Introdução: O diabetes mellitus (DM) é uma doença que apresenta elevada incidência e prevalência na população em diversas partes do mundo, e, estudos experimentais e clínicos, sugerem que o estresse oxidativo esteja envolvido na patogênese e na progressão da mesma. Objetivo: Este estudo tem como objetivo investigar os efeitos do antioxidante quercetina administrado intraperitonealmente sobre o estresse oxidativo, a ativação do fator de transcrição nuclear kappa B (NF-kB) e expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) hepática no modelo experimental de DM tipo I. Material e métodos: Foram utilizados 32 ratos machos Wistar, divididos em quatro grupos de oito animais: controle, controle que receberam a quercetina, diabéticos não tratados e diabéticos tratados com quercetina. A dose utilizada da quercetina foi de 50 mg/Kg de peso corporal diariamente. O DM foi induzido por única injeção intraperitoneal de estreptozotocina (70 mg/kg). Após oito semanas (60 dias), foi avaliado os marcadores do estresse oxidativo hepático através das substâncias que reagem ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), e a quimiluminescência (QL). A atividade hepática das enzimas antioxidantes catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx), bem como a ativação do NF-kB pelo método (Electrophoretic Mobility Shift Assay – EMSA) foram mensurados. Também foram avaliados a expressão das quinases dos inibidores do NF-kB (IKK-a e IKK-b), bem como os inibidores (IkB-a e IkB-b) e a iNOS hepática pela técnica do Wersten blot. Resultados: A concentração da glicose sangüínea aumentou significativamente nos animais diabéticos e não diminuiu após a administração da quercetina. No tecido hepático dos animais diabéticos aumentou o TBARS, a QL, a atividade da SOD e da CAT, e no grupo diabético que recebeu a quercetina os valores diminuíram. O DM aumentou a ativação do NF-kB, os níveis do IKK-a e da iNOS, e diminuiu o IkB-a. Todos os valores foram atenuados quando administrado a quercetina, somente a atividade da GPx, do IKK-b e IkB-b não apresentou diferença entre os grupos estudados. Conclusão: A quercetina inibiu o estresse oxidativo hepático, a ativação do NF-kB e a expressão da iNOS. O tratamento com o antioxidante quercetina parece inibir as vias sinalizadoras de transdução, podendo interferir na produção dos mediadores nóxios envolvidos no modelo experimental de DM. / Introduction: Diabetes mellitus (DM) is an disease that presents high incidence and prevalence in the population in diverse parts of the world, and, experimental studies and clinical, suggest that oxidative stress is involved in pathogenesis and progression of the same. Objective: This study it has as objective to investigate the effect of quercetin treatment on oxidative stress, the activation of the factor of nuclear transcription kappa B (NF-kB) and hepatic expression of inducible nitric oxide sintase (iNOS) in the experimental model of DM type I. Material and methods: Male rats Wistar had been used, divided in four groups with eight animals: control, control that had received quercetin, diabetic not treated and diabetic treated with quercetin. The used dose of quercetin was of 50 mg/Kg of corporal weight intraperitoneally (i.p.) daily. The DM was induced for i.p. injection of estreptozotocin (70 mg/kg). After eight weeks (60 days), it was evaluated the markers of oxidative stress hepatic through the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), and the chemiluminiscence (QL). The hepatic activity of antioxidants enzymes catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx), as well as the activation of the NF-kB for the method (Electrophoretic Mobility Shift Assay - EMSA) had been measured. Also they had been evaluated the expression of quinases of inhibitors of the NF-kB (IKK-a and IKK-b), as well as inhibitors (IkB-a and IkB-b) and iNOS for the Western blot. Results: Blood glucose concentration increased significantly in the diabetic animals and did not decreased after administration of quercetin. In hepatic tissue of diabetic animals increased the TBARS, the QL, the activity of the SOD and the CAT, and in the diabetic group that received the quercetin the values had diminished. The DM increased the activation of the NF-kB, the levels of the IKK-a and iNOS, and decreased the IkB-a. All the values had been attenuated when used the quercetin, only the activity of the GPx, the IKK-b and IkB-b did not present difference between the studied groups. Conclusion: The quercetin inhibited the hepatic oxidative stress, the activation of NF- kB and the expression of the iNOS. The treatment with the antioxidant quercetin seems to inhibit the signal transduction pathway, may block the production of noxios mediators involved in the experimental model of DM.

A atividade antiviral de compostos polifenólicos, especialmente flavonóides, tem sido extensivamente investigada. Neste contexto, diversos estudos têm como foco o efeito da quercetina (Q) e 3-O-metilquercetina (MQ) sobre o Vírus do Herpes Simplex (HSV) uma vez que eles são importantes patógenos humanos. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de nanoemulsões de uso tópico contendo os flavonóides Q e MQ. Primeiro, nanoemulsões compostas de octildodecanol, lecitina de gema de ovo (NE), brometo de cetil trimetilamônio – CTAB – (NEC), água e Q ou MQ foram preparadas através do procedimento de emulsificação espontânea. O procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões monodispersas (IP<0,2) com um diâmetro médio de gotícula de aproximadamente 200-300 nm, confirmado por microscopia eletrônica de transmissão. A viscosidade e a tensão superficial permanecem similares para as formulações NE e NEC, de aproximadamente 2 cP e 29 mN/m, respectivamente. O potencial zeta foi influenciado principalmente pela presença do tensoativo CTAB, sendo negativo para NE (-29 to -27 mV) e positivo para NEC (76 to 79 mV). Em uma segunda etapa, foi validado um método isocrático para a quantificação da Q e MQ por CLAE com detecção por UV em 368 e 354 nm. O método foi linear, preciso, exato e específico para a determinação da Q e MQ nas formulações. A quantidade dos flavonóides associada com as nanoemulsões foi de 100% (para 1 mg/mL). A reduzida solubilidade de Q e MQ no núcleo oleoso sugere a participação da lecitina na sua associação com as nanoemulsões. Em uma última etapa, foi realizado o estudo de permeação cutânea da Q e MQ a partir das formulações utilizando pele de orelha suína em células de difusão de Franz. Independente da formulação, foi demonstrado que a permeação da Q ou MQ é reduzida. Entretanto, existe um aumento significativo do fluxo de permeação dos flavonóides a partir das nanoemulsões NEC (~0,2 μg/cm2/h) comparado com NE (~0,08 μg/cm2/h), demonstrando o efeito da carga de superfície positiva da formulação NEC sobre este parâmetro. Os resultados também indicam o acúmulo de Q ou MQ na pele (maior que 250 μg/g) para ambas as formulações. Em conclusão, o conjunto dos resultados obtidos demonstra o efeito da composição das nanoemulsões sobre propriedades físico-químicas e perfil de permeação cutânea de Q e MQ a partir das nanoemulsões. / The antiviral activity of polyphenolic compounds, especially flavonoids, has been extensively investigated. In this context, several studies have been focused on the effect of quercetin (Q) and 3-O-methylquercetin (MQ) over Herpes Simplex Virus (HSV) since they are important human pathogens. The objective of the present work was the development of topical nanoemulsions containing the flavonoids Q and MQ. First, nanoemulsions composed by octyldodecanol, egg lecithin (NE), cetyl trimetylamonium bromide – CTAB – (NEC), water and either Q or MQ were prepared by spontaneous emulsification procedure. The procedure yielded monodisperse nanoemulsions (IP<0.2) with a typical mean droplet size of approximately 200-300 nm, confirmed for transmission electron microscopy. The viscosity and surface tension remained quite similar for both NE and NEC, approximately 2cP and 29mN/m, respectively. The ζ-potential was mainly influenced by the presence of the cationic surfactant CTAB, being negative for NE (-29 to -27mV) and positive for NEC (76 to 79mV). In the second step, it has been validated an isocratic method to quantify Q or MQ by HPLC with UV detection at 368 and 354nm. The method was linear, precise, accurate and specific for the determination of Q and MQ in formulations. The amount of flavonoids associated with nanoemulsions was close to 100 % (to 1mg/mL). The low solubility of Q and MQ in the oil core suggests the role of lecithin on their association with nanoemulsions. In a last step, the permeation of Q or MQ from formulations using ear pigskin mounted in Franz diffusion cells was performed. Whatever the formulation, it was shown that Q or MQ permeation rate was low. However, there was a significant increase of the flavonoids flow rate from NEC (~0.2μg/cm2/h) compared to NE (~0.08μg/cm2/h), showing the effect of the positively charged surface of NEC on this parameter. The results also indicate the accumulation of Q or MQ in the skin (higher than 230μg/g) for both formulations. In conclusion, the overall results show the effect of the nanoemulsion components on both physico-chemical properties of the nanoemulsions and Q or MQ skin permeation profile.

A ocorrência de lesão hepática induzida por drogas representa um problema de saúde crescente e um desafio para os médicos, órgãos reguladores e a indústria farmacêutica, não só devido à sua potencial gravidade, mas também porque muitas vezes é diagnosticada de forma imprecisa, e outras vezes não são declaradas. Estudos sobre o metabolismo de drogas, juntamente com avaliações patológicas e histológicas, fornecem conjuntos de dados importantes para ajudar a compreender mecanismos subjacentes à hepatotoxicidade da droga. Neste estudo avaliamos a participação das espécies reativas de oxigênio (EROs) e do estresse oxidativo, bem como o envolvimento da sinalização intracelular relacionada ao processo de apoptose, através da ativação de membros da família Bcl-2 (Bcl-2 e Bax) e da família das MAPKs (p-ERK1/2), na hepatotoxicidade induzida por tioacetamida (TAA). Ratos machos Wistar foram divididos em 4 grupos experimentais: CO (controle); CO + Q (controle + quercetina); TAA (tioacetamida) e TAA + Q (tioacetamida + quercetina). Nos grupos que receberam TAA, administrou-se duas doses de 350 mg/Kg de TAA em ratos, em intervalo de 8 horas e, 2 horas após a segunda dose, iniciou-se o tratamento com quercetina (50 mg/Kg). Os grupos tratados com quercetina receberam o flavonóide intraperitonealmente por 4 dias, quando os animais foram mortos para análises de enzimas séricas (AST e ALT) e análises morfológicas, bioquímicas e moleculares de amostras de fígado. Os grupos que receberam TAA mostraram um aumento significativo nas aminotransferases séricas acompanhado de alterações morfológicas, com presença de necrose perivenular em absorção, infiltrado inflamatório com linfócitos e macrófagos e eventuais células gigantes multinucleadas. Além disso, estes animais apresentaram aumento da lipoperoxidação e dos metabólitos de óxido nítrico (nitritos e nitratos) no fígado, com alterações na atividade das enzimas antioxidantes e na expressão das enzimas na apoptose das células hepáticas, Bax, Bcl-2 e pERK1/2. O tratamento com quercetina por 4 dias mostrou níveis séricos significativamente reduzidos de AST e ALT, e as alterações morfológicas foram amplamente prevenidas. A administração de quercetina mostrou também uma redução da lipoperoxidação hepática, bem como dos níveis de metabólitos de óxido nítrico. Também observou-se retorno no equilíbrio das defesas antioxidantes e aumento das enzimas antiapoptóticas em relação às pró-apoptóticas. Os resultados obtidos sugerem efeito protetor da quercetina em ratos com lesão hepática induzida por TAA. / Drug-induced liver injury is an increasing health problem and a challenge for physicians, regulatory bodies and the pharmaceutical industry, not only because of its potential severity and elusive pathogenesis but also because it is often inaccurately diagnosed, commonly missed entirely and more often not reported. Drug metabolism studies, together with pathologic and histologic evaluation, provide critical data sets to help understand mechanisms underlying drug-related hepatotoxicity. We evaluated the involvement of reactive oxygen species (ROS) and oxidative stress, as well as the intracellular apoptosis via activation of the Bcl-2 (Bcl-2 and Bax) and MAPK (p-ERK 1/2) signaling pathway on the thioacetamide (TAA)-induced hepatotoxicity. Male Wistar rats were divided into four groups: CO (control), CO + Q (control + quercetin), TAA (thioacetamide) and TAA + Q (thioacetamide + quercetin). TAA group was administered intraperitoneally (i.p.) two doses of TAA (350 mg / kg) in the range of 8 hours, while TAA + Q group was administered i.p. quercetin (50 mg / kg), 2h after administration of thioacetamide (50 mg / kg). This group received flavonoid quercetin during 4 days, when animals were killed for analysis of serum enzymes (AST and ALT) and morphological, biochemical and molecular study of liver samples. The group receiving TAA showed a significant increase in serum aminotransferases accompanied by morphological changes, with extensive necrosis and inflammatory infiltration, mainly in the centrilobular region and portal tract. Moreover, these animals showed increased lipid peroxidation and nitric oxide metabolites (nitrites and nitrates) in the liver and changes in antioxidant enzyme activity, as wel as expression of apoptotic enzymes in the liver cells (Bax, Bcl-2 and pERK1 / 2). After 4 days treatment with quercetin, rats showed significantly reduced AST and ALT serum levels, with the morphological changes largely prevented. The administration of quercetin also showed a reduction of lipid peroxidation and in the levels of nitric oxide metabolites. It was observed a balance between antioxidant defense systems and production of ROS and increased ratio of anti- versus pro-apoptotic enzymes. The results suggest a protective effect of quercetin in rats with TAA-induced liver disease.

Introdução: A Esteato-Hepatite Não-Alcoólica (EHNA) é uma doença com alta incidência, difícil diagnóstico e tratamentos ainda não efetivos, o que impulsiona a utilização de modelos experimentais para indução da EHNA e o estudo das rotas de desenvolvimento desta doença, bem como tentativas de tratamento. Objetivo: Tem-se como objetivo desenvolver um modelo experimental de EHNA a partir do uso de uma dieta deficiente de metionina e colina (MCD) fabricada no Brasil, avaliar as alterações hepáticas, o estresse oxidativo, os danos ao DNA e os parâmetros moleculares de inflamação e fibrose decorrentes da doença, bem como avaliar a modulação resultante da suplementação do flavonóide antioxidante quercetina (Q). Métodos: Foram utilizados camundongos machos da linhagem C57BL/6 com 8 semanas. No primeiro experimento, que visou estabelecer o modelo experimental de EHNA, os animais foram divididos em dois grupos (n=15), onde um grupo foi alimentado com dieta MCD e o outro com dieta controle no período de duas semanas. No segundo experimento, utilizaram-se quatro grupos (n = 16): (i) controle + veículo (ração controle com carboximetilcelulose sódica a 1%, usada como veículo, CO + V), (ii) ração controle mais Q 50 mg / kg administrada intragastricamente (CO + Q), (iii) dieta MCD mais veículo (EHNA + V), e (iv) dieta MCD mais Q (EHNA + Q). As dietas foram administradas por 4 semanas e avaliou-se as alterações bioquímicas hepáticas, a repercussão histopatológica e imuno-histoquímica, a lipoperoxidação e as enzimas antioxidantes, os danos causado ao DNA por ensaio cometa, bem como, os parâmetros moleculares de inflamação e fibrose através da avaliação de mRNA de TNF-α, HMGB-1, COX-2, CTGF, TGF-β, MMP-9 e AREG por RT-PCR, e a expressão proteíca de TLR-4, JNK e pJNK por Western blotting, avaliando-se o efeito da suplementação do flavonóide antioxidante Q. Resultados: Os camundongos que receberam a dieta MCD apresentaram perda de peso e aumento significativo das enzimas de integridade hepática e diminuição dos níveis bioquímicos sistêmicos de glicemia, triglicerídeos, colesterol total, HDL e VLDL. Todos os animais EHNA mostraram, pelo menos, algum grau de esteatose macrovesicular. O diagnóstico de EHNA foi realizado em 100% dos camundongos que receberam a dieta MCD e nenhum dos animais que recebeu dieta controle apresentou alterações histológicas. Os animais EHNA apresentaram aumento de lipoperoxidação e do antioxidante glutationa (GSH). O ensaio cometa revelou um aumento significativo nos danos de DNA no fígado do grupo EHNA + V em comparação com CO + V. O grupo EHNA + Q mostrou danos ao DNA significativamente menores do que EHNA + V e uma significativa diminuição do processo inflamatório através da avaliação da expressão de: TNF-α, HMGB1, TLR-4, a COX-2 e JNK e na fibrose pela expressão de CTGF, TGF-β, MMP-9 e AREG no fígado. Conclusão: A dieta deficiente de metionina e colina induziu no fígado de camundongos C57BL/6 características histopatológicas semelhantes à esteatose e à esteato-hepatite de humanos. A suplementação com o flavonoide antioxidante quercetina (50 mg / kg) reduziu os níveis de lipoperoxidação, os danos ao DNA no fígado, os níveis enzimáticos hepáticos, bem como os níveis dos parâmetros moleculares inflamatórios e de fibrose estudados, sugerindo proteção hepática neste modelo. / Introduction: Non-alcoholic steatohepatitis is a disease with a high incidence, difficult diagnosis, and yet no effective treatment. This reasons lead to the use of experimental models for induction of NASH, and the study of routes developing this disease, as well as attempts to a effective therapy. Aims: This study was designed to develop an experimental model of non-alcoholic steatohepatitis based on a methionine- and choline-deficient diet which is manufactured in Brazil. Furthermore, evaluate the liver alterations, oxidative stress parameters, lipoperoxidation, DNA damage, and the molecular parameters of inflammatory and fibrosis, as well as the response to the antioxidant flavonoid quercetin (Q). Methods: Male C57BL/6 mice were used with 8 weeks of age. In the first experiment, which aimed to establish an experimental model of NASH, the animals were divided into two groups (n = 15), the experimental group fed with a methionine- and choline-deficient diet manufactured by Brazilian company PragSoluções®, and the control group fed with a normal diet, for a period of 2 weeks. In the second experiment, we used four groups (n = 16): (i) Control plus Vehicle (control ration plus carboxymethylcellulose 1% used as vehicle, CO + V); (ii) Control ration plus Q 50 mg/kg (CO + Q); (iii) MCD diet plus vehicle (NASH + V); and (iv) MCD diet plus Q (NASH + Q). Diets were administered for 4 weeks, which aimed to evaluate the hepatic biochemical changes, the histopathological impact and immunohistochemical analysis, lipid peroxidation and antioxidant enzymes, the damage caused to DNA, and the molecular parameters of inflammation and fibrosis by assessment of mRNA of TNF-α, HMGB-1, COX-2, CTGF, TGF-β, MMP-9 and AREG by RT-PCR Protein expression and TLR-4, pJNK and JNK by Western blotting to assess the effects of supplementation of the antioxidant flavonoid Q. Results: The mice that received the methionine- and choline-deficient diet showed weight loss and significant increase in hepatic damage enzymes, as well as a decrease on systemic levels of glycemia, triglycerides, total cholesterol, HDL and VLDL. The diagnosis of non-alcoholic steatohepatitis was performed in 100% of the mice that were fed the methionine- and choline-deficient diet. All non-alcoholic steatohepatitis animals showed some degree of macrovesicular steatosis, ballooning, and inflammatory process. None of the animals which were fed with the control diet presented histological alterations. All non-alcoholic steatohepatitis animals showed significantly increased lipoperoxidation and antioxidant GSH activity. The comet assay revealed a significant increase in DNA damage in the NASH + V group, in comparison to CO + V. The NASH + Q group showed significantly lower DNA damage than NASH + V. The NASH+Q group showed a significant reduction of inflammation based on the expression of TNF-α, HMGB1, TLR-4, COX-2 and JNK and a reduction in fibrosis based on the expression of CTGF, TGF-β, MMP-9 and AREG in the liver. Conclusion: The low cost and easily accessible methionine- and choline-deficient diet explored in this study is highly effective in inducing steatosis and steatohepatitis in animal model, leading to alterations that are similar to those observed in human livers. The results demonstrate that an antioxidant supplementation of Q 50 mg / kg reduced the levels of lipid peroxidation, DNA damage, liver enzymes, as well as the levels of inflammation and fibrosis in the liver, suggesting protective effects of the liver in this model.

O mercúrio (Hg) é um dos metais mais tóxicos presente no meio ambiente e o principal mecanismo relacionado à sua toxicidade é a indução do estresse oxidativo; sua forma orgânica, metilmercúrio (MeHg) é a que apresenta maior toxicidade. A exposição ao Hg ocorre principalmente através da inalação por trabalhadores ocupacionalmente expostos em diversas indústrias e/ou através do consumo de peixes e outros alimentos aquáticos contendo este metal, como por exemplo, populações amazônicas que estão expostas ao MeHg, via dieta, através do consumo de peixes contaminados. Por outro lado, é pressuposto que alimentos ricos em antioxidantes possam prevenir os efeitos adversos à saúde causados pela exposição ao Hg. O flavonóide quercetina (QC) é o principal polifenol da dieta humana, encontrado principalmente em cebola e frutas cítricas e os carotenóides bixina (BIX) e norbixina (NOR) estão presentes em grandes quantidades no urucum, o qual é amplamente utilizado como condimento no Brasil. Assim sendo, o presente trabalho teve por objetivo avaliar os possíveis efeitos protetores do flavonóide QC e dos carotenóides BIX e NOR contra os diversos efeitos adversos causados pelo cloreto de mercúrio (HgCl2) e MeHg, em modelos experimentais in vitro e in vivo. Para tal, culturas de células de hepatoma humano (HepG2) e ratos machos Wistar foram expostos a diversas concentrações do metal, dos fitoquímicos bem como à suas associações. Determinações das concentrações de glutationa, malondialdeído, proteínas carboniladas, atividades das enzimas antioxidantes catalase e glutationa-peroxidase os quais refletem o estado redox das células e monitoramento do dano no material genético pelo uso do ensaio do cometa e determinações dos níveis de 8-hidroxi-2-deoxiguanosina foram realizados no presente estudo. Os resultados obtidos indicam que o Hg causa claros efeitos genotóxicos e leva a uma serie de alterações de parâmetros bioquímicos relacionados ao estado redox das células, in vitro e in vivo. Além disso, foi evidenciado que fitoquímicos, os quais são comumente encontrados na dieta de seres humanos, denominados QC, BIX e NOR protegem contra a instabilidade genética causada pelo metal e restabelece os distúrbios do estado redox das células causados pela exposição ao Hg. / Mercury (Hg) is one of the most hazardous metals in the environment and the major process responsible for its toxicity is oxidative damage; its organic form methylmercury (MeHg) presents the highest toxicity. The main way of exposition to Hg is through inhalation by workers occupationally exposed in several industries and/or through consumption of fishes and other aquatic food with the metal, as Amazonian populations which are exposed to MeHg, via diet, by consumption of contaminated fishes. On the other hand, it is conceivable that antioxidants may play a protective role in the prevention of adverse effects of Hg. The flavonoid quercetin (QC) is the most abundant polyphenol of the human diet, found mainly in onions and citric fuits and the carotenoids bixin (BIX) and norbixin (NOR) are present in high concentrations in annatto, which is widely used as flavoring in Brazil. Therefore, the present study aims to evaluate the possible protective effects of the flavonoid QC and of the carotenoids BIX and NOR against the adverse effects caused by mercury chloride (HgCl2) and MeHg, in experimental models in vitro and in vivo. For this, human hepatoma cells (HepG2) cultures and male rats Wistar were exposed to several concentrations of the metal, of the phytochemicals as well as their associations. Determination of concentrations of glutathione, malondialdehyde, carbonil proteins, activity of the antioxidant enzymes catalase and glutathione-peroxidase, which reflect the redox status of the cells and monitoring of DNA-damage by use of comet assay and measurements of 8-hydroxi-2-deoxyguanosine levels were carried out in the present study. The results indicate that Hg cause clear genotoxic effects and lead to several alterations of biochemical parameters related to redox status of the cells, in vitro and in vivo. Moreover, it was observed that pythochemicals commonly found in the human diet, namely QC, BIX and NOR counteract the genetic instability induced by the metal and restore the disturbances of redox status of the cells caused by Hg exposition.

A exposição à radiação ultravioleta (RUV) pode provocar desequilíbrio no balanço oxidante/antioxidante da pele, causando prejuízos à sua integridade e levando a diversas alterações, entre as quais o envelhecimento precoce e o câncer de pele. Considerando a estreita relação entre o aumento do estresse oxidativo e os efeitos danosos causados pela RUV na pele, aliado ao fato de que estudos epidemiológicos demonstram que o uso de protetores ou bloqueadores solares não é completamente efetivo na prevenção dos diversos malefícios causados pela exposição à RUV, o uso de antioxidantes aparece como importante alternativa nas terapias de fotoproteção. A administração tópica de antioxidantes, como a quercetina, poderia afetar as alterações moleculares desencadeadas pela RUV e conseqüentemente as seqüelas biológicas e clínicas resultantes das mesmas. Desta forma, na presente pesquisa, sistema microemulsionado para a liberação cutânea de quercetina foi obtido, caracterizado e avaliado quanto a sua capacidade em promover maior penetração cutânea deste ativo, estabilidade, segurança e eficácia in vivo contra os danos na pele causados pela exposição à RUV. Além disso, o efeito da quercetina contra diferentes alterações moleculares induzidas pela RUV foi também avaliado, com o objetivo de investigar os possíveis mecanismos de ação fotoprotetora deste flavonóide. Os resultados demonstram que a incorporação da quercetina em sistema microemulsionado aumentou a penetração cutânea in vitro e in vivo deste flavonóide sem causar irritação, sendo, portanto, uma importante estratégia para melhorar a liberação tópica da quercetina. O estudo de estabilidade demonstra a necessidade de armazenamento deste sistema a 4°C para manutenção de sua funcionalidade. A microemulsão contendo quercetina inibiu a depleção do antioxidante endógeno GSH, assim como o aumento da atividade/secreção de proteinases e da atividade da MPO, induzidos pela exposição à RUVB. O pré-tratamento de queratinócitos com quercetina não alterou a indução pela RUV das MAP quinases, conseqüentemente não houve inibição na elevação dos níveis de c-Jun e c-Fos, assim como no aumento da produção das MMPs 1 e 3, mas por outro lado foi efetivo contra o aumento na produção das citocinas IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-. Finalmente, demonstrou-se que a ação fotoprotetora da quercetina contra os danos na pele causados pela RUV é mediada principalmente pela inibição da via de sinalização do NF-kB, uma vez que, enquanto o pré-tratamento de queratinócitos com quercetina diminuiu a ativação deste fator de transcrição, nenhum efeito contra a indução da via de sinalização da AP-1 foi observado. Concluindo, este trabalho sugere a incorporação da quercetina em sistema microemulsionado como estratégia relevante no combate ao aparecimento de desordens cutâneas causadas pela exposição à RUV, além de contribuir para a elucidação, pelo menos em parte, do mecanismo de ação fotoprotetora da quercetina contra alterações moleculares induzidas pela RUV. / The ultraviolet radiation (UVR) exposition may lead to the skin oxidant/antioxidant imbalance injuring its integrity and leading to several disorders, such as ageing and skin cancer. Considering the close relationship between the increase in oxidative stress and UV-induced skin damages, together with the fact that epidemiological studies indicate that the use of sunscreen and sun block are not completely effective in preventing UV-induced damages, the use of antioxidants arises as an important approach to photoprotection therapies. The topical use of antioxidants, such as quercetin, would affect the molecular changes induced by UV and subsequent biological and clinical sequela. Therefore, in the present study, microemulsion system for topical delivery of quercetin was obtained, characterized and evaluated with regards to its capability to increase skin penetration of quercetin, stability, toxicity and in vivo effectiveness against UV-induced skin damages. Moreover, quercetin effect against different UV-induced molecular changes was also assessed, in order to investigate the possible photoprotective mechanisms of action of this flavonoid. The results demonstrate that the incorporation of quercetin into microemulsion increased the in vitro and in vivo skin penetration of this flavonoid without causing skin irritation, being an important strategy to improve the topical delivery of quercetin. The stability study demonstrate the necessity to storage this system at 4°C to maintain its functionality. The microemulsion containing quercetin inhibited the depletion of the endogenous antioxidant GSH, as well as the increase in proteinases activity/secretion and MPO activity induced by UVB irradiation exposure. The pretreatment of keratinocytes with quercetin had no blocking effect on UV activation of MAP kinases, consequently, there was no inhibition in the c-Jun and c-Fos levels, as well as in the induction of MMPs 1 and 3, on the other hand, it was effective against the increase in the production of cytokines IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-. Finally, it was demonstrated that the photoprotective action of quercetin against UV-induced skin damages is mediated mainly by suppression of NF-kB signaling pathway, once, while the pretreatment of keratinocytes with quercetin suppressed the activation of this transcription factor, no effect was observed against UV-induced AP-1 activation. In conclusion, the present study suggests the incorporation of quercetin into microemulsion system as a relevant strategy to prevent UV-induced skin disorders, and contribute, at least in part, to the elucidation of quercetin photoprotective mechanism of action against UV-induced molecular changes.

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T00:22:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maso_Victor_D.pdf: 2835269 bytes, checksum: f3165794df6b39b4fa01215914687cc9 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Síndromes mielodisplásicas (SMD) abrangem um espectro de doenças hematológicas caracterizadas por hematopoese ineficaz e risco de evolução para leucemia mielóide aguda (LMA). As leucemias agudas apresentam altas taxas de mortalidade devido, principalmente, à sua capacidade de resistir a diversos tipos de quimioterápicos, sendo necessário buscar novos compostos capazes de interferirem no crescimento tumoral. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos da quercetina in vitro e in vivo, na linhagem celular P39/Tsugane, a qual foi estabelecida a partir de células leucêmicas do sangue periférico de paciente que possuía síndrome mielodisplásica, como modelo. O desenho experimental compreendeu o tratamento in vitro e in vivo com quercetina das células leucêmicas, verificando-se vias de apoptose, ciclo celular e autofagia. O modelo xenográfico de tumor de células leucêmicas subcutâneo foi utilzado para os ensaios in vivo. A quercetina induziu pronunciada apoptose das células leucêmicas P39, seguida por supressão da expressão de BcL-2, BclxL, Mcl-1, aumento da expressão de Bax e modulação do potencial de membrana mitocondrial com liberação de citocromo c e ativação de caspases. O tratamento com quercetina resultou em retenção das células na fase G1 do ciclo celular, com pronunciada diminuição das proteínas CDK2, CDK6, ciclina D, ciclina E e ciclina A, diminuição na fosforilação de Rb e aumento na expressão de p21 e p27. Quercetina induziu a formação do autofagossomo nas células P39, com ativação de PI3K classe III, Beclina 1, Atg5-Atg12, Atg7, conversão de LC3-I em LC3-II e desfosforilação de Akt e mTOR. A inibição da autofagia induzida por cloroquina juntamente com quercetina viii desencadeou aumento na apoptose, mas não alterou a modulação da fase G1 do ciclo celular induzida por quercetina. As células P39 tratadas com a combinação de quercetina e inibidores seletivos de ERK1/2 e/ou JNK (PD184352 e SP600125, respectivamente) apresentaram diminuição na retenção em fase G1 do ciclo, Este tratamento combinado, entretanto, não alterou a percentagem de células apoptóticas. Além disso, administração in vivo de quercetina reduziu significativamente o volume tumoral em camundongos inoculados com células P39 e confimar os resultados in vitro relacionados com apoptose, autofagia e ciclo celular. Assim, quercetina demonstra uma potente atividade antileucêmica através de sinalizações que causam parada do ciclo celular, apoptose e indução da autofagia. Esta última, por sua vez, parece proteger as células do alto grau de apoptose / Abstract: This study proposes to investigate quercetin antitumor efficacy in vitro and in vivo, using P39 cell line as a model. The experimental design comprised leukemic cells or xenografts of P39 cells, treated in vitro or in vivo, respectively, with quercetin; apoptosis, cell cycle and autophagy activation were then evaluated. Quercetin caused pronounced apoptosis in P39 leukemia cells, followed by Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 downregulation, Bax upregulation and mitochondrial translocation, triggering cytochrome c release and caspases activation. Quercetin also induced the expression of FasL protein. Furthermore, our results demonstrated an antioxidant activity of quercetin. Quercetin treatment resulted in an increased cell-arrest in G1 phase of the cell cycle, with pronounced decrease in CDK2, CDK6, cyclin D, cyclin E and cyclin A proteins, decreased Rb phosphorylation and increased p21 and p27 expression. Quercetin induced autophagosome formation in P39 cell line, with upregulation of PI3K class III proteins, Beclin-1, Atg5-Atg12, Atg7, conversion of LC3-I to LC3-II, and dephosphorylation of Akt and mTOR. Autophagy inhibition induced by quercetin with chloroquine triggered apoptosis but did not alter quercetin modulation in the G1 phase. P39 cell treatment with a combination of quercetin and selective inhibitors of ERK1/2 and/or JNK (PD184352 or SP600125 respectively), significantly decreased cells in G1 phase, this treatment however did not change the apoptotic cell number. Furthermore, in vivo administration of quercetin significantly reduced tumor volume in P39 xenografts and confirmed in vitro results regarding apoptosis, autophagy and cell cycle arrest / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

A deterioração oxidativa de alimentos é o fator determinante na qualidade sensorial e nutricional do produto, podendo ocorrer em alimentos complexos tanto na fase contínua como na fase dispersa. Em geral, a formação de radicais e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio é o evento primário que ocorre priori ao progresso da oxidação de componentes e estruturas sensíveis e está comumente associado a eventos na fase aquosa. A oxidação de lipídeos é frequentemente investigada em alimentos e em meio biológico separadamente dos eventos no meio aquoso e a proteção antioxidante somente avaliada na fase dispersa. Entretanto, a oxidação de proteínas e eventos na fase contínua vêm despertando considerável interesse e aparentemente antioxidantes eficientes na fase dispersa não protegem de forma eficaz as proteínas e os componentes na fase contínua. Um futuro progresso na proteção antioxidante de alimentos e sistemas biológicos origina de uma abordagem holística dos processos redox envolvidos em ambas as fases dispersa e contínua, bem como o uso combinado de espécies antioxidantes e antiredutoras para um superior efeito antiradical global. Neste sentido, foram preparados três novos compostos antiradicais de dupla função (antioxidante e antiredutor) com adequado balanço hidrofílico-lipofílico e aprimorada propriedade antiradical global. Os antiradicais diferulato de astaxantina, retinoato de quercetina e retinoato de epicatequina se mostraram melhores antioxidantes e antiredutores do que seus precursores isoladamente ou em misturas, apresentando superior eficiência na desativação do oxigênio singlete excitado, captação do radical 1-hidroxietila, menor efeito pró-oxidante em sistemas de oxidação catalisados por íons de ferro, e eficiência na redução do reativo estado triplete da safranina (E1/2 = 1,48 V vs. NHE). / The oxidative deterioration of foods is the determining factor in the sensory and nutritional quality of the product, which may occur in complex food both at the continuous and the dispersed phases. In general, the formation of radicals and reactive oxygen and nitrogen species is the primary event that occurs prior to the progress of oxidation of components and sensitive structures and is commonly associated with events in the aqueous phase. The oxidation of lipids is often investigated in food and biological media separately from the events in the aqueous phase and the measurement of the antioxidant protection is only evaluated in the dispersed phase. However, the oxidation of proteins and the events in the continuous phase have attracted considerable interest and apparently, efficient antioxidants in dispersed phase do not effectively protect proteins and components in the continuous phase. A further progress in the antioxidant protection of food and biological systems arise from a holistic approach of the redox processes involved in both the dispersed and continuous phases as well as the combined use of antioxidant and antireductant species for a superior overall antiradical effect. In this sense three new antiradical compounds with dual function (antioxidant and antireductant) were prepared with proper hydrophilic-lipophilic balance and global antiradical properties. The antiradicals astaxanthin diferulate, epicatechin retinoate, and quercetin retinoate are shown to be better antioxidant and antireductant than their precursors, isolated or in mixture, exhibiting enhanced singlet excited oxygen deactivation, 1-hydroxyethyl radical scavenging, lower pro-oxidative effect in the oxidative system catalysed by iron ions and an efficient reduction of the reactive triplet state of safranine (E1 / 2 = 1.48 V vs. NHE).

A quercetina é um flavonoide com alta atividade antioxidante reconhecida. Devido a este fato, a indústria alimentícia tem buscado alternativas para a aplicação deste bioativo como antioxidante em matrizes alimentícias. No entanto, incorporar a quercetina em formulações alimentícias pode ser desafiador, pois sua molécula tem relativo grau de hidrofobicidade. Os métodos de encapsulação em nanoemulsões podem tornar viável a proteção do flavonoide, bem como permitir sua dispersibilidade em meios aquosos . O objetivo do presente trabalho foi produzir nanoemulsões (fase oleosa: óleo de girassol) encapsulando quercetina pelo método do ponto de inversão da emulsão (EIP, emulsion inversion point), determinando parâmetros de operação que viabilizem um futuro escalonamento do processo, e a realização de um estudo de caso sobre a incorporação das nanodispersões em patê de frango. Os parâmetros de produção que foram avaliados foram : tipo e concentração de tensoativo (razão SOR, razão tensoativo:óleo), concentração de óleo, concentração de cosolvente e velocidade de agitação. Foram produzidas nanoemulsões utilizando dois tensoativos diferentes, Tween 80 e Brij 30. As porcentagens de quercetina encapsulada foram 0,15 e 0,30% (m/m). Dentre estas, a concentração de 0,30% foi a mais viável para a aplicação no patê de frango, por apresentar melhor distribuição de tamanho de gotícula (diâmetro hidrodinâmico), não apresentar variação significativa de oxidação lipídica e maior conservação da quercetina encapsulada por um período de 90 dias. Os valores de tensão interfacial obtidos mostram que a quercetina provoca abaixamento da tensão interfacial do sistema, o que pode indicar que a quercetina forma um complexo com os tensoativos utilizados, fato que influencia decisivamente na sua localização nas nanogotas. Das formulações testadas para patê de frango contendo quercetina, apenas a formulação usando quercetina livre não apresentou boa avaliação nos itens cor e sabor. Tal resultado justifica a necessidade da incorporação da quercetina em nanoemulsões para não causar alterações sensoriais no produto. / Quercetin is a flavonoid with recognized high antioxidant activity Due to this fact, the food industry has been trying to use it as an alternative as a preservative in food matrices. However, incorporating quercetin into food formulations may be challenging due to its relative degree of hydrophobicity. Encapsulation methods in nanoemulsions may render the protection of the flavonoid viable, as well as enable its dispersibility in aqueous media. The objective of the present study was to produce nanoemulsions (oil phase: sunflower oil) encapsulating quercetin by the emulsion inversion point method (EIP), determining operating parameters that enable a future process scale-up. A case study on the incorporation of nanodispersions into chicken patê was also carried out. The production parameters evaluated were: type and concentration of surfactant (SOR ratio, surfactant:oil ratio), soybean oil concentration, cosolvent concentration and stirring speed. Nanoemulsions were produced using two different surfactants, Tween 80 and Brij 30. The percentages of encapsulated quercetin were 0.15 and 0.30% (m / m). Among these, the concentration of 0.30% was the most feasible for application in chicken pâté, since it presented better droplet size distribution (hydrodynamic diameter), did not present significant variation of lipid oxidation and higher capacity of preserving encapsulated quercetina for a period of 90 days. The interfacial tension values obtained show that quercetin lowered the interfacial tension of the system, which may indicate that quercetin forms a complex with the surfactants used, a fact that decisively influences its location in the nanodroplets. Among the formulations tested in chicken pâté containing quercetin, only the formulation using free quercetin did not show good acceptance evaluation on the color and taste itens. Such an evaluation was important as it justifies the need for the incorporation of quercetin into nanoemulsions in order to not cause significant sensorial changes in the product.

Câncer de bexiga (CB) é a segunda doença mais prevalente do trato urinário. Atualmente as principais terapias para o CB apresentam baixa eficácia, altas taxas de recorrência e vários efeitos adversos. Assim, avalia-se o potencial de novas moléculas para a terapia do CB. Quercetina (QT) é um flavonóide com propriedades inibidora da proliferação celular e apoptótica que são interessantes para o tratamento do câncer, porém é um composto instável e fotossensível, o que inviabiliza sua administração na forma livre. Desta forma, o encapsulamento da QT em carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) funcionalizados com folato (CLN-F) pode ser um sistema efetivo de entrega de QT em células de CB que poderá superar os desafios da terapia intravesical do CB. O encapsulamento da QT pode aumentar a estabilidade da QT, sua permeação pelo urotélio, internalização em células tumorais, seu tempo de residência na bexiga e sua eficácia farmacológica. Os objetivos deste trabalho foram preparar, caracterizar e avaliar a citotoxicidade de QT livre e encapsulada em CLN e CLN-F em células de CB. O CLN e CLN-F foram preparados pelo método de emulsão e sonicação. A funcionalização do CLN foi realizada pela reação do estabilizante Pluronic F68 com folato (PF68F). Esta funcionalização foi avaliada por espectroscopia de ressonância magnética Nuclear (RMN) unidimensional de 1H. Os CLNs foram caracterizados quanto ao diâmetro, índice de polidispersão (PdI), potencial zeta (PZ), cristalinidade, eficiência de encapsulamento (EE) e morfologia. Além disso, foi avaliado o perfil de liberação da QT, a atividade antioxidante e a citotoxicidade da QT livre e encapsulada. A funcionalização foi confirmada pelos espectros de RMN que apresentaram sinais atribuídos ao PF68 e ao folato. O diâmetro, PdI e o PZ dos CLN foram 176,5 nm, 0,124 e -11,4 mV, respectivamente. O CLN-F apresentou 197,9 nm de diâmetro, 0,160 de PdI e -17,5mV de PZ. O encapsulamento da QT não alterou significativamente estes parâmetros para ambas as partículas. Obteve-se uma alta eficiência de encapsulamento da QT, para os dois carreadores (~98%), devido, provavelmente, ao baixo valor de índice de recristalização (~28) dos CLNs. Os CLN apresentam forma esférica, estabilidade por 330 dias e um perfil de liberação sustentada da QT. O IC50 do CLN-F-QT (83,4 ?g/mL) foi menor que o IC50 do CLN-QT (94,9 ?g/mL) provavelmente devido ao aumento da internalização causada pela funcionalização das partículas com folato. Os CLN-QT e CLN-F-QT apresentaram alta atividade antioxidante. Os resultados obtidos sugerem que o CLN-F-Q é um sistema com potencial para a futura terapia do CB, pois apresenta tamanho menor que 200 nm, baixo PdI, alta estabilidade, EE e atividade antioxidante, liberação sustentada além de ser citotóxico para as células RT4. / Bladder cancer (BC) is the second most prevalent tumor of urinary tract. Currently the main BC therapies have low effectiveness, high recurrence rate and several adverse effects. Thus, new molecule have been investigate to CB therapy. Quercetin (QT) is a flavonoid with interesting properties for cancer therapy such as inhibition of cancer cell proliferation and apoptosis. However, QT is an unstable and photosensitive compound. Therefore, QT encapsulated in nanostructure lipid carriers (NLC) functionalized with folate (F-NLC) might be an alternative targeting system of QT for tumor cell and can be strategy to overcome intravesical CB therapy challenges. The QT encapsulation can improve QT stability, increase its permeation in the urothelium and uptake in tumor cells, increase retention time in the bladder and enhancing its pharmacological efficacy. Aims of this study were preparation, characterization of NLC-QT and F-NLC-QT and cytotoxic evaluation of these particles in BC cells. NLC and F-NLC were prepared by ultrasonication method. NLC were funcionalized by conjugated between surfactant Pluronic and folate (PL68F). This conjugation was characterized by proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR). The particles were characterized regarding to size, polydispersity index (PdI), zeta potential (ZP), crystallinity, encapsulation efficiency (EE) and morphology. Furthermore, stability, release profile, cytotoxicity and antioxidant activity of QT encapsulated or not in NLC, were evaluated. RMN spectrums confirmed the PF68 functionalization, exhibiting peaks attributed to PF68 and folate. Size, PdI and ZP of NCL were respectively 176.5 nm, 0.124 and -11.4, whereas F-NLC showed 197.9 nm of size, 0.160 of PdI and ZP of -17.5mV. The QT encapsulation did not affect these physical parameters. Low values of crystalization index (~28) might promote high EE of quercetin (~98%). NLC shows spherical shape, sustained release profile of QT and were stable for 330 days. IC50 of NLC-QT (87.4 ?g/mL) was smaller thanthe IC50 of F-NLC-QT (94.9 ?g/mL). This difference might be explained by the increase of NLC uptake by endocytosis mediated by folate receptor. NLC-QT and F-NLC-QT showed high antioxidant activity. Therefore, our results suggest that QT-F-NLC is a carry system with potential for future BC therapy that show size smaller than 200 nm, low PdI, high long-term stability, high EE and antioxidant activity, sustained release and cytotoxic to CB cells (RT4).