTR augmente l'expression d'un transcrit plus court, produit par polyadénylation alternative, contenant moins de sites de liaison aux microARNs résultant en un gain de synthèse protéique. Les résultats recueillis lors de ce travail suggèrent également que la présence de ce motif dans les 3'-UTR diminue l'efficacité d'un site de polyadénylation situé en aval de celui-ci. Clairement, les G-quadruplexes présents dans les 3-UTR possèdent différents rôles pouvant affecter l'expression d'un gène. En conclusion, ces études ont permis de soulever l'importance majeure des G-quadruplexes d'ARN dans différents phénomènes, dont l'expression génique, et de définir de nouvelles règles majorant leur formation et leur interaction dans divers contextes cellulaires. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que la structure G-quadruplexe, en plus d'être largement distribuée à travers le transcriptome, possède plusieurs caractéristiques faisant de celle-ci un élément de régulation de l'ARN des plus compétent. L’identification et la caractérisation de phénomènes cellulaires associés aux G-quadruplexes s'avèrent indispensables afin de développer de nouvelles thérapies géniques ciblant ces structures.

Les télomères sont des structures nucléoprotéiques protégeant l’extrémité des chromosomes de la dégradation et assurant la réplication de l’ADN terminal. En effet, de nombreuses protéines de réplication sont impliquées dans le maintien de ces structures, comme le complexe RPA (Replication Protein A). Ce complexe très conservé chez les eucaryotes se fixe à l’ADN simple brin et est impliqué dans la réplication, les mécanismes de recombinaison et la réparation de l’ADN. Chez S.pombe, la mutation ponctuelle de la sous-unité RPA1 (Rpa1-D223Y) provoque le raccourcissement des télomères. Dans cette étude, nous montrons que cette mutation provoque l’accumulation de structures aberrantes de haut poids moléculaire aux télomères corrélant avec une présence persistante de Polα aux télomères suggérant une accumulation de structures sur le brin riche en G. Nous avons pu mettre en évidence que la surexpression d’hélicases de la famille Pif1 incluant S.cerevisiae Pif1 et PIF1 humain ainsi que Pfh1 (S.pombe) sont capable de restaurer une longueur de télomères sauvage dans mutant rpa1-D223Y. Ces résultats suggèrent que RPA pourrait empêcher l’accumulation de G4 au niveau du brin retardé télomérique afin de faciliter l’élongation des télomères par la télomérase. De plus, des expériences in vitro ont montré que la mutation correspondante de RPA1 humain réduisait spécifiquement l’affinité de RPA pour le simple brin télomérique humain dans les conditions ou il forme des G4.Enfin l’étude de la stabilité de séquences répétées formant des G4 (minisatellite CEB25), chez S.pombe, a permis de renforcer l’hypothèse selon laquelle RPA pourrait empêcher la formation ou aiderait à la résolution de G4. / Telomeres are nucleoprotein structures that protect chromosome ends from degradation and ensure replication of the terminal DNA. In fact, many of replication proteins are involved in telomere maintenance, like RPA (Replication Protein A). RPA is a highly conserved heterotrimeric single-stranded DNA-binding protein involved in DNA replication, recombination and repair. In S. pombe a mutation in the largest RPA subunit (Rpa1-D223Y) leads to substantial telomere shortening. In this study, we found that the D223Y mutation leads to the accumulation of aberrant secondary structures at telomeres. The presence of these secondary DNA structures correlates with a high association of Polα with telomeres suggesting that this mutation impairs lagging strand (G-rich) telomere replication. Strikingly, heterologous expression of the budding yeast Pif1 known to efficiently unwind G-quadruplex, human PIF1 and Phf1 (homolog of Pif1 in S.pombe) rescue the telomeric length defects of the D223Y cells. Furthermore, in vitro data show that the identical D to Y mutation in human RPA specifically affects its ability to bind G-quadruplex. We propose that RPA prevents the formation of G-quadruplex structures at lagging strand telomeres to facilitate telomerase action at telomeres. Furthermore, the study, in S.pombe, of the stability of G-rich repeat sequences (minisatellite CEB25) as known to form G4 enforce the hypothesis that RPA can prevents the formation of G4 or helps to solve this structure.

Les triarylamines sont de petites molécules largement utilisées comme porteurs de charges dans le domaine de l'électronique organique, car elles présentent des mobilités de transport de trous élevées. En 2010, notre groupe a démontré pour la première fois que les molécules de triarylamine décorées avec des groupements amide subissent une polymérisation supramoléculaire. D'autre part, les propriétés de reconnaissance des résidus de nucléobases ont été largement utilisées au cours des 25 dernières années pour déclencher des processus d'auto-assemblage de polymères ou de petites molécules en polymères supramoléculaires bien définis. Dans cette thèse, une série de molécules triarylamine décorées avec des amides sur leurs chaînes latérales avec différentes nucléobases comme la guanine, la thymine et la cytosine ont été synthétisées. Nous avons démontré que les monomères de triarylamine conservent leurs propriétés d'auto-assemblage dans les solvants chlorés lors de l'irradiation lumineuse, à condition que le résidu de la nucléobase n'affecte pas les interactions non covalentes nécessaires pour l'auto-assemblage du cœur de triarylamine. En outre, nous avons démontré que la présence d'amines primaires sur le résidu de la nucléobase interdit la formation de structures auto-assemblées dès qu'elles ne sont pas incorporées dans des réseaux de liaisons hydrogène. Dans un deuxième chapitre, nous avons ensuite étudié les auto-assemblages de nos molécules triarylamine-nucléobase dans des solvants organiques en utilisant des ions ou de petites molécules comme matrice. Tout d'abord, la polymérisation supramoléculaire de la triarylamine-monothymine à l'aide de mélamine dans divers solvants a été étudiée. Par ailleurs, l'influence sélective des ions de mercure sur les propriétés sensibles légères de triarylamine-monothymine a été soigneusement analysé. Enfin, les polymères supramoléculaires hybrides de triarylamine-monoguanine conjugué en absence et en présence d'ions potassium ont été obtenus. En particulier, nous avons décrit le premier exemple de polymères supramoléculaires construits à partir de mélamine dans des solvants organiques. Dans l'ensemble, l'impact de ce travail est triple: a) il conduit à une meilleure compréhension du comportement d'auto-assemblage des conjugués de triarylamine, b) il influence la conception des structures de triarylamine auto-assemblées et c) il offre de nouvelles approches pour l'auto-assemblage des molécules de triarylamine. / Triarylamines are small molecules widely used as charge carriers in the field of organic electronics as they display high hole-transport mobilities. In 2010, our group demonstrated for the first time that chemically-tailored triarylamine amide molecules undergo supramolecular polymerization. On the other hand, the recognition properties of nucleobase residues have been widely used in the last 25 years to trigger self-assembling processes of polymers or small molecules into well-defined supramolecular polymers.In this thesis, a series of triarylamine amide molecules decorated on their side chains with various nucleobases such as guanine, thymine and cytosine have been synthesized. We have demonstrated that the triarylamine monomers retain their self-assembling properties in chlorinated solvent upon light irradiation, provided that the nucleobase residue does not affect the non-covalent interactions necessary for the self-assembly of the triarylamine core. In addition, we have demonstrated that the presence of primary amines on the nucleobase residue prohibit the formation of self-assembled structures, as soon as they are not embedded in hydrogen bonding arrays. In a second chapter, the templated self-assemblies of our triarylamine-nucleobase molecules in organic solvents were studied. Firstly, templated supramolecular polymerization of triarylamine-monothymine using melamine in various solvents was investigated. Besides, selective influence of mercury ion on the light responsive properties of triarylamine-monothymine was analyzed carefully. At last, hybrid supramolecular polymers of triarylamine-monoguanine conjugate in absence and in presence of potassium ion were obtained. In particular, we have described the first example of supramolecular polymers build from melamine in organic solvents. Overall, the impact of this work is three-fold: a) it leads to a better understanding of the self-assembly behavior of triarylamine conjugates, b) it influences the design of self-assembling triarylamine structures and c) it offers new approaches for the self-assembly of triarylamine molecules.

Un G-quadruplex (G4) est une structure non-canonique d’acides nucléiques formée par des séquences riches en guanines. Certains G4s sont polymorphiques, une même séquence peut former desG4s de différentes topologies. Les G4s sont proposés comme régulateurs de processus biologiques car ils sont trouvés dans des régions génomiques clés telles que dans des promoteurs de gènes et au niveau des télomères. Stabiliser ces G4s par rapport à la forme duplexe est une stratégie proposée pour combattre le cancer. Pour ce faire, des ligands spécifiques et affins sont utilisés. Le design de ces ligands implique habituellement de larges plans aromatiques, optimisés pour se lier par des interactions π-π sur les Gquartets extérieurs. Cependant, si ce type d’interaction était le seul mode de liaison, tous les ligands auraient des affinités similaires pour tous les G4s.Afin de caractériser les structures ciblées et de quelle manière les ligands vont interagir avec celles-ci, nous avons utilisé la spectrométrie de masse de type native (MS). D’abord, nous avons développé une méthode de préparation d’échantillons en conditions KCl pour former les G4s dans des conditions biologiquement pertinentes. Ensuite, nous avons caractérisé les équilibres de liaison du K+ aux G4s et caractérisé leur mécanisme de repliement. Ce mécanisme implique la présence d’une impasse constituée de G4s antiparallèles à 1- et 2-K+ qui sont formés rapidement. Enfin, nos études de liaison de ligands ont montré que certains des ligands les plus affins pouvaient influencer la structure des G4s comme observé par le nombre d’ions potassium liés. Les ligands Phen-DC3, 360A et PDS sont capables de déplacer les équilibres vers la forme à 1-K+ antiparallèle. La structure antiparallèle à 2-K+ est favorisée par la liaison coopérative de deux ligands Cu-ttpy. Ces résultats démontrent l’importance de la caractérisation des stoechiométries de complexes ternaires (G4:ligand:K+), obtenue par la spectrométrie de masse native. / A G-quadruplex (G4) is a non-canonical nucleic acids structure formed by guanine-rich sequences. Some G4s are polymorphic, a given sequence can form G4s of different topologies. G4s are proposed to be biological regulators because they are found in key regions of the genome, for example, ingene promoters or at the telomeres. Stabilizing G4s formed in those regions as compared to the duplex form is a strategy to fight cancer. To do so, specific and affine ligands are used. Ligand design usually implies the optimization of large aromatic planes to π-π stack on external G-quartets. However, if this was the only binding mode, all ligands would bind with similar affinities to all G4s.To characterize which structures should be targeted and how the ligands interact with these structures, we used native mass spectrometry (MS).First, we developed a MS-compatible sample preparation method in KCl conditions in which G4s are folded with similar topologies as compared to those obtained in biologically relevant conditions. Then, we characterized the K+ binding equilibria and G4s folding pathways. This folding pathway involves the presence of a dead-end constituted by antiparallel G4s with either 1- or 2-K+ cations that are folded first. Finally, our ligand binding studies showed that some of the most affine ligands can influence G4’sstructures, as probed by the number of K+ ions bound. Ligands Phen-DC3, 360A and PDS are able to shift the equilibria towards the 1-K+ antiparallel G4s. The formation of antiparallel with 2-K+ complexes is induced by the cooperative binding of two Cu-ttpy ligands. Our results demonstrate the importance to characterize ternary complex stoichiometries (G4:ligand:K+) as obtained from native mass spectrometry.

Les acides nucléiques riches en guanines ou en cytosines peuvent se replier sur eux-mêmes et former des systèmes tétramériques tels que les G-quadruplexes (G4) ou les i-motifs. Ces motifs, abondamment représentés dans certaines régions du génome humain semblent contribuer à la régulation cellulaire et suscitent depuis plusieurs années un intérêt grandissant. Ils sont notamment présents dans la région télomérique, mais aussi dans les promoteurs d’oncogènes ou au sein des génomes viraux et sont impliqués dans certaines pathologies humaines. Ils représentent ainsi des cibles thérapeutiques et diagnostiques potentielles. Cependant, les G4 adoptent in-vitro des topologies variées qui compliquent le développement de ligands spécifiques et affins. Dans ce contexte, le laboratoire a développé le concept du TASQ pour ‘‘Template Assembled Synthetic G-Quadruplex’’ dans le but d'accéder à des G4 se structurant en une topologie définie.Le premier chapitre décrit l’assemblage de mimes de motifs G4 contraints en une topologie unique. En utilisant un gabarit cyclodécapeptide rigide et différentes méthodes de conjugaison, nous avons assemblé des motifs G4 ARN parallèle et hybride ADN/ARN dérivant de la séquence télomérique ainsi qu’un motif G4 d’ADN présent dans la séquence promotrice du VIH-1. L’utilisation du concept TASQ nous a également permis de préparer un motif G-triplexe (G3), intermédiaire à la formation des motifs G4. Nous avons montré une forte stabilisation de tous les édifices G4 contraints ainsi préparés.Le second chapitre concerne les études de caractérisation et de sélection de ligands vis-à-vis des motifs G4 et G3 contraints. La caractérisation repose sur l’évaluation de l’affinité et de la sélectivité de différentes familles de ligands pour ces édifices, par résonance plasmonique de surface ou par interférométrie bio-couche. La sélection de ligands a été réalisée par la méthode SELEX dans le but d’obtenir des aptamères affins et spécifiques d’un motif G4 contraint. / Guanines or cytosines rich nucleic acids can fold into tetrameric G-quadruplexes (G4) or i-motifs structures. G4 motifs are found within the human genome and should contribute to cellular regulation. In particular G4 are found at telomeric region and also in promoters of oncogenes or within viral genomes. They are suspected of participating in the regulation of human pathologies and have therefore been envisioned as potential therapeutic and diagnostic targets. However, the intrinsic conformational polymorphism of G4 motifs complicates the development of specific and affine ligands. In this context, the laboratory has developed the TASQ concept for "Template Assembled Synthetic G-Quadruplex" with the aim to obtain a defined G4 topology.The first chapter reports on the assembly on the peptide template of RNA and DNA:RNA hybrid G4 structures that derive from the human telomeric sequence as well as of DNA G4 structure found within the HIV virus promoter. G-triplex (G3) motif which is supposed to be an intermediate during the formation of the G4 motifs has also been prepared. By using appropriate ligations of the oligonucleotide strands on the peptide template we were able to control the folding of G-quadruplex motifs and stabilize them.The second chapter reports the studies for the characterization and the selection of ligands against G4 and G3 motifs. The evaluation of the affinity and selectivity of different families of ligands for these constrain motifs was performed by using surface plasmon resonance or by bio-layer interferometry. The selection of ligands was carried out by the SELEX method in order to obtain affine and specific aptamers of a constrained G4 motif.

Les régions terminales (les télomères) des chromosomes de la plupart des organismes sont<br />essentielles au maintien de l'intégrité des chromosomes et sont impliquées dans la cancérogenèse et<br />le vieillissement cellulaire. Les télomères sont formés d'un brin riche en guanines et d'un brin<br />complémentaire riche en cytosines. In vitro, chaque brin s'organise en une structure repliée, le<br />quadruplexe de guanines pour l'un, le motif i pour l'autre, ce qui pose la question du rôle<br />biologique de ces structures. Plusieurs protéines s'associant au brin G et favorisant la formation de<br />quadruplexes de guanines sont connues. Deux protéines reconnaissant spécifiquement le brin C de<br />l'ADN télomérique humain viennent d'être identifiées (ASF/SF2 et hnRNP K).<br />Nous avons voulu contribuer à la compréhension des mécanismes de régulation des<br />télomères en recherchant une protéine se liant spécifiquement à une séquence d'ADN télomérique<br />riche en cytosines. Cette étude a été entreprise sur un organisme eucaryote, la levure<br />Saccharomyces cerevisiae.<br />Nous avons commencé par montrer que le fragment d'ADN télomérique de levure,<br />d[(CCCACA)3CCC], pouvait former un motif i in vitro. Nous avons observé par migration<br />électrophorétique non dénaturante, la formation d'un complexe ADN-protéine sur lequel nous<br />avons focalisé nos efforts. La masse moléculaire de cette protéine (~ 250 kDa) a été déterminée par<br />passage sur tamis moléculaire. L'association ADN-protéine a été observée pour une gamme de pH<br />allant de 6 à 8. Un duplexe d'ADN B d(CGCGATCGCG) ou une petite suite de cytosines d(CCC)<br />ne sont pas compétiteurs et le signal retardé est atténué de moitié pour un rapport monobrin<br />d(T14)/sonde de 4000. L'ADN d'E. coli, coupé en fragments de 10 à 1000 bases, est compétiteur<br />(50%) pour un rapport compétiteur/sonde égal à 1000. Mais toutes les séquences d'oligomères<br />testées formant in vitro un motif i monomérique (séquences comptant 4 répétitions de 2, 3, 4 ou 5<br />de désoxycytidines, dont des séquences télomériques ou centromériques naturelles), entrent en<br />compétition avec la séquence d[(CCCACA)3CCC], notamment dans des conditions (pH,<br />température, force ionique,..), où le motif i est observé in vitro.<br />Pour identifier les protéines impliquées dans l'association avec l'ADN télomérique, nous<br />avons utilisé des billes de streptavidine greffées ou non avec la séquence d'ADN. Nous avons<br />identifié les protéines liées à l'ADN par spectrométrie de masse MALDI-TOF et Q-TOF MS/MS. Il<br />s'agit de trois protéines Yhr216p, Ylr432p et Yml056p, dont les séquences sont très proches. Cette<br />identification a été confirmée par séquençage par dégradation d'Edman de peptides internes. Les<br />séquences de ces protéines sont similaires (~ 78 %) aux deux inosine 5'-monophosphate<br />déshydrogénases humaines (IMPDH 1 et 2 (masse de ~ 56 kDa)) connues pour leur implication<br />dans le métabolisme des purines. Celles-ci sont habituellement observées sous forme tétramérique<br />(masse > 200 kDa). Malgré la présence dans des extraits nucléaires humains HeLa d'une protéine<br />ayant des caractéristiques de migration natives identiques à celles observées chez la levure, et<br />différentes des protéines ASF/SF2 et hnRNP K déjà identifiées, nous avons montré que les<br />protéines IMPDH 1 et 2 purifiées ne sont pas capables de fixer seules l'ADN télomérique humain.<br />Nous montrons également que les protéines identifiées (Yhr216p, Ylr432p et Yml056p)<br />s'associent au brin complémentaire riche en G. Des migrations électrophorétiques en présence de<br />compétiteurs montrent que cette association est spécifique. A notre connaissance, il s'agit des<br />premières protéines de levures interagissant séparément avec chacun des deux brins télomériques<br />dans des conditions d'incubation où l'on observe la formation de quadruplexes de guanines et de<br />motif i.